ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Національна академія наук України
Інститут біології південних морів
ім. О.О.Ковалевського
РУБЦОВА
Світлана Іванівна
УДК 576.8.095.3:547.912
САМООЧИЩЕННЯ МОРСЬКОГО СЕРЕДОВИЩА ВІД ВУГЛЕВОДНІВ НАФТИ
У ПРИБІЙНІЙ ЗОНІ СЕВАСТОПОЛЯ
03.00.17 - гідробіологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Севастополь - 2003
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Інституті біології південних морів
ім. О.О. Ковалевського Національної академії наук України
Науковий керівник: | доктор біологічних наук, професор, Миронов Олег Глібович ІнБПМ НАНУ, завідувач відділу
Офіційні опоненти: | доктор біологічних наук, професор, Сіренко Лідія Акимівна
Інститут гідробіології НАНУ, провідний науковий співробітник
доктор біологічних наук, професор, Самишев Ернест Зайнуллінович ІнБПМ НАНУ, завідувач відділу
Провідна установа: | Одеський Національний університет ім. І. І. Мечникова, біологічний факультет, Міністерство освіти та науки України, м.Одеса
Захіст відбудеться 17. 09. 2003 р.
о 10.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 50.214.01
при Інстітуті біології південних морів НАН України за адресою:
99011, м. Севастополь, пр. Нахімова, 2
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту біології південних морів НАН України за адресою: 99011, м. Севастополь, пр. Нахімова, 2
Автореферат розісланий 04. 08. 2003 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Д 50.214.01,
кандидат біологічних наук Неврова О.Л.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Нафта і нафтопродукти є на даний час одними з найбільш розповсюджених забруднюючих речовин морського середовища. У сучасних умовах слід очікувати змін транспортних потоків вуглеводневих енергоносіїв у Чорному морі, наближення їх до берегів України і Криму, і, як наслідок, можливого посилення нафтового забруднення прибережної зоні, зокрема, при аварійних ситуаціях. У цьому зв'язку особливої актуальності набувають дослідження процесів самоочищення водойм і перетворення нафтових вуглеводнів. Провідна роль у цьому процесі належить мікроорганізмам, здатним використовувати вуглеводні нафти як єдине джерело вуглецю й енергії. Кількісний і якісний склад нафтокислюючих мікроорганізмів у бухтах Севастополя досить добре висвітлений у літературі (Миронов 1976, 1985, 2000). Однак акваторія вузької прибережної зони - від урізу води до глибин 1,5-2 м у цьому плані практично не вивчена. Тут взаємодіють і концентруються потоки забруднюючих речовин, що надходять як з боку суші, так і з боку моря.
Прибережна зона моря характеризується великою різноманітністю розмірної структури донних відкладів, що впливає на процеси нагромадження і швидкість трансформації нафтового забруднення. У мілководній зоні завдяки активності гідродинамічних процесів трансформація забруднень буде, очевидно, іншою, ніж на великих глибинах, де гідродинамічні процеси послаблені. Частки зависі є субстратом, на якому, як правило, оселюються мікроорганізми, і при цьому підвищується інтенсивність трансформації органічної речовини. В зв'язку з цим можна сподіватися, що найбільш активно процеси бактеріальної деструкції органічних забруднень, включаючи нафту і нафтопродукти, будуть відбуватися у водяній товщі в період її каламучення й осідання часток на дно.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота є складовою частиною планової теми відділу морської санітарної гідробіології ІнБПМ НАНУ і входить у науково-дослідну тему "Дослідження і кількісна оцінка екологічної ємності чорноморських акваторій України у відношенні забруднень ядерної і неядерної природи" (№ ДР 0199U001390). Дисертант приймав участь в роботах в якості виконавця. Дисертаційна робота є основою виконання проекту в рамках стипендії Всесвітньої федерації вчених "Всесвітня лабораторія" за 2002 рік, індивідуального гранта Президента України для обдарованої молоді (розпорядження Президента України від 8.10.2002р. № 384/2002 рп), індивідуального гранта Національної академії наук України (постанова Президії НАНУ від 09.07.2003 р. № 203).
Мета і задачі дослідження. Метою дисертаційної роботи було визначення загальної чисельності гетеротрофних бактерій, виділення з неї нафтоокислюючого бактеріального комплексу і вивчення його фізіолого-біохімічних особливостей як показників самоочищення морського середовища від нафтових вуглеводнів у прибійній зоні моря. Для досягнення мети поставлені наступні задачі:
· вивчити чисельність і закономірності поширення бактерій, здатних використовувати вуглеводні нафти як джерело вуглецю й енергії в прибійній зоні моря;
· вивчити особливості взаємодії бактерій, зависі і нафти в умовах активного гідродинамічного режиму за експериментальними даними;
· виділити чисті культури нафтоокислюючих мікроорганізмів і вивчити їхні морфологічні і фізіолого-біохімічні властивості;
· визначити родову належність виділених культур;
· вивчити здатність росту нафтоокислюючих мікроорганізмів на різних джерелах вуглецю;
· визначити вплив деяких гідрометеорологічних факторів на чисельність нафтоокислюючих бактерій;
· одержати кількісні показники бактеріального самоочищення прибережної акваторії від нафтових вуглеводнів.
Об'єкт дослідження - процес самоочищення морського середовища від вуглеводнів нафти в прибійній зоні моря.
