НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

СЛЕТА ІРИНА ВАДИМІВНА

УДК 615.832.9: 617: 616-001.19: 612.135: 611.36+616.36-004

ВПЛИВ ЛОКАЛЬНИХ КРІОПОШКОДЖЕНЬ

НА МІКРОГЕМОЦИРКУЛЯЦІЮ НОРМАЛЬНОЇ

І ЦИРОТИЧНО ЗМІНЕНОЇ ПЕЧІНКИ

03.00.19 -кріобіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків –2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини

НАН України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Сандомирський Борис Петрович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу експериментальної кріомедицини, м. Харків

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук Малова Наталія Георгіївна, Інститут проблем ендокринної патології

ім. В.Я. Данілевського АМН України, заступник директора з наукової роботи, м. Харків

доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України Галахін Костянтин Олександрович, Інститут онкології АМН України, завідувач патологоанатомічного відділу, м. Київ

Провідна установа: Харківський національний університет

ім. В.І. Каразіна, факультет фундаментальної медицини, м. Харків

Захист відбудеться “18” лютого 2003р. о “13-30” годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків,

вул.. Переяславська, 23)

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків,

вул.. Переяславська, 23)

Автореферат розісланий “16” січня 2003 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук, професор Гольцев А.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Кріохірургічний вплив на печінку було вперше запропоновано на початку 60-х років 20-го століття з метою руйнування патологічного осередку (Cooper I.S., 1968; Stucke K., 1972; Кандель Э.И., 1974). Великі труднощі прогнозування границь необоротних руйнувань тканин були причиною тимчасового зниження інтересу до цього методу. Метод був відроджений на початку 80-х років 20-го століття, коли експериментальними і клінічними дослідженнями була переконливо доведена можливість застосування кріохірургічних впливів при захворюваннях печінки (Альперович Б.И., 1980, 1985; Милонов О.Б., 1979). Локальні кріовпливи на печінку можуть бути використані для руйнування осередкових уражень печінки (Pistorius G., 1999, 2000; Альперович Б.И., 2001; Korpan N.N.; 2002), досягнення гемостатичного ефекту при кріорезекції печінки (Коцько Н.И., 1981, 1986), а також для стимуляції регенераторних процесів у циротично зміненому органі (Сандомирский Б.П., 1987; Сигал Н.С., 1992; Даценко Б.М., 1998). Однак, дотепер широке поширення кріохірургічних методів у гепатології стримується недостатньо розробленою методикою локальної кріодеструкції печінки не тільки через різноманітність патології органа, але і через відсутність чітко визначеної залежності між параметрами кріовпливу й одержуваними розмірами зон заморожування і некротизації.

В даний час інтерес до кріохірургії знову переживає підйом. У значній мірі це зв'язано з появою обновленої теорії ушкодження тканини in vivo, що позначає мікрогемоциркуляторне русло як первинну й одну з основних “мішеней” для реалізації низькотемпературного впливу на тканину. Зміни мікроциркуляторного русла, викликані дією низьких температур, спостерігаються як у безпосередній близькості до зони кріовпливу, так і на відстані від неї. Зміни агрегатного стану і параметрів системи зсідання крові, тромбоз судин і гіпоксія тканин є основними проявами судинного компонента при формуванні кріонекрозу (Василовский В.Ю., 1983; Шафранов В.В., 2001; Rubinsky B., 2001).

Дослідники кріопошкоджень тканини печінки оцінювали стан мікроциркуляції, як правило, на підставі гістологічних досліджень, що не враховують широкої різноманітності вітальних процесів (Парамонова Л.М., 1985, 2001; Даценко Б.М., 1998). Актуальним залишається вивчення динаміки мікрогемоциркуляторних змін у нормальній і патологічно зміненій печінці методами прижиттєвого спостереження після низькотемпературних впливів, що дозволяє установити залежність цих порушень від температури тканини і тимчасових параметрів. Потрібно створення можливості прогнозування результату охолодження і контролю за його досягненням, виявлення протипоказань до холодового лікування захворювань печінки і ймовірних ускладнень при застосуванні методу, що особливо важливо при лікуванні хронічних дифузійних поразок органа. Усе це дозволить не тільки з загальнобіологічних позицій судити про деструктивно-відновні процеси після холодового впливу, але і буде сприяти удосконалюванню існуючих і створенню нових кріометодів у гепатології.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана відповідно до плану науково-дослідних робіт з теми 2.2.6.5 Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

(№ держреєстрації 00102U002027) по проблемі 2.28.7.4 “Клітинна фізіологія, механізми ушкодження, адаптації, старіння і репарації клітин“.

Мета і задачі дослідження.

Мета дослідження. Виявити закономірності формування відповідних реакцій мікрогемоциркуляції нормальної і циротично зміненої печінки і системи крові після дозованих локальних кріовпливів на печінку.

Задачі дослідження.

1. Провести порівняльний прижиттєвий аналіз мікроциркуляції печінки в нормі і при експериментальному цирозі, викликаному введенням чотирьоххлористого вуглецю.

2. Вивчити in vivo формування температурних полів у печінці при локальних дозованих кріовпливах, порівняти експериментальні дані з результатами теоретичних розрахунків.

3. Установити залежність прижиттєвих мікрогемоциркуляторних порушень у печінці від температури тканини при дозованих локальних кріовпливах.

4. Порівняти характер мікрогемоциркуляторних розладів при дозованих локальних кріовпливах на нормальну і циротично змінену печінку.

