НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна

СМЕРДОВА Лариса Миколаївна

УДК 577.1:578.083:612.4.42

Роль оксиду азоту в реалізації цитотоксичної дії

N-нітрозодиметиламіну та обміні цієї

нітрозосполуки

03.00.04 - біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ 2003

Дисертація є рукопис.

Робота виконана в Інституті екогігієни та токсикології ім.Л.І.Медведя МОЗ України

Науковий керівник – доктор біологічних наук, професор

ДМИТРЕНКО Микола Петрович,

завідувач лабораторії біохімії

Інституту екогігієни та токсикології ім.Л.І.Медведя.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

ВИНОГРАДОВА Руфіна Петрівна,

провідний науковий співробітник

Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України;

доктор біологічних наук, професор

ЦУДЗЕВИЧ Борис Олександрович,

професор Київського національного університету

імені Тараса Шевченка.

Провідна установа – Національний медичний університет ім.О.О.Богомольця МОЗ України, кафедра біоорганічної, біологічної та фармацевтичної хімії, м. Київ

Захист відбудеться “21” квітня 2003 року о 14 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім..О.В.Палладіна НАН України за адресою: 01601, м.Київ-30, вул. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституті біохімії ім..О.В.Палладіна НАН України за адресою: м. Київ, вул. Леонтовича, 9.

Автореферат розісланий “15 “ березня 2003 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук КІРСЕНКО О.В.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. N-нітрозосполуки є поширеними антропогенними забруднювачами довкілля і можуть надходити в організм з повітрям, їжею, напоями, при палінні, користуванні косметичними виробами, тощо. N-нітрозосполуки можуть утворюватися в організмі при надходженні з їжею та питною водою нітритів, нітратів, оксидів азоту та наявності в організмі певних умов для нітрозування відповідних амінів екзогенного та ендогенного походження [Tannenbaum S.R.,1988, Рубенчик Б.Л., 1990]. Але цитотоксична дія N-нітрозосполук досліджена недостатньо. Зокрема, не зважаючи на значну кількість робіт по вивченню послідовності і взаємозв’язку біохімічних процесів при запрограмованій загибелі різних типів клітин в умовах дії хімічних чинників (Матишевська О.П., 1999, R.A.Lockshin, 2002), відсутні дані про механізм і характер перебігу індукованої N-нітрозосполуками загибелі макрофагів. Ці клітини цікаві тим, що є одними з головних в системі імунітету і можуть перебувати в неоднакових за чутливістю до дії ушкоджуючих факторів метаболічних станах: неактивованому і активованому, який супроводжується значним збільшенням синтезу оксиду азоту. За різних умов та за різними концентраціями дія оксиду азоту може бути різнобічною: в низьких концентраціях він діє як фізіологічний внутрішньоклітинний месенджер; токсична дія проявляється при високих його концентраціях, що можуть утворюватись в організмі в умовах активації індуцибельної ізоформи NO-синтази, яка локалізована, головним чином, в клітинах імунної системи - макрофагах, нейтрофілах і лімфоцитах [Реутов В.П., 1995, Knowles R.G.,1994]. Оксид азоту, що вивільнюється при біотрансформації цитохромом Р-450 з N-нітрозосполук, може визначати цитотоксичність останніх. До того ж швидкість синтезу NO і стан сполучених з ним ділянок обміну в макрофагах може впливати на життєздатність та перебіг загибелі клітин при ушкоджуючій дії N-нітрозосполук. Резистентність організму до токсичної дії N-нітрозосполук залежить від швидкості їх утворення з попередників і біотрансформації та може змінюватися при патологічних станах. В цьому аспекті привертає увагу цукровий діабет, враховуючи поширеність і серйозність метаболічних порушень при вказаному захворюванні (M.P.Longnecker, 2001).

Мета роботи: з’ясувати роль оксиду азоту в реалізації токсичної дії N-нітрозодиметиламіну (НДМА) на макрофаги та виявити особливості обміну цієї нітрозосполуки у щурів при дії екзогенних та ендогенних джерел оксиду азоту.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні задачі: 1.Розробити метод активації перитоніальних макрофагів за умов in vivo, визначити біохімічні, цитоморфологічні, гістохімічні показники активованих макрофагів. 2. Дослідити здатність активованих макрофагів синтезувати оксид азоту, визначити вплив метаболітів пуринового та енергетичного обміну на цей процес. 3.Дослідити характер загибелі активованих і неактивованих макрофагів під впливом НДМА і дексаметазону. 4. Встановити роль денітрозуючої та N-деметилюючої активності цитохрому Р-450 макрофагів в розвитку НДМА-індукованої загибелі. 5. Розробити метод визначення участі оксиду азоту в механізмі загибелі макрофагів в умовах in vitro та визначити можливість використання цього методу при вивченні цитотоксичної дії донорів NO. 6. Дослідити роль оксиду азоту, іонів амонію і сечовини в процесі НДМА-індукованої загибелі макрофагів та при дії ефекторів, які впливають на синтез цих сполук. 7. Вивчити особливості утворення НДМА з амідопірину при дії нітрозуючих агентів екзогенного і ендогенного походження та у щурів із стрептозотоциновим діабетом.

Об’єкт дослідження – перитоніальні макрофаги, кров, сеча, печінка щурів. Предмет дослідження – механізм цитотоксичної дії НДМА, роль оксиду азоту в цьому процесі.