Предмет дослідження - нафтоокислюючі бактерії як агенти самоочищення моря від нафти і нафтопродуктів.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше отримані дані про розподіл гетеротрофної мікрофлори в акваторії прибійної зони, дані про зміну чисельності і деяких фізіолого-біохімічних показників нафтоокислюючих мікроорганізмів у прибійній зоні Севастопольських бухт - на ділянках з різним рівнем нафтового забруднення, визначена родова належність бактерій. Експериментально установлена швидкість седиментації зависі і її взаємодії з нафтою і бактеріями в умовах активного гідродинамічного режиму. Уперше проведена оцінка бактеріальної деструкції нафти в прибійній зоні, розраховані рівні бактеріальної складової і періоди самоочищення морських вод від нафтових вуглеводнів на різних ділянках.
Висновки базуються на достатній кількості фактичного матеріалу (282 проби морської води і 185 проб донних відкладів) і наступній статистичній обробці їх за допомогою пакетів стандартних програм для персонального комп'ютера: "Mіcrosoft Exсel 7.0" і "Statіstіca".
Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати досліджень закономірностей поширення гетеротрофних і нафтоокислюючих мікроорганізмів у воді і донних відкладах Севастопольських бухт Чорного моря можуть бути використані при оцінці рівня забруднення морського середовища. Виявлені фізіолого-біохімічні особливості нафтоокислюючих бактерій у прибійній зоні моря є новими даними, що можуть бути використані для прогнозування здатності до самоочищення і екологічної ємності морських акваторій, для проведення екологічного моніторингу, при розробці комплексу заходів для поліпшення якості морських прибережних вод м. Севастополя. Розраховані рівні бактеріального самоочищення водойми від нафти і нафтопродуктів, а також тривалості процесів самоочищення можуть бути використані при оцінці стану і надійності морських екосистем шляхом порівняння потоків забруднення й екологічної ємності, що дозволить оцінити тенденцію збільшення чи зменшення забруднень у морському середовищі. Дані розрахунки придатні для визначення внеску у мікробне самоочищення інших видів гетеротрофних бактерій.
Особистий внесок здобувача. У зборі матеріалу, його обробці й аналізі дисертант приймав безпосередню участь. Ідентифікація нафтоокислюючих мікроорганізмів до роду проводилася автором. Їм безпосередньо здійснювалася постановка лабораторних експериментів. Постановка наукових задач, методичні розробки, обґрунтування належать дисертанту, що підтверджується самостійністю публікацій основних матеріалів роботи.
Апробація роботи. Матеріали дисертації повідомлені на Всеукраїнській конференції молодих вчених з проблем Чорного й Азовського морів (Севастополь, 2000, 2002, 2003), Міжнародній науковій конференції "Екологічні і гідрометеорологічні проблеми великих міст і промислових зон" (Санкт-Петербург, 2000), Всеукраїнській конференції молодих учених "Актуальні питання сучасного природознавства" (Сімферополь, 2001, 2002), І-ій Міжвузівскій науково-практичній конференції "Молоді вчені Криму в рішенні актуальних питань сучасності" (Севастополь, 2002), ювілейній науковій конференції студентів, аспірантів і молодих учених "Біорізноманітність. Екологія. Еволюція. Адаптація" (Одеса, 2003).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 12 робіт, з яких 5 статей у наукових журналах, рекомендованих ВАК України, 7 - у матеріалах міжнародних і регіональних конференцій. Без співавторів написано 11 робіт.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 147 сторінках машинописного тексту, складається з вступу, літературного огляду, 8 розділів, заключної частини та висновків. Перелік використаної літератури включає 88 вітчизняних джерел і 82 іноземних. Робота містить 29 таблиці та 29 рисунків.
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Збір матеріалу проводили на шести станціях у прибережній акваторії Севастополя з глибин 0,25-2 м. Станції розташовані в бухті Севастопольська (Приморський бульвар) - ст.1, у бухті Северна - ст.2, в Учкуєвці - ст.3, у бухті Кругла (причал) - ст.4, у бухті Кругла (район вершини) - ст.5, у районі дитячого пляжу в б. Кругла - ст.6 (Рис. 1).
3?
2?
1?
4?
6? ?5
Рис. 1. Схема розташування станцій відбору проб. Станції: 1 - б. Севастопольська (Приморський), 2 - б. Северна, 3 - Учкуєвка, 4 - б. Кругла (причал), 5 - б. Кругла (вершина), 6 - б. Кругла (дитячий пляж) |
Проби відбирали щомісяця з грудня 1999 по квітень 2002 року. Усього було відібрано 282 проби морської води і 185 проб донних відкладів. Відбір морської води і наступна обробка матеріалу велася за методами, розробленими у відділі морської санітарної гідробіології ІнБПМ НАНУ (Миронов, 1974, 1985, 2000).
Кількісний облік нафтоокислюючих бактерій проводили методом граничних розведень на мінеральному середовищі Діанової-Ворошилової з додаванням нафти. Паралельно методом граничних розведень проводили посів мікроорганізмів морської води і донних відкладів на пептонній воді для визначення загальної кількості гетеротрофних бактерій. Виділення чистих культур гетеротрофних бактерій проводили посівом досліджуваних проб води і донних відкладів на стандартний рибо-пептонний агар, нафтоокислюючих - посівом чистої гетеротрофної культури на рідке середовище Діанової-Ворошилової з нафтою. Визначення мікроорганізмів до роду проводили по Красильнікову Н.А. (1949) і Берджи (2000), мікроскопію культур бактерій проводили на мікроскопах МБІ-3 і JENAVAL.
Морфологічні, культуральні і фізіолого-біохімічні властивості мікроорганізмів вивчали відповідно до посібників Родіної А.Г. (1965) і Єгорова Н.С. (1974). Загальну кількість нафтових вуглеводнів у відібраних пробах морської води і донних відкладів вимірювали методом інфрачервоної спектрофотометрії, хлороформекстрагованих речовин - ваговим методом.