5. Оцінити морфологічні, біохімічні і гемокоагуляційні зміни в крові після дозованих локальних кріовпливів на нормальну і циротично змінену печінку

Об'єкт дослідження. Нормальна і циротично змінена печінка експериментальних тварин.

Предмет дослідження. Мікрогемоциркуляція в печінці, морфо-функціональні зміни у венозній крові при дозованих локальних кріовпливах на нормальну і циротично змінену печінку.

Матеріали і методи дослідження. Дослідження проведено на 210 щурах – самцях лінії Вістар масою 250 – 300 г і 189 кролях породи шиншила масою 3,0 - 3,5 кг із нормальною та патологічно зміненою печінкою.

Експериментальну патологію печінки отримано підшкірним уведенням 40% масляного розчину чотирьоххлористого вуглецю. Кролям гепатотропну отруту вводили двічі на тиждень протягом 3-х місяців із рахунку 0,2 мл розчину на 1 кг маси, щурам – двічі на тиждень протягом 2-х місяців із рахунку 6,2 мл розчину на 100 г маси тварини.

Кріовплив на нормальну та циротично змінену печінку здійснено за допомогою автономних азотних кріоінструментів із діаметрами аплікаторів 11 мм (у кролів) і 1,5мм (у щурів) протягом 2-х хвилин, що приводило до утворення зон обмерзання, які складали 8-10% загальної маси органа.

Основним методом вивчення мікрогемоциркуляції було обрано вітальну мікроскопію, яка дозволила оцінити швидкість кровообігу, діаметр і характер контурів внутрішньої та зовнішньої стінок мікросудин, кількість функціонуючих мікросудин, взаємодію формених елементів крові. Застосування мікроскопа “Люмам К-1” дало можливість проводити дослідження в режимах поляризації та люмінесценції. Як люмінесціючу мітку застосовано 2% розчин ураніну.

Для індикації транспорту білка у печінці внутрішньовенно вводили глобулін, який мічено ізотіоціанатом флуоресцеїну (ФІТЦ). Вимірювання площі світного поля дозволило судити про поширеність індикатора в тканинах, а за інтенсивністю світіння визначити його концентрацію в тій чи іншій ділянці печінки. Кількісна оцінка люмінесценції здійснювалася за допомогою фотометричної насадки ФМЕЛ - 1А. Результати вимірювання виражали в умовних одиницях. Результати флуориметричного аналізу оброблено статистично. Рівень вірогідності р<0,95.

Для гістологічних досліджень шматочки печінки фіксовано у 10% розчині нейтрального формаліну. Парафінові зрізи забарвлено гематоксиліном та еозином по ван Гізон.

Для дослідження периферичної крові використано загальноприйняті клініко-лабораторні методи, які включають визначення концентрації гемоглобіну, еритроцитів і лейкоцитів, підрахунок лейкоцитарної формули, визначення гематокриту, середнього об'єму та діаметра еритроцитів.

Кров для біохімічних досліджень брали з крайової вени вуха кроликів до кріовпливу (вихідні показники) і в динаміці протягом 2-х місяців. Показники визначали на 1, 3, 7, 14 і 60 добу після операції.

У сироватці крові експериментальних тварин вивчали динаміку вмісту загального білка, концентрації глюкози, активності ферментів – лужної фосфатази (ЛФ), аланін і аспартатамінотрансфераз (АлТ и АсТ), а також рівня неспецифічного маркера важкості патологічних процесів – малонового діальдегіду (МДА), який є продуктом перекисного окислення ліпідів (ПОЛ).

Стан системи зсідання крові визначено за такими тестами: тромбоеластографія, рекальцифікація цільної крові, толерантність крові до гепарину, визначення тромбопластинового часу, дослідження агрегаційної здатності тромбоцитів, підрахунок кількості тромбоцитів.

Одержані експериментальні дані статистично оброблено за методом Стьюдента, а також непараметричними методами (критерій серій та Уілкоксона – Манна – Уітні).

Розподіл експериментальних тварин за методами дослідження подано в табл.1.

Таблиця 1

Характеристика експериментального матеріалу.

№ п/п Методи дослідження метричні термометричні біомікроскопічні флуориметричні гістологічні гематологічні біохімічні гемакоагуляційні

Групи Кількість тварин

1. Тварини з нормаль-ною печінкою 0 3 х 15 х 20 х 5 хх 13 хх 7 хх 10 хх

2. Тварини з кріовпли-вом на нормальну печінку 10 х 10 хх 10 х 20 х 20 х 15 хх 13 хх 7 хх 10 хх

3. Тварини з циротично зміненою печінкою 0 3 х 29 х 20 х 10 хх 10 хх 12 хх 10 хх

4. Тварини з кріовпливом на циротично змінену печінку 10 х 10 хх 10 х 20 х 20 х 18 хх 10 хх 12 хх 7 хх