Наукова новизна отриманих результатів. В результаті проведених оригінальних досліджень отримані активовані вакциною БЦЖ за умов in vivo та охарактеризовані перитоніальні макрофаги щурів; показано посилення синтезу оксиду азоту макрофагами при дії сполук, які містять гуанідинову групу - аргініну, креатинфосфату, гуанідиноцтової кислоти, креатину, а також глутаміну, гіпоксантину. З’ясована часова та концентраційна залежність загибелі активованих і неактивованих макрофагів при дії дексаметазону та НДМА. Показано, що активовані макрофаги більш стійкі до цитотоксичної дії НДМА, ніж неактивовані. Встановлено, що в процесі індукованої НДМА загибелі макрофагів денітрозуюча та N-деметилююча активність цитохрому Р-450 зазнає змін, що мають свої особливості в залежності від функціонального стану клітин - активовані чи неактивовані. Досліджено характер змін в утворенні оксиду азоту, іонів амонію, сечовини в процесі загибелі макрофагів при дії НДМА; виявлено зв’язок між вираженістю цитотоксичної дії НДМА та особливостями синтезу вказаних сполук. Застосування розробленого методу включення в макрофаги “пастки” оксиду азоту дало змогу встановити, що цитотоксична дія НДМА не є результатом вивільнення з нього оксиду азоту. Показано, що під впливом екзогенних нітрозуючих факторів - оксиди азоту і нітрат натрію - в організмі щурів суттєво посилюється утворення НДМА з амідопірину. Введення алопуринолу сприяє утворенню НДМА, а індукція ендогенного синтезу оксиду азоту вакциною БЦЖ суттєво не впливає на цей процес. Встановлено, що при стрептозотоциновому діабеті у щурів знижується N-деметилююча активність цитохрому Р-450 в печінці та ендогенне утворення НДМА з попередників.

Практичне значення одержаних результатів. Дослідження по вивченню механізму цитотоксичної дії НДМА на макрофаги можуть бути основою для розробки засобів, що підвищують стійкість макрофагів до токсичної дії хімічних сполук, а отже і відновлюють захисну функцію імунної системи організму. Розроблена модель розвитку запрограмованої загибелі макрофагів може бути використана як альтернативний метод in vitro для скринінгу токсичності хімічних сполук. Розроблено метод прямого визначення участі оксиду азоту в розвитку токсичної дії хімічних сполук, як донорів, так і акцепторів оксиду азоту за умов in vitro. Узагальнення даних щодо обміну НДМА за умов впливу нітрозуючих факторів дозволило нам зробити висновок, що показником оцінки небезпеки впливу N-нітрозосполук є швидкість їх біотрансформації в організмі.

Зв’язок з науковою тематикою організації. Робота відповідає плану науково-дослідної роботи лабораторії біохімії Інституту екогігієни та токсикології ім. Л.І.Медведя МОЗ України та виконана в рамках теми 5.4/448 “Дослідження біохімічних механізмів апоптозу клітин імунної системи”, номер держреєстрації 196U024284.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом разом з науковим керівником розроблена схема та обґрунтована методологія постановки експериментів, підготовлені наукові публікації. Дисертантом особисто здійснений інформаційний пошук та оцінка літературних даних, виконані експериментальні дослідження, проведений аналіз отриманих результатів. Визначення ЕПР-спектроскопічних характеристик макрофагів виконувалось у співробітництві з науковим співробітником лабораторії біохімії Інституту екогігієни та токсикології ім. Л.І.Медведя МОЗ України Шандренком С.Г. Визначення ендогенного утворення НДМА в організмі щурів виконувалося разом із старшим науковим співробітником Інституту експериментальної патології, радіобіології та онкології ім.Кавецького НАН України кандидатом біологічних наук Главіним О.А. Отримані результати викладені у спільних публікаціях.

Апробація роботи. Основні положення роботи були представлені на VII Українському біохімічному з’їзді (Київ, 1997), The 2nd Parnas Conference (Gdansk, Poland, 1998), на конфе---ренції молодих вчених, яка проводилась в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАНУ (Київ, 1997), на конфе---ренції, присвяченій 75-річчю з дня народження Ю.С.Кагана (Київ, 1999), The 4th Workshop of Balkan Countries “Xenobiotic Metabolism and Toxicity”(Antalya, Turkey, April, 2000), на ІІ з’їзді онкологів країн СНД (Київ, травень, 2000), EUROTOX-2001 (Туреччина, вересень, 2001), EUROTOX-2002 (Угорщина, вересень, 2002 р.), на VIIІ Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002).

Публікації. Результати досліджень представлені у 6 статтях та 12 тезах, які опубліковані у профільних журналах, матеріалах з’їздів та конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 158 сторінках машинописного тексту і складається із вступу, основної частини, яка містить огляд літератури (4 розділи) та експериментальну частину (6 розділів), заключної частини (1 розділ), висновків та переліку використаної літератури (223 джерела). Робота містить 17 рисунків, 17 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ. Докладно розглянуті питання біологічної ролі оксиду азоту в клітинах евкаріот. Проведений детальний аналіз сучасних уявлень про молекулярні механізми та функціональне значення апоптотичної загибелі клітин імунної системи. Висвітлено молекулярні основи активації макрофагів та визначено їх біохімічні маркери. Розглянута роль нітрозосполук як широко розповсюджених забруднювачів навколишнього середовища, особлива увага приділена їх канцерогенній дії та головній небезпеці, пов’язаній із здатністю цих сполук легко утворюватись в організмі та навколишньому середовищі.

