Загальна характеристика роботи
КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
ПАРШИКОВА ТЕТЯНА ВІКТОРІВНА
УДК 57.08 : 535.37 : 582.261
CТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНІ МАРКЕРИ АДАПТАЦІЇ МІКРОВОДОРОСТЕЙ ПРИ ДІЇ ПОВЕРХНЕВО-АКТИВНИХ РЕЧОВИН
03.00.12 – фізіологія рослин
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
доктора біологічних наук
Київ – 2003
Дисертацією є рукопис
Робота виконана на кафедрі фізіології та екології рослин Київського національного університету імені Тараса Шевченка
Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор, членкор
УААН МУСІЄНКО Микола Миколайович,
Київський національний університет імені Тараса
Шевченка, завідувач кафедри фізіології та
екології рослин
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор МУСАТЕНКО
Людмила Іванівна, Інститут ботаніки імені
М.Г.Холодного НАН України, завідувач відділу
фітогормонології
доктор біологічних наук, професор ГОЛОВКО
Ераст Анатолійович, Національний ботанічний
сад імені М.М.Гришка НАН України, завідувач
відділу алелопатії
доктор біологічних наук ТАРАНОВА Людмила
Анатоліївна
Провідна установа: Донецький національний університет Міністерства
освіти та науки України
Захист відбудеться “24 ” лютого 2003 р. о 14 годині
на засіданні спеціалізованої вченої ради Д26.001.24 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: 03127, Київ, проспект акад. Глушкова, 2, корпус 12 (біологічний факультет), ауд. 215.
Поштова адреса: 01033, Київ, вул. Володимирська, 64, спецрада Д26.001.24, біологічний факультет.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: Київ, вул. Володимирська, 58.
Автореферат розісланий “ 23” січня 2003 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
кандидат біологічних наук, професор Брайон О.В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність роботи
Водорості є основними первинними продуцентами органічних речовин, кисню та утилізаторами вуглекислого газу водних екосистем як континентальних водних об’єктів, так і Світового океану. Завдяки високому фотосинтетичному потенціалу вони синтезують до 74% органічних речовин водних екосистем або 24% сумарної продукції земної кулі (Considine, 1984; Саут, Уиттик, 1990). Разом з тим щорічно об’єми споживання поверхнево-активних речовин (ПАР) та їх попадання у водні об’єкти істотно збільшуються. Так, наприклад, якщо прийняти рівень споживання синтетичних ПАР у 1985р. за 100%, то у 2000 р. темпи зростання їхнього використання в різних галузях коливались від 116 до 750% (Поверхностно-активные …, 1989; Савин и др., 1991; Остроумов, Федоров, 1999; Остроумов, 2001). Це й обумовлює збільшення частоти випадків значного перевищення гранично допустимих концентрацій (ГДК) вмісту ПАР у природних водах. Створені завдяки успіхам хімії синтетичні ПАР (СПАР) поступово перетворюються в стрес-фактор водного середовища, що істотно впливає на функціональну активність не лише водоростей, але й інших гідробіонтів.
Не зважаючи на це механізми дії ПАР на життєдіяльність водоростей, зміни фотосинтетичної активності, водного обміну, шляхи формування стійкості останніх не з’ясовані.
Успішному розв’язанню даної проблеми в значній мірі заважає відсутність інформаційних маркерів експрес-виявлення початкових етапів дії ПАР на клітини водоростей. Мало відомі реакції на контакт з ПАР основних структурних компонентів та функціональних показників у представників різних систематичних відділів водоростей залежно від фізіологічного стану клітин. Обмежена також й інформація щодо значення в процесах стійкості до ПАР їх метаболічних характеристик, особливостей виживання мутантних організмів та їх адаптації до дії ПАР. Це й обумовило проведення комплексу досліджень, які склали основу даної роботи.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами, проектами. Дисертаційна робота виконувалася у рамках бюджетних тем кафедри фізіології та екології рослин Київського національного університету імені Тараса Шевченка, проектів Фонду фундаментальних досліджень України де дисертант була виконавцем тем: “Забруднення навколишнього середовища поверхнево-активними сполуками як фактор регуляції росту та продуктивності водоростей” (N 0197U017067); “Дослідження структурно-функціонального стану мікроводоростей під впливом присутніх у воді поверхнево-активних речовин” (N 0102U004059); “ Екзогенна індукція адаптивних реакцій для стабілізації продуктивності зернових культур в несприятливих екологічних умовах” (N 0197U003136); “Адаптивні реакції рослин в системі моніторингу агро- та фітоценозів за умов дії факторів довкілля та антропогенного забруднення” (N 01БФ036-02); спільного гранту уряду України та Фонду цивільних досліджень та розвитку США (CRDF) “Вплив поверхнево-активних речовин на адгезію та сорбцію важких й благородних металів клітинами мікроводоростей” (UB1-320) Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, проекту INTAS N 99-0130 “Особливості зміни біорізноманіття фітопланктону під дією екологічних факторів” Інституту Південних морів НАН України.
Мета і задачі дослідження. Головною метою досліджень було з’ясування механізмів формування стійкості мікроводоростей до впливу стрес-факторів водного середовища (на прикладі природних та штучних ПАР), визначення маркерів процесів, що лежать в основі формування адаптивного потенціалу клітин, виживання та збереження їхньої продуктивності.
Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі задачі:
· вивчити реакції відгуку представників Cyanophyta (Cyanobacteria), Chlorophyta, Bacillariophyta та Rhodophyta, як домінуючих відділів у екосистемах ряду водних об’єктів на дію різного типу синтетичних й природних ПАР Критеріями вибору ПАР як діючих реагентів були об’єми та різноманіття використання цих сполук на практиці, а також рівні їхнього фактичного знаходження у природних водах. та їхніх сумішей;
· визначити найбільш інформативні маркери прояву негативної дії ПАР на водорості для своєчасної діагностики та можливого усунення подальших негативних змін у альгоценозах;
· з’ясувати якісні й кількісні зміни у структурі основних органел клітин (ядра, хлоропластів, мітохондрій, апарату Гольджі тощо), особливості перебігу фотосинтезу (залежно від комплексу фоточутливих пігментів, швидкості фотовицвітання) та вплив низки зовнішніх і внутрішніх факторів (інтенсивності сонячного освітлення, особливостей морфометрії та рухливості клітин водоростей) при дії ПАР*;
· визначити особливості гідратації внутрішньоклітинних структур водоростей під час контакту з ПАР методом діелектрометрії в короткохвильовому діапазоні частот (КХЧ-діелектрометрії);
· дослідити можливості прояву синергізму в дії ПАР та важких металів зі змінною валентністю (на прикладі Cr6+);
· з’ясувати перспективи одержання та використання генетично трансформованих культур (ГТК) водоростей, резистентних до ПАР;
· оцінити стійкість та функціональну активність ГТК в присутності ПАР;
· розробити методи вирощування ГТК для практичного використання в біотехнологічних процесах.
Об’єкт дослідження – біопродуктивність й фізіологічний стан природних популяцій та промислово цінних культур водоростей за умов дії поверхнево-активних речовин.
Предмет дослідження – структурно-функціональні маркери формування стійкості та адаптації мікроводоростей в антропогенно забрудненому ПАР водному середовищі й можливості їх практичного використання;
Методи дослідження – системний підхід до вивчення фізіологічної реакції мікроводоростей з різним комплексом фоточутливих пігментів й кількісна оцінка показників функціональної активності організмів за умов дії поверхнево-активних речовин як стресових факторів за допомогою фізіологічних (диференціальної флуорометрії, лазерної кореляційно-допплерівської спектрометрії, КХЧ-діелектрометрії), біохімічних, люмінесцентно-мікроскопічних та статистичних методів.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше сформована концепція адаптаційної стратегії фізіологічних реакцій мікроводоростей при формуванні біопродуктивних характеристик водних екосистем за умов дії ПАР. В основі її покладені оригінальні цитологічні та морфометричні біоіндикаційні маркери поведінки, швидкості та енергетики руху, як складові загальної адаптативної відповіді клітин водоростей на дію стресових факторів.
Визначені основні захисні реакції мікроводоростей на вплив ПАР. До них належать посилення негативного таксису у здатних до активного руху видів; утворення кулеподібних формувань трихом, зовні покритих шаром слизу; наявність загострених виростів клітинної оболонки, що осаджують міцели ПАР на менш життєво важливих частинах поверхні клітин; формування щільних багатоклітинних плівок та агрегатів в моноклітинних суспензіях мікроводоростей. З’ясовано, що у виживанні водоростей під впливом стресових факторів виключно важливу роль відіграють екзогенні слизові полісахариди, що формують навколо клітин захисні оболонки. Істотне значення в посиленні деструктивного впливу ПАР на клітини водоростей має негативний електрокінетичний заряд поверхні клітин (дзета-потенціал), що прискорює контакт клітин, в першу чергу, з катіонактивними ПАР (КПАР).
Доведені вперше факти впливу ПАР на ступінь гідратації внутрішньоклітинних структур та форми води у водоростей. На клітинах 16 видів та штамів прокаріотних й еукаріотних водоростей різного фізіологічного стану вивчено особливості прояву реакції. Встановлено, що стан і особливості гідратації внутрішньоклітинних структур є основним регулятором фотосинтетичних і метаболічних процесів у водоростей та маркером взаємодії ПАР з клітинами останніх.
Вперше встановлено, що характер впливу ПАР на життєдіяльність фітопланктону залежить від інтенсивності сонячної інсоляції. Збільшення останньої в межах від 10 до 130 Вт/м2 підсилює негативний вплив ПАР на ріст, розвиток та фотосинтетичну активність водоростей тим сильніше, чим вищий рівень освітлення.
Показано, що негативна реакція водоростей на сонячне опромінення, особливо в роки високої активності Сонця, реєструється не лише в поверхневій плівці води (для водоростей нейстону), але й на глибині до 0,1-0,2 м водної товщі залежно від прозорості води та її кольору. Однією з причин зазначеної негативної реакції на високий рівень сонячного випромінювання є зміни в стані світлочутливих пігментів, в першу чергу, хлорофілу а та гідрофобного комплексу клітинних структур.
Вперше дослідженні процеси фотовицвітання хлорофілів прокаріотичних та еукаріотичних клітин водоростей під впливом ПАР. Присутність КПАР у воді значно посилювала процеси фотовицвітання водоростей й пригнічувала їхню фотосинтетичну активність. Більшу стійкість до фотовицвітання виявила пігментна система еукаріотичної водорості (Chlorella) в порівнянні з прокаріотами (Microcystis, Anabaena).
Вперше одержані генетично трансформовані клітини р.Anabaena PCC 7120 стійкі до сильнодіючих мембранотропних КПАР. Серед одержаних ГТК виділені форми стійкі до впливу катаміну в концентраціях до 10 мг/л.
Підібрані умови інтенсивного культивування ГТК (оптимальне поживне середовище, тип і концентрації антибіотиків, що зберігають асептичність культури), досліджені особливості їх морфогенезу і росту.
Практичне значення одержаних результатів. Визначені та запропоновані маркери експрес-індикації негативного впливу ПАР на фізіологічний стан мікроводоростей, що були використані для біопродуктивних характеристик водних екосистем.