х – щури; хх – кролі

Наукова новизна отриманих результатів. У проведеному дослідженні вперше дана комплексна оцінка реакції судин мікроциркуляторного русла нормальної і циротично зміненої печінки у відповідь на дозований локальний кріовплив, заснована на прижиттєвій реєстрації діаметра мікросудин, щільності функціонуючих капілярів і характеру кровотока в них. Установлено параметри кріовпливу, що викликають необоротні порушення функції мікросудин печінки. Показано реакцію крові на локальне кріопошкодження нормальної і циротично зміненої печінки.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані на основі прижиттєвої мікроскопії дані про характер мікрогемоциркуляторних змін у нормальній і патологічно зміненій печінці після дозованих кріовпливів важливі для розуміння механізмів адаптації і порушень у системі мікроциркуляції при дії холоду. Визначено температурні і тимчасові параметри охолодження, що приводять як до оборотних, так і летальних ушкоджень мікросудин. Показана можливість застосування запропонованої математичної моделі для прогнозування області кріонекрозу. Отримані дані спрямовані на удосконалювання існуючих і створення нових методів кріовпливу в хірургічній гепатології. Результати дослідження реакції крові на локальні кріопошкодження циротично зміненої печінки можуть бути використані для обґрунтування малої травматичності даного методу при застосуванні його в практиці лікування хронічних дифузійних поразок печінки.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертаційної роботи самостійно проведений аналіз літератури по темі дослідження. Експериментальна частина роботи, первинний аналіз даних і їхня статистична обробка виконані безпосередньо автором дисертації. Співавтор наукових праць здобувача проф. Б.П.Сандомирский, що є науковим керівником дисертанта, брав участь у постановці мети і задач, а також в обговоренні отриманих результатів. Дисертант самостійно провів аналіз отриманих результатів і зробив висновки за матеріалами роботи.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи представлені на Всеукраїнській науковій конференції “Успіхи і перспективи розвитку кріобіології і кріомедицин” (Харків, 2001); Міжнародному симпозіумі “Досягнення кріомедицини” (Санкт-Петербург, 2001).

Публікації матеріалів дослідження За матеріалами дисертації опубліковано 9 робіт, з них у фахових наукових журналах – 7, у монографії (глава) – 1, у збірниках наукових праць – 1.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 153 сторінках машинопису і складається зі вступу, огляду літератури, розділу, який присвячений методам дослідження, розділу власних досліджень, який складається з п'яти підрозділів, висновків. Список використаної літератури містить 221 джерело. Робота ілюстрована 59 рисунками, 7 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Теоретичні та експериментальні розрахунки розподілу температурних полів при кріовпливі на печінку. Для визначення залежності мікрогемоциркуляторних порушень від розподілу температурних полів при локальній кріодеструкції печінки і прогнозу результатів кріовпливу нами використано математичну модель процесів заморожування біотканини, запропоновану А.А.Березовським (1984). Використовуючи описані в літературі теплофізичні параметри тканини печінки (Г.Комини, С. дель-Джиудиче, 1976), ми провели розрахунки розподілу температурних полів при локальному 2-х хвилинному кріовпливі на печінку автономним азотним кріоінструментом з діаметром наконечника 1,5 мм і температурою на повітрі -930С (рис.1).

Рис. 1. Графік залежності температури від координати при фіксованих значеннях часу (вихідна температура печінки 300С).

Експериментальні дані про температурні режими тканини печінки одержано при проведенні термометрії за допомогою хромель-копелевих термопар. Дослідження показали, що застосований кріовплив викликав зниження температури печінки під кріоаплікатором до -21,0 ± 2,10С та утворення ділянки обмерзання радіусом 4,5±0,19 мм, яка на поверхні має вигляд білої крижаної плями. Після знімання кріоаплікатора відбувається дальше збільшення зони обмерзання, пов'язане з потоком холоду, що продовжує поширюватися від центра кріовпливу. Так, на відстані 5 мм від центра кріоаплікації мінімальні значення температури (-30С) зафіксовано через 90 с після знімання кріоаплікатора. Ці експериментальні дані використано для побудови графіка мінімальних температурних значень залежно від відстані до центра кріовпливу (рис.2).

Рис.2. Графік розподілу мінімальних температур залежно від віддалення від центру кріовпливу.

а– експериментальні значення.

Згідно з цим графіком, кінцева ізотерма з температурою 00С розташовувалася на відстані 6,3±0,1 мм від центра охолодження. Одержані нами експериментальні дані по термометрії печінки при локальному кріовпливі добре узгоджуються з теоретичною моделлю охолодження.

За даними термометрії, застосований нами кріовплив викликав утворення 3-х зон:

Зона I - зона обмерзання, відповідна до початкової зони обмерзання з радіусом 4,5±0,2 мм, яка виникає за 2 хв контакту печінки з кріоаплікатором. Після повного відтаювання ця зона мала темно-вишневе забарвлення та чіткі обриси.

Зона II - зона охолодження, або погранична зона, являє собою ділянку печінки, яка оточує зону обмерзання та зазнає зниження температури до 00С при температурних перерозподілах після знімання кріоаплікатора.

Зона III - зона гіпотермії – ділянки печінки, віддалені від центра кріовпливу на 10мм і більше. У цих ділянках печінки мінімальна температура, яка виникає при кріовпливі на орган, не виходила за межі позитивних значень.

Біомікроскопічні дослідження елементів мікрогемоциркуляторного русла нормальної і циротично зміненої печінки після кріовпливу. Прижиттєва біомікроскопія зони обмерзання (зона I) показала, що як у нормальній, так і в циротично зміненій печінці застосовуваний кріовплив спричиняв різкий спазм усіх елементів мікрогемоциркуляторного русла, зупинку кровообігу. Через 5-10 хв мікросудини розширювались, утворювалися множинні крововиливи. Синусоїди всієї зони було затромбовано, їхні контури розмито. Через 1 год після кріоаплікації зона обмерзання ставала набухлою, напруженою, що свідчить про гемостаз і набряк тканини. При біомікроскопії спостерігали набухання стінок судин, збільшення діаметра мікросудин венулярного типу вдвоє у порівнянні з нормальним. Кровообіг не відновлювався. Його відсутність підтверджувалась методом кількісної фотометрії. У зоні, що вивчається, вимірювали інтенсивність люмінесценції після внутрішньовенного введення глобуліну, міченого ізотіоціанатом флуоресцеїну. Світіння порівнювали з рівнем аутофлуоресценції органа. Нами виявлено, що рівень аутофлуоресценції циротично зміненої печінки (3,0±0,34 ум.од.) вірогідно вищий проти нормальної (2,1±0,1 умов.од.). Результати дослідження показали, що інтенсивність світіння в зоні I вірогідно не відрізнялася від рівня аутофлуоресценції органа. Відсутність люмінесціючої мітки свідчить про повний гемостаз у цій зоні. Спостереження протягом 6 год показали, що функції мікросудин у зоні I не відновлювались.