МЕТОДИ ТА МАТЕРІАЛИ ДОСЛІДЖЕНЬ. В роботі використані такі реагенти та матеріали: середовище RPMI-1640, бікарбонат натрію, о-фталевий альдегід, препарат уреази, метиларгінін, тіопролін, алопуринол, піразол, НДМА, канаванін, АТФ (фірма “Sigma”, США), глутамін, глутамінова кислота, інозин, гіпоксантин, валін, дексаметазон, аденозин, аргінін, нітросиній тетразолій, трипановий синій (фірма “Chemapol”, Угорщина), інактивована сироватка (Інститут ветмедицини, Київ), діетилдитіокарбамат натрію, сульфат заліза, нітропрусид натрію (фірма “Реахим”, ч.д.а.), нітрогліцерин, пеніцилін, ампіцилін (“Фармацевтична фірма “Дарниця”, Київ).

Досліди проведені на щурах-самцях лінії Вістар вагою 120-150 г, які утримувалися на стандартному раціоні віварію. Активовані перитоніальні клітини отримували через 7 - 10 діб після ін’єкції щурам живої послабленої вакцини БЦЖ ( 1 мг на 100 г маси тіла). Перитоніальні клітини отримували в стерильних умовах, промиваючи черевну порожнину середовищем RPMI 1640 (рН 7.25). Клітини ресуспендували до кінцевої концентрації - 107 на 1 мл. Одержували очищену фракцію макрофагів шляхом адгезії на пластиковій поверхні планшетів (Дж.Клаус, 1990). Отриману суспензію макрофагів інкубували при 370С у вказаному середовищі з додаванням 5% інактивованої сироватки теляти, по 75 ОД пеніциліну і стрептоміцину. Фагоцитарну активність перитоніальних макрофагів оцінювали методом по відновленню тетразолію нітросинього (Вагнер, 1989). Визначення параметру РНК/ДНК проводили цитофлуоресцентним методом (Чернушенко, 1978). Життєздатність клітин визначали суправітальним тестуванням за допомогою пофарбування трипановим синім (Дж.Клаус, 1990). Цитоморфологічні дослідження проводили загальноприйнятими методами (Кост Е.А., 1975, Глузман Д.Ф., 1993). Рівень нітриту визначали спектрофотометричним методом з реактивом Грісу (Green, 1982). Визначення сечовини та іонів амонію проводили флуоресцентним методом (Richard J.Roman, 1979). Денітрозуючу та N-деметилюючу активність цитохрому Р-450 вимірювали за утворенням нітрит-іону та формальдегіду (Сноз С.В., 1993). Кількість формальдегіду визначали за методом Nash (1953). Визначення активності аденозиндезамінази проводили флуоресцентним методом за утворенням іонів амонію (Дмитренко М.П., 1980), активність креатинкінази - флуоресцентним методом за утворенням креатину (Дмитренко М.П., 1985). Метаболіти пуринового, енергетичного обміну, НДМА, дексаметазон вносилися в культуральне середовище макрофагів. Рівень оксиду азоту, іонів амонію, сечовини визначали в середовищі культивування макрофагів. Для визначення цитотоксичної дії донорів оксиду азоту суспензію макрофагів інкубували 30 хв. при 370С в середовищі RPMI 1640 з 0.1 мМ діетилдитіокарбамат-Na (ДТК), центрифугували 3 хв. при 1000 об/хв., ресуспендували в середовищі RPMI 1640 з 0.1 мМ FeSO4*7H2O; інкубували 30 хв. при 370С, ретельно відмивали середовищем RPMI 1640 з наступним повторним центрифугуванням. В результаті такої обробки на мембранах макрофагів формується комплекс ДТК-Fe 2+, що проявляє парамагнітні властивості і реєструється методом ЕПР. ЕПР-дослідження проводили на радіоспектрометрі “Varian E-109” при температурі рідкого азоту. Кількість НДМА визначали за допомогою газового хроматографа з термальним енергетичним аналізатором (Fine D.H., 1976). Статистичну обробку результатів проводили загальноприйнятими методами варіаційної статистики (Плохинский М., 1981). Розрахунки та побудова графіків здійснені на AMD-K5 (tm) з використання програм Excel, Statistica.

Вивчення впливу метаболітів пуринового та енергетичного обмінів на синтез оксиду азоту перитоніальними макрофагами щурів. Токсичну дію НДМА вивчали на неактивованих та активованих перитоніальних макрофагів щурів; активовані макрофаги отримували шляхом внутрішньочеревневого введення тваринам вакцини БЦЖ. Під впливом БЦЖ відбувається збільшення в перитоніальному ексудаті кількості клітин в 2.4 рази, головним чином за рахунок макрофагів, змінюється клітинний склад ексудату. На активацію макрофагів вказувало збільшення величини співвідношення РНК/ДНК (табл.1) та активності ферментів аденозиндезамінази в 1.8 рази і креатинкінази - в 1.5 рази в порівнянні з макрофагами контрольних тварин. Зростання активності креатинкінази свідчить про активізацію процесів синтезу і споживання АТР, а аденозиндезамінази - про прискорення аденіннуклеотидного катаболізму.

Таблиця 1

Показники перитоніального ексудату щурів при активації вакциною БЦЖ

Умови

досліду | Макрофаги | Лімфоцити | Гранулоцити

% | РНК/ДНК

відн. од. | % | РНК/ДНК

відн. од. | % | РНК/ДНК

відн. од.

