АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ІМУНОЛОГІЇ ІМ. І.І.МЕЧНИКОВА

шевчук наталя Миколаївна

УДК 582.282.23:615.28

ПОРІВНЯЛЬНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ АНТИМІКРОБНОЇ АКТИВНОСТІ І ВЛАСТИВОСТЕЙ НОВИХ АНТИСЕПТИЧНИХ ПРЕПАРАТІВ

03.00.07 - мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Харків – 2003

Дисертація є рукописом

Робота виконана в Вінницькому національному медичному університеті
ім. М.І. Пирогова МОЗ України

Науковий керівник - заслужений діяч науки і техніки України доктор медичних наук, професор Г.К.Палій, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології Вінницького національного медичного університету ім. М.І.Пирогова МОЗ України

Офіційні опоненти:

-

-

Провідна установа: Інститут епідеміології і інфекційних хвороб
ім. Л.В.Громашевського АМН України

Захист дисертації відбудеться “ 4 ” березня 2004 р. о 11.00 годині на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д 64.618.01 при Інституті мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України (61057, м.Харків, вул. Пушкінська, 14)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України, 61057, м.Харків, вул. Пушкінська, 14.

Автореферат розісланий “ 15 ” січня 2004 р.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради

кандидат медичних наук С.В.Бруснік

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. На початку двадцять першого століття набуло поширення вивчення антисептичних препаратів, що об’єднані терміном антисептика, який є найбільш поширеним і доступним методом лікування і профілактики місцевих інфекційних процесів і сепсису. Зараз для лікування інфекційних та гнійно-запальних захворювань провідна роль належить новим поколінням антибіотиків і сульфаніламідних препаратів. Це зумовлено тим, що за останні десять років відкриті і впроваджені в медичну практику нові групи антибіотичних препаратів.

Значно поширилась уява про механізми дії антибіотиків на молекулярному рівні, про природу лікарської стійкості мікроорганізмів. Потрібно додати, що вдалось вдосконалити лабораторні методи визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків, антисептиків вивчення кінетики всмоктування та розподілу препаратів в умовах різних патологічних станів хворих (Ю.Л.Волянський, 1991; В.М.Мороз, Г.К.Палій, 2000.).

Проте в значній мірі ефективному використанню антибіотичних засобів сьогодні перешкоджає формування резистентності збудників хвороб до цих препаратів. Ряд дослідників вважають, що в лікуванні і профілактиці місцевих інфекцій пріоритет потрібно віддавати антисептикам або антибіотикам, які задовольняють вимоги, що висувають до антисептиків.

Доцільно констатувати, що в розробці проблеми антисептики мають місце досягнення. Одержано декілька класів нових хімічних антисептиків. Встановлені частота, причини та умови мікробної контамінації готових лікарських форм антисептиків. В медичну практику впроваджені полімерні антисептики. Вже розроблено доступні для практики методи визначення резистентності клінічних штамів бактерій до антисептиків. В Україні впроваджено в медичну практику біля 20 нових антисептичних препаратів, до яких повільно формуються резистентні варіанти збудників (Г.К.Палій, В.М.Мруг, 1991; І.Г.Палій, В.П.Ковальчук, 2000; Ю.Л.Волянський і співавт., 1991 та ін).

Головною негативною стороною антибактеріальної терапії є набуття мікроорганізмами стійкості до антибіотиків, які проявляли високу ефективність до інтенсивного їх поширення в медичній практиці. Особливо великого значення набули антибіотикорезистентні штами стафілококу. Проблема лікування стафілококових захворювань набула великої ваги.

Найбільш раціональним шляхом вирішення назрілих проблем – пошук нових антибактеріальних препаратів, які діють на антибіотикостійкі штами мікроорганізмів. До таких протимікробних препаратів потрібно віднести вітчизняні лікарські засоби декаметоксин, мірамістін, етоній, декамін, похідні фенолів, хінолінів, які характеризуються широким антимікробним спектром і низькою токсичністю (В.Т.Чумак, 2000).

Значну увагу в двадцять першому столітті дослідники приділяють пошуку, розробці лікарських форм антисептиків, які тривалий час створюють високі діючі концентрації антимікробних препаратів у гнійно-запальних вогнищах. Сюди належать м’які антимікробні лікарські форми мазі, які мають лікувальні властивості різнонаправленої дії. В мазі закладена можливість постійного вдосконалення як самих лікарських препаратів, так і методів лікування хворих (Т.И.Тамм, 1997; Б.М.Даценко і співавт., 2002; та ін). Розробка та впровадження МЛФ у вигляді антисептичних мазей на гідрофільній основі відкриває сприятливі умови для забезпечення вітчизняного ринку лікарськими антимікробними засобами.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом планової науково-дослідної тематики кафедри мікробіології, вірусології, імунології Вінницького національного медичного університету ім. М.І.Пирогова “Клініко-лабораторне дослідження властивостей та промислове впровадження нових лікарських засобів на основі декаметоксину, рекомбінантного інтерферону” (№ державної реєстрації 0198U002709).