За здатністю до виживання в присутності різноманітних ПАР представників основних систематичних відділів водоростей можна розташувати в такому порядку: Chlorophyta + Euglenophyta > Bacillariophyta > Cyanophyta > Dinophyta > Chrysophyta.
Доведено, що дія ПАР, і в першу чергу КПАР, є суттєвим фактором зниження фотосинтетичної активності фітопланктону внаслідок пошкодження біологічних мембран й прискорення фотовицвітання світлочутливих пігментів. Це може бути використано для прогнозування тенденцій розвитку фітопланктону на вплив даного забруднювача особливо в роки високої активності Сонця у водних об’єктах, розташованих у південних районах.
Доведено, що життєдіяльність водоростей пов’язана не лише з прямою дією ПАР на функціонування біологічних мембран й фотосинтетичну активність, але й з наявністю у воді важких металів зі змінною валентністю (зокрема, Cr6+). З’ясовані нами механізми спільного впливу важких металів із змінною валентністю та ПАР є новим напрямком досліджень впливу водного середовища на функціонування екосистем та формування їхньої біологічної продуктивності і можуть бути запропоновані для технології видалення ПАР із стічних вод за рахунок іммобілізованих клітин найбільш резистентних видів зелених та діатомових мікроводоростей. Потребують перегляду діючі нормативні акти, що регулюють рівні гранично допустимих концентрацій ПАР у водоймах. В реальних умовах вони недооцінюють загрозу, яку становлять речовини з поверхневою активністю для фотосинтезуючого ланцюга водних екосистем.
В числі метаболітів водоростей виявлені біологічно активні речовини, які мають значну перспективу різноманітного використання (Патенти на винахід N 13945 від 17.04.1996 р. та N 27446 від 17.04.2001 р.).
Теоретичні розробки даної проблеми включені до підручників “Фізіологія рослин” та “Фотосинтез”, використовуються при викладанні нормативних курсів “Фізіологія рослин”, “Біохімія рослин” та спецкурсів “Фізіологія та біохімія нижчих рослин”, “Індустріальний фотобіосинтез”, “Стійкість рослин”.
Особистий внесок автора. Дисертантом особисто здійснені інформаційний пошук та аналіз літературних даних, розроблені робочі гіпотези, обґрунтована методологія постановки дослідів, виконані експериментальні дослідження, проведені інтерпретація та узагальнення одержаних результатів, підготовлені друковані праці.
Результати деяких підрозділів отримані безпосередньо автором при консультативній допомозі проф. Брайона О.В. – підрозділ 6.4, д-ра Куритц Т. (Окриджська Національна лабораторія, США) – підрозділ 5.5; д. ф.-м. н. Щеголевої Т.Ю. (Інститут радіофізики та електроніки НАН України) – підрозділ 4.2. Цитологічні дослідження виконані разом з д. б. н. Поповою А.Ф. (Інститут ботаніки НАН України). Результати спільних досліджень представлені у відповідних спільних публікаціях. Кваліфіковану допомогу у визначенні видового складу фітопланктону та його кількісних характеристик систематично надавала старший інженер Пахомова М.Н. (Інститут гідробіології НАН України).
Апробація результатів дисертації. Основні наукові результати були представлені на 8-му Міжнародному симпозіумі по фототрофних прокаріотах (Урбіно, Італія, 1994); Міжнародному симпозіумі з фармакології (Мілан, Італія, 1995); 1-й, 2-й Міжнародних конференціях “Прогрес в науці про рослини, їх вирощуванні та регуляції росту” (Мосонмадьяровар, Угорщина, 1996, 1998); 3-му, 4-му, 5-му Міжнародних симпозіумах по забрудненню довкілля в Центральній та Східній Європі (Варшава, Польща, 1996, 1998; Прага, Чехія, 2000); 10-му з’їзді Українського ботанічного товариства (Полтава, 1997); практичному семінарі НАТО “Біорізноманіття органічних ксенобіотиків” (Єсенік, Чехія, 1997); 4-й Всеукраїнській науково-практичній конференції “Вода – проблеми та рішення” (Дніпропетровськ, 1998); Міжнародній конференції “Онтогенез рослин в природному та трансформованому середовищі” (Львів, 1998); наукових читаннях, присвячених 100-річчю відкриття подвійного запліднення у покритонасінних рослин професором С.Г.Навашиним (Київ, 1998); конференції молодих дослідників “Сучасна екологія та проблеми сталого розвитку” (Львів, 1999); 2-й Міжнародній конференції “Актуальні проблеми сучасної альгології” (Київ, 1999); Міжнародній конференції “Озерні екосистеми: біологічні процеси, антропогенна трансформація, якість води” (Мінськ, Бєларусь, 1999); Міжнародній конференції “Фізіологія рослин – наука III тисячоліття” (Москва, Росія, 1999); 4-му Європейському семінарі “Біотехнологія мікроводоростей” (Бергольц-Рейбрюке, Германія, 2000); 10-му Міжнародному симпозіумі по фототрофних прокаріотах (Барселона, Іспанія, 2000); 5-й Всеросійській конференції по водних рослинах “Гідроботаніка-2000” (Борок, Росія, 2000); практичному семінарі НАТО “Інноваційні можливості для відновлення забруднених територій” (Прага, Чехія, 2001); Симпозіумі по використанню мікроводоростей та насіннєвих рослин в системі рослина – грунт (Мосонмадьяровар, Угорщина, 2001); 3-му з’їзді Гідроекологічного Товариства України (Тернопіль, 2001); конференції “Фізіологія рослин в Україні на межі тисячоліть” (Тернопіль, 2002); 15-му Міжнародному симпозіумі по рослинних ліпідах (Оказакі, Японія, 2002); 8-му з’їзді Українського біохімічного товариства (Чернівці, 2002); Міжнародній конференції “Фотосинтез й продуктивність рослин” (Київ, 2002).