За межами зони обмерзання кровообіг зберігався, проте зміни мікрогемоциркуляції були в прямій залежності від близькості до ділянки кріовпливу.

Так, на відстані 3-4 мм від краю зони обмерзання (погранична зона -зона II) після кріовпливу відзначалася вазоконстрикція протягом 5-10 хв. Потім діаметр судин значно збільшувався, кровообіг уповільнювався. Поступово наростали порушення агрегатного стану крові, що виявилося в утворенні пристінкових тромбів, переривистості кровообігу, зернистості. Спостерігалась адгезія лейкоцитів до стінок венулярних судин, яка могла бути викликана збільшенням напруги зрушення біля стінки судини внаслідок зниження швидкості кровообігу. Через 30 хв після кріовпливу частину синусоїд пограничної зони було затромбовано. До того ж , якщо кількість затромбованих мікросудин у пограничних ділянках нормальної печінки складала приблизно 20% загальної кількості судин у полі зору, то в циротично зміненій печінці їх було 40-45%. В міру віддалення від ділянки кріовпливу кількість нефункціонуючих синусоїд різко знижувалась.

Біомікроскопічна картина зони II через 1 год після кріоаплікації характеризувалася нерівномірним повнокрів'ям розширених мікросудин. Кровообіг уповільнений. Спостерігались множинні “білі тромби”, а також великі агрегати еритроцитів, частина яких осідала в мікросудинах, перешкоджаючи кровообігу. Зустрічались синусоїди, заповнені плазмою, яка не містить формених елементів крові. Мікрогемоциркуляція пограничної зони циротично зміненої печінки відзначалася множинними крововиливами, значнішою переривистістю кровообігу, виключенням із кровообігу більшої кількості синусоїд.

Біомікроскопічний кровообіг у ділянках печінки, віддалених від місця кріовпливу (зона III), характеризувався стійким рівномірним збільшенням просвітів мікросудин, уповільненням кровообігу. Протягом 5-10 хв після кріовпливу зберігалась гомогенність потоку крові. Через 15 хв відзначалось крайове стояння лейкоцитів, гомогенність кровообігу зникала, з'явилися дрібні агрегати формених елементів крові. У циротично зміненій печінці спостерігалося різке скорочення кількості функціонуючих синусоїд. Через 30 хв після кріовпливу в мікрогемоциркуляторному руслі печінки зустрічалися численні, добре помітні агрегати еритроцитів у вигляді “монетних стовпчиків”. У звужених, звивистих синусоїдах печінки щурів із експериментальним цирозом агрегати еритроцитів руйнувалися, дрібні агрегати були розділені плазмою, кровообіг набирав пунктирного переривистого вигляду. Зустрічалися мікрокрововиливи. Через 1 год після кріопошкодження мікрогемоциркуляторні порушення зберігалися, що виявлялось у дилатації всіх елементів мікроциркуляторного русла печінки, тромбозі частини синусоїд, уповільненні кровообігу.

Для спеціального вивчення нами було обрано більш ранні, початкові порушення в транспорті білка в печінці, спричинені її локальним кріопошкодженням. Для індикації цих порушень глобулін, який вводився внутрішньовенно, мічено ізотіоціанатом флуоресцеїну. Вимірювання площі світного поля дозволило судити про поширеність індикатора в тканинах, а за інтенсивністю світіння визначити його концентрацію в тій чи іншій ділянці тканини.

Методом люмінесцентної біомікроскопії встановлено, що застосований кріовплив спричиняв порушення транспорту міченого глобуліну в пограничних ділянках печінки (зона II). Тут проникання глобуліну до паренхіматозних клітин, у нормі непроникних для білка, відбувалося вже в перші хвилини після кріовпливу, досягаючи максимуму через 50 хв. Уся погранична ділянка починала інтенсивно та гомогенно флуоресціювати. Поступово виявлявся рисунок розширених синусоїд. Кількісне визначення інтенсивності світіння пограничних ділянок нормальної та циротично зміненої печінки показало, що у нормальній печінці рівень світіння значно нижчий.

У ділянках печінки, віддалених від осередку кріовпливу на відстань більше 10 мм (зона III) , ознак порушень міченого білка не виявлено. Білок було виявлено тільки в границях мікросудин і в просторі Діссе. Максимальна інтенсивність світіння в цих ділянках печінки реєструвалася через 60 хв після введення флуоресціюючого білка, потім вона поступово знижувалася. Рівень світіння периферійних ділянок нормальної печінки вірогідно нижчий, ніж у циротично зміненій, і він має слабо виражений максимум.

Як було вже нами описано, при люмінесцентній біомікроскопії в зоні обмерзання (зона I) міченого ФІТЦ білка не виявлено через відсутність кровообігу в цій зоні. Ділянка печінки мала вигляд темної плями, в якій судини погано помітні. Таким чином, застосований метод дозволив установити границі ділянки необоротних кріопошкоджень, в якій надалі формується зона ішемічного некрозу. Було також визначено розміри пограничної зони, в якій мікрогемоциркуляторні порушення відповідали гострій фазі запальной реакції. Порушення судинно-тканинної проникності приводили до тотальної імбібіції печінкових клітин пограничної зони люмінесцюючим білком. В міру віддалення від ділянки пошкодження ступінь запального процесу значно знижувалась.