Контроль

Активація БЦЖ | 25.9+0.8

57.4+7.9* | 0.35+0.02

0.57+0.02* | 30.5+6.8

24.0+8.4 | 0.28+0.03

0.28+0.03 | 43.9+6.9

19.9+4.8* | 0.29+0.01

0.27+0.03

* - р<0.05 відносно контролю

Активовані макрофаги більше накопичують у культуральному середовищі NO2-, ніж клітини контрольних тварин. При внесенні L-аргініну – субстрату NO-синтази в середовище інкубації клітин утворення NO2- суттєво посилюється (табл.2).

Таблиця 2

Динаміка утворення оксиду азоту макрофагами (нмоль NO2- /107 кл.)

Стан макрофагів | Час інкубації,

год. | А р г і н і н, 2 мМ

- | +

контрольні

активовані | 3

5

3

5 | Не визначено

8.3+0.8

34.1+4.8

56.2+7.5* | 0.2

11.5+1.2

63.6+9.0

129.7+19.8*

*- р<0.05 відносно контролю

Метаболіти, які подібно до L-аргініну містять гуанідинову групу: креатин, креатинфосфат, гуанідиноцтова кислота, в концентрації 10 мМ за 5 годин інкубації викликають більш інтенсивне, на 30.0% - 80.0%, утворення макрофагами оксиду азоту відносно контрольних дослідів без L-аргініну. Вказані метаболіти можуть, як і L-аргінін, бути субстратами для NO-синтази.

Беручи до уваги, що в NO-синтазній реакції беруть участь NADPH та О2, можна припустити наявність зв’язку між утворенням оксиду азоту та пуриновим і енергетичним обміном. З досліджуваних метаболітів пуринового та енергетичного обміну тільки глутамін і гіпоксантин викликали суттєве збільшення рівня нітрит-іонів у культуральному середовищі макрофагів (рис.1).

Активуючу дію глутаміну на синтез NO у макрофагах, очевидно, можна пояснити тим, що він легко проникає через клітинну мембрану і є більш ефективним, ніж глюкоза, енергетичним “паливом”, прискорює швидкість гліколізу, посилює синтез пуринів de novo і мобілізацію вільного L-аргініну в клітинах [Sessa W.C., 1990]. Гіпоксантин легко реутилізується макрофагами гіпоксантинфосфорибозилтрансферазною реакцією і поповнює в них фонд пуринових нуклеотидів, збільшуючи вміст NADPH (Iyengar R.,1987).

Таким чином, аналізуючи результати проведених досліджень, можна зробити узагальнення, що введення щурам вакцини БЦЖ призводить до збільшення кількості клітин перитоніального ексудату, переважно за рахунок макрофагів. Активовані макрофаги значно інтенсивніше, ніж клітини контрольних тварин, синтезують оксид азоту, особливо під впливом сполук, що містять гуанідинову групу. На цей процес впливають сполуки, які пов’язані з енергетичним станом клітин.

Вивчення загибелі перитоніальних макрофагів щурів при дії N-нітрозодиметиламіну та дексаметазону. Для вивчення цитотоксичної дії на макрофаги in vitro вибрані такі сполуки як НДМА – найбільш поширений серед N-нітрозосполук забруднювач, і дексаметазон - класичний індуктор апоптозу макрофагів. Чисельні дослідження in vitro, присвячені механізму загибелі макрофагів при дії різних хімічних сполук, як правило, не розглядають загибель клітин в залежності від часу та концентрації хімічних сполук (Ranjan P., 1998).

Нами з’ясовано, що при дії як НДМА, так і дексаметазону загибель макрофагів у залежності від часу інкубації досить схожа і має майже лінійний характер (рис.2). Ця лінійність процесу загибелі макрофагів без явного латентного періоду, на наш погляд, може свідчити про гетерогенність фракції перитоніальних макрофагів, в якій є різноманітні субпопуляції клітин, що до того ж можуть знаходитись на різних стадіях розвитку, функціональної активності та гинути за апоптотичним або некротичним типом.

Гетерогенність макрофагів підтверджується також і аналізом концентраційної залежності загибелі активованих та неактивованих макрофагів при дії дексаметазону та НДМА. Виявляється, принаймні, дві популяції перитоніальних макрофагів: клітини першої популяції гинуть вже при малих дозах індуктора; друга - більш стійка до дії індуктора.

Дослідження цитотоксичної дії НДМА та дексаметазону на активовані та неактивовані макрофаги виявили ще одну особливість процесу загибелі цих клітин: більшу уразливість до дексаметазону саме активованих макрофагів, а неактивованих - до дії НДМА. Таким чином, активація макрофагів сама по собі ще не визначає їх чутливість до токсичної дії хімічних сполук, важливу роль, перш за все, відіграє саме природа токсичного агенту. Схожість часової динаміки загибелі перитоніальних макрофагів при дії НДМА та дексаметазону, незважаючи на різні механізми цитотоксичної дії цих сполук, свідчить на користь того, що макрофаги складають гетерогенну за чутливістю по відношенню до НДМА та дексаметазону популяцію клітин. Оскільки відомо, що дексаметазон викликає загибель клітин за типом апоптозу, то і при дії НДМА макрофаги, очевидно, гинуть переважно за типом апоптозу.