ЧИСЕЛЬНІСТЬ І ЗАКОНОМІРНОСТІ ПОШИРЕННЯ НАФТООКИСЛЮЮЧОЇ МІКРОФЛОРИ В ПРИБІЙНІЙ ЗОНІ СЕВАСТОПОЛЯ
Визначення чисельності і дослідження закономірностей поширення гетеротрофних і нафтоокислюючих бактерій проводили на обраних станціях в акваторії Севастополя (Рис. 1).
Бухта Севастопольська (Приморської бульвар) - ст. 1. Донні відклади на ст. 1 представлені дрібною галькою з включеннями піску, ракуши і мулу: рн - 7,54, Eh - -124 мВ, натуральна вологість 65,40 %. Кількість хлороформекстрагованих речовин у донних відкладах на ст. 1 складала в середньому 0,08-0,015 г/100г ґрунту, нафтові вуглеводні представлені в слідових кількостях. Чисельність гетеротрофних мікроорганізмів на цій станції сягала 105 кл/г, нафтоокислюючих - 103 кл/г. Нафтоокислюючі мікроорганізми в морській воді на цій станції представлені 4 родами: Pseudomonas, Marіnomonas, Azotobacter, Erіthrobacter. У донних відкладах було виявлено 5 родів нафтоокислюючих бактерій: Pseudomonas, Marіnomonas, Mezophіlobacter, Altheromonas, Mіcrobacterіum.
Бухта Северна - ст. 2. Донні відклади на ст. 2 представлені дрібною галькою з включеннями піску і мулу: рн - 7,05-7,12, Eh - -124 мВ, натуральна вологість 65,40 %. Кількість хлороформекстрагованих речовин у донних відкладах бухти Северна варіює в межах 0,107-0,125 г/100 г ґрунту, нафтових вуглеводнів - 23,6-28,3 мг/100 г ґрунту. Чисельність гетеротрофних мікроорганізмів на цій станції варіювала в межах 106 кл/г, нафтоокислюючих - 105 кл/г. Нафтоокислюючі мікроорганізми в морській воді на цій станції представлені 6 родами: Pseudomonas, Marіnomonas, Marіnococcuc, Azotobacter, Altheromonas, Bacіllus. У донних відкладах було виявлено 6 родів нафтоокислюючих бактерій: Pseudomonas, Marіnococcus, Azotobacter Mezophіlobacter, Bacіllus, Arthorobacter.
Учкуєвка - ст. 3. Донні відклади на ст. 3 представлені пісками: рн - 8,12, Eh - +176 мВ, натуральна вологість 23,29 %. Кількість хлороформекстрагованих речовин у донних відкладах району Учкуєвки в середньому дорівнює 0,002 г/100г ґрунту, нафтові вуглеводні представлені в слідових кількостях. Чисельність гетеротрофних мікроорганізмів на цій станції варіювала в межах 106 кл/г, нафтоокислюючих - близько 102 кл/г. Нафтоокислюючі мікроорганізми в морській воді на цій станції представлені 3 родами: Pseudomonas, Mezophіlobacter, Marіnococcuc. У донних відкладах було виявлено 3 роди нафтоокислюючих бактерій: Pseudomonas, Altheromonas, Marіnococcus.
Бухта Кругла (причал) - ст. 4. Донні відклади на цій станції представлені дрібною галькою з крупнозернистим піском і уламками ракуші: рн - 8,04, Eh - +266 мВ, натуральна вологість 31,84 %. Кількість хлороформекстрагованих речовин у донних відкладах у районі причалу бухти Кругла варіює в межах 0,01-0,03 г/100г ґрунту, нафтові вуглеводні представлені в слідових кількостях. Чисельність гетеротрофних мікроорганізмів на цій станції знаходиться в межах 106 кл/г, нафтоокислюючих - близько 102 кл/г. Нафтоокислюючі мікроорганізми в морській воді на цій станції представлені 2 родами: Pseudomonas, Mezophіlobacter. У донних відкладах було виявлено 3 роди нафтоокислюючих бактерій: Pseudomonas, Mezophіlobacter, Marіnomonas.
Бухта Кругла (вершина) - ст. 5. Район вершини бухти Кругла розташований у глибині бухти. Прибережні наноси на цій станції утворені пісками з домішкою тонкозернистих темних мулів і залишками морської рослинності: рн - 7,82, Eh - -35 мВ, натуральна вологість 43,30 %. Кількість хлророформекстрагованих речовин у донних відкладах у районі причалу бухти Кругла варіює в межах 0,032-0,275 г/100г ґрунту, нафтових вуглеводнів - 6,5-59,9 мг/100г. Чисельність гетеротрофних мікроорганізмів на цій станції варіювала в межах 107 кл/г, нафтоокислюючих - близько 104 кл/г. Нафтоокислюючі мікроорганізми в морській воді на цій станції представлені 7 родами: Pseudomonas, Marіnococcus, Mezophіlobacter, Altheromonas, Bacіllus, Mіcrobacterіum, Erіthrobacter. У донних відкладах було виявлено 9 родів нафтоокислюючих бактерій: Pseudomonas, Mezophіlobacter, Marіnomonas, Marіnococcus, Altheromonas, Mіcrobacterіum, Bacіllus, Mіcrococcus, Vіbrіо.