Публікації. Результати досліджень представлені у 49 друкованих роботах, що включають монографію у співавторстві, 21 статтю у профільних вітчизняних і зарубіжних виданнях, 2 патенти на винаходи у співавторстві та 25 публікацій з матеріалами і тезами доповідей у збірках вітчизняних та закордонних з’їздів та конференцій.
Об’єм та структура роботи. Дисертаційна робота викладена на 271 сторінці машинописного тексту й складається зі вступу, інформаційної частини, що містить огляд літератури (1 розділ), експериментальної частини (5 розділів), узагальнення, висновків, списку цитованої літератури (407 джерел). Робота містить 80 рисунків та 69 таблиць.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
ПОВЕРХНЕВО-АКТИВНІ РЕЧОВИНИ Й ДЖЕРЕЛА ЇХНЬОГО НАДХОДЖЕННЯ У ВОДНІ ОБ’ЄКТИ
Узагальнено інформацію щодо використання ПАР у виробництві, масштабів їх надходження у навколишнє середовище та концентрацій у воді. На прикладі 16 різних галузей промисловості дається перелік технологічних процесів, де застосовують ПАР з наступним скиданням відпрацьованих стоків у водні об’єкти. Лише по місту Києву використовується більше 25 композицій миючих засобів вітчизняного й зарубіжного виробництва з високими діючими дозами (до 16 г/л й вище).
Окремо розглянуті питання поведінки ПАР у воді, методи моніторингу, а також їхнього впливу на формування якості природних вод.
На підставі узагальнення сучасної літератури розглянуто вплив ПАР на життєдіяльність водоростей, а також процеси самоочищення природних вод за активною участю багатьох гідробіонтів.
Проведений аналіз ситуації свідчить про актуальність й гостроту проблеми взаємодії ПАР з клітинами мікроскопічних водоростей, оскільки стабільність найбільш поширених СПАР у воді коливається від 3 до більше ніж 30 діб, а біологічне руйнування відбувається в межах від 35 до максимум 92%. Враховуючи, що на одного мешканця України припадає в середньому в 12-15 разів менше води, ніж на території колишнього СРСР в цілому (Природа, 1987), виникає необхідність глибоких досліджень взаємодії фотосинтезуючих клітин з ПАР та з’ясування факторів, що визначають глибину та напрямок цих процесів.
ОБ’ЄКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Об’єктами досліджень були альгологічно чисті (15 видів) й бактеріально чисті (2 штами та їх мутанти) культури водоростей, а також фітопланктон водосховищ Дніпра й низки малих річок його басейну. Культури водоростей відрізнялися між собою набором фоточутливих пігментів та інтенсивністю фотосинтезу, а саме:
- синьозелені водорості-прокаріоти (Cyanophyta), які в останні роки відносять до фототрофних Cyanobacteria (Определитель бактерий Берджи, 1997). Однак далеко не всі фахівці з цим погоджуються (Кондратьева, 1975, 1992, 2002; Костяев, 2001). З фізіологічного боку ці організми важливі тим, що вони першими на Землі почали здійснювати аеробний фотосинтез при наявності лише хлорофілу а;
- зелені водорості – еукаріоти (Chlorophyta), що фотосинтезують, як і всі вищі рослини, за участю хлорофілів a та b;
- діатомові водорості (Васіllariophyta), здійснюють фотосинтез за участю хлорофілів а та с;
- червоні водорості (Rhodophyta) як рослини, що мають хлорофіли а та d.
В дослідах було використано об’єкти, отримані з колекції культур водоростей лабораторії мікробіології біологічного науково-дослідного Інституту Санкт-Петербурзького університету, Інституту гідробіології НАН України, Окриджської Національної лабораторії (США) та кафедри гідробіології МГУ ім. М.В.Ломоносова. З синьозелених - Anabaena PCC 7120 (б/ч), Anabaena PCC 7120 (генетично трансформовані мутанти, б/ч); Microcystis aeruginosa Kuetz. em Elenk., HPDP-66; Nostoc muscorum Ag. (Elenk.), HPDP-22; Nostoc sp.; Nostoc punctiforme (Kuetz.) Hariot.(б/ч - Ок Ридж, США); Oscillatoria limosa Ag., Str. Kov.8715; Spirulina platensis (Nordst.) Geitl., HPDP-60; з зелених - Chlamydomonas reinhardtii Dang. (Ок Ридж, CША); Ankistrodesmus fusiformis Corda, Chlorella vulgaris Bejer., Str.Larg 3, HPDP-3; Chlorella vulgaris Bejer., HPDP-19; Dunaliella salina Teod., HPDP-11; Dunaliella salina Teod., HPDP-12; Scenedesmus quadricauda (Turp.) Breb., HPDP-10; Scenedesmus obliquus (Turp.) Kutz., HPDP-13; з червоних –Porphyridium cruentum (Ag.) Nag., HPDP-22.
Культури водоростей вирощували на селективних поживних середовищах при температурі 20 ± 2оС та освітленні 6,6-7,4 Вт/м2 (тривалість чергування світла й темряви – 12/12 годин). Для Microcystis aeruginosa, Ankistrodesmus fusiformis використовували середовище Фитджеральда N11, для представників роду Scenedesmus – середовище Успенського, для Dunaliella salina – середовище Артарі, для Spirulina platensis – середовище Зарукка, для представників Anabaena – середовище Аллена-Арнона, для Porphyridium cruentum – середовище Йохнес (Каталог, 1991). Для дослідів брали культуру на логарифмічній та стаціонарній фазах росту.
Крім культур, використовували природні популяції водоростей (фітопланктон) в складі якого розвивались представники Bacіllariophyta, Сhlorophyta, Euglenophyta, Cyanophyta та поодинокі організми інших типів водоростей.