Дослідження механізму цитотоксичної дії N-нітрозодиметиламіну на макрофаги. Дослідження включало з’ясування ролі N-деметилюючої та денітрозуючої активності ізоформ цитохрому Р-450, які беруть участь в реакції біотрансформації N-нітрозосполук, в механізмі цитотоксичної дії НДМА. Визначення динаміки змін активності в процесі НДМА-індукованої загибелі макрофагів представляє інтерес для розуміння характеру метаболізму ксенобіотиків в організмі за несприятливих умов, коли збільшується частота випадків загибелі клітин.

Як видно з табл.3, активація макрофагів суттєво не відбивається на вихідній денітрозуючій та N-деметилюючій активності цитохрому Р-450. Враховуючи дані про те, що етанол індукує відповідні за біотрансформацію N-нітрозосполук ізоформи цитохрому Р-450 в печінці (Yang C.S., 1990), нами з’ясовані особливості загибелі макрофагів тварин, що вживали етанол, та зміни денітрозуючої та N-деметилюючої активності цитохрому Р-450. При цьому нами не було виявлено збільшення денітрозуючої та N-деметилюючої активності в макрофагах щурів, які отримували етанол, що, можливо вказує на меншу чутливість цитохромів Р-450 перитоніальних макрофагів до дії етанолу в порівнянні з клітинами печінки. Але введення щурам етанолу знижує життєздатність макрофагів до дії НДМА: відсоток загиблих клітин достовірно збільшувався в середньому на 18% в порівнянні з макрофагами контрольних тварин.

В процесі НДМА-індукованої загибелі значно знижується денітрозуюча активність цитохрому Р-450 в активованих макрофагах. В той же час в макрофагах контрольних тварин та тих, які отримували етанол, вона, навпаки, зростає. N-деметилююча активність макрофагів контрольних тварин та тих, що отримували етанол, в процесі НДМА-індукованої загибелі не змінюється, а в активованих макрофагах вона, в порівнянні з клітинами, що інкубувались без НДМА, суттєво зростає (табл.3).

Таблиця 3

Денітрозуюча та N-деметилююча активність цитохромів Р-450 макрофагів щурів

в процесі НДМА-індукованої загибелі

Умови експерименту | Час інкубації макрофагів, години

тварини | НДМА | 0 | 1 | 3 | 5 | 7

Денітрозуюча активність (нмоль NO2- /год. на 107кл)

контроль | - | 30.8+2.8 | 30.4+2.6 | 25.6+5.5 | 17.3+3.1 | 13.0+4.5

+ | 37.59.8 | 54.217.5 | 66.49.4*’** | 49.516.3* | 69.111.1*’**

Активовані | - | 27.8+6.4 | 28.0+5.6 | 21.9+5.7 | 22.7+3.4 | 15.3+3.1

+ | 23.03.9 | 19.86.1 | 17.37.7 | 8.31.7*’** | 9.91.8**

+етанол | + | 39.09.0 | 35.89.8 | 31.09.0 | 46.014.0* | 55.113.1*

N-деметилююча активність (нмоль НСНО /год. на 107кл)

контроль | - | 47.2+4.7 | 46.9+4.5 | 42.8+9.4 | 42.0+5.2 | 42.1+4.5

+ | 47.27.3 | 43.28.4 | 45.75.1 | 45.16.1 | 52.09.5

Активовані | - | 48.5+5.1 | 48.3+5.0 | 36.6+4.3 | 39.2+5.0 | 39.3+5.1

+ | 57.87.5 | 52.45.4 | 63.53.3* | 61.47.6* | 61.95.9*

+ етанол | + | 48.73.5 | 42.62.5 | 44.01.9 | 45.92.5 | 49.36.9

* - p<0.05 відносно відповідних експериментів без НДМА (ферментативна активність макрофагів щурів, які отримували етанол, порівнювалась з ферментативною активністю макрофагів інтактних щурів у відсутності НДМА).

** - p<0.05 відносно початкової активності (нуль годин)

Внесення в середовище інкубації макрофагів піразолу - інгібітору ізоформи цитохрому Р-450 викликає значне пригнічення денітрозуючої активності в макрофагах контрольних та імунізованих БЦЖ щурів майже на 72%, а N-деметилюючої активності - на 36% і 32% відповідно. При цьому суттєво підвищується стійкість макрофагів контрольних щурів та тих, які отримували етанол, до цитотоксичної дії НДМА.

Таким чином, підсумовуючи отримані результати, можна зробити висновок, що здатність НДМА викликати загибель перитоніальних макрофагів пов’язана з його біотрансформацією цитохромами Р-450. В процесі загибелі макрофагів денітрозуюча та N-деметилююча активність цитохрому Р-450 зазнає змін, що мають свої особливості в залежності від стартового функціонального стану клітин.

Для з’ясування, які саме продукти біотрансформації НДМА відіграють головну роль в механізмі цитотоксичної дії на макрофаги, було розроблено і кількісно охарактеризовано оригінальний метод для визначення вкладу NО в цитотоксичну дію НДМА. Суть методу полягає у включенні в мембранні структури макрофагів пастки NО, що являє собою комплекс діетилдитіокарбамату натрію і заліза (ДТК- Fe2+). Так, за даними ЕПР-спектрометрії, в активованих макрофагах, які не вміщували пастку, визначався асиметричний синглетний сигнал динітрозильного комплексу ендогенного негемового заліза з SH-вміщуючими білками RSH-Fe-NO (g=2.037). Цей сигнал повністю відсутній в спектрі макрофагів з пасткою. Замість нього має місце триплетний сигнал комплексу ДТК-Fe-NO (рис.4).