Проаналізована динаміка чисельності гетеротрофних і нафтоокислюючих бактерій за трирічний період досліджень. Найбільша чисельність гетеротрофних мікроорганізмів на всіх станціях відзначена влітку і на початку осені, що обумовлено, очевидно, оптимальною для росту бактерій температурою води і підвищеними концентраціями органічної речовини. Найменша чисельність бактерій на всіх станціях спостерігалася в холодний зимовий період. Що стосується динаміки чисельності нафтоокислюючих мікроорганізмів, то значних коливань чисельності цієї групи бактерій відзначено не було, однак, на деяких станціях (б. Северна, Кругла), спостерігали зменшення чисельності нафтоокислюючих бактерій у зимовий час і збільшення влітку.
Розраховано середні значення чисельності гетеротрофних і нафтоокислюючих бактерій на всіх станціях у різні роки. Найбільша чисельність бактерій відзначена в 2001 році, у порівнянні з 2000 і 2002 роками, що, очевидно, обумовлено оптимально високими температурами води і повітря в цей період. Та ж закономірність відзначена і при аналізі сезонних змін чисельності гетеротрофних і нафтоокислюючих бактерій.
Станції за мікробіологічними показниками були умовно розподілені на дві групи. У першу групу війшли станції з чисельністю гетеротрофних мікроорганізмів 106 - 107 кл/г, нафтоокислюючих - більше 103 кл/г донного осаду (б. Северна і Кругла, вершина). Кількість хлороформекстрагованих речовин і нафтових вуглеводнів на цих станціях варіювало в межах 0,05-0,6 г/100г ґрунту і 16-126 мг/100г ґрунту, відповідно. До другої групи віднесені станції з чисельністю гетеротрофних мікроорганізмів до 105 кл/г, нафтоокислюючих - до 103 кл/г. Це станції в Учкуєці, бухті Севастопольська (Приморський бульвар) і бухті Кругла (причал). Хлороформекстраговані речовини і нафтові вуглеводні у цих районах представлені в слідових кількостях.
ДИНАМІКА ЧИСЕЛЬНОСТІ РІЗНИХ ГРУП ГЕТЕРОТРОФНИХ БАКТЕРІЙ У ПРИБЕРЕЖНІЙ ЗОНІ БУХТИ КРУГЛА
Гетеротрофні бактерії є одним з показників ступеня евтрофування водойми і дозволяють оцінити якість морської води. Чисельність гетеротрофних бактерій, бактерій групи кишкової палички, нафтоокислюючих і фенолокислюючих бактерій характеризує ступінь антропогенного забруднення прибережної смуги. У результаті проведених досліджень було встановлено, що на кінець дня збільшується загальна кількость гетеротрофних мікроорганізмів, а також тих, що використовують глюкозу як джерело вуглецю й енергії, бактерій, які гідролізують крохмаль (у 90% випадків), мікробного числа і чисельності мікроорганізмів, що ростуть на середовищі Эндо (у 100% випадків). Висока чисельність цих мікроорганізмів свідчить про постійну присутність у прибійній зоні бухти Кругла забруднюючих речовин органічного походження. Останні два показники свідчать про безпосередній вплив людини на прибережну акваторію.
Більшність виділенних гетеротрофних мікроорганізмів здатні рости не тільки на пептоні, але і на інших джерелах вуглецю, зокрема, на глюкозі, крохмалі, середовищі Эндо, жирі, фенолі, нафті. Мікробне число коливалося в межах 98-2900, чисельність ліполітичних бактерій варіювала в межах 9-950, амілолітичних - 4-2500, фенолокислюючих - 3-450, бактерій кишкової групи-1-6 кл/мл.
Чисельність гетеротрофних мікроорганізмів добре корелює з мікробним числом, чисельністю бактерій, що ростуть на середовищі Эндо, і бактеріями, що використовують як джерело вуглецю глюкозу (коефіцієнти кореляції перевищують 0,7 при Р=0,05). Коефіцієнт кореляції між нафтоокислюючими і гетеротрофними бактеріями дорівнює 0,4 (Р=0,05). Високий коефіцієнт кореляції відзначений між чисельністю нафтоокислюючих і фенолокислюючих бактерій (0,61), нафтоокислюючих і ліполітичних бактерій (0,53), тому що жир і фенол можуть утворюватися в процесі біодеградації нафти.
Таким чином, висока чисельність гетеротрофних бактерій свідчить про забруднення бухти Кругла органічними речовинами і про високу здатність адаптації мікроорганізмів до їхньої деструкції, а широкий спектр біохімічної активності мікрофлори свідчить про можливість природного самоочищення морської води від багатьох забруднюючих речовин органічної природи.
ВПЛИВ ДЕЯКИХ ГІДРОМЕТЕОРОЛОГІЧНИХ ФАКТОРІВ НА ЧИСЕЛЬНІСТЬ НАФТООКИСЛЮЮЧИХ БАКТЕРІЙ
На чисельність нафтоокислюючих бактерій впливають різні біотичні й абіотичні фактори. В умовах моря ці фактори можуть змінюватися під впливом гідрометеорологічних умов і температури поверхневого шару морської води. Вітер і викликане їм хвилювання насичують морську воду киснем, і сприяють переносу забруднень і склаламученню донних відкладів, що призводить до збільшення суспензії в морській воді, а з нею і біогенних елементів. Крім того, при цьому можливо вторинне забруднення водяної товщі. Атмосферні опади змивають у прибережну зону забруднення з берега. Нами були проведені дослідження чисельності нафтоокислюючих бактерій протягом 2000 року на двох станціях: ст. 5 і ст. 6, результати представлені на рис. 2. З даних рисунка випливає, що чисельність нафтоокислюючих бактерій на ст. 5 вище, ніж на ст. 6. Цілком ймовірно це визначається більшою трофніст'ю моря в районі станції п'ятої, ніж шостої. Максимальний ріст нафтоокислюючої мікрофлори на обох станціях спостерігався влітку і на початку осені (12500+758 кл/мл на станції 5 і 1300+245 кл/мл на станції 6). Мінімальні значення чисельності спостерігалися в зимовий період (450+98 кл/мл на станції 5 і 30+13 кл/мл на станції 6).