В процесі роботи вивчався вплив 9 ПАР різної хімічної природи:
- катіонактивні (КПАР) – катамін (алкілдиметилбензиламоній хлорид), етоній;
- аніонактивні (АПАР) – лаурилсульфат, сульфанол;
- неіоногенні (НПАР): превоцел Е, стеарокс – 6, синтамід;
- природні (ППАР) – міристинова (тетрадеканова) та альгінова кислоти.
Використані концентрації ПАР підбирались в залежності від реальних перевищень у воді їх ГДК, що реєструвались в природних водах різних водних об’єктів згідно даних Державних водних кадастрів та наших аналітичних визначень з використанням індикатора Азур 1 (Калениченко, 1987, 1996).
Підрахунки клітин водоростей та ідентифікацію видового складу водоростей здійснювали за допомогою камери Горяєва (для культур) та камери Нажотта (для природного матеріалу) на мікроскопах МБИ-1, МБИ-6. Для ідентифікації видового складу водоростей використовували загальноприйняті визначники: для Cyanophyta (Cyanobacteria) – Голлербах и др., 1953; Берджи, 1997; Bacillariophyta – Топачевский, Масюк, 1960; Бухтиярова, Вассер, 1999; Chlorophyta – Царенко, 1990; Царенко, Петлеванный, 2001; для різних відділів Топачевский, Масюк, 1984. Для дослідження зразків природної води при необхідності використовували концентрування фітопланктону – фільтрацію крізь мембранні фільтри (Синпор 3, 4).
Інтенсивність росту клітин мікроводоростей визначали: а) за зміною чисельності та біомаси лічильно-об’ємним методом у фіксованих 40%-ним формаліном пробах води за Топачевским, Масюк, 1984; б) концентрацією хлорофілу а; в) приростом сухої ваги.
Розміри поверхні (мкм2) та об’єму клітин мікроводоростей (мкм3) розраховували за відповідними формулами (Knutsen, Lien, 1981; Брянцева, 1999) після вимірів розмірних характеристик клітин з допомогою окуляр-мікрометра.
Контроль пігментного комплексу водоростей здійснювали за змінами вмісту хлорофілу а екстрактним та безекстрактним методами. При застосуванні екстрактного спектрофотометричного методу виміри концентрації пігментів проводили на СФ-46 з відповідними рекомендаціями робочої групи ЮНЕСКО (Мусієнко та ін., 2001). Для безекстрактного визначення застосовувався метод диференціальної флуорометрії нативних клітин водоростей з використанням Planctofluorometer FL 300 3M, розробки Красноярського університету (Гольд и др., 1984, 1993, 1996). Паралельно визначали DF (різницю інтенсивності флуоресценції до й після внесення симазину, як інгібітора електронного транспорту фотосинтезуючих клітин). Цей показник давав характеристику рівня життєздатності клітин або величину їх потенціальної фотосинтетичної активності.
Оцінку фотовицвітання клітин водоростей проводили за допомогою люмінесцентного мікроскопу МЛ-2, використовуючи варіант падаючого світла (через об’єктив), відфільтрованого зі спектру лампи ДРШ-250 світлофільтром ФС-1 (lmax = 430 нм).
Швидкість руху клітин водоростей (мкм/с) та їх енергетичний потенціал (ум. од.) визначали з допомогою лазерного кореляційно-допплерівського спектрометра (Власенко и др., 1992; Пономаренко, Паршикова, 2001).
Стан води та гідратацію внутрішньоклітинних структур водоростей визначали методом КХЧ-діелектрометрії в міліметровому діапазоні радіохвиль (Щеголева, 1983; Щеголева и др., 2000; Паршикова и др., 2001). При внесенні зразка в хвилепровід вимірювали зміни параметрів стоячої хвилі: 1) зміщення мінімуму останньої – DL; 2) зміни подвоєного мінімум – DX. Ці параметри використовуються для обчислення комплексної діелектричної проникності. Завдяки малим об’ємам для вимірювання (об’єм відповідної камери 0,005 мл) , а також короткотривалості проведення аналізу (2-3 хв.), дослідження виконувалися не лише в багатьох повторностях, але й з великою кількістю зразків. На останні діяли різні фактори (тривалість освітлення, темрява, різні концентрації ПАР) в реальному часі й умовах неруйнуючого контролю.
Одержання генетично трансформованих клітин Anabaena PCC 7120 Kutz. здійснювали за методом Wolk et al., 1988, з використанням УФ-опромінення та введення плазмід, виділених з Escherichia coli. Для подальшого захисту мутантів від бактеріальної контамінації нами були експериментально визначені концентрації антибіотиків: еритроміцину (25 мкг/мл) та неоміцину (400 мкг/мл поживного середовища).
Для визначення цитологічних змін у водоростей під впливом ПАР клітини фіксували 2,5% розчином глютарового альдегіду на фосфатному буфері, рН 7,4 (2 год. при кімнатній температурі). Постфіксацію здійснювали 1% OsO4 в тому ж буфері при 4оС 2 год. (Popova, 1999). Фіксовані зразки зневоднювали в серії спиртів зі зростаючою концентрацією та включали в ЕПОН-812. Ультратонкі зрізи клітин отримували на ультрамікротомі LKB-8800 (LKB, Швеція), контрастували ураніл-ацетатом та розчином цитрату свинцю за Reinolds, 1976. Зрізи аналізували на електронному мікроскопі 1200 EX (JEOL, Японія).
Експериментальна частина даної роботи виконувалась в період з 1991 по 2002 рр.
Математичне опрацювання одержаних результатів здійснювали з використанням методів статистичного аналізу (Лапач и др., 2000). Висновки робили на підставі критерію Стьюдента при довірчій імовірності Р= 0,95.