Мета і задачі дослідження. Мікробіологічна характеристика антисептичних препаратів і експериментальне обгрунтування застосування антисептичної мазі для профілактики і лікування стафілококової ранової інфекції.

Виходячи з поставленої мети визначені такі основні завдання дослідження:

1.

2.

3.

4.

Об’єкт дослідження – Антисептичні засоби. Музейні та клінічні штами мікроорганізмів.

Предмет дослідження – антимікробна дія та біологічні властивості нових антисептичних препаратів.

Методи дослідження. Мікробіологічні (визначення протимікробних властивостей антисептичних препаратів, виділення чистих культур мікроорганізмів), біохімічні (ідентифікація бактерій), фізико-хімічні (властивості, стабільність антимікробних засобів), математико-статистичні (статистичний аналіз результатів дослідження).

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше було вивчено мікробіологічну характеристику трьох нітронів арілхінолілів і мазей з декаміном, декаметоксином, етонієм, мірамістіном. Встановлено, що протимікробна дія антисептичних препаратів залежала від несприятливих фізичних, хімічних, біологічних умов. Доведено особливості формування резистентних варіантів стафілококів, ешерихій. Вперше розроблено методики якісного та кількісного визначення стабільності, складових компонентів у мазі палісепт. Вперше в експерименті і клініці вивчено особливості перебігу стафілококових уражень шкіри після місцевих аплікацій палісепту. Доведено доцільність клінічного застосування антисептичного засобу палісепт при мікробних ураженнях шкіри.

Практичне значення одержаних результатів. Визначено рівень чутливості до антибіотиків стафілококів, виділених від хворих з гнійно-запальними захворюваннями. Встановлено, що мазі декаметоксину, етонію, мірамістіну, препарати нітронів арілхінолілів мають високу активність до гноєтворних коків, ентеробактерій, спорових аеробних сапрофітів. Матеріали експериментальних досліджень мазі з декаметоксином включені до АНД. Створено промисловий технологічний регламент, ТФС 42У-60-191-96 на виробництво мазі декаметоксину медичною промисловістю.

Дослідно-промисловий регламент на виробництво мазі палісепт №02010669:13328191 затверджено технологічною комісією ДНЦЛЗ України 26.06.1996 р. (протокол №32). Фармакологічний комітет МОЗ України, затвердив інструкцію, дозволив медичне застосування для лікування хворих та промислове виробництво мазі палісепт 29.06.1995 р. (протокол №6).

Результати роботи впроваджено в навчальний процес на кафедрах мікробіології, вірусології, імунології; загальної хірургії; терапевтичної стоматології; дерматології Вінницького національного медичного університету ім. М.І.Пирогова, кафедрах мікробіології Національного фармацевтичного університету України, Буковинської державної медичної академії, Тернопільської державної медичної академії ім. І.Я.Горбачевського, кафедрі клінічної мікробіології та імунології Харківської державної медичної академії післядипломної освіти.

Особистий внесок здобувача. Автор самостійно здійснила пошук і аналіз літературних джерел. Дисертант виконала порівняльне дослідження протимікробної активності НАХ, мазі палісепт; вивчила особливості формування резистентності у мікроорганізмів до антимікробних препаратів. Автор визначила фізико-хімічні властивості мазі палісепт, вивчила стабільність цього лікарського засобу в процесі тривалого зберігання. Вона дослідила на тваринах ефективність аплікацій мазей в експерименті на моделі інфікованої рани; узагальнила результати клінічного дослідження лікарського препарату мазь палісепт. Самостійно виконала статистичну обробку одержаних даних, сформулювала висновки та практичні рекомендації. У наукових працях в співавторстві їй належить фактичний матеріал, одержаний нею під час проведення досліджень.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідались і обговорені на університетських підсумкових конференціях молодих вчених ВНМУ ім. М.І.Пирогова (2000, 2001, 2003), міжнародній науковій конференції “Стратегія і тактика боротьби з інфекційними захворюваннями” (Харків, 2001, 2003), науковій конференції “Нові технології отримання і використання біологічно активних речовин” (Алушта, Крим, 2002.), науковій конференції “Розвиток санітарної мікробіології в Україні” (Чернівці, 2002), науково-практичній конференції з міжнародною участю “Актуальні питання стратегії, тактики застосування та дослідження антисептиків, антибіотиків” (Вінниця, 2002).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 10 наукових робіт, серед них 5 статей в наукових фахових журналах та 5 в збірниках конференцій, симпозіумів.

Обсяг та структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 191 сторінці машинописного тексту, містить вступ, огляд літератури, розділ матеріали і методи досліджень, 4 розділи власних досліджень, розділ аналіз та узагальнення результатів дослідження, висновків та практичних рекомендацій. Список використаних джерел літератури налічує 317 джерел вітчизняних і зарубіжних авторів. Робота ілюстрована 28 таблицями і 22 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження.

