КИЇВСЬКИЙ УНІВЕРСИТЕТ ім. ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

На правах рукопису

ЛАВРУШЕНКО ЛЮДМИЛА ФЕДОРІВНА

УДК 576. 345 : 591. 133. 1

ОКИСНІ ПРОЦЕСИ В МІТОХОНДРІЯХ

ПІД ВПЛИВОМ КСЕНОБІОТИКІВ ТА ЇХ

АЛІМЕНТАРНА КОРЕКЦІЯ

03.00.04 - біохімія

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ - 1998

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в лабораторії біохімії ВАТ "Науково-дослідний інститут харчування".

НАУКОВИЙ

КОНСУЛЬТАНТ: доктор медичних наук

Жирнов Віктор Валентинович,

завідуючий лабораторією молекулярних механізмів клітинної сигналізації

Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, Київ

ОФІЦІЙНІ ОПОНЕНТИ: доктор біологічних наук

Виноградова Руфіна Петрівна, професор кафедри біохімії Київського університету ім. Тараса Шевченка, Київ

доктор біологічних наук, с.н.с.

Дмитренко Микола Петрович,

завідуючий лабораторією біохімії Інституту екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя МОЗ України, Київ

доктор біологічних наук, с.н.с.

Тугай Василь Андрійович,

провідний науковий співробітник відділу біохімії мязів Інституту біохімії

ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ

ПРОВІДНА УСТАНОВА: Інститут фармакології і токсикології АМН України, Київ

Захист дисертації відбудеться "15" грудня 1998 р. о 14 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 при Київському університеті ім. Тараса Шевченка за адресою: 252127, м. Київ, проспект Глушкова, 2, корпус 12 (біофак), ауд. 215.

Поштова адреса: 252033, Київ-33, вул. Володимирська, 64, спецрада

Д 26.001.24, біологічний факультет.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці університету, Володимирська, 58.

Автореферат розісланий "13" листопада 1998 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук,

професор О. В. Брайон

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. На протязі життя організм людини підлягає впливу значної кількості токсичних речовин як природного, так і, в основному, антропогенного походження, які надходять з атмосферним повітрям, питною водою, продуктами харчування, а також при контакті з ними в умовах виробництва.

До ксенобіотиків належать різні групи токсичних речовин. Нітрати– постійні супутники людини входять до складу рослин як продукти їх метаболізму (В. П. Реутов та ін., 1997). Останнім часом вплив їх на організм людини значно посилився, що обумовлено використанням інтенсивних технологій у рослинництві, які потребують внесення до грунту великої кількості мінеральних добрив. Потрапляючи до грунту з азотними добривами та із стоками тваринницьких комплексів, нітрати легко мігрують у верхні шари грунтових вод (О. І. Циганенко, 1994). При цьому виникають значні зони забруднення, що створює проблему з питною водою для сільського населення України. Вважають, що в середньому 17 % нітратів надходить до організму саме з питною водою.

Крім нітратів певну загрозу створюють також фтористі сполуки, розповсюдження яких обумовлено не тільки значними викидами промислових підприємств і присутністю їх у фосфорних мінеральних добривах, але й наявністю в Україні біогеохімічних провінцій з надлишком неорганічних сполук фтору в питній воді та продуктах харчування, найбільшою з яких є Бучакська (В. Н. Окунєв та ін., 1987). Сполуки фтору з харчовим раціоном потрапляють до організму людини, що сприяє розвитку симптомів хронічної фтористої інтоксикації – флюорозу (О. С. Касяненко та ін., 1993). Надлишок фтору особливо негативно впливає на організм дітей. У регіонах, де раціони харчування мають підвищений вміст фтору, здорових дітей у 3,5 рази менше, ніж у контрольних регіонах (В. П. Дьомін та ін., 1994).

Існує також проблема забруднення довкілля галогензаміщеними вуглеводнями, а саме, тетрахлорметаном. Установлено, що термін напівроз-кладу його в довкіллі становить 40 років (G. N. Peterson et al., 1994). Про актуальність цієї проблеми свідчить існування у США міжнародних програм, які розробляють методи ефективного знезараження грунтових вод та очищення їх від ССL4.

Викликає тривогу поширення використання харчових добавок – речовин, які добавляють до їжі під час її приготування, вплив яких на організм остаточно не зясовано. Це ароматизатори, консерванти, барвники, антиоксиданти, підсолоджувачі та багато інших. Особливої уваги потребують харчові добавки синтетичного походження. Для їх одержання використовують не тільки натуральні речовини, але й хімічні сполуки, такі як спирти, ароматичні вуглеводні, лактони, фурани, циклічні, ациклічні та карбонільні сполуки (Д. Мс. Gill, 1990, К. К. Бабієвський, 1990, E. N. Seitz, 1990, Е. К. Титов та ін., 1993). Різноманітність та складна будова цих речовин, їх здатність реагувати з білками, вуглеводами, жирами та іншими речовинами харчового раціону і перетворюватись при цьому на речовини із невідомими властивостями, спонукає відноситись до їх широкого використання із надзвичайною осторогою, оскільки організм людини раніше з ними ніколи не спіткався і тому не має системи для їх детоксикації. До того ж проблема ускладнюється застосуванням комбінації цих речовин у харчовому раціоні, оскільки сумарний вплив їх на організм не досліджено. Кількість харчових добавок, які використовуються у харчовій промисловості країн Європи і США, перевищує 1500. Недосконалість державного законодавства України приводить до проникнення на ринок харчових добавок, механізм дії яких на організм детально не вивчений. Все це свідчить про необхідність проведення сучасних біохімічних досліджень впливу ксенобіотиків на метаболічні процеси в організмі.