СТІЙКІСТЬ ВОДОРОСТЕЙ ДО ДІЇ ПОВЕРХНЕВО АКТИВНИХ РЕЧОВИН В СЕЗОННОМУ АСПЕКТІ
Дослідження проводились на природних зразках води з Дніпра (Київська ділянка Канівського водосховища) та з Кременчуцького водосховища в районі Канівського природного заповідника. У фонових (вихідних зразках) дослідної води, яка відбиралась для експонування в присутності ПАР за методом мікрокосмів, різноманіття мікроскопічних водоростей коливалось в межах від 21 до 51 одиниць представлених видів. Вихідна чисельність клітин водоростей залежно від сезону змінювалась від 695 до 36462 тис. кл/л, біомаса від 0,2 до 4,7 мг/л. Сумарний вміст хлорофілу а у фоновій воді складав від 3,7 до 16,3 мкг/л. Тривалість контакту водоростей з ПАР в експериментах коливалась в межах від 24 до 288 годин з контролем їх стану через кожну добу по всіх досліджуваних показниках.
Встановлено, що внаслідок контакту з ПАР різноманіття водоростей, показники їх чисельності, біомаси та потенційної фотосинтетичної активності істотно відрізнялися не лише в порівнянні з фоновою (вихідною водою), але й від контрольних варіантів.
Показано, що навіть за прийнятих рівнів ГДК присутності у природній воді КПАР (в межах 0,012-0,5 мг/л) порушується нормальний розвиток планктонних водоростей. КПАР не лише гальмували їх ріст, повністю припиняли фотосинтетичну активність, але й спричиняли відмирання організмів. Водорості різних систематичних відділів істотно відрізнялися за адаптаційною здатністю до негативної дії КПАР. Найкраще зберігали свою життєздатність й темпи приросту діатомові водорості (представники рр. Melosira, Stephanodiscus). Однак збільшення концентрації КПАР до 10 й 20 ГДК та тривалості контакту погіршувало ситуацію й викликало відмирання організмів цих родів.
Аналогічні досліди з фітопланктоном в присутності АПАР свідчать, що за характером свого впливу на життєдіяльність водоростей представники АПАР виявляють слабший альгіцидний ефект, ніж КПАР. Проте при попаданні у воду навіть в концентраціях близьких до різних ГДК, а тим більше при перевищенні останніх, вони негативно впливають на ріст та функціональну активність водоростей. Рівні пригнічення росту фітопланктону під впливом АПАР для різних в систематичному відношенні видів водоростей істотно відрізняються й в середньому складають в порівнянні з контролем не менше 2-3 разів для досліджених АПАР.
Найбільш стійкими до дії АПАР виявилися діатомові водорості, які інтенсивно розвивалися навіть при збільшенні концентрації діючих реагентів до 10 ГДК. За стійкістю водоростей до АПАР представників різних відділів можна розташувати в такому порядку: діатомові > зелені > синьозелені.
Цікаво, що до цього часу діатомові водорості, незважаючи на їх широке розповсюдження в природних умовах й високу продуктивність, в технологічному напрямку як компоненти штучних систем не привертали увагу дослідників. Одержані нами дані свідчать, що при наявності АПАР в низьких концентраціях в присутності діатомових водоростей поверхнево-активні сполуки взагалі зникали з води. При високих концентраціях АПАР (в межах 10-40 разів перевищення ГДК) водорості також тривалий час зберігали свою життєздатність й істотно зменшували концентрацію детергентів. Одним з найближчих завдань для практичної реалізації відповідної біотехнології для різних типів води є підбір найбільш продуктивних для цієї мети видів й штамів саме діатомових водоростей. По-друге, виключно важливе значення має розробка методів оптимального використання їхньої здатності до утворення кремнеземних структур та особливостей природної іммобілізації на останніх органічних сполук, а також адгезії на субстратах.
Щодо перевірених представників найбільш поширених АПАР (лаурилсульфат, сульфанол) можна зазначити, що негативність їх впливу на життєдіяльність водоростей посилювалась при збільшенні концентрації й часу контакту (від 24 до 96 годин й більше). У всіх випадках функціональний стан водоростей погіршувався тим сильніше, чим вищою була концентрація детергенту.
Суттєвих відмін реакції водоростей планктону на присутність синтетичних ПАР у різних за видовим складом їх угрупуваннях залежно від сезону року (весняний, весняно-літній, типово літній, літньо-осінній фітопланктон) нами не виявлено. У виживанні водоростей після контакту з ПАР більш істотну роль, ніж сезон року, відігравали видові особливості організмів як в будові клітин, так і в здатності до адаптації в несприятливих умовах навколишнього середовища.
Внесення в воду НПАР (превоцел Е, стеарокс та їх суміші) як в межах ГДК (0,03-0,5 мг/л), так і особливо у випадках їх перевищення, негативно впливало на розвиток фітопланктону навіть при наявності окремих НПАР у дослідній воді. Це свідчить про те, що прийняті нормативи гігієнічних та рибогосподарських ГДК для превоцелу та стеароксу 6 (в межах 0,5-0,1 мг/л) не гарантують для природних популяцій водоростей здійснення нормальних ритмів функціонування. Варіанти з НПАР відрізнялись від контролю за темпами приросту водоростей. Зміни ростових процесів та рівня життєздатності останніх були тим істотнішими, чим більшими були концентрація НПАР та тривалість контакту клітин водоростей.