Рис. 2. Динаміка чисельності нафтоокислюючих бактерій у морській воді на станціях добору проб (світле тло - ст. 5, темне - ст. 6)
Ми проаналізували вплив деяких гідрометеорологічних факторів на чисельність нафтоокислюючих бактерій. Крім чисельності нафтоокислюючих бактерій у морській воді ми оцінювали температуру води і повітря, напрямок і силу вітру, хвилювання моря, наявність атмосферних опадів. Коефіцієнт кореляції між чисельністю нафтоокислюючих бактерій і температурою води дорівнює 0,76, температурою повітря - 0,46, силою вітру - 0,06, хвилюванням моря - 0,41, з атмосферними опадами - -0,14 (Р=0,05). При аналізі впливу гідрометеорологічних факторів на чисельність нафтоокислюючих бактерій установлено, що найбільша кількість клітин відзначена при сильному хвилюванні моря і підвищених температурах морської води. Зниження температури призводило до зменшення кількості нафтоокислюючих бактерій. Зв'язку між чисельністю нафтоокислюючих бактерій і кількістю атмосферних опадів відзначено не було.
ЯКІСНА ХАРАКТЕРИСТИКА НАФТООКИСЛЮЮЧИХ БАКТЕРІЙ, ВИДІЛЕНИХ ІЗ ПРИБІЙНОЇ ЗОНИ СЕВАСТОПОЛЯ
З прибійної зони Севастопольських бухт була виділена 281 культура водяної мікрофлори, з них на долю нафтоокислюючих припадає 98 культур.
Найбільша зустрічальність відзначена для представників роду Pseudomonas - 54% виділених культур, представники інших родів зустрічалися рідше. Частка мікроорганізмів, віднесених до роду Marіnomonas, сягає 7%, Azotobacter - 4%, Erіthrobacter - 5 %, Marіnococcus - 6 %, Mezophіlobacter - 6 %, Altheromonas - 5 %, Bacіllus - 5 %, Mіcrobacterіum - 4 %. Представники родів Arthorobacter, Mіcrococcus і Vіbrіo зустрічалися в одиничних випадках, і на їхню долю припадає близько 1 % від усіх родів мікроорганізмів (Рис. 3).
Рис. 3. Родова різноманітність нафтоокислюючих бактерій | Найбільша різноманітність родів відзначена на станціях, розташованих на Приморському бульварі, бухтах Северна і Кругла (район вершини).
Представники роду Pseudomonas зустрічалися в усі сезони року і були виділені на спеціальному середовищі з підвищеним вмістом вуглеводнів.
Представники інших родів зустрічалися трохи рідше, їхня частка складала близько 40 % від загального числа виділених культур. Очевидно, їм необхідний більш тривалий період адаптації до вуглеводнів; можливо також, що деякі з мікроорганізмів не виносять підвищених концентрацій вуглеводнів.
Характерною рисою більшості виділених культур є утворення синьо-зеленого флуоресцірюючого пігменту. Флуоресценція особливо добре помітна в ультрафіолетових променях. В окремих випадках пігмент дифундував у навколишнє середовище й забарвлював його в коричневий чи інші кольори.
Ті самі види і роди мікроорганізмів, потрапляючи в різні екологічні умови, розрізняються рядом біохімічних ознак. Вони були перевірені нами на здатність використовувати різні вуглеводні нафти. З аналізу отриманих нами даних випливає, що бактеріям, виділеним з прибійної зони моря, притаманна різна вуглеводніокислююча активність.
Процентний вміст гетеротрофних бактерій, що використовують у своїй життєдіяльності нафтові вуглеводні, був значним - 10-27 % від усього гетеротрофного населення. На культури, що використовують у якості єдиного джерела вуглецю соляр, припадає близько 58 % від загального числа нафтоокислюючих мікроорганізмів, доля мікробів, що утилізують мазут, сягає близько 42 %. Найбільш активними культурами-деструкторами нафти, соляру і мазуту були представники роду Pseudomonas.
Отримані результати дозволяють судити про мікрофлору прибійної зони Севастопольських бухт, здатної здійснювати ферментативні процеси трансформації білків і вуглеводів. Процентний вміст нафтоокислюючих бактерій, що утилізують глюкозу, наближався до 80 % , жир - 63 %, фенол - близько 30 %, крохмаль - 14 % усіх виділених культур.
Результати дослідження фізіолого-біохімічних властивостей нафтоокислюючих мікроорганізмів, виділених із прибійної зони моря, свідчать про їх різнобічну біохімічну активність. Отримані результати дозволяють судити про те, що мікроорганізми, що ростуть на нафті, широко поширені в прибійній зоні Севастопольських бухт, беруть участь у самоочищенні морського середовища від нафти і нафтопродуктів.