Як доведено, переважна більшість ксенобіотиків викликає порушення окисних процесів в клітинах живого організму. Відомо, що більшість метаболічних перетворень здійснюється в мікросомах печінки та в мітохондріях (Н. Я. Головенко, 1981). Реакційно здатні інтермедіати, що при цьому утворюються, можуть викликати зміну структури мембран, порушення активності мембранозвязаних ферментів та структурноорганізованих комплексів. Процеси, що знаходяться в основі цих порушень, їх послідовність та черговість до цього часу не зясовані.

За цих обставин особливе значення мають дослідження щодо зясування механізмів впливу ксенобіотиків на метаболічні процеси, а також розробка заходів, спрямованих на обмеження проникнення їх у внутрішнє середовище організму, прискорену елімінацію їх з організму, і, зрештою, попередження процесів порушень обміну речовин, індукованих ксенобіотиками.

В наш час вважається перспективним використання аліментарних факторів як антиоксидантів, що зумовлено участю їх в біохімічних процесах, які визначають клітинну резистентність до кисню та дозволяють цілеспрямовано використовувати протиокисні властивості речовин. Дослідження таких факторів є необхідним для обгрунтування можливості використання окремих біологічно активних сполук у складі харчових продуктів, виявлення їх оптимальних співвідношень у раціоні для розробки засобів аліментарної профілактики патологічних станів, які викликають ксенобіотики, і створення продуктів харчування спрямованої дії. Закономірним у цьому відношенні є інтерес до таких нутриєнтів як ретинол і токоферол, які можуть сприяти стабілізації структури мітохондріальної мембрани і тим самим нормалізувати процеси енергозабезпечення тканин.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було встановити біохімічні механізми дії різних класів ксенобіотиків та незбалансованого харчування на окисні процеси в мітохондріях і ліпідний склад гепатоцитів та наукове обгрунтування принципів аліментарної профілактики даних процесів.

Для досягнення поставленої мети до завдання роботи входило:

-

- дослідження дії харчових добавок (як натуральних, так і синтетичного походження) на окисні процеси в мітохондріях печінки;

- вивчення впливу на організм найбільш розповсюджених видів незбалансованого харчування (різні кількісні і якісні співвідношення жирів у раціоні, вплив фосфоліпідів);

- встановлення звязку між змінами у складі харчового раціону та метаболізмом у гепатоцитах;

- створення наукових підходів до аліментарного захисту організму від несприятливого впливу токсичних речовин і незбалансованого харчування.

Наукова новизна одержаних результатів. При проведенні досліджень вперше встановлено, що в патогенезі загальнотоксичної дії багатьох ксенобіотиків особливо важливу роль відіграє порушення окисного фосфорилювання в мітохондріях печінки, обумовлене накопиченням продуктів ПОЛ, що веде до ушкодження структурної цілісності мітохондріальної мембрани, активності звязаних з нею ферментів, а також зниженню вмісту аденозинтрифосфату. При цьому харчування виявляє модифікуючий вплив на окисні процеси в клітинах печінки.

Встановлено, що харчові добавки різного походження і призначення (ароматизатори, замінники цукру) можуть негативно впливати на окисно-відновні процеси в мітохондріях подібно до таких токсичних речовин, як фториди, нітрати, тетрахлорметан. Ступінь впливу на окисні процеси залежить від дози і тривалості їх дії на організм.

Вивчено закономірності змін основних компонентів ліпідної фази - загальних ліпідів, фосфоліпідів, холестеролу та його ефірів, жирнокислотного складу сироватки крові і тканин печінки, продуктів пероксидного окислення ліпідів - в звязку з різним якісним і кількісним складом раціону харчування.

Визначено універсальний механізм дії хімічних токсикантів і ксенобіотиків їжі на окисні процеси в мітохондріях. Односпрямованість порушень процесів окисного фосфорилювання зумовлена змінами активності ферментів циклу Кребса і дихального ланцюга, змінами ліпідного складу і структурної організації мембран мітохондрій.

Виявлено, що існують закономірності між якісним і кількісним ліпідним складом раціону і ступенем активації процесів пероксидного окислення ліпідів та змінами жирнокислотного складу тканин організму. Показано, що реалізація механізму дії оптимального за складом ліпідного компоненту раціону здійснюється через стабілізацію структурно-функціональної організації мембран мітохондрій.

Експериментально обгрунтовано ефективність застосування раціонів, збагачених вітамінами, як природними антиоксидантами, і поліненасиченими жирними кислотами, при порушенні процесів окисного фосфорилювання в мітохондріях за умов дії токсичних речовин.

Зясовано, що збалансованість харчування дозволяє помякшити наслідки токсичної дії на організм окремих ксенобіотиків, зокрема, фториду натрію і тетрахлорметану.

Розроблено наукові підходи до системи аліментарного захисту організму від токсичної дії ксенобіотиків, основними положеннями якої є збалансованість раціону, його ліпотропність і антиоксидантна спрямованість.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено принципи створення спеціальних продуктів харчування для корекції раціонів з метою усунення наслідків токсичної дії ксенобіотиків, що дає можливість знизити інтенсивність процесів ПОЛ і модифікувати ліпідний склад клітин печінки, нормалізувати окисно-відновні процеси в мітохондріях.