В дисертаційній роботі подано результати дослідження властивостей трьох хімічних сполук нітронів N-арілхінолілів, мазі палісепт, що містить декаметоксин, в порівнянні з мазями декаміну, етонію та мірамістіну, які володіють протимікробною дією.

Нітрониарілхіноліли являють собою дрібнокристалічні порошки темно-фіолетового кольору з металевим блиском, гіркі на смак, які розчиняються в етанолі, не розчиняються в ефірі, бензолі.

Декаметоксин (Decamethoxinum). 1,10-Декаметилен-біс (диметилментокси-карбонілметил) амонію хлорид відносять до сучасних високоактивних і швидкодіючих лікарських антимікробних засобів. Він має приємний запах. ДК описують як білий дрібнокристалічний порошок з характерним слабким запахом. Ця лікарська речовина належить до препаратів чотирьохвалентного азоту, які легко розчиняються в воді, етанолі, не розчинні в ефірі.

Етоній має вигляд білого кристалічного порошку з характерним запахом. Препарат легко розчиняється у воді.

В роботі проведено порівняльне дослідження декаміну (Decaminum). 1,10-Декаметилен-біс-(4-амінохінальдіній)-хлорид білий з кремовим або жовтим відтінком порошок, без запаху, гіркий на смак. Мало розчиняється у воді і етанолі. ДМ відносять до бісчетвертинних амонієвих сполук.

Мірамістін. Бензилдимітін3-(мірістиламіно)пропіл амоній хлорид Порошок. Водний розчин мірамістіну (МР) являє собою прозору безбарвну речовину, без запаху. Антимікробна активність МР зменшується при зберіганні в звичайних умовах. МР не руйнується при кип’ятінні та автоклавуванні.

Для виробництва мазі палісепт використовували різні крохмалі, а саме: картопляний (Amilum Solani), пшеничний (Amilum Tritici), кукурудзяний (Amilum Maydis).

Для виготовлення гідрогелевої основи мазі використовували трьохатомний спирт гліцерин (Glicerinum). СН2(ОН)-СН(ОН)-СН2(ОН). Емпірична формула С3Н8О3. Гліцерин відповідав ФС 42.2202-84, і являв собою прозору безбарвну, гігроскопічну речовину солодку на смак, без запаху. Гліцерин добре змішувався з водою, етанолом (95о) у всіх співвідношеннях. Погано розчинявся в ефірі, хлороформі, жирних, летючих маслах.

Методика приготування мазі палісепт включала наступні основні етапи: виготовлення (варка) гідрогелевої основи, введення декаметоксину в основу; гомогенізація (перемішування), стандартизація, фасування.

Крохмально-гліцеринова гідрогелева мазева основа містить 7% крохмальний розчин, виготовлений на гліцерині. Така мазь не залишає жирних слідів на одязі, білизні, легко змивається з шкіри тощо. Неможливість довгочасного зберігання мазей на гідрогелевій основі через мікробну контамінацію раніше слугували причиною обмеженого застосування цієї основи. Стабільність мазевих основ можливо підвищити за допомогою антисептичних лікарських препаратів, які попереджають розмноження мікроорганізмів, що контамінують мазеві основи.

Встановлено, що в процесі виготовлення мазі необхідно визначати в ній вміст води та гліцерину. Проте, всі методи визначення води в основі трудоємкі, недоступні для виробництва, або не можуть використовуватись для гідрогелевої основи. Нами розроблено і впроваджено методики визначення вмісту гліцерину і відповідно води рефрактометричним методом, по показнику заломлення. Для аналізу нами було виготовлено п’ять модельних зразків мазі з точним вмістом інгредієнтів, в першу чергу гліцерину. Дослідження були проведені по безпосередньому визначенню показника заломлення мазей, виготовлених на різних основах. На призму рефрактометра ІРФ-22 наносили невелику кількість мазі і визначали nD за рекомендаціями ДФ СРСР. Для оцінки якості лікарського препарату мазь палісепт було проведено визначення рН свіжовиготовлених мазей на різних крохмалях та таких, що зберігались протягом двох років.

Дослідження в’язкості антимікробних мазей палісепту, ЕТ, МР, ДМ проводили у відповідності з фізичним законом Стокса. Залежність в’язкості від концентрації лікарських антисептичних препаратів досліджували в порівнянні з крохмально-гліцериновою основою. Досліди проводили з температурою води 36оС і 40оС в зовнішньому циліндрі.

Коефіцієнт поверхневого натягу досліджуваних антисептичних мазей палісепту ДМ, ЕТ, МР визначали у розплавлених лікарських препаратів і порівнювали з поверхневим натягом води в одному твердому контурі, яким служила золота пластинка.

Вивчення концентрації антимікробних препаратів в рідинах організму відносять до основних параметрів, які визначають ефективність антисептикотерапії та антисептикопрофілактики. Результати дослідження особливостей вивільнення антисептиків з м’яких лікарських форм (мазі, креми, супозиторії) є основною для розробки методик лікування хворих, які забезпечують безпеку терапії і лікувальний ефект.