Концентрація пастки оксиду азоту, яка додавалась до суспензії макрофагів, нетоксична для клітин, але достатня, щоб зв’язати не тільки ендогенний NО, що підтверджено дослідами по визначенню вмісту нітритів в культуральному середовищі макрофагів за 6 годин інкубації, але й NО екзогенних джерел.

Порівняння цитотоксичної дії нітропрусиду натрію (НПН), нітрогліцерину (НГ) та НДМА на макрофаги, яку визначали за кількістю загиблих клітин в процесі інкубації, вказує на те, що наявність пастки NО в структурі макрофагів усувала цитотоксичну дію НПН на 86% і НГ на 63%, але суттєво не відбивалась на цитотоксичній дії НДMA. Отже, токсичність НДMA не обумовлена метаболічним денітрозуванням, в процесі якого NO утворюється в значно меншій кількості і, можливо, в інших компартментах клітини, ніж при денітрозуванні НПН і НГ.

Дослідження ролі оксиду азоту, іонів амонію і сечовини в процесі НДМА-індукованої загибелі макрофагів та при дії ефекторів, які впливають на синтез цих сполук. Показано, що НДМА викликає дозозалежне збільшення синтезу іонів амонію та сечовини у неактивованих та активованих макрофагів. Існує висока кореляція між збільшенням цих метаболітів та зростанням кількості загиблих клітин: між концентрацією НДМА і загибеллю макрофагів (коефіцієнт кореляції – 0.959 для неактивованих, 0.957 – для активованих макрофагів), і синтезом іонів амонію (0.905 и 0.934, відповідно), і синтезом сечовини (0.903 и 0.948, відповідно). Посилення утворення іонів амонію і сечовини, ймовірно, відноситься до ранніх проявів викликаної НДМА загибелі клітин, оскільки воно є найбільшим в першу годину з моменту додавання НДМА до суспензії макрофагів (в 2.3 рази та в 2.5 рази для іонів амонію та сечовини відповідно). Для з’ясування взаємозв’язку між утворенням іонів амонію, сечовини, NO та загибеллю макрофагів, що викликана НДМА, ми впливали на обмін цих метаболітів сполуками, що здатні змінювати внутрішньоклітинні рівні оксиду азоту шляхом підсилення його синтезу або зв’язування відповідними акцепторами. В активованих макрофагах, де синтез оксиду азоту збільшений, утворення іонів амонію та сечовини дещо знижене в порівнянні з неактивованими макрофагами, при цьому відмічається менша уразливість до цитотоксичної дії НДМА.

Аргінін - субстрат NO-синтази в низьких концентраціях (2-8 мМ) підсилював синтез NO, що супроводжується збільшенням синтезу іонів амонію та сечовини (рис.5), сприяв життєздатності макрофагів при дії НДМА (табл.4).

При концентрації аргініну 32 мМ рівні NO та іонів амонію знижувались до вихідних величин, а кількість сечовини залишалась завищеною. Загибель клітин при цих концентраціях аргініну суттєво збільшувалась. Цитотоксична дія високих концентрацій аргініну та НДМА сумується.

Таблиця 4

Загибель макрофагів (%) при різних концентраціях аргініну за 6 годин інкубації

НДМА | Концентрація аргініну, мМ

0 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32

+ | 33.50.5 | 28.61.1* | 26.40.9* | 31.01.3 * | 58.02.1* | 77.02.9*

- | 10.00.7 | 12.10.6 | 15.10.2 | 20.40.4 | 31.21.4 | 43.30.5

*-р 0.05 – вірогідно відносно відповідних величин без НДМА

Механізми цитотоксичної дії високих доз аргініну не з’ясовані. Протекторні властивості низьких концентрацій аргініну пов’язані з його відомою роллю в синтезі поліамінів, ключових ферментів, гормонів, протамінів та гістонів. Аргінін - субстрат циклу сечовини, NO-синтази і аргінази; необхідний для функціонування ядер та мітохондрій.

Канаванін як інгібітор NO-синтази [Hrabak A., 1994], а тіопролін – як ковалентний акцептор NO [Miwa M., 1989] можуть знижувати рівень NO. Дійсно, в проведених нами дослідженнях обидві ці сполуки самостійно та в присутності НДМА ефективно знижували накопичення NO в середовищі інкубації макрофагів і проявляли залежний від концентрації цитотоксичний вплив на клітини. Але канаванін при цьому значно підсилює синтез іонів амонію, а тіопролін практично не впливає на утворення іонів амонію та сечовини. При комбінованій дії НДМА з канаваніном на макрофаги спостерігається адитивність ефекту, а з тіопроліном - за цитотоксичностю ефект нижче адитивного (табл.5). Таким чином, при однонаправленості дії на рівень NO в макрофагах вплив канаваніну та тіопроліну на інші показники неоднаковий. Це свідчить, що обидві сполуки впливають на життєздатність клітин через механізми, які не опосередковуються дією NO.