Визначення стану системи “структурно-функціональна організація мембран мітохондрій – процеси ПОЛ – антиоксидантний захист організму” запропоновано використовувати як обєктивні критерії для оцінки ступеня тяжкості порушень при дії ксенобіотиків або дисбалансу харчового раціону на організм.

Результати досліджень впливу раціонів із спеціалізованими продуктами харчування на стан ліпідного обміну і функцію антиоксидантної системи в організмі, можуть бути використані для оцінки ефективності їх використання при дії на організм токсичних речовин.

Створено новий харчовий продукт "Атлет", який впроваджено як лікувально-профілактичний. За матеріалами роботи одержано патент на винахід “Харчовий продукт “Атлет” (№ 9300611Ц від 15. 07. 97 р.).

Результати досліджень використано для написання і видання монографії “Патогенез, профілактика і лікування фтористої інтоксикації”; Київ: Здоровя, 1987. - 147 с. (в співавт. із В. М. Окунєвим і В. І. Смоляром).

Положення, які виносяться на захист

1.

1.

1.

1.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи викладено на V Всесоюзному біохімічному зїзді (Київ, 1986); 14 Всесоюзній конференції по травленню та всмоктуванню (Тернопіль, 1986); Республіканській науковій конференції "Еколого-гігієнічні проблеми харчування населення" (Київ, 1992); V Національному конгресі з харчування (Пловдів, НРБ, 1993); Республіканській науковій конференції "Медико-біологічні аспекти розробки продуктів харчування" (Київ, 1993); I Міжнародному науковому конгресі "Традиційна медицина і харчування" (Москва, 1994); 5-му Конгресі світової федерації Українських лікарських товариств (Дніпропетровськ, 1994); VII Українському біохімічному зїзді (Київ, 1997); IV Міжнародній конференції "Франція та Україна, науково-практичний досвід у контексті діалогу національних культур" (Дніпропетровськ, 1997); Науково-практичній конференції "Реабілітація хворих похилого віку із захворюванням серцево-судинної системи й церебрально-судинною патологією" (Київ, 1997); Науково-практичній конференції "Актуальні проблеми екогігієни і токсикології" (Київ, 1998).

Особистий внесок здобувача. В процесі виконання дисертаційної роботи здобувач був науковим керівником та відповідальним виконавцем окремих НДР, співвиконавцем фрагментів робіт. Дослідження впливу ксенобіотиків на активність сукцинатдегідрогенази та процеси окисного фосфорилювання в мітохондріях печінки щурів, а також підрозділи 3.3, 3.4 і 3.5 виконані здобувачем особисто. Показники ліпідного обміну під впливом фториду натрію досліджували разом із д.м.н. Жирновим В. В.; дію тетрахлорметану на показники обміну ліпідів вивчали разом з д.б.н. Фінагіним Л. К. Імунологічні дослідження на білих мишах проводили разом з член-кор. НАНУ, АМН України і РАМН Фроловим А. Ф., на хворих із серцево-судинною патологією – разом з к.б.н. Дроздовою І. В.; особлива подяка к.б.н. Мурашко С. В. за надану технічну допомогу при вивченні жирнокислотного складу тканин.

Публікації. По темі дисертації опубліковано 22 наукові роботи, в тому числі одна монографія і один патент на винахід.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, результатів роботи та їх обговорення, заключення, висновків, списку літератури, що складається з 351 роботи. Дисертація викладена на 220 стор., має у своєму складі 35 таблиць, 1 схему.

Дисертаційна робота виконувалась за планом науково-дослідних робіт Київського науково-дослідного інституту гігієни харчування (КНДІГХ).

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Для створення моделі фтористої інтоксикації використовували фторид натрію, який в організмі швидко дисоціює з утворенням іону фтору (О. П. Бресткін та ін., 1971).

Досліди проводили на білих щурах-самцях. Водний розчин фториду натрію щоденно вводили тваринам у шлунок за допомогою зонда. В експерименті використовували токсичні дози фтористого натрію – 35 мг/ кг маси тіла на протязі 3 діб, а також 2,4 мг/ кг (1/100 ЛД50) або 0,35 мг/ кг на протязі 180 діб, що відповідає тій кількості фтору, яка найчастіше надходить до організму працівників промислових підприємств, зайнятих у виробництві алюмінію та фосфатних добрив, або жителів районів з концентрацією фтору у питній воді в межах 4-6 мг/ л, що спостерігається в Бучакській біогеохімічній провінції Лівобережної України (О. С. Касяненко та ін., 1993). Частина тварин в умовах тривалого надходження в організм фториду натрію одержувала у харчовому раціоні ретинол-ацетат чи токоферол ацетат у дозах 70 мкг/кг або 5 мкг/кг маси тіла відповідно. З метою зясування механізму дії фториду натрію в дослідах in vitro вивчали його вплив на активність сукцинатдегідрогенази у мітохондріях печінки в залежності від концентрації та терміну дії.

Вплив пероксиду водню на окисне фосфорилювання вивчали в умовах додавання його в концентрації 1 - 5 мкМ Н2О2 до суспензії мітохондрій.