Вивільнення антисептиків з мазі визначали за допомогою методу діалізу. При цьому вимірювали концентрацію досліджуваних антисептиків в діалізаті. Досліди виконували на приладі Мюллемана. Досліджували мазі, що містили різні концентрації ДК, ЕТ, МР (0,05 %; 0,1 %; 0,5 %). Дослід тривав 7 годин. Через кожну годину проводили взяття проби діалізату (1 год; 2 год; 3 год; 4 год; 5 год; 6 год; 7 год.). Потім визначали в ній концентрації антисептиків ДК, ЕТ, ДМ, МР.

Для вивчення протимікробної дії тринітронів арілхінолілазометинів, мазей палісепт, ЕТ, ДМ, МР використовували музейні та клінічні штами, які виділено від хворих з гнійно-запальними захворюваннями. Дослідження проводили на грампозитивних, грамнегативних бактеріях різних таксономічних груп, дріжджоподібних грибах роду Candida.

Визначення чутливості стафілококів до антибіотиків проводили по загальновживаній методиці дифузії в агар (метод дисків) в максимально стандартних умовах дослідів. В дослідженнях було задіяно 22 музейних штамів мікроорганізмів та 93 штами було виділено від людей з різними гнійно-запальними захворюваннями, яких достатньо для математико-статистичного аналізу результатів.

Для визначення чутливості мікроорганізмів до антимікробних препаратів використовували метод двократних серійних розведень в рідкому поживному середовищі. Під час дослідів ставили контроль середовища на стерильність, контроль досліджуваних антисептиків. Всі досліди повторювали три рази з кожним мікроорганізмом і препаратом.

На рівень чутливості мікробів до лікарських засобів впливають в значній мірі рН поживного середовища, величина посівної дози мікроорганізмів, умови культивування, розчинність, стабільність досліджуваного препарату. Протимікробну активність препаратів вивчали при різних значеннях рН поживного середовища (6,0; 7,2; 8,0); різному мікробному навантаженні на 1 мл.

Досліджували утворення стійких форм стафілококу до палісепту (ДК), нітронів (1; 2; 3). Досліди виконували на S.aureus АТСС 25923, S.aureus 21, E.coli АТСС 25922. Всі досліди ставили тричі. Пасування стафілококів, кишкових паличок проводили в присутності зростаючих концентрацій антимікробних лікарських препаратів. Всього було проведено 50 пасажів. Через 10 пасажів бактерій в присутності антимікробних препаратів вивчали культуральні, морфологічні, тинкторіальні властивості тест-штамів та їх чутливість до антисептиків ДК, нітронів (1; 2; 3).

Досліди по визначенню специфічної лікувальної дії мазі палісепт виконували на 40 здорових морських свинках. Експериментальні рани у тварин створювали за загальновживаною методикою. Через 2 доби в центр зони некротичного утворення вводили 1 мл бактеріальної суспензії в концентрації 2 млрд КУО S.aureus 209. Вогнища інфікованих ран піддослідних тварин змазували 2 рази в день (ранок, вечір) мазями палісепту, етонію, мірамістіну. Тривалість місцевого лікування продовжували в дослідних і контрольній групах протягом 6-10 днів. Одержані числові матеріали обробляли методом варіаційної статистики на комп’ютері ІВМ PS/АТ 386 з використанням пакету програм Statgraf. Показник вірогідності розраховували по t – критерію Стюдента.

Результати власних досліджень в 3 – 6 розділах.

1. Оцінка властивостей антимікробних препаратів. В роботі наведено визначення протимікробної дії 3 нових сполук нітронів в порівнянні з декаметоксином (табл. 1.). Нітрони з шифром 1, 2, 3 та ДК проявляли мікробоцидну

Таблиця 1

Антимікробна активність нових нітронів N-арілхінолілазометінів, ДК, ДМ (мкг/мл)