Досліджували вплив глутаміну та гіпоксантину, які, впливаючи на енергозабезпечення клітини, можуть контролювати синтез оксиду азоту, іонів амонію, сечовини. Нами показано, що глутамін підсилює синтез NO, викликає незначне зниження рівня іонів амонію; при концентрації 8 мМ знижує рівень сечовини в 1.3 рази, але по мірі збільшення концентрації до 16 мМ кількість сечовини виходить на початковий рівень. Високі дози глутаміну підсилюють загибель макрофагів, так як в результаті глутаміназної реакції вивільнюється токсичний аміак: активність глутамінази в клітинах зосереджена, головним чином, в ядрах та мітохондріях [Бекир-Заде Г.М., 1967], де локальне утворення навіть малих кількостей аміаку може ініціювати процес запуску загибелі клітин і посилити його (табл.5).

Таблиця 5

Загибель макрофагів при дії різних ефекторів

(% за 6 годин інкубації в присутності 2 мМ аргініну)

Ефектори | НДМА

| Концентрації ефекторів, мМ

2 | 4 | 8 | 16

валін | + | 30.30.8* | 34.21.2 * | 32.10.6* | 30.60.9 *

_ | 13.80.7 | 17.50.5 | 18.40.7 | 19.21.6

канаванін | + | 30.10.4* | 35.40.9 * | 37.91.5* | 47.40.2*

_ | 15.50.5 | 18.21.2 | 20.40.2 | 23.62.1

гіпоксантин | + | 34.40.5* | 37.40.3* | 39.51.1* | 57.31.3*

_ | 28.01.0 | 28.70.4 | 35.40.6 | 44.50.3

глутамін | + | 27.10.5* | 30.60.3* | 33.71.1* | 35.91.2*

_ | 17.61.0 | 19.80.4 | 21.10.6 | 24.70.3

*- р 0.05 – вірогідно відносно відповідних величин без НДМА

Гіпоксантин через реутилізаційний шлях обміну пуринів може поліпшувати енергозабезпечення клітин, що необхідно і для синтезу NO, сечовини і для утилізації іонів амонію [Дмитренко М.П., 1991]. Ефектор викликає дозозалежну загибель макрофагів, яка супроводжується накопиченням NO, іонів амонію і, в меншій мірі, сечовини. Таку цитотоксичну дію гіпоксантину можна пояснити тим, що він служить субстратом ксантиноксидазної реакції, одним з продуктів якої є супероксид з сильною ушкоджуючою дією на клітини [Хіа Y.,1997], здатністю блокувати подальше використання утворених метаболітів: оксиду азоту, іонів амонію, сечовини. При сумісній дії гіпоксантину та НДМА цитотоксичний ефект на макрофаги менше, ніж адитивний, що, на нашу думку, можна пояснити конкуренцією за мішені дії.

При внесенні в середовище інкубації макрофагів валіну - інгібітору аргінази [Chang C.I.,1998], в концентрації 16 мМ як в присутності НДМА, так і без нього, зафіксовано зниження вмісту сечовини в 4.5 рази та іонів амонію - в 1.9 рази. Валін, не впливаючи на загибель макрофагів в присутності НДМА, сам проявляє високу цитотоксичність: загибель клітин збільшується в 1.8 раз. Присутність валіну в культуральному середовищі суттєво не відбивалась на рівні утворення оксиду азоту макрофагами.

Таким чином, проведеними нами дослідженнями встановлено, що такі метаболіти як оксид азоту, іони амонію, сечовина відіграють певну регуляторну роль в механізмі цитотоксичної дії НДМА. Посилення утворення іонів амонію і сечовини найбільш інтенсивно відбувається на першу годину інкубації і характеризує ранні прояви загибелі клітин. Модуляція рівня оксида азоту в клітинах не визначає життєздатність клітин до дії НДМА.

Вивчення особливостей утворення НДМА з амідопірину при дії нітрозуючих агентів екзогенного і ендогенного походження. Проведені дослідження вказують на високу цитотоксичну дію НДМА in vitro. Враховуючи значну небезпеку N-нітрозосполук, доцільним було з’ясувати можливість утворення та накопичення НДМА в організмі за умов, сприятливих для його синтезу.

Встановлено, що значне підвищення ендогенного утворення у щурів НДМА з амідопірину - попередника НДМА, відбувається при дії екзогенних нітрозуючих агентів - інгаляції оксидів азоту і внутрішньошлункового введення нітриту натрію. Створення умов для підсилення ендогенного синтезу оксиду азоту шляхом введення тваринам вакцини БЦЖ не позначилося на синтезі НДМА. При введенні нітриту натрію та алопуринолу, який зменшує генерацію вільних радикалів, спостерігається збільшення вмісту НДМА в крові щурів. Це, можливо, пояснюється тим, що в умовах інгібування алопуринолом ксантиноксидази зменшується синтез О2-. При цьому окислення нітриту в малореактогенний нітрат, що виводиться з організму з сечею, відбувається менш інтенсивно, і створююються умови для відновлення нітриту в NO, що має більш високі нітрозуючі властивості.

Враховуючи вплив антропогенних чинників на ендокринну систему та зростаючу кількість хворих на цукровий діабет, представляло інтерес дослідити ендогенне утворення НДМА при дії екзогенних нітрозуючих факторів на фоні експериментального стрептозотоцинового діабету. Діабет характеризується різносторонніми та сильно вираженими порушеннями обміну, при яких можуть виникати умови, що впливають на утворення та накопичення НДМА. Рівень НДMA визначали в сечі щурів. Інгаляція оксидами азоту з попереднім пероральним введенням амідопірину та піразолу - інгібітору ізоформ цитохрому Р450, відповідних за процес біотрансформації N-нітрозосполук, призводить до появи в сечі НДМA, кількість якого у діабетних тварин нижча в 1.4 рази, ніж у контрольних. В сечі діабетних щурів, які не отримували піразол, визначаються лише слідові кількості НДМA при тому, що в сечі контрольних тварин його вміст знижений в 1.7 рази, але залишається суттєвим.