Згідно з одержаними експериментальними даними, кріовплив на частку печінки товщиною 4,5±0,2 мм протягом 2-х хв кріоаплікації викликав утворення зони кріонекрозу, яка являє собою півсферу радіусом 4,5±0,19 мм та об'ємом 191±25,4 мм3. При цьому погранична зона, яка являє собою на поверхні печінки яскраво люмінесцююче кільце шириною 1,8±0,1 мм, мала об'єм 275±70,4 мм3. При порівнянні об'ємів зони кріонекрозу та пограничної зони встановлено, що відносний об'єм пограничної зони складав 144,0±41,5 %.

При зіставленні результатів біомікроскопічних досліджень із даними термометрії печінки при локальних кріопошкодженнях визначено, що необоротні порушення функції мікросудин спостерігались у ділянках печінки, які відповідають первісним зонам обмерзання. В них при заморожуванні – відтаванні відбувалося зниження температури від –300С (у центрі кріоаплікації) до – 6,0 ± 1,20С (на границі зони кріонекрозу). Зниження температури тканини від – 6,0 ± 1,20С до 00С спричиняло мікрогемоциркуляторні порушення, які відповідають гострій фазі запального процесу.

Через 3 год після кріовпливу спостерігалось чітке розмежування зони ішемічного некрозу та ділянок печінки, в яких зберігався кровообіг. У зоні обмерзання контури розширених мікросудин розмито. У пограничній зоні вазодилятація зберігалась, швидкість кровообігу підвищувалась, спостерігалась дезагрегація еритроцитів, кровообіг ставав одноріднішим. Однак близько 30% синусоїд в цій зоні, як і раніше, затромбовано. Через 6 год після кріовпливу в синусоїдах пограничної зони зустрічаються одиничні мікротромби. У більшості мікросудин кровообіг відновлювався.

Застосування методу люмінесцентної біомікроскопії через 1 добу після внутрішньовенного введення 2% розчину ураніну дозволило спостерігати чітку границю зони кріонекрозу, розміри якої відповідають первісній зоні обмерзання. У пограничних ділянках функції мікросудин і жовчних капілярів зберігалися. Синусоїди усе ще розширені, кровообіг швидкий, ламінарний.

У ділянках печінки, віддалених від зони кріонекрозу, мікросудини також розширені. У циротично зміненій печінці зберігалися порушення агрегатного стану крові, які виявилися в агрегації еритроцитів, утворенні мікротромбів, уповільненні кровообігу. Проте при біомікроскопічних спостереженнях картина мікрогемоциркуляторного русла як нормальної, так і циротично зміненої печінки мало відрізнялася від вихідного стану. Таким чином, підтверджено раніш установлений факт незначності локального кріовпливу на периферійні ділянки органа.

Морфологічні, біохімічні і коагуляційні зміни в крові після кріовпливу на печінку. Вивчення динаміки лейкоеритроцитарної реакції показало, що у здорових інтактних кролів в 1-у добу після кріовпливу на печінку виникала лейкопенія, обумовлена в основному пониженням рівня нейтрофілів у крові. Протягом усього періоду спостереження у кролів мали місце відносна й абсолютна еозинопенія.

Таким чином, у реакції білої крові на кріовплив можна було виділити фазу ініціальної нейтропенії та наступну, більш стійку фазу відносного та абсолютного лімфоцитозу, після чого протягом перших трьох місяців лейкоцитограма поступово нормалізовувалась.

Втрата крові у тварин була такою незначною, що практично нею можна було знехтувати. Тварини втрачали не більше 1% крові. Проте з 1-ї доби після оперативного втручання у кролів реєструвалася стійка еритропенія. Концентрація еритроцитів знижувалася в середньому на 1,3х1012 клітин у 1л (р<0,01). Із коливаннями кількість еритроцитів трималася на цьому рівні до місяця та більше.

Характерно, що кольоровий показник крові у кролів не знижувався. Навпаки, чітко виявлялася тенденція до його збільшення. У 1-у добу показник збільшувався з 0,65 до 0,80 і надалі коливався у межах цього нового рівня. Нормалізація еритроцитарного складу наставала тільки через 2-3 місяця після оперативного втручання.

У другій серії дослідів внаслідок хронічної інтоксикації чотирьохлористим вуглецем у кролів виникали дегенеративно-деструктивні зміни в печінковій тканині, знижувалась детоксикаційна функція органа, з'являлася токсемія, що, звичайно, відбивалося на діяльності системи крові.

Насамперед у тварин розвивалась анемія. Знижувалася кількість гемоглобіну й особливо еритроцитів у периферичній крові. Кольоровий показник був вищим, ніж вихідний. Концентрація еритроцитів знизилася на 2х1012 клітин у 1 л крові (р<0,05). Кількість нейтрофілів зменшилась у середньому в 1,6 рази (р<0,05). Ядерний індекс зрушення нейтрофілів збільшився вдвоє, що вказувало на деяке омолодження нейтрофільного складу крові.