Мікроорганізми | Кіль-кість штамів | Препарат 1 | Препарат

2 | Препарат 3 | ДК | ДМ

Мінімальна мікробоцидна концентрація

1 | 2 | 4 | 5 | 6 | 3 | 7

S.aureus 209 P | 1 | 0,12 | 0,97 | 1,95 | 0,24 | 0,97

S.albus Wood-46 | 1 | 0,48 | 0,97 | 1,95 | 0,24 | 0,97

S.aureus ATCC 25923 | 1 | 0,48 | 3,9 | 7,8 | 0,48 | 1,95

S.aureus | 26 | 0,48-15,6 | 1,95-31,25 | 1,95-31,25 | 0,48-7,8 | 0,97-15,6

S.epidermidis | 19 | 0,24-7,8 | 1,95-15,6 | 3,9-31,25 | 0,48-15,6 | 1,95-31,25

S.saprophyticus | 14 | 0,24-7,8 | 0,97-7,8 | 3,9-31,25 | 0,48-3,9 | 0,48-15,6

S.faecalis | 1 | 3,9 | 15,6 | 15,6 | 7,8 | 15,6

E.coli ATCC 25922 | 1 | 7,8 | 31,25 | 62,5 | 15,6 | 62,5

E.coli O-124 | 1 | 15,6 | 62,5 | 62,5 | 31,25 | 31,25

E.coli M-17 | 1 | 15,6 | 125 | 125 | 62,5 | 125

S.typhi | 1 | 31,25 | 125 | 125 | 62,5 | 125

S.typhimurium | 1 | 31,25 | 125 | 125 | 62,5 | 125

C.diphtheriae | 1 | 7,8 | 31,25 | 31,25 | 3,9 | 31,25

K.pneumoniae | 1 | 62,5 | 125 | 125 | 31,25 | 62,5

M.lisodeiticus | 1 | 7,8 | 15,6 | 15,6 | 7,8 | 15,6

Y.enterocolitica | 2 | 15,6 | 31,25 | 15,6 | 3,9 | 15,6

P.vulgaris | 2 | 250 | 500 | 500 | 125 | 500

P.mirabilis | 1 | 250 | 500 | 500 | 125 | 500

P.aeruginosa ATCC 27853 | 1 | 500 | 500 | 500 | 250 | 500

Sh.flexneri | 1 | 31,25 | 62,5 | 62,5 | 15,6 | 62,5

P.aeruginosa | 11 | 500 | 500 | 125 | 250 | 500

B.megaterium | 1 | 7,8 | 250 | 62,5 | 7,8 | 31,25

B.subtilis 25 | 1 | 7,8 | 31,25 | 31,25 | 7,8 | 31,25

C.albicans АТСС 27853 | 1 | 31,25 | 62,5 | 62,5 | 15,6 | 62,5

C.albicans 590 | 1 | 7,8 | 31,25 | 62,5 | 7,8 | 62,5

C.albicans 690 | 1 | 7,8 | 62,5 | 62,5 | 15,6 | 62,5

C.tropicales 85 | 1 | 15,6 | 62,5 | 62,5 | 15,6 | 62,5

E.кaufman-wolf | 1 | 62,5 | 250 | 500 | 31,25 | 125

T.gypseum | 1 | 31,25 | 250 | 125 | 15,6 | 62,5

A.niger | 1 | 500 | 1000 | 1000 | 500 | 1000

A.sydowi | 1 | 500 | 1000 | 1000 | 500 | 1000

C.albicans | 15 | 31,25 | 31,25-62,5 | 62,5 | 7,8-31,25 | 15,6-62,5

дію по відношенню до 115 штамів музейних і виділених від хворих культур мікроорганізмів. Високу мікробоцидну дію препарати проявляли на стафілококи (0,12-31,25 мкг/мл), фекальний стрептокок (3,9-15,6 мкг/мл), M.lisodeiticus (7,8-15,6 мкг/мл), спорові сапрофіти (7,8-62,5 мкг/мл), дріжджоподібні гриби роду Candida (7,8-62,5 мкг/мл).

Сполука нітрону з шифром № 1 по мікробоцидній активності на грампозитивні бактерії (стафілокок, фекальний стрептокок, паличка дифтерії, M.lisodeiticus, спорові сапрофіти, C.albicans) діяла на рівні ДК. Препарати № 2; 3 проявляли меншу мікробоцидну активність в порівнянні з нітроном № 1, ДК. Подібну закономірність виявили у препарату з шифром № 1, ДК досліджуючи мікробоцидну активність по відношенню до грамнегативних бактерій.

Наступним етапом було дослідження антимікробної активності нової антисептичної мазі палісепт в порівнянні з аналогічними антисептичними мазями, які місять антимікробні препарати ЕТ, МР, ДМ. На основі одержаних результатів доцільно підкреслити, що нова антисептична мазь палісепт переважає по рівню мікробоцидної активності для 115 штамів мікроорганізмів антимікробні мазі ЕТ, МР, ДМ.

Поширення стійких до антибіотиків, антисептиків штамів стафілокока висуває необхідність розробки нових антисептичних антистафілококових препаратів, в тому числі у формі мазей. Вирішенню цього завдання буде сприяти порівняльне дослідження чутливості клінічних антибіотикорезистентних штамів стафілококу до антисептичних мазей палісепту, ЕТ, МР та препарату нітрону 1.

На увагу заслуговують дослідження дозової чутливості штамів стафілокока до антисептичної мазі, що містила ДК. Доведено, що МБцК ДК для антибіотикорезистентних стафілококів знаходилась в межах від 0,48 мкг/мл (8,5% штамів) до 31,25 мкг/мл. Для нітрону 1 у 98% штамів, для ДК для 84,8% штамів бактерицидний ефект знаходився в діапазоні від 0,97 мкг/мл до 7,8 мкг/мл цих антисептиків. Результати цих досліджень дозволяють стверджувати, антибіотикорезистентні штами стафілокока мають високу чутливість до антисептичних препаратів. Проте, ЕТ, МР уступають в антимікробній активності ДК, нітрону 1.