Певну специфічність в дії різних видів природних ПАР вдалось встановити при порівнянні чутливості до них водоростей різних систематичних відділів. Відмічено, що на початку контакту водоростей з міристиновою кислотою (в концентрації 0,1-10 мг/л), а також синтамідом (0,3-3,0 мг/л) досліджені ПАР як окремо, так і в сумішах виявляли стимулюючий вплив на ріст та розвиток водоростей, в першу чергу, діатомових. Менш стимулюючий ефект відмічено для зелених й синьозелених.
З ряду досліджених НПАР в меншій мірі на розвиток водоростей впливав, порівняно з контролем, синтамід, як окремо, так і в суміші з міристиновою кислотою. При збільшенні часу контакту з НПАР до 120-240 годин темпи ростових процесів також знижувались спочатку вдвічі, а далі тим сильніше, чим довше взаємодіяли системи.
Приймаючи до уваги, що в складі стічних вод різні типи НПАР поступають у водойми щоденно, навіть при більш різноплановій дії їх на життєдіяльність водоростей, цю групу ПАР також слід віднести до істотних антропогенних факторів, які обумовлюють негативні зміни у формуванні фотосинтезуючого ланцюга водних екосистем.
Особливий вплив мають ПАР в регуляції морфогенезу водоростей та в формуванні їхніх цитологічних характеристик. Це питання досліджувалось на прикладі як рухливих водоростей, так і нерухливих форм. Об’єктами дослідження були: з Cyanophyta – Oscillatoria limosa Ag., O. neglecta Lemm., O. planctonica Wolosz., які здійснюють активні ковзаючі та коливальні рухи, а також Spirulina platensis (Nordst.) Geitl. Для останньої був характерним “скачковидний” рух, що нагадував поведінку спіралі, яка після стискання “плигала” на досить істотну відстань. З Chlorophyta об’єктами досліджень були Сhlamydomonas reinhardtii Dang. та Dunaliella salina Teod. З нездатних до активного руху форм були використані Сhlorella vulgaris Bejer. та Nostoc muscorum Ag.
Застосування лазерно-доплерівської спектроскопії свідчить, що в присутності ПАР активно рухливі форми водоростей намагаються виходити з зони контакту з ними. Ніби одержавши “хемосигнал” від поверхнево-активної сполуки, клітини Chlamydomonas reinhardtii мобілізують свій енергетичний потенціал й на 30-40% підвищують швидкість руху (рис. 1).
Рис. 1. Зміни енергетичного потенціалу та швидкості руху клітин Chlamydomonas reinhardtii Dang під впливом КПАР (катаміну).
Оскільки в умовах замкненого в колбі об’єму рідини повністю уникнути контакту з міцелами ПАР клітинам водорості не вдається, ефект реакції проявляється короткотерміново. При наявності в спеціалізованій кюветі зон чистої води Chlamydomonas reinhardtii активно концентрується саме на цих ділянках. Негативний хемотаксис активно проявляють й інші здатні до руху клітини водоростей.
Проаналізувавши за “Атласом сапробних організмів” перелік стійких до органічного забруднення води видів природних популяцій водоростей, ми пересвідчились в тому, що найбільш високим індексом сапробності характеризувалися саме рухливі форми. В даному разі здатність до активного виходу з забрудненої ділянки водної маси допомагає виживати саме цим представникам різних видів водоростей.
Встановлено, що під впливом КПАР істотно змінюється площа поверхні клітин водоростей та їх об’єм. Це є наслідком набрякання клітин, яке відбувається тим інтенсивніше, чим вища концентрація КПАР діє на клітини. При зниженні чисельності останніх реєструється значне збільшення об’єму клітин (рис. 2). Наприклад, при концентрації КПАР в межах ГДК об’єм клітин збільшився за рахунок розбухання в 2-3 рази, при 3 мг/л КПАР – в 3-20 разів, при 5 мг/л – в 17-30 разів.
Рис. 2. Вплив катаміну на зміну площі поверхні клітин Chlamydomonas reinhardtii.
Зміни морфологічних та фізіологічних показників водоростей під впливом КПАР свідчать про істотний негативний вплив детергента на мембрани організмів. Це й обумовлює падіння фотосинтетичної активності, зниження інтенсивності первинного синтезу органічних речовин та виділення кисню у водних екосистемах. Факти набрякання клітин в забруднених СПАР водоймах слід також враховувати при моніторингу розвитку фітопланктону за показниками біомаси.
При дослідженні цитологічних змін було встановлено, що при обробці Chlamydomonas reinhardtii розчином катаміну (КПАР) в концентраціях від 1 до 5 мг/л відмічається посилення вакуолізації клітин (до 50%). Як результат істотної вакуолізації, ядро в більшості клітин тісно оточено вакуолями (рис. 3а), а при високій концентрації спостерігались численні випадки злиття декількох вакуолей. Перинуклеарний простір нерідко мав незначні еввагінації зовнішньої мембрани. При всіх концентраціях КПАР відмічалась висока активність апарату Гольджі. Особливо високі концентрації ПАР вносили істотні зміни в структуру хлоропластів. Розмір хлоропласта сильно збільшувався, мабуть завдяки значному розбуханню й звивистості тилакоїдів (рис. 3б). Відмічаються часті випадки злиття тилакоїдів внаслідок чого формуються зони з порушеною структурою. Суттєві зміни спостерігаються і в піреноїді, його електронна щільність істотно знижується, в ньому відмічені тільки залишки білкової частини піреноїда у вигляді гранулярних структур. Амілогенна обкладка представлена лише трьома вузькими крохмальними зернами.
Рис. 3. Фрагменти клітин Chlamydomonas reinhardtii Dang. (катамін, а – концентрація 2 мг/л, б – 5 мг/л).
Встановлені структурно-функціональні зміни клітин водоростей віддзеркалюють складні адаптивні реакції клітин у відповідь на негативну дію КПАР і є ознакою не лише пригнічення її, але й пояснюють причини виникнення летального ефекту.