Для вивчення дії нітратів на процеси окисного фосфорилювання в мітохондріях печінки використовували нітрат натрію. Досліди виконували як на новонароджених, так й на дорослих щурах. У дослідних групах новонародженим щуренятам внутрішньошлунково вводили на протязі 14 діб розчин нітрату натрію у дозах 1/2 ЛД50 - 1089,5, 1/4 ЛД50 544,0, 1/8 ЛД50 272,4 мг/кг NO3- на 1 кг маси тіла відповідно. Дорослі щури отримували нітрат у біоеквівалентних дозах: 1/2 ЛД50 2250,0; 1/4 ЛД50 1125,0; 1/8 ЛД50 – 562,5 мг/кг. Коефіцієнт кореляції визначали за методом (О. І. Мерков, Л. Є. Поляков, 1974), де rху незалежно від знаку приймали за величин від 0 до 0,29 – як малу; 0,30 - 0,69 – як середню; 0,70 - 1,0 – як сильну кореляцію.

Досліди по вивченню впливу тетрахлорметану на показники окисного фосфорилювання у мітохондріях печінки та стан антиоксидантної системи організму виконували на білих щурах-самцях. Пошкодження печінки у щурів дослідних груп викликали шляхом трьохразового внутрішньошлункового введення 4 мл/кг маси тіла 40 % розчину тетрахлорметану у соняшниковій олії. У щурів III та IV груп половину ліпідного компоненту в раціоні замінювали на соняшниковий або соєвий фосфатидний концентрат відповідно.

Підсолоджувач сахарол, вилучений з дволистника солодкого, у 300 разів солодший від сахарози. Головні речовини сахаролу складають дитерпенові глікозиди стевіозид (60 %) та ребаудіозиди А і Б (30 %). За максимально переносиму дозу сахаролу була прийнята така, що в субхронічному експерименті не викликала загибелі тварин і гальмувала збільшення маси тіла не більш ніж на 10 % у порівнянні з контрольними тваринами. Дослідні щури одержували сахарол у кількості 3,6 мг/кг маси тіла, що за солодкістю адекватно фізіологічному нормативу цукру, а також збільшену у 10 та 50 разів кількість сахаролу (36 та 180 мг/кг маси тіла відповідно) протягом 5 місяців.

Для вивчення впливу сахаролу на процеси окисного фосфорилювання у мітохондріях печінки використовували білих щурів-самців з індукованим цукровим діабетом. Діабет викликали шляхом внутрішньошлункового введення алоксану у дозі 150 мг/кг маси тіла після 48-годиннного голодування. Через два тижні у тварин визначали вміст глюкози у сироватці крові. В експеримент брали тільки тих тварин, у яких концентрація глюкози в сироватці була підвищеною від 12 до 25 ммоль/л.

Вивчення впливу синтетичного підсолоджувача отизону (калієва сіль 6-літій-3,4-дегідро-1,2,3-окситіазин-4-ОН-2,2-диоксиду) здійснювали на білих щурах-самцях. Тварини одержували отизон у дозах, що складали 1/50 ЛД50, III групи – 1/100 ЛД50, IV групи – 1/1000 ЛД50 (160, 80 і 8 мг/кг маси тіла відповідно). Показники знімали через 4 місяці від початку експерименту.

Враховуючи достатньо високий рівень сапонінів у продуктах харчування та неоднозначність даних літератури про їх токсичність вивчали вплив таких сполук на організм у відповідності до загальноприйнятих в гігієні харчування та харчовій токсикології рекомендацій. Відносно вибору кількості сапонінів виходили з дози, яку використовують в процесі виробництва халви (300 мг/кг). Дозу розраховували на одиницю маси тіла людини, базуючись на реальному вживанні продукту (0,5 кг на добу). У такій кількості халви міститься 150 мг сапонінів, тобто 2,2 мг сапонінів на 1 кг маси тіла. Крім того дослідні групи тварин отримували в 50 і 100 разів збільшену дозу сапонінів (110 та 220 мг/кг маси тіла відповідно). Показники знімали через 2, 5 та 10 місяців від початку експерименту.

За обєкт дослідження було також використано ароматичні композиції, що імітують запах мяса та являють собою комбінацію ароматичних речовин біс(фурфурол)дисульфіду, 2-метил-2-пропентіолу, біс(2-метилаліл)сульфіду, 2-тіофентіолу. Тварини щоденно на протязі 4 місяців одержували ці препарати у дозах, що складали 1/20 ЛД 50, тобто 249 мг/кг маси тіла. На протязі експериментального періоду сумарна доза складала 4,5 ЛД50.

Вплив суміші амінокислот на процеси окисного фосфорилювання вивчали на білих щурах протягом 10 місяців. Тварин тримали на раціоні, у якому 25 % білків замінювали на суміш амінокислот, одержану із відходів мясної промисловості чи із крові великої рогатої худоби.

Згідно з рекомендаціями Всесвітньої організації охорони здоровя кількість жирів повинна складати від 15 % (нижня межа) до 30 % (верхня межа) добової енергетичної цінності раціону людини. Тому при проведенні експерименту використано саме такі кількості, а також 23 % – середнє значення величини жиру у складі раціону.

Вивчення впливу на організм різної кількості та різних співвідношень жирів рослинного та тваринного походження у раціоні проводили у хронічному експерименті на 240 білих щурах-самцях, які одержували ізоенергетичні раціони, збалансовані за вмістом харчових компонентів. Тварин поділяли на 3 групи, які одержували 15, 23 чи 30 % жиру з харчовим раціоном.