2. Протимікробна дія антисептичних препаратів в несприятливих умовах. Взаємодія мікроорганізмів і антисептиків в умовах макроорганізму в присутності факторів, які можуть впливати на активність антимікробних препаратів, може змінюватись в широких межах. Тому було цікавим вивчити вплив рН середовища, мікробного навантаження і зміни вмісту білків сироватки крові на антимікробну активність препаратів.

Результати визначення протистафілококової активності досліджуваних препаратів при різному рН показали, що антистафілококова бактерицидна активність ДК, синтетичних сполук нітронів при рН 7,2 поживного середовища знаходилась в межах 0,48-31,25 мкг/мл.

Дослідження антистафілококової бактерицидної концентрації цих препаратів при рН 6,0 і 8,0 поживного середовища показали, що протимікробна дія антисептиків зменшувалась у 2-4 рази в порівнянні з контролем. На підставі сказаного вище нітрони 1, 2, 3; ДК можна віднести до препаратів, які проявляють високу бактерицидну активність в кислому і лужному середовищі по відношенню до антибіотикорезистентних штамів стафілококу.

Для антисептиків дуже важливою вимогою є збереження знезаражуючої активності антисептиків в біологічних рідинах організму, тому нами проведено більш глибокий скринінг нітронів в порівнянні з ДК на поживному середовищі, що містило 10%, 20% сироватки крові. Встановлено, що в присутності сироватки (10%, 20%) спостерігали зменшення антистафілококової бактерицидної активності нітронів 1, 2, 3 та препарату порівняння. Проте, МБцК всіх препаратів залишалась вищою ніж необхідно для лікувальних цілей.

Нами вивчено залежність бактерицидної дії 3 нітронів арилхінолілів, ДК від дози мікробного навантаження в поживному середовищі. Збільшення посівної дози бактерій до 109 знижувало бактерицидну активність ДК у 4-8 разів для стафілококів і у 2-4 рази для кишкових паличок. У хімічних сполук нітрони 1, 2 в аналогічних умовах бактерицидна активність зменшувалась в 4-16 разів. Більш суттєве зменшення було зареєстровано у сполуки нітрон 3.

В серії досліджень було вивчено особливості формування стійких до антисептичних препаратів (ДК, нітрони 1, 2, 3) варіантів стафілококів та кишкової палички. Протягом дослідження виконано 50 пасажів на МПБ в присутності суббактеріостатичних концентрацій ДК (препарат порівняння), нітронів 1; 2; 3.

Стійкість до ДК у стафілококів і ешерихій розвивалась повільно в процесі пасажування їх на МПБ. Так, у стафілококів протягом 10 пасажів чутливість їх до цього антисептика не змінилась. Протягом наступних 10 пасажів чутливість до ДК у стафілококів зменшилась у 4 рази. Лише після 50 пасажів стійкість стафілококів збільшилась у 64 рази (рис. 1; 2).

Доведено, що протягом 10 пасажів E.coli ATCC 25922 на МПБ з ДК її чутливість змінилась у 2 рази. Протягом наступних 40 пасажів стійкість ешерихій до ДК збільшилась у 64 рази. Тобто, резистентність ешерихій формувалась повільно і особливостей стрибкоподібного утворення DKR-варіантів E.coli не встановлено. Можна допустити, що для ДК характерно повільне утворення DKR-варіантів стафілококів і ешерихій.

Потрібно констатувати, що формування стійкості до нітрону 1 проходило повільно і не досягло високих величин. Після 20 пасажів чутливість коків знизилась у 8 разів (у 2 рази більше ніж у препарату порівняння – ДК).Після 40 пасажів стафілококів з нітроном 1 в МПБ стійкість до антисептика збільшилась у 32 рази, після 50 пасажів – у 128 разів:

Необхідно підкреслити, що для E.coli ATCC 25922 МБсК нітрону 1 була 3,9 мкг/мл в контролі. Після пасажування протягом 20 пасажів стійкість ешерихій збільшилась у 4 рази. В процесі подальшого пасажування протягом 50 пасажів виявлено стрибкоподібне збільшення стійкості у 64 рази, що в 2 рази менше ніж у препарату порівняння ДК.

Формування резистентності до нітронів 2, 3 у стафілококів проходило аналогічно подібному процесу як у нітрону 1, але у 2 рази швидше ніж у препарату порівняння ДК. В присутності нітронів 2, 3 у E.coli ATCC 25922 розвиток стійкості характеризувався повільністю. Проте необхідно відмітити, що після 50 пасажів ешерихій мінімальна бактеріостатична доза нітрону виросла у 256 раз в порівнянні з контролем. Для ешерихій після 50 пасажів МБсК нітрону 3 збільшилась у 128 разів по відношенню до контролю.

3. Фізико-хімічна характеристика мазі палісепт. Для розробки антисептичних мазевих препаратів є важливим зробити підбір оптимальних концентрацій лікарських препаратів для забезпечення їх високої специфічної активності по відношенню до збудників захворювань та комфортність для організму хворого. Для створення мазі палісепт використовували крохмально-гліцеринову основу.