ГІДРАТАЦІЯ ВНУТРІШНЬОКЛІТИННИХ СТРУКТУР ВОДОРОСТЕЙ ЯК МАРКЕР ЇХНЬОГО СТАНУ ТА ФУНКЦІОНАЛЬНОЇ АКТИВНОСТІ
З сучасних методів, що дозволяють одержувати унікальну інформацію відносно стану водної компоненти клітин та структурно-функціональних змін їх в біологічних об’єктах нами була застосована КХЧ-діелектрометрія в міліметровому діапазоні радіохвиль (Щеголева и др., 2000). Наші дослідження за цією методикою є пріоритетними оскільки раніше вміст води в клітинах мікроскопічних водоростей характеризувався за загальною вологістю при визначенні сухої ваги. На прикладі культур мікроскопічних водоростей (представників Сyanophyta, Chlorophyta, Rhodophyta) залежно від календарного віку, стадії розвитку, фізіологічного стану, фотосинтетичної активності, умов освітлення) визначалася діелектрична проникність в діапазоні дисперсії вільної води при довжині хвилі 7,56 мм.
Вперше нами було показано, що клітини водоростей різного систематичного положення, навіть вирощені в ідентичних умовах і взяті для досліду на однакових фазах росту (логарифмічній, стаціонарній), характеризуються видовою специфічністю гідратного оточення клітинних структур. Зміни стану клітинної води у одного й того ж виду відмічені в залежності від фази росту та календарного віку культури.
Встановлено, що інтенсивно фотосинтезуюча культура містить максимальну кількість вільної (незв’язаної) води. У стаціонарній фазі росту клітини синьозелених водоростей також відрізнялися за станом й вмістом різних форм води. Видовою специфічністю фонових діелектричних параметрів відрізнялися й представники зелених та червоних водоростей (рис. 4). За кількісними показниками діелектричних параметрів виділялась водорість Chlamydomonas reinhardtii Dang., яка активно змінювала напрям та швидкість руху й уникала контакту з несприятливими хімічними факторами, одночасно збільшуючи енергетичний потенціал.
Порівняння величин співвідношення діелектричних параметрів на логарифмічній та стаціонарній стадіях росту показало, що досліджені культури за цими показниками чітко відрізнялись (рис. 5), що давало можливість оцінювати потенціальний рівень їх максимальної продуктивності.
Рис. 4. Діелектричні параметри стану води нативних клітин зелених та червоних водоростей.
Рис. 5. Зміна діелектричних параметрів мікроводоростей на логарифмічній фазі росту відносно стаціонарної фази.
В подальших дослідженнях вивчали вплив КПАР на діелектричні параметри водоростей різних систематичних груп. Одержані дані свідчать, що діелектричні показники стану води клітин водоростей чутливо реагують на зміну умов існування організмів. У випадку контакту клітин з КПАР гідратне оточення клітинних структур зменшувалось. Цей процес по-різному відбувався на світлі й в темряві. Під впливом контакту з КПАР істотно змінювався вміст вільної води в клітинах. Зміни були тим істотнішими й несумісними з нормальною життєдіяльністю клітин, чим вищою була концентрація та довшою тривалість контакту з КПАР.
Рис. 6. Зміни гідратного оточення клітинних структур (DL) та кількості вільної води (DХ) в культурі Microcystis aeruginosa у логарифмічній фазі росту через 3 та 24 години контакту з КПАР.
В цілому, характер змін гідратації внутрішньоклітинних структур водоростей як в нормі, так і під впливом різноманітних факторів дає чітке уявлення про динаміку цих процесів. Це дозволяє апаратурно без руйнування клітин проводити експрес-оцінку функціонального стану хлорофілвмісних організмів, визначати тенденції подальшого розвитку технологічного процесу їх вирощування, рівня продуктивності як в системах індустріального фотосинтезу, так й у водоймі.
Характер змін гідратації внутрішньоклітинних структур мікроводоростей за станом води (вільна/зв’язана) є чутливим інформативним експрес-маркером контролю функціональних процесів в організмах для оптимізації їх росту в різних умовах, а також при проведенні моніторингу за розвитком природних популяцій водоростей .
Метод КХЧ-діелектрометрії був застосований й у дослідженнях по вивченню взаємодії мікроводоростей з ПАР в присутності важких металів (на прикладі Сr6+). Раніше було доведено (Карамушка, 1991; Гладышев, 1999; Грузина и др., 2000), що поведінка у воді ПАР і акумуляція металів водоростями залежать від електрокінетичного заряду поверхні й трансмембранного потенціалу клітин. В зв’язку з цим нами з’ясовувались окремі питання взаємодії тест-культури водорості з ПАР в присутності у середовищі Cr6+. Як видно з табл. 1, за темпами приросту хлорофілу а Chlorella vulgaris Beijer. при додаванні солі хрому розвивалася досить інтенсивно. При додаванні КПАР приріст хлорели був нижчим контрольного варіанта. Ще більш суттєвими темпами зниження вмісту хлорофілу відрізнявся варіант із спільним внесенням солі хрому й КПАР. На кінець експерименту клітини водорості за цих умов повністю гинули, хоча хлорела, як відомо вважається еврібіонтним організмом і здатна виживати не лише в різних умовах земного існування, але й в космосі.
Таблиця 1
Зміна вмісту фотосинтезуючих пігментів у хлорели за різних умов хімічного навантаження (в мкг/л хлорофілу а)
Дата | Контроль | Cr6+ 1,8 мг/л | КПАР 3 ГДК | Cr6+ 1,8 мг/л + КПАР, 3 ГДК
15.04.99 | 93,5 ± 4,1 | 81,3 ± 3,2 | 75,1 ± 2,3