Склад раціону, % | I група | II група | III група

Жир | 15 | 23 | 30

Білок | 18 | 18 | 18

Вуглеводи | 67 | 59 | 52

Кожна з цих груп тварин в свою чергу була поділена на 3 підгрупи (А, Б, С), які одержували олію і лярд відповідно у співвідношеннях 1 : 3,3; 1 : 2; 1 : 1,3. Визначення проводили через 1, 3, 6 і 10 місяців від початку експерименту.

Вплив фосфоліпідного концентрату вивчали на 200 білих щурах. Тварини дослідних груп одержували 5, 50 чи 100 % фосфатидного концентрату замість відповідної кількості соняшникової олії і лярду від їх енергетичної цінності. Енергетична цінність контрольного раціону (1,696 мДж/100 г) була всього на 4,5 % більша від раціону із 100 % заміною (1,620 мДж/100 г) внаслідок того, що енергоцінність фосфатидного концентрату менша, ніж триацилгліцеролів і складала біля 27,21 кДж/г. Показники знімали через 1 та 6 місяців від початку експерименту.

Розроблений нами разом з співробітниками Інституту хімії та технології харчових продуктів АМН України екструзійний продукт "Атлет" складається з 55 % крупяної сировини (пшениця, кукурудза, рис, горох, овес), багатої на вітамін Є, 14 % сухого молока, що містить вітамін А, 10 % соняшникової олії, що містить токофероли, 16 % цукру, 5 % суміші амінокислот гідролізатної.

Дослідження впливу препарату “Атлет” на імунну відповідь організму здійснювали на білих мишах лінії СВА. У першій серії дослідів піддослідна група одержувала препарат “Атлет” у кількості 40 мг на 1 г маси тіла протягом 5 діб, у другій серії – у такій самій кількості на протязі 18 діб. По закінченні строку експерименту визначали вміст у селезінці імунних ро-зеткоутворюючих клітин (І – РУК), а також титр гемолізинів та гемаглютинінів у сироватці периферичної крові.

З метою вивчення впливу препарату “Атлет” на імунну відповідь у людей обстежено двадцять чоловіків, хворих на ішемічну хворобу серця (ІХС) без інфаркта міокарда, середній вік яких складав 52,6 2,8 роки, стаж праці на виробничому обєднанні “Південний машинобудівний завод” – 22,3 7,6 років, тривалість захворювання – 8,3 1,5 роки. Хворих було поділено на дві групи. До І групи увійшли десять чоловіків, які в амбулаторних умовах одержували по 100 г продукту “Атлет” на добу. Десять чоловіків, які складали контрольну групу, знаходилися на домашньому раціоні. На протязі одного місяця проводили традиційне медикаментозне лікування усіх хворих І та ІІ груп. Після закінчення періоду лікування вивчали в їх крові вміст Т- та В-лімфоцитів, а також вміст І, А та М-імуноглобулінів.

Мітохондрії із печінки щурів виділяли за методом D. Jonson, H. Lardy (1967). Визначення сукцинатдегідрогеназної активності проводили за методом T. P. Singer (1974). Швидкість поглинання кисню мітохондріями визначали за методом B. Chance, G. R. Williams, 1955; А. Д. Виноградов з спів. (1978). Активність АТР-ази визначали за методом H. Bradford (1976). Кількість білка визначали за біуретовою реакцією (A. Gornall et all, 1949). Аденілові нуклеотиди аналізували методом електрофорезу (Т. Б. Векстерн, О. О. Баєв, 1957), концентрацію їх вивчали спектрофотометрично (О. Спірін, 1957). Екстракцію ліпідів із печінки проводили за методом G. Folch et al. (1957). Аналітичний поділ сумарних ліпідів здійснювали хроматографічно (Е. Шталь, 1965). Рівень вільного та звязаного холестеролу в ліпідних екстрактах визначали за методом A. J. Courchaine et al. (1959) та M. J. Yasuda (1932). Визначення вмісту холестеролу ліпопротеїнів високої щільності (ЛПВЩ) та індексу атерогенності проводили за методом О. Н. Климова та І. Є. Ганеліної (1975). Вміст сумарних фосфоліпідів визначали за модифікованим методом R.J.L. Allen (1940). Вміст фосфору в ліпідних фракціях вимірювали методом (М. Кейтс, 1975). Інтенсивність процесів пероксидного окислення ліпідів оцінювали за вмістом дієнових конюгатів (R. A. Klein, 1970). Індекс окислення визначали як співвідношення поглинання зразку ліпідів при довжині хвилі 233 нм до довжини хвилі, при якій поглинання пропорційне до сумарної концентрації ліпідів у зразку – 216 нм. Кількість малонового діальдегіду визначали за методом H. Ohkawa (1979). Вміст ретинолу в печінці у щурів вимірювали флюорометрично за методом B. D. Druyan (1971). Електричні характеристики біслойних фосфоліпідних мембран знімали на приладі, принципова схема якого описана Л. І. Болтакс (1971). Жирнокислотний склад тканин вивчали на хроматографі "Інтерсматі" GC 121 DFL с детектором ДІП. Метилювання жирних кислот проводили по методу Лапкіна В.З., Садовніковой Н.П. (1971). Титр гемолізинів та гемаглютинінів у сироватці крові мишей визначали за методом О. Е. Вязова (1967). Вміст імунних розеткоутворюючих клітин у сироватці крові мишей досліджували за методом E. Бем (1979). Кількість імуноглобулінів визначали методом радіальної імунодифузії за Manchini, кількість Т- та В-лімфоцитів досліджували методом спонтанного та комплементарного розеткоутворення відповідно (Г. Фримель, 1987). Статистичну обробку результатів досліджень проводили за Стюдентом - Фішером і вважали їх вірогідними при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Окисні процеси в мітохондріях за дії фториду натрію