ВЗАЄМОДІЯ НАФТООКИСЛЮЮЧИХ БАКТЕРІЙ, ЗАВИСІ І НАФТОВИХ ВУГЛЕВОДНІВ В УМОВАХ АКТИВНОГО ГІДРОДИНАМІЧНОГО РЕЖИМУ
З огляду на те, що активна частина процесів бактеріального руйнування забруднень, включаючи нафтові вуглеводні, буде відбуватися у водяній товщі в період скаламучення й осідання часток на дно, нами були проведені спостереження за швидкістю осідання часток із природних морських ґрунтів. За результатами експериментів на всіх горизонтах спостерігалися частки приблизно в однаковому співвідношенні в залежності від діаметра; 1 мкм - близько 45 %, 2 мкм - близько 14 %, 3 мкм - близько 15 %, 5 мкм - близько 11 %, 10 мкм - близько 5 %. Частки осідали плавно, протягом усієї тривалості експерименту. Спостерігалося збільшення сумарної кількості часток від верхнього горизонту до нижнього, що пов'язано з нагромадженням суспензії в міру її осідання в придонний шар. Швидкість осідання зависі з розміром часток від 40-60 мкм до 5-1 мкм із морських донних осадів, узятих у бухті Кругла, визначена експериментально, складає, відповідно, від 384 до 35 мм/доб у залежності від розміру осідаючих часток. Для осідання частинок цих донних осадів у стовпі морської води 1 м потрібно близько 28 діб. Частки зависі є субстратом, на якому, як правило, поселяються мікроорганізми, і при цьому підвищується їхня метаболічна активність по спрямування на трансформацію органічної речовини.
Для дослідження процесу самоочищення моря від нафтових вуглеводнів великий інтерес представляє вивчення взаємодії зависі, бактерій і нафти. Нами відзначено, що після перемішування відбувається помітне збільшення чисельності мікроорганізмів (майже в 100 разів), що визначається, у першу чергу, надходженням у водяне середовище мікроорганізмів з донних осадів. Після скаламутнення донного осаду поряд зі збільшенням кількості часток зависі у морській воді (>200 разів), більш ніж у 10 разів збільшується і кількість вуглеводнів, але вже через 4 год після скаламутнення їхня кількість практично повертається до первісного значення, і протягом наступного часу змінюється незначно. Це пов'язано, імовірно, з переходом зависі, а разом з нею і нафти, з донного осаду в товщу води в результаті скаламучення вмісту судини. Через добу після перемішування кількість нафтових вуглеводнів знижується до початкового рівня, що, імовірно, пов'язано з осіданням за цей проміжок часу основної маси зависі, а разом з нею і нафтових вуглеводнів. Були розраховані коефіцієнти кореляції між кількістю нафтових вуглеводнів і числом часток, а також з кількістю зависі, відповідно рівні 0,96 і 0,90. Установлено, що на кількість нафтових вуглеводнів у морській воді впливає кількість завислих часток і вуглеводнів, що потрапили в морську воду при перемішуванні донного осаду. Чисельність нафтоокислюючих мікроорганізмів у морській воді залежить від загальної чисельності гетеротрофних мікроорганізмів в ній і донних відкладах, від кількості зависії і нафтових вуглеводнів, що переходять при перемішуванні з донних осадів у морську воду.
При вивченні самоочищення морського середовища від нафтових вуглеводнів доцільно визначати і продукційні показники нафтоокислюючих мікроорганізмів. Нами була проведена робота з метою визначення продукційніх показників гетеротрофної і нафтоокислюючої мікрофлори в морській воді в присутності часток зависі в умовах експерименту.
Коефіцієнт питомої добової продукції визначався по формулі:
Кдоб.= 1/T* Ln Nt/No
де Кдоб. – коефіцієнт питомої добової продукції (доб-1);No и Nt– початкова і кінцева кількість бактерій (кл/мл), Т – час експозиції (доб).
Бактеріальна продукція визначалася по формулі:
Pn=Kсут. * Ncp.
де Pn - бактеріальна продукція (млрд кл/м3/доб-1), Ncp. – середня чисельність бактерій (кл/мл) (Иванов, 1954, Заика, 1983).
Для проведения експерименту використували морську воду і мулисто-піщані донні відклади (бухта Кругла), поміщені в колби на нерухомому місці й апараті для струшування рідин ("мішалці"). При перемішуванні на "мішалці" відбувалося збільшення кількості зависі (до 4,67+2,24 г/л), а разом з нею і нафтових вуглеводнів (до 3,82+1,64 мг/л) за рахунок переходу часток донних відкладів у морську воду при струшуванні. У нерухомій воді завись і нафтові вуглеводні осідали на дно, і їхня кількість у морській воді наближалося до нульових значень. Коефіцієнт кореляції між масою зависі і загальною кількістю нафтових вуглеводнів у морській воді (Р=0,05) дорівнює 0,89. Коефіцієнт питомої добової продукції нафтоокислюючих і гетеротрофних бактерій у колбах, росташованих на "мішалці", доходив до 4 доб-1, а в колбах, установлених нерухомо, цей показник був значно нижче (до 0,5 доб-1). Та ж закономірність відзначена і при аналізі бактеріальної продукції. Коефіцієнт питомої добової продукції нафтоокислюючих бактерій вище в тих колбах, куди додавалася нафта. Коефіцієнт кореляції між чисельністю нафтоокислюючих мікроорганізмів і загальною кількістю нафтових вуглеводнів у морській воді дорівнює 0,65. Коефіцієнт кореляції між чисельністю гетеротрофних мікроорганізмів і масою зависі в морській воді, дорівнює 0,61, чисельністю нафтоокислюючих бактерій і масою зависі - 0,49, чисельністю гетеротрофних і нафтоокислюючих бактерій - 0, 52. Високі продукційні показники нафтоокислюючих і гетеротрофних бактерій у колбах, установлених на "мішалці", свідчать про те, що мікробіологічні процеси протікають більш активно в гідродинамічно рухливому середовищі з достатком часток зависі.