Результати проведених досліджень по визначенню N-деметилюючої та денітрозуючої активності цитохрому Р-450 в печінці щурів вказують на те, що у тварин із стрептозотоциновим діабетом у порівнянні з інтактними тваринами при незмінному рівні денітрозування спостерігається зниження N-деметилюючої активності. Інгаляція тваринам оксидів азоту приводить до зниження на 20-25% денітрозуючої активності як у інтактних тварин, так і у тварин із діабетом. Введення тваринам піразолу та амідопірину за 1 год. до інгаляції оксидами азоту приводить до зниження активності як у дослідних, так і у інтактних тварин: на 33% та 22 % N-деметилюючої активності; на 53 % та 45 % денітрозуючої активності, відповідно.

Отримані дані вказують на те, що у щурів із стрептозотоциновим діабетом ендогенний синтез НДМА з попередників значно уповільнений.

Аналіз результатів досліджень, проведених в експериментах in vivo, свідчить, що значного накопичення N-нітрозосполук в організмі не відбувається навіть за умов, що сприяють їх ендогенному синтезу або посиленому надходженню з довкілля. Тому визначення підвищеного вмісту НДМА не може стати біомаркером небезпечності N-нітрозосполук. Небезпека впливу на організм НДМА та інших N-нітрозосполук полягає, очевидно, в швидкості їх обміну, коли біотрансформація не є лімітуючою ланкою і визначає загальні токсичні ефекти.

ВИСНОВКИ

1. N-нітрозосполуки є поширеними антропогенними забруднювачами довкілля. Однією з цих сполук є N-нітрозодиметиламін (НДМА), біохімічний механізм дії якого на клітини імунної системи вивчений недостатньо. Проведені нами дослідження механізму цитотоксичної дії НДМА на перитоніальні макрофаги щурів in vitro показали, що цитотоксична дія НДМА пов’язана з його біотрансформацією цитохромами Р-450 і залежить від стану обміну оксиду азоту в клітині. В процесі загибелі макрофагів денітрозуюча та N-деметилююча активність цитохрому Р-450 зазнає змін, що мають свої особливості в залежності від стартового функціонального стану клітин. В дослідах in vivo показано, що у щурів утворення НДМА з амідопірину відбувається при дії екзогенних нітрозуючих агентів; значно уповільнений синтез, а також біотрансформація цієї сполуки у щурів із стрептозотоциновим діабетом.

2.Введення щурам вакцини БЦЖ (1 мг/100 г маси тіла) призводить до збільшення в перитоніальному ексудаті кількості макрофагів, до інтенсифікації процесів біосинтезу білку в них, про що свідчить збільшення величини співвідношення РНК/ДНК, а також до утворення активних форм кисню і збільшення активності ферментів креатинкінази та аденозиндезамінази. Активовані БЦЖ макрофаги в порівнянні з неактивованими значно інтенсивніше синтезують оксид азоту, особливо під впливом сполук, що містять гуанідинову групу: аргінін, креатин, креатинфосфат, гуанідиноцтова кислота, - а також глутаміну і гіпоксантину.

3.Дослідженнями дозово-часової залежності загибелі перитоніальних макрофагів при дії дексаметазону та НДМА in vitro встановлено, що загибель макрофагів, індукована цими сполуками, відбувається однотипно; активовані макрофаги є більш стійкими до цитотоксичної дії НДМА, ніж неактивовані.

4.В процесі загибелі макрофагів при дії N-нітрозодиметиламіну денітрозуюча та N-деметилююча активність цитохрому Р-450 змінюється в залежності від функціонального стану клітин: в активованих макрофагах знижується денітрозуюча активність і не змінюється N-деметилююча, в неактивованих - денітрозуюча активність зростає, а N-деметилююча суттєво не змінюється. Інгібітор цитохромів Р-450 піразол значно пригнічує біотрансформацію НДМА та підвищує стійкість макрофагів до його цитотоксичної дії.

5.Розроблено і апробовано метод in vitro прямого визначення участі оксиду азоту в механізмі цитотоксичної дії хімічних сполук. Цим методом встановлено, що токсичність НДМА не обумовлена метаболічним денітрозуванням, в той час як нітропрусид натрію і нітрогліцерин здійснюють свою цитотоксичну дію безпосередньо через оксид азоту.

6.Оксид азоту, іони амонію, сечовина, не являючись активними учасниками механізму розвитку загибелі перитоніальних макрофагів, відіграють певну регуляторну роль в механізмі цитотоксичної дії НДМА. Утворення іонів амонію і сечовини значно зростає на першу годину інкубації і характеризує ранні прояви загибелі клітин.

7.У дослідах in vivo встановлено, що утворення НДМА з амідопірину у щурів відбувається при дії екзогенних нітрозуючих агентів – оксидів азоту та нітриту натрію, швидкість синтезу цієї N-нітрозосполуки особливо збільшується при введенні тваринам інгібітору ксантиноксидази алопуринолу. Інтенсивність утворення НДМА суттєво не змінювалась при посиленні ендогенного синтезу оксиду азоту.

8.За умов стрептозотоцинового діабету у щурів знижується N-деметилююча активність цитохрому Р-450 в печінці та ендогенне утворення НДМА з попередників.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.