У 1-у добу після кріовпливу збільшувалася також кількість моноцитів (у середньому в 2,7 рази, р<0,05) і лімфоцитів (у середньому в 1,4 рази, р<0,05). В основному ж, ініціальну лейкопенію було обумовлено нейтропенією, яка стійко трималася протягом двох тижнів після впливу. Починаючи з 3-ї доби, відновлення загальної кількості лейкоцитів у периферичній крові відбувалося, головним чином, за рахунок лімфоцитів. Через 3-4 тижні відновлювалася також концентрація нейтрофілів і моноцитів у крові. Показник гематокриту зменшувався в середньому на 12об % (р<0,05), що свідчило про розрідження крові.

Виявилося, що кріодеструкція циротично зміненої печінкової тканини не спричиняла знайомої нам по 1-й серії дослідів лейко-еритроцитарної реакції. Коливання кількості еритроцитів відбувалися на більш низькому рівні, а початкової еритроцитопенії при цьому не було. Кольоровий показник частіш усього був вищий за вихідний. У кролів з цирозом печінки не спостерігалося нейтропенії та лейкопенії. Навпаки, через 1 добу після кріовпливу мала місце тенденція до підвищення вмісту нейтрофілів.

До особливостей лейкоцитарної реакції в даній серії дослідів слід віднести й запізніле настання фази лімфоцитозу, й більш значне її виявлення. Так, через 2-3 місяці після кріовпливу абсолютний вміст лімфоцитів у крові збільшувався в 2,84 рази (р<0,05). Загальний лейкоцитоз досягав 13,2 х 106 лейкоцитів у 1л крові.

Проведено дослідження біохімічних показників у сироватці крові після кріовпливу у тварин з нормальною і циротично зміненою печінкою.

Аналіз динаміки глюкози в крові обстежених тварин засвідчив, що кріовплив не спричинив явних функціональних порушень у печінці, які торкаються вуглеводного обміну. У тварин з цирозом зафіксовано помірну гіперглікемію, що в цілому є характерним для цієї хвороби. Вважається, що причиною гіперглікемії при цирозі печінки є зростання активності основних гормональних антогоністів інсуліну. Кріовплив спричиняв тільки тимчасове посилення гіперглікемії у тварин с цирозом, через 2 міс спостережень рівень глюкози нормалізувався.

Більш суттєвим функціональним порушенням метаболічних процесів у печінці після кріодеструкції можна вважати розвиток гіпопротеїнемії. Гіпопротеїнемія є звичайним наслідком ушкоджень і захворювань печінки, тому що саме в печінці синтезується більшість білків сироватки крові з найрізноманітнішими функціями. Локальна кріодеструкція нормальної печінки спричиняла недовгочасну помірну гіпопротеїнемію з нормалізацією показників під кінець двомісячного періоду спостережень. Локальна кріодеструкція циротично зміненої печінки, вже пригніченої білоксинтетичною функцією, викликала додаткове поглиблення гіпопротеїнемії у кролів у перші тижні після впливу. Але під кінець періоду спостережень (60 діб після кріовпливу) зміст загального сироваткого білка у кролів з цирозом повертався до вихідного рівня. Отже, кріовплив на циротично змінену печінку тільки тимчасово підсилює недостатність білоксинтетичної функції печінки. Цікавою метаболічною особливістю локального кріовпливу на печінку була зміна кількості МДА у сироватці крові, одного з кінцевих продуктів ПОЛ. У нашому досліджені локальний вплив на нормальну печінку спричиняв зниження рівня МДА у сироватці крові у перші тижні після кріовпливу, під кінець періоду спостережень (60 діб) значення показників нормалізувалися. У тварин з експериментальним цирозом кріовплив на печінку підсилював викид МДА тільки в окремі строки спостережень. Тобто формування зон кріонекрозу і запалення не супроводжувались стабільним виходом у кров продуктів ПОЛ.

Аналіз динаміки гепатозалежних ферментів крові (АлТ, АСТ, ЛФ) виявляє, що локальна кріодеструкція печінки в основному гальмує їхній викид у загальне циркуляторне русло. У тварин з нормальною печінкою підвищення активності амінотрансфераз у сироватці відмічалося тільки у ранній період після кріовпливу (1–3 доби) на фоні відсутності підвищення активності ЛФ протягом періоду спостережень. У тварин із циротично зміненою печінкою відмічалися фазні зміни активності АлТ відносно вихідних величин, коли періоди її зниження (1, 7 доба) чергувалися із періодами підвищення (3, 14 доба). Активність АсТ після короткочасного підвищення (1 доба) була зниженою або відповідала вихідним показникам, приблизно так саме змінювалася активність ЛФ.

У цілому, судячи по динаміці гепатозалежних метаболітів у сироватці крові, можно зробити висновок, що локальна кріодеструкція нормальної печінки спричиняє короткочасні та помірні порушення її функціональної активності, а локальний кріовплив на циротично змінену печінку суттєво не збільшує характерні для цього захворювання метаболічні зрушення.