ОЦІНКА БАКТЕРІАЛЬНОГО САМООЧИЩЕННЯ ВОД ВІД НАФТОВИХ ВУГЛЕВОДНІВ У ПРИБІЙНІЙ ЗОНІ СЕВАСТОПОЛЯ
Значне і стійке забруднення морського середовища висунуло задачу складання балансів і прогнозів забруднення океанічних і морських вод на основі різних моделей. Ми розглядаємо взаємодію морських організмів і їхніх угруповань із забрудненням, штучно відокремлюючи з цього комплексу роль біоти в трансформації забруднення, звужуючи цей процес до бактеріальної біодеградації. Однак відомо, що далеко не всі бактеріальні клітини знаходяться у фізіологічно активному стані і, тому, сама по собі загальна чисельність мікроорганізмів, вимірювана методом прямого рахунку, не може визначати їхній деструкційний потенціал. Застосовувана у відділі морської санітарної гідробіології ІнБПМ НАНУ методика визначення чисельності нафтоокислюючих бактерій (метод граничних розведень) дозволяє враховувати чисельність тільки тих бактерій, що активно окисляють нафту. Застосовуючи даний метод, ми провели розрахунки інтенсивності процесу деструкції нафти в прибійній зоні Севастополя.
Розрахунок величин бактеріальної біодеградації нафтових вуглеводнів (потоків самоочищення) вели по формулі:
Б=NК
де: Б - величина бактеріальної біодеградації нафтових вуглеводнів (потоки самоочищення), (мг в/в г-1доб-1), N – чисельність нафтоокислюючих бактерій (клг-1), К – кількість вуглеводнів, окислених однією бактеріальною кліткою, розрахована Зобеллом (3,7610-8 мгкл-1доб-1) (ZoBell, 1973).
Розрахунок періоду мікробіального самоочищення вод проводили по формулі:
Тмк = В/Б
де: Тмк – період мікробіального самоочищення вод (доб), В – загальна кількість нафтопродуктів у донних відкладах (мг в/в г-1), Б – величина бактеріальної біодеградації нафтових вуглеводнів (мг в/в г-1доб-1).
Результати представлені в табл. 1.
Таблиця 1.
Середні значення чисельності нафтоокислюючих бактерій (N, кл/г-1) і рівні бактеріальної біодеградації вуглеводнів нафти (Б, 10-8 мг в/в*г-1*доб-1) у прибійній зоні Севастопольських бухт
Дата | Ст. 1 | Ст. 2 | Ст. 3 | Ст. 4 | Ст. 5
N | Б10-8 | N | Б10-8 | N | Б10-8 | N | Б10-8 | N | Б10-8
2000 г. | 52 | 199 | 14100 | 53016 | 229 | 861 | 6398 | 24055 | 6838 | 25709
Літо | 95 | 357 | 45000 | 169200 | 450 | 1692 | 25000 | 94000 | 25000 | 94000
Осінь | 52 | 197 | 5225 | 19646 | 229 | 859 | 273 | 1025 | 950 | 3572
Зима | 10 | 36 | 950 | 3572 | 9 | 34 | 45 | 169 | 450 | 1692
2001г. | 40 | 149 | 5909 | 22219 | 48 | 180 | 4661 | 17527 | 13829 | 51996
Зима | 0,4 | 2 | 55 | 207 | 100 | 376 | 60 | 226 | 7548 | 28379
Весна | 15 | 56 | 967 | 3635 | 32 | 121 | 857 | 3221 | 1300 | 4888
Літо | 16 | 58 | 1650 | 6205 | 75 | 282 | 1615 | 6072 | 10150 | 38164
Осінь | 120 | 451 | 20833 | 78333 | 10 | 36 | 15817 | 59471 | 36333 | 136613
2002г. | 416 | 1565 | 3636 | 13671 | 36 | 134 | 554 | 2007 | 7000 | 26320
Зима | 773 | 2905 | 273 | 1025 | 48 | 181 | 875 | 3290 | 9500 | 35720
Весна | 60 | 226 | 7000 | 26320 | 23 | 87 | 2323 | 874 | 4500 | 16920
Проаналізувавши отримані результати, ми відзначили зв'язок рівнів бактеріального самоочищення (Б) з температурою. Мінімальні значення Б були відзначені в зимові місяці і на початку весни 2001 року в районі Приморського бульвару (ст. 1) і Учкуевки (ст. 3). Максимальні значення зафіксовани влітку і на початку осені 2002 року в районі бухт Северна (ст. 2) і Кругла (вершина) (ст. 5). Аналіз величин потоків самоочищення від нафтопродуктів у морській воді і донних відкладів показав, що Б в донних осадах вище, ніж у морській воді. Як видно, це пояснюється великою кількістю живильних речовин, і, як наслідок, чисельності нафтоокислюючих бактерій у донних осадах у порівнянні з морською водою.
Якщо порівняти отримані значення Б с кількістю нафтопродуктів у донних осадах Севастопольських бухт, то можна відзначити високий коефіцієнт кореляції між цими параметрами (r=0,89, P=0,05). Однак відносне біотичне самоочищення вод знижується зі збільшенням концентрації забруднювача в середовищі. Період мікробіального самоочищення донних осадів від вуглеводнів нафти в прибійній зоні Севастопольської бухти (району Приморського бульвару) складає більше півроку, у районі Укчуєвки - дві третини року, бухті Кругла (район у виходу з бухти) - більш двох місяців. Період мікробіального самоочищення в районі бухти Северна складає більш 3 років, у районі вершини бухти Кругла - близько 3 років. Таким чином, для природного самоочищення морського середовища від нафтових вуглеводнів у прибійній зоні Севастополя необхідно в середньому близько 2 років. Ця величина може коливатися в залежності від ступеня забруднення морської води і донних осадів нафтопродуктами, самоочисної здатності ґрунтів, чисельності нафтоокислюючих мікроорганізмів, продукційних характеристик бактерій. У цьому зв'язку оцінка самоочищення моря від такого складнішого хімічного забруднювача, яким є нафта і нафтопродукти, може бути дуже умовна.