В медичній практиці застосовують лікарські форми антисептиків, які тривалий час стабільно зберігають специфічну дію, фізико-хімічні властивості, що дозволяє виготовляти ці ліки в промислових масштабах. Виходячи зі сказаного, вивчали тричі 5 серій препарату протягом двох років: зовнішній опис палісепту, тотожність по чотирьох параметрах, рН, однорідність, масу вмісту пакування; вміст ДК в 1 г препарату; терміни зберігання мазі, відхилення від вимог АНД.

Кількість ДК в мазі палісепт залишалась стабільною протягом всього терміну зберігання і знаходилась в 1 г препарату в межах 0,000900-001088 г; рН палісепту протягом двох років знаходилась в межах 5,5-6,4, що необхідно вважати оптимальним для вогнищ уражень.

Наявність в’язкості в палісепту попереджує седиментацію субстанції лікарських препаратів ДК, ЕТ, МР, ДМ. Одержані дані показали, що різні субстанції (ДК, ЕТ, МР, ДМ) суттєво не впливали на в’язкість мазей, що підтвердило гарні фізичні властивості цих лікарських препаратів.

Для всебічної оцінки нової антисептичної мазі палісепт вивчали швидкість вивільнення ДК з препарату (рис. 3.). Найменший відсоток ДК (7,6) дифундував за 6 годин з 0,05% мазі. Збільшення концентрації ДК у мазі в 10 разів супроводжувалось прискоренням швидкості його проникнення через мембрану до 11,8% через 6 годин. Проте, з палісепту з 0,1% ДК через 6 годин вивільнилось 17,2% субстанції ДК. Потрібно зазначити, що протягом 6 годин з палісепту вивільняється достатня кількість ДК, яка створює достатню мікробоцидну концентрацію ДК для збудників і забезпечення клінічної ефективності.

4. Вплив мазі палісепт на мікроорганізми в експерименті та клініці. На підставі високої бактерицидної активності антисептиків ДК, ЕТ, МР по відношенню до стафілококів, в тому числі до антибіотикорезистентних, вивчили лікувальну дію антисептичних мазей палісепту, ЕТ, МР на перебіг і результати лікування експериментальних ран, інфікованих стафілококом.

Антисептична мазь палісепт проявляла позитивну лікувальну дію у тварин з рановою стафілококовою інфекцією. Так, ліквідація перифокального запалення навколо рани наступала протягом 406 годин. Очищення рани від некротичних клітин спостерігали через 502 години. Появу грануляцій в ранах зафіксовано протягом двох діб (482 години). Виповнення рани грануляціями завершилось через 6 діб. Початок краєвої епітелізації зареєстрували через 7 діб. У тварин на 6-7 добу припинилось зменшення ваги, нормалізувалась температура тіла. Тварини почали з охотою приймати їжу.

В контрольній групі тварин загоювання гнійних ран проходило в’яло, що обумовлено повільним початком краєвої епітелізації (25 діб). Всі показники виявились статистично вірогідними (Р0,05).

Порівняльна оцінка ефективності антисептичних мазей палісепту, ЕТ, МР показала, що раніше інших заживали гнійні рани, для лікування яких застосовували палісепт (7 діб). Потім заживали гнійні рани у тварин, лікованих ЕТ (8 діб). Гнійні рани, які лікували МР, заживали також порівняно швидко (10 днів), але повільніше ніж в групах тварин, лікованих палісептом, ЕТ. Це доведено термінами припинення висівання мікрофлори з виділень ран піддослідних і контрольних тварин (рис. 4.).

У відповідності до рішення Фармакологічного комітету МОЗ України від 30 березня 1995 р. (протокол №3) було проведено клінічне дослідження нового антисептичного препарату палісепт як основного лікувального засобу в клініці кафедри дерматології Вінницького національного медичного університету ім. М.І.Пирогова. Дослідження палісепту проводили згідно інструкції по клінічному випробуванню палісепту, затвердженої Фармакологічним комітетом МОЗ України.

Оцінку терапевтичної дії нового лікувального засобу палісепту співставляли з лікуванням 57 дерматологічних хворих з звичайними добре апробованими антимікробними мазями ЕТ, МР. Після застосування палісепту у пацієнтів з дифузними стафіло-стрептодерміями, імпетигінозними піодермітами наступало одужання швидше на 2 дні в порівнянні з ЕТ, МР. Таким чином, можна зробити висновок на основі проведених клінічних випробувань про те, що новий препарат антисептична мазь палісепт проявляє високу лікувальну дію у хворих з ураженнями шкіри, викликаними стафілококом і стрептококом. Одержані дані дозволяють пропонувати палісепт для лікування інфекційних захворювань шкіри.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведено теоретичне узагальнення та нове вирішення вивчення антимікробних, фізико-хімічних властивостей 7 оригінальних препаратів (три нових органічних сполуки нітрону, декаметоксин, декамін, етоній, мірамістін, палісепт).

1.

2.

3.

4.

5.

Рішенням Фармакологічного Комітету МОЗ України від 29.06.1995р. (протокол №6) препарат “Мазь палісепт” дозволено для клінічного застосування та промислового виробництва медичною промисловістю.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1.