Локальний кріовплив на нормальну печінку спричиняв зміни в системі зсідання крові. За даними тромбоеластографії, в 1-у добу спостерігалося статично значуще подовження часу реакції “r” на 40%, подовження максимальної амплітуди “mA” на 20%. Стійкість крові до гепарину підвищувалася на 14%, на стільки ж збільшувалась активність факторів протромбінового комплексу. Характер зазначених змін був статистично вірогідний. Статистично невірогідно змінювався час “К” на тромбоеластограмі та час рекальцифікації, хоча ці показники мали тенденцію до скорочування. У 1-у добу кількість тромбоцитів практично не змінювалась. Але максимальна амплітуда агрегатограми тромбоцитів була на 20% нижче (р<0,05), маючи при цьому незмінний кут нахилу. На 3-ю добу ці зміни продовжували наростати. Час реакції “r” на тромбоеластограмі довшав удвоє. Максимальна амплітуда збільшувалася на 20%. Продовжувався час рекальцифікації крові, спадала стійкість крові до гепарину. Ці показники змінювались у 1,3 – 1,5 рази. На 50 % зростала активність факторів протромбінового комплексу. Протягом цього періоду спостережень кількість та агрегаційна активність тромбоцитів залишилися незмінними. На 7-у добу після кріовпливу спостерігалася тенденція до повернення порушених показників коагулограми до вихідного стану. Час “r” на тромбоеластограмі та максимальна амплітуда скоротились у порівнянні з 3-тьою добою на 11 %. На 7-у добу статистично невірогідно відрізнялися від вихідних значень час рекальцифікації та толерантність крові до гепарину.

Таким чином, локальний кріовплив на нормальну печінку справляє на систему зсідання крові різноспрямовану дію. Час реакції на тромбоеластограмі, час рекальцифікації крові та час толерантності крові до гепарину є відбиттям гіпокоагуляційних зрушень після кріовпливу, причому максимальні зміни розгортаються на 3-ю добу. Проте ці зміни не є наслідком порушення синтетичної функції печінки. Навпаки, активність факторів протромбінового комплексу на 3-ю добу збільшується максимально на 50%. Зміни в системі гемокоагуляції мають стійкий компенсований характер.

Хронічна інтоксикація ССl4 викликала деякі зміни в системі зсідання крові у кролів. Так, на тромбоеластограмі визначалось укорочення часу “К” на 40% і подовження максимальної амплітуди на 30% (р <0,05). Більше, ніж у 2 рази, збільшилася кількість тромбоцитів при активації їх агрегаційної активності. Кут нахилу на кривій агрегації вірогідно збільшений на 10%. На зміненому гемокоагуляційному фоні в 1-у добу після кріовпливу у тварин не вдалося виявити статистично значних відмінностей в усіх компонентах, крім тромбоцитарного. Так, кількість тромбоцитів вірогідно збільшилася на 11%, а максимальна амплітуда агрегатограми вірогідно знижувалася на 15%. На 3-ю добу час “К” на тромбоеластограмі залишався вірогідно скороченим на 25%, а максимальна амплітуда не відрізнялася від вихідних значень. У 1,5 рази подовжувався час рекальцифікації (р<0,05), на 29% зростала толерантність крові до гепарину, на 27% збільшувалась активність факторів протромбінового комплексу. Кількість тромбоцитів відповідала стану тварин до кріовпливу. Але максимальна амплітуда агрегатограми тромбоцитів зменшувалася на 29%. На 7 добу більшість показників коагулограми мали первісні значення. Тільки максимальна амплітуда агрегатограм тромбоцитів залишилася зниженою на 5%, і значно (у 2 рази) знижувалася стійкість крові до гепарину. До того ж толерантність крові до гепарину в порівнянні з третьою добою після кріовпливу була на 30% нижче. На 14-у добу після кріопошкодження печінки у кролів із експериментальним цирозом показники коагулограми частково поверталися до первісних значень. Так, час “К“ i “mА” на тромбоеластограмі, час рекальцифікації та кількість тромбоцитів не мали статистично значних відмінностей від вихідних значень. Статистично значно відрізнялися толерантність крові до гепарину й амплітуда агрегатограми тромбоцитів. Кут нахилу залишався при цьому незмінним. Зростала активність протромбінового комплексу.

Стан системи зсідання крові після локального кріопошкодження циротично зміненої печінки кроликів характеризується неоднозначно. На фоні зміненої хронічною інтоксикацією CCl4 гемокоагуляційної системи найбільші зміни спостерігалися на 3-ю добу після кріовпливу, а на 17-14 добу параметри коагулограми поверталися до вихідних значень. Таким чином, у кролів із експериментальним цирозом печінки після кріовпливу грубих порушень у системі зсідання крові використаними коагулогічними тестами виявити не вдалось.

ВИСНОВКИ

1. Вперше проведене прижиттєве спостереження впливу дозованої локальної кріодії на нормальну і циротичну печінку експериментальних тварин дозволило ранжирувати залежність відповідних місцевих мікрогемоциркуляторних реакцій та змін в системі крові від часу та глибини охолодження, відокремити значущі температурні зони і встановити головні напрямки патоморфозу в них.

2. Під час локального кріовпливу на печінку методами прижиттєвої люмінесцентної мікроскопії, термометрії печінки та математичного моделювання виділено три температурні зони : I – зона оледеніння, обмежена ізотермою –50С, де відбувається формування ішемічного некрозу; II – зона охолодження, або погранична зона, обмежена ізотермами –50С і 00С, в якій ранні мікроциркуляторні порушення відповідають гострій фазі запального процесу; III – зона гіпотермії з температурою вище 00С, де мікрогемоциркуляторні зміни незначні та короткочасні.

3. Мікрогемоциркуляторні розлади після локальних кріопошкоджень нормальної і циротично зміненої печінки носять однонаправлений характер, але ступінь прояву цих порушень у патологічно зміненій печінці набагато вищий. Встановлено факт незначного впливу локального кріопошкодження печінки на периферійні ділянки органу.

4. Експериментальний цироз печінки супроводжується глибокими порушеннями гематологічної реактивності, які проявляються в перекрученні динаміки лейко–еритроцитарної реакції на кріодеструкцію печінки: відсутня стійка еритроцитопенія, двофазна лейкоцитарна реакція в формі абсолютної нейтропенії і подальшого абсолютного і відносного лейкоцитоза, що характерні для кріодеструкції нормальної печінки.