Забезпечення енергією живих клітин тісно повязане з безперервним постачанням відновлювальних еквівалентів із циклу трикарбонових кислот сукцинатдегідрогеназою (КФ 1.3.99.1) та NADH-дегідрогеназою (КФ 1.6.99.3) в дихальний ланцюг, локалізований у внутрішній мембрані мітохондрій. Раніше нами було зясовано, що фторид натрію негативно впливає на активність ферментів циклу Кребсу і дихального ланцюга, тобто на функціональну активність мітохондрій (Л. Ф. Лаврушенко, 1984). Ступінь негативного впливу залежить від дози та терміну дії ксенобіотика на організм тварин. Досліди було виконано на цілісному організмі, в якому на активність сукцинатдегідрогенази прямо чи опосередковано впливає значна кількість факторів.

Проведені нами дослідження свідчать, що через 5 хв інкубації суспензії мітохондрій в присутності 1 мМ NaF спостерігається зменшення сукцинадегідрогеназної активності на 21 %, яке зберігається на тому ж самому рівні протягом 20 хв. Збільшення концентрації фториду натрію у середовищі інкубації з 1 до 5 мМ викликає пригнічення сукцинатдегідрогеназної активності у 2 рази. При подальшому збільшенні концентрації NaF до 10 мМ зменшення ферментативної активності було незначним (6 %).

Дослідження впливу сукцинату на активність сукцинатдегідрогенази в присутності 10 мМ фториду натрію показали, що активність ферменту дещо підвищувалась (на 10 %) при концентрації сукцинату 40 мкМ. Повне відновлення ферментативної активності відбувалося при концентрації сукцинату 50 мкМ. Таким чином, сукцинат у певній концентрації сприяє повному відновленню первинної активності ферменту.

Активність ферментів, зокрема сукцинатдегідрогенази, в клітині залежить не тільки від кількості та властивостей ферментативного білка, ступеня насиченості його коферментом, але й від наявності активаторів, інгібіторів, доступності субстрату, що в значній мірі залежить від стану мембрани. Можливо, що в організмі дія іонів фтору може бути направлена на мітохондріальну мембрану, що викликає зміну її структури, активності ферментів та повязаних з ними процесів окисного фосфорилювання.

Виміри, проведені нами на плоских біслойних фосфоліпідних мембранах, показали, що аніони фтору не модифікують провідність ліпідного біслою і остання залишається на рівні, що притаманний іншим одновалентним іонам. Одержані дані свідчать про відсутність безпосередньої взаємодії іону фтору з фосфоліпідним компонентом біомембран, тобто його вплив опосередкований іншими процесами. З одного боку, ефект ксенобіотика може здійснюватись через безпосередній вплив продуктів пероксидного окислення ліпідів (ПОЛ) на ферменти циклу Кребса, а з другого боку на мембрану можуть впливати пероксиди, порушуючи її структурну цілісність і таким чином сприяють зниженню функціональної активності мітохондрій.

Показано, що пероксид водню в концентрації 5 мкМ порушує механізм окисного фосфорилювання (табл. 1).

Таблиця 1

Окисне фосфорилювання в мітохондріях печінки під впливом

пероксиду водню, Mm

Умови

досліду | Швидкість

поглинання кисню, мкмоль/хв на 1 мг білка |

Дихальний контроль,

КДК= | Швидкість фосфорилю-вання, [АДР]

мкмоль/хв

на 1 мг білка | Коефіцієнт фосфорилю-вання,

АДР/О

V3 | V

Контроль | 0,0440,003 | 0,0170,001 | 2,680,23 | 0,0650,005 | 1,930,11

+5 мкМ Н2О2 | 0,0220,001* | 0,0190,001 | 1,160,12* | 0,028*0,003 | 0,900,08*

% гальмування | 50 | +11 | 57 | 57 | 53

Тут і далі * - відмінності вірогідні у порівняні з контролем, р < 0,05.

При цьому виявлено ефект зменшення ступеня спряження окислення сукцинату з фосфорилюванням в мітохондріях внаслідок різкого (на 50 %) зниження швидкості дихання в метаболічному стані 3 (V3). Це дає підству вважати, що порушення активності ферментів циклу Кребса й дихального ланцюга, а також процесів окисного фосфорилювання в мітохондріях печінки спричинюється пероксидами, які утворюються у клітині під дією ксенобіотиків.

Експериментальні дані, представлені в табл. 2, свідчать, що індекс окислення жирних кислот сумарних ліпідів печінки у білих щурів, яким вводили щоденно по 0,35 мг/кг фториду натрію протягом 180 діб, вірогідно вище, ніж у контрольних тварин. Це можливо, хоча б частково, повязано зі встановленим нами зниженням рівнів фосфатидилхоліну й фосфатидилетаноламіну – найбільш ненасиченого фосфоліпіду (табл. 3).