Інструкцію по клінічному застосуванню препарату палісепт, затверджену Фармакологічним Комітетом МОЗ України 29 червня 1995 р. (протокол № 6), доцільно використовувати при медичному застосуванні лікарського засобу для профілактики та лікування інфекційних хвороб шкіри, ротової порожнини, сечостатевого тракту.

2.

ПЕРЕЛІК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

АНОТАЦІЯ

Шевчук Н.М. Порівняльне дослідження антимікробної активності і властивостей нових антисептичних препаратів. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Інститут мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України. Харків, 2003.

Дисертація присвячена проблемі розробки нового протимікробного лікарського засобу палісепт та дослідженню антимікробної активності хімічних сполук, які відносять до нітронів N-арілхінолілазометінів. В роботі дана мікробіологічна оцінка та приведено порівняльне вивчення препаратів нітронів, антисептичних мазей палісепту, ЕТ, МР. Вивчено швидкість формування резистентності у мікроорганізмів до антимікробних препаратів. Доведено, що фізико-хімічні властивості препарату залишаються стабільними в процесі тривалого зберігання. Розроблено експрес-методику визначення компонентів мазевої основи для промислового виробництва препарату. Експериментально доведено виражену антимікробну активність мазі з декаметоксином, препарату нітрону 1. На основі проведених клінічних випробувань доведено, що новий лікарський препарат антисептична “Мазь палісепт” проявляє високу лікувальну дію у хворих з ураженнями шкіри, викликаними стафілококом і стрептококом. Під впливом аплікацій палісепту відбувається загоєння інфікованих уражень шкіри та інших ділянок тіла хворих, яке характеризується зменшенням щільності колонізації шкіри бактеріями, особливо стафілококами, стрептококами.

Ключові слова: антисептики, нітрони, палісепт, декаметоксин, гідрогелева мазева основа.

АННОТАЦИЯ

Шевчук Н.Н. Сравнительное исследование антимикробной активности и свойств новых антисептических препаратов. – Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 03.00.07 – микробиология. – Институт микробиологии и иммунологии им. И.И.Мечникова АМН Украины. Харьков, 2003.

Диссертация посвящена проблеме разработки нового антимикробного лечебного средства палисепт и исследованию антимикробной активности химических соединений, которые относят к нитронам N-арилхинолилазометинам. В работе дана микробиологическая оценка, приведено результаты сравнительного изучения антисептических препаратов, экспериментальное обоснование использования антисептической мази для профилактики и лечения стафилококковой раневой инфекции. Дана микробиологическая оценка и проведено сравнительное изучение препаратов нитронов, антисептических мазей палісепта, ЕТ, МР. Выявлено закономерности скорости формирования резистентности у стафилококков, эшерихий к антимикробным препаратам. Обосновано, что физико-химические свойства препарата палисепта сохраняют стабильность в процессе продолжительного хранения. Изучено скорость высвобождения активного вещества ДК из мазевой основы. Разработано экспресс-методику определения компонентов мазевой основы в условиях промышленного производства лекарственного препарата палисепта.

Показано, что антимикробная активность препаратов нитронов, ДК в неблагоприятных условиях (при разном рН среды, микробной нагрузке, различной концентрации белков сыворотки крови) снижается незначительно и сохраняется на высоком уровне.

Экспериментально доказана выраженная антимикробная активность препарата нитрона 1, мази с декаметоксином по отношению к музейным и клиническим штаммам грампологжительных и грамотрицательных бактерий и дрожжеподобных грибов рода Candida. Доказано, в клинике и эксперименте, что новый антисептический препарат “Мазь палисепт” проявляет высокое лечебное действие у больных с поражениями кожи, вызванными стафилококком и стрептококком. Под влиянием аппликаций палисепта происходит заживление инфицированных повреждений кожи и других участков тела больных, которое характеризуется уменьшением плотности колонизации кожи бактериями, особенно стафилококками, стрептококками.

Ключевые слова: антисептики, нитроны, палисепт, декаметоксин, гидрогелевая мазевая основа.

SUMMARY

Shevchuk N.M. Comparative research of antimicrobial activity and properties of new antiseptic drugs. – Manuscript. A thesis on competition of a scientific degree of the candidate of medical sciences on a speciality 03.00.07 – microbiology. – Institute of a microbiology and immunology n.a. I.I.Mechnikov, Academia of Medical Sciences of Ukraine. Kharkiv, 2003.

The thesis is dedicated to a problem of mining new antimicrobial of a medical means Palisept and investigation of antimicrobial activity of chemical combinations, which fall into to nitrones N-arilhinolilazometin. In activity conducted the microbialogic tests and the comparative analysis of antiseptic drugs of nitrones, unguentums Palisept, ET, MR. Studed velocity on speed of researches formation of a microorganisms to antimicrobial drugs. Proved that physicist-chemical characteristics of preparation stay to be stable after long keeping The express-technique of definition of components unguentum a fundamentals for a commercial production of a drug is developed. Proved experimentally