ВИСНОВКИ
1. Уперше проведені комплексні санітарно-біологічні дослідження в прибійній зоні акваторії Севастопольських бухт і прилягаючих до них ділянок узбережжя, що характеризуються різним складом ґрунтів, від мулистих до піщаних, із включеннями морської гальки, і знаходяться під хвильовим впливом різної інтенсивності. У цій зоні відбувається концентрація забруднюючих речовин, що поступають як із суші, так і з боку моря, а також посилений обмін компонентів забруднення між морською водою і донними відкладами.
2. Вперше отримані систематичні дані про чисельність, закономірність розподілу, родовий склад і біохімічні особливості нафтоокислюючих мікроорганізмів у морській воді і донних осадах прибійної зони Севастополя.
3. З морської води і донних відкладів виділена 281 культура гетеротрофних бактерій, з яких 98 здатні використовувати вуглеводні нафти як єдине джерело вуглецю й енергії. Найбільше число нафтоокислюючих культур було віднесено до роду Pseudomonas -54 % виділених культур. На культури роду Marіnomonas - припадає 7%, Azotobacter - 4%, Erіthrobacter - 5 %, Marіnococcus - 6 %, Mezophіlobacter - 6 %, Altheromonas - 5 %, Bacіllus - 5 %, Mіcrobacterіum - 4 %, Arthorobacter, Mіcrococcus і Vіbrіo - близько 1 %.
4. Культури нафтоокислюючих бактерій здатні використовувати, крім нафтових вуглеводнів, інші джерела органічної речовини - білки, ліпіди, вуглеводи. Процентне співвідношення культур, що використовують як єдине джерело вуглецю глюкозу, складає близько 80 % від загального числа нафтоокислюючих мікроорганізмів, жир - 63 %, фенол - близько 30 %, крохмаль - 14 % усіх виділених культур. Це може вплинути на інтенсивність процесів самоочищення водойоми від нафтових вуглеводнів. З однієї сторони основні класи органічних речовин можуть бути конкурентними компонентами джерела вуглецю для нафтоокислюючих бактерій, а з іншого боку - джерелом азоту і фосфору для цієї групи бактерій при надлишку вуглецю у випадку аварійних нафтових розливів.
5. Найбільше число культур нафтоокислюючих бактерій росло на дизельному паливі (соляр) - 58 %, на мазуті росло 42 % виділених культур. Це можна пояснити більшою адаптацією вуглеводніокислюючих бактерій до цього виду нафтопродуктів (соляр), що є основним енергоресурсом для морських кораблів.
6. Найбільша чисельність гетеротрофних (106-107 кл/г) і нафтоокислюючих (103-104 кл/г) бактерій у донних осадах відзначена на станціях, що потерпають від сильного антропогенного навантаження, і розташованих у глибині бухт (бухта Северна, вершина бухти Кругла). Чисельність нафтоокислюючих бактерій залежить від температури морської води, хвилювання моря і напрямку переносу вітрових мас, кількості зависі і нафтових вуглеводнів, що переходять при перемішуванні з ґрунту в морську воду.
7. Серія щоденних спостережень у літні місяці за складом мікрофлори в бухті Кругла показала різкі коливання чисельності бактерій (у десятки і сотні разів) у ранкові (8-00) і вечірні (17-00) години. Це пов'язано з бризовым станом погоди (збільшенням хвилювання моря в денні години, що призводить до скаламутнення ґрунтів) і різким зростанням антропогенного навантаження. Останнє є додатковим джерелом забруднення, про що свідчить зростання мікробного числа і чисельності бактерій кишкової групи в кілька разів у вечірній час у порівнянні з ранковими годинам. Наявність у морській воді органічних забруднюючих речовин сповільнює процеси самоочищення моря від нафтових вуглеводнів.
8. Експериментально встановлено, що швидкість осідання мулових часток морських донних осадів розміром від 40-60 мкм до 5-1 мкм складає відповідно від 384 до 35 мм*доб-1 у залежності від розміру осідаючих частинок. Для осідання часточок зависі цих донних осадів у стовпі морської води 1 м необхідно приблизно 28 діб. Частки зависі є субстратом, на якому, як правило, оселюються мікроорганізми, і при цьому підвищується їхня метаболічна активність, спрямована на трансформації органічної речовини.
9. Розраховано рівні бактеріальної складової в прцессі самоочищення морського середовища від вуглеводнів нафти за рахунок нафтоокислюючої мікрофлори. Установлено, що мінімальні значення спостерігали в зимові місяці і на початку весни 2001 року в районі Приморського бульвару й Учкуєвки. Максимальні значення відзначені в літню пору і на початку осені 2002 року в районі бухт Северна і Кругла (вершина). При аналізі рівнів самоочищення від нафтопродуктів у морській воді і донних осадах установлено, що їхнє значення в донних осадах вище, ніж у морській воді.
10. Розраховано період мікробіального самоочищення донних осадів від вуглеводнів нафти в прибійній зоні Севастополя. Максимальні значення періоду спостерігали в районі вершини бухти Кругла і бухти Северна - близько 3 роки, мінімальні - у районі виходу з бухти Кругла - менше року. Для природного самоочищення морського середовища від нафтових вуглеводнів у прибійній зоні Севастополя необхідно в середньому близько 2 років.
11. Отримані результати можуть бути використані при оцінці стану і надійності морських екосистем