Таблиця 2

Вміст холестеролу, ретинолу та індекс окисленості ліпідів у печінці щурів

при введенні фториду натрію, Mm

Умови

досліду | Холестерол, мг/ г сирої тканини | Ретинол,

мкг/ г | Індекс окис-

сумарний | вільний | звязаний | сирої тканини | леності

Контроль | 5,52 0,20 | 3,36 0,06 | 2,20 0,21 | 126,3 9,4 | 0,29 0,013

Фторид натрію,

0,35 мг/ кг, 180 діб | 4,91 0,11* | 1,56 0,04* | 3,35 0,12* | 114,9 8,9 | 0,34 0,011*

Фторид натрію,

2,4 мг/ кг, 180 діб | 5,19 0,28 | 1,12 0,04* | 4,07 0,28* | 101,2 7,5* | 0,36 0,01*

Таблиця 3

Вміст фосфоліпідів у печінці щурів при введенні фториду натрію, Mm

Умови

досліду | Загальний вміст фосфоліпідів | Сфінгоміелін+фосфатидил-інозит | Фосфатидил-холін | Фосфатидил-етаноламін | Дифосфатидил-гліцерин

+фосфатидна кислота

мкг ліпідного фосфору на 1 г сирої тканини

Контроль | 1255,0 93,0 | 214,6 9,2 | 542,2 17,1 | 384,0 12,2 | 62,8 2,5

Фторид натрію, 0,35 мг/ кг, 180 діб | 1098,0 61,0 | 196,5 9,9 | 486,4 16,3* | 322,8 11,4* | 52,7 2,7*

Фторид натрію, 2,4 мг/ кг, 180 діб | 890,0 47,0* | 154,0 5,7* | 407,6 13,7* | 252,8 7,9* | 47,2 3,6*

Зниження вмісту ретинолу, як одного із компонентів антиоксидантної системи, що виявлено в тканинах тварин, можливо повязано з більш інтенсивним його використанням в умовах фтористої інтоксикації,. При збільшенні дози фториду натрію до 2,4 мг/кг зменшується не тільки загальний вміст фосфоліпідів, але й всіх його фракцій (P < 0,05). Вміст сумарного холестеролу зменшується у печінці щурів тільки при дозі 0,35 мг/ кг на 180 добу, але перерозподіл його фракцій має таку ж саму спрямованість, що й при дозі 2,4 мг/ кг, тобто відбувається вірогідне зменшення вільного холестеролу і збільшення кількості звязаного. Вказані зміни властиві для неспецифічної відповіді організму на мембраноушкоджуючу дію токсичного агента.

Відомо, що підтримання нормальної рідинності біологічних мембран забезпечується у значній мірі жирнокислотним складом фосфоліпідів. Зменшення загальної кількості і зміна співвідношення окремих фосфолі-підних фракцій сприяє компенсаторному збільшенню вмісту холестеролу в мітохондріальній мембрані, що супроводжується змінами їх функціональних властивостей, внаслідок чого в клітинах тварин виникає дефіцит макроергічних сполук.

Експериментальні дані свідчать, що фторид натрію у дозі 0,35 мг/кг маси тіла через 180 днів викликає різке зниження вмісту АТР в тканинах печінки білих щурів у порівнянні з контролем (р < 0,05). При цьому зростає у 2,5 раза кількість АДР, можливо, за рахунок підвищення АТР-азної активності (табл. 4).

Таблиця 4

Вміст аденілових нуклеотидів та активність АТР-ази в мітохондріях печінки щурів при введенні фториду натрію, Mm

Умови досліду | Вміст аденілових нуклеотидів,

мкмоль/мг білка | Активність АТР-ази, мкатом Рi/мг

АМР | АДР | АТР | білка

Контроль | 0,369 0,068 | 0,285 0,007 | 0,502 0,023 | 0,70 0,10

Фторид натрію, 0,35 мг/ кг, 180 діб |

0,186 0,006* |

0,696 0,018* |

0,219 0,004* |

1,14 0,09*

Таким чином, за дії фториду натрію в печінці щурів спостерігається стимуляція процесів ПОЛ, що призводить до зміни її ліпідної компоненти, а також порушення активності ферментів, повязаних з мембраною, і спричинює дефіцит аденозинтрифосфату у тканинах. При цьому має значення не тільки доза фториду, але й термін його дії на організм.

Окисні процеси в мітохондріях в умовах впливу окремих промислових та сільськогосподарських токсикантів

Н і т р а т и. Експериментальні дані впливу нітрату натрію на дорослих та новонароджених щурів представлені в табл. 5.

Таблиця 5

Окисне фосфорилювання в мітохондріях печінки щурів при введенні

нітрата натрію, Mm

Умови

досліду |

Швидкість поглинання кисню, мкмоль/хв на 1 мг білка

V3 |

Коефіцієнт дихального контролю, |

Швидкість фосфорилюван-ня, [АДР]