5. Дозоване локальне кріопошкодження печінки призводить до багатобічних різнонаправлених змін в системі гемокоагуляції, які, проте, не порушують її компенсований стан.

6. Кріопошкодження печінки викликає порушення метаболізму у вигляді короткочасної гіперглікемії, більш тривалої (2 місяці) гіпопротеінемії, гіпоферментемії.

7. Локальна кріодеструкція нормальної печінки спричиняє помірні зрушення її функціональної активності, що носять транзиторний характер. Локальний кріовплив на циротично змінену печінку не обтяжує метаболічні і структурно-функціональні порушення, пов'язані з перебігом експериментального цирозу.

Список робіт, опублікованих за темою дисертації.

1. Слета И.В., Сандомирский Б.П. Микрогемоциркуляторные изменения в печени при локальных криовоздействиях // Низкие температуры при лечении хронических диффузных заболеваний печени. – К.: Наукова думка, 1992. -С. 29-39. (Дисертантом самостійно здійснено кріовпливи на печінку тварин, проведено термометричні дослідження зон заморожування, вітальну мікроскопію та фотореєстрування, проаналізовані дані).

2. Слета И.В. Начальные изменения микрогемоциркуляции печени крыс после локальных криовоздействий // Криобиология. – 1986. – № 2. – С. 48.

3. Ульянов М.И., Ступин И.В., Слета И.В. Гематологические сдвиги при криодеструкции и резекции печени с применением плазменного скальпеля // Криобиология. – 1989. - № 2. – С. 44-47. (Дисертантом здійснено кріовпливи на печінку тварин, забор матеріалу, статистичну обробку та аналіз даних).

4. Ступин И.В., Микаелян Н.П., Сандомирский Б.П., Слета И.В., Коцько Н.И. Влияние резекции печени плазменным потоком и криовоздействием на некоторые биохимические показатели сыворотки крови // Криобиология. – 1989. - № 3. – С. 40-43. (Дисертантом здійснено кріовпливи на печінку тварин, забор матеріалу, статистичну обробку та аналіз даних).

5. Микаелян Н.П., Ступин И.В., Слета И.В. Возможность коррекции метаболических нарушений при экспериментальном циррозе печени методом криодеструкции и резекции плазменным потоком // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. – 1989. - №5. – 604-606. (Дисертантом самостійно одержана експериментальна модель цирозу печінки, здійснено кріовпливи на печінку тварин, забор матеріалу, аналіз даних).

6. Слета И.В.Реакции микроциркуляции печени на низкотемпературное воздействие // Пробл. криобиологии. – 2002. - № 3. – С. 89-91.

7. Слета И.В. Влияние локального криоповреждения печени на основные биохимические гепатозависимые показатели сыворотки крови у кроликов // Пробл. криобиологии. – 2002. - №3. – С. 59-63.

8. Слета И.В. Реакции крови на низкотемпературное повреждение нормальной и цирротически измененной печени кроликов // Вісник біології і медицини. – 2002. - №9-10. – С. 45-47.

9. Слета И.В., Гришин В.Л., Сандомирский Б.П. Изменение показателей свертывающей системы крови при локальных криоповреждениях нормальной и цирротически измененной печени // Патофизиологические аспекты действия холода на организм: Сб. науч. тр. – Харьков, 1989. – С. 124-127. (Дисертантом проведено моделювання цирозу печінки, кріовпливи на печінку тварин, забор матеріалу, аналіз даних).

АНОТАЦІЇ

Слета І.В. “Вплив локальних кріопошкоджень на мікрогемоциркуляцію

нормальної і циротично зміненої печінки.”- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 – кріобіологія. - Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2003.

У роботі, що виконувалась на 189 кролях і 210 щурах, досліджені місцеві мікрогемоциркуляторні реакції та зміни в системі крові після дозованої локальної кріодії на нормальну печінку і печінку з CCl4-індукованим цирозом.

Методами прижиттєвої люмінесцентної мікроскопії, термометрії печінки під час кріовпливу, математичного моделювання виділено три температурні зони і встановлено основні направлення патоморфозу в них: I – зона оледеніння, обмежена ізотермою –50С, де відбувається формування ішемічного некрозу; II – зона охолодження, або погранична зона, обмежена ізотермами –50С і 00С, в якій ранні мікроциркуляторні порушення відповідають гострій фазі запального процесу; III – зона гіпотермії з температурою вище 00С, де мікрогемоциркуляторні зміни незначні та короткочасні.

При дослідженні морфологічних, біохімічних і коагуляційних показників крові встановлено, що локальна кріодеструкція нормальної печінки спричиняє помірні зрушення її функціональної активності, які мають тимчасовий характер. Локальний кріовплив на циротично змінену печінку не обтяжує метаболічні і структурно-функціональні порушення, пов'язані з перебігом експериментального цирозу.

Ключові слова: локальна кріодеструкція, мікрогемоциркуляція печінки, цирроз печінки, прижиттєва мікроскопія, термометрія, гематологічна реактивність, гемокоагуляція.

Слета И.В. “Влияние локальных криоповреждений на микрогемоцирку-ляцию нормальной и цирротически измененной печени”. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 – криобиология. – Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2003.

В работе, которая проведена на 189 кроликах и 210 крысах, исследованы местные микрогемоциркуляторные реакции и изменения в системе крови после дозированных локальных криовоздействий на нормальную печень и печень с CCl4-индуцированным циррозом.

Для определения зависимости микрогемоциркуляторных изменений