мкмоль/хв на 1 мг білка |

Коефіцієнт фосфорилю-

вання, ADP/O

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6

Новонарождені щури

Контроль | 0,0630,001 | 0,0240,005 | 2,530,23 | 0,0420,004 | 1,880,13

Нітрат натрію

| 0,0330,0037* | 0,0200,002 | 1,680,10* | 0,0330,005 | 0,970,13*

| 0,0290,003* | 0,0160,0019 | 1,890,10* | 0,0280,003* | 1,0380,13*

| 0,0340,005* | 0,0150,002 | 2,140,20 | 0,0360,004 | 1,0400,09*

r/ху | 0,82 | 0,71

Дорослі щури

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6

Контроль | 0,0540,006 | 0,0200,008 | 2,590,17 | 0,0670,006 | 1,870,07

Нітрат натрію

| 0,0380,0027* | 0,0210,002 | 1,640,07* | 0,0560,005 | 1,440,08*

| 0,0390,004 | 0,0230,0016 | 1,640,15* | 0,0490,005* | 1,390,07*

| 0,0360,003* | 0,0200,002 | 1,750,098* | 0,0560,005 | 1,480,06*

r/ху | 0,03 | 0,03

Встановлено, що введення нітрата натрію у дозах, які складають 1/2, 1/4 або 1/8 ЛД50 протягом 14 діб, викликає вірогідне зменшення коефіцієнту дихального контролю, швидкості та коефіцієнту фосфорилювання в мітохондріях печінки як дорослих, так і новонароджених щурів. При цьому у новонароджених щуренят встановлена чітка залежність порушень функціональної активності мітохондрій від дози нітрату натрію, тоді як у дорослих тварин такої чіткої залежності не виявлено. Таким чином, при отруєнні нітратами змінюється не тільки склад і функції гемоглобіну (Є. І. Кривицька, Є. Г. Жук, 1994), але і зменьшується функціональна активність мітохондрій, що призводить до дефіциту в тканинах макроергічних сполук.

Т е т р а х л о р м е т а н. Одержані нами експериментальні дані свідчать, що введення тетрахлорметану в організм викликає різке розєднання процесів дихання і фосфорилювання та зниження енергетичної ефективності дихання в мітохондріях (табл. 6).

Таблиця 6

Окисне фосфорилювання в мітохондріях печінки щурів при введенні

тетрахлорметану, Mm

Умови

досліду | Швидкість поглинання кисню, мкмоль/ хв на 1 мг білка | Коефіцієнт дихального контролю, КДК= | Швидкість фосфорилювання, [АДР]

мкмоль/хв на 1 мг білка | Коефіцієнт фосфорилю-вання, ADP/O

V3

Контроль | 0,0370,005 | 0,0140,003 | 2,800,12 | 0,0740,008 | 2.020,15

Дослід | 0,0230,002* | 0,0120,002 | 1,940,06* | 0,0430,004* | 1,510,09*

Разом з цим, у печінці спостерігаються зміни показників ліпідного обміну: статистично вірогідне зростання вмісту сумарних ліпідів, малонового діальдегіду, дієнових конюгатів (табл. 7).

Таблиця 7

Вміст сумарних ліпідів, малонового діальдегіду, дієнових конюгатів та сумарного холестеролу в печінці щурів під впливом тетрахлорметану, Mm

Умови

досліду | Сумарні ліпіди, мг/г | Малоновий

діальдегід, мкмоль/г | Дієнові конюгати, мкмоль/г | Сумарний

холестерол, мг/г

Контроль | 61,9 7,8 | 0,90 0,03 | 0,15 0,02 | 3,91 0,34

Дослід | 229,8 53,7* | 15,96 2,67* | 0,73 0,03* | 5,13 1,18

На основі одержаних даних можна вважати, що інтенсифікація ПОЛ є важливим ланцюгом у патогенезі ураження печінки тетрахлорметаном. Згідно із даними G. Poli et al. (1992), тетрахлорметан негативно впливає на секрецію ліпідів у комплексі Гольджі, що свідчить про спільний механізм дії тетрахлорметану та фториду натрію (Л. Ф. Лаврушенко, 1982).

Окисні процеси в мітохондріях в умовах використання харчових добавок різного походження

А р о м а т и з а т о р и. Введення тваринам кожного з компонентів, що складають мясний аромат, у дозах 1/20 ЛД50 протягом 4 місяців призводить до статистично вірогідного зменшення коефіцієнту дихального контролю, швидкості та коефіцієнту фосфорилювання (табл. 8).

Таблиця 8

Окисне фосфорилювання в мітохондріях печінки щурів, які отримували

компоненти ароматизатору з запахом мяса, M m

Умови

досліду | Швидкість поглинання кисню, мкмоль/хв на 1 мг

білка | Коефіцієнт дихального контролю,

КДК= | Швидкість фосфорилю-

вання, [АДР] мкмоль/хв на

1 мг білка | Коефіцієнт фосфорилю-вання, ADP/O

V3

Контроль | 0,061 0,009 | 0,021 0,002 | 2,90 0,19 | 0,137 0,014 | 2.16 0,29

Біс(2-метилаліл)ди-сульфід | 0,076 0,014 | 0,040 0,004* | 1,87 0,24* | 0,076 0,022* | 1,44 0,19*

2-Метил-2-пропантіол | 0,053 0,007 | 0,038 0,006* | 1,44 0,12* | 0,094 0,009* | 1,12 0,11*

2-Тіофентіол | 0,066 0,012 | 0,048 0,009* | 1,39 0,13* | 0,064 0,008* | 1,31 0,30*

Біс(фурфурол)ди-сульфід | 0,075 0,002 | 0,052 0,007* | 1,47 0,21* | 0,065 0,008* | 1,21 0,019*

Інгібуючий вплив ароматизаторів на функціональну активність мітохондрій може бути зумовлений, з одного боку, безпосередньо за дії ароматизаторів з гетероциклічною структурою – біс(фурфурол)дисульфіду та 2-тіофентіолу) на активність ферментів, а саме АТР-аз, а, з другого боку, наслідком активації процесів ПОЛ у печінці щурів під впливом таких ароматичних речовин, як меркаптани та бісульфіди. На користь останнього свідчать дані про появу пероксиду водню в еритроцитах щурів за дії ароматичних бісульфідів (J. Ford et al., 1983).

С а х а