НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

Синчикова Ольга Петрівна

УДК: 57.043:612.111:352.462

ВПЛИВ АМФІФІЛЬНИХ СПОЛУК
НА ГІПЕРТОНІЧНИЙ ГЕМОЛІЗ ЕРИТРОЦИТІВ

03.00.19 – кріобіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків – 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Бондаренко Валерій Антонович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу кріофізіології клітини, м. Харків.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук Гордієнко Євген Олександрович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу низькотемпературної консервації, м. Харків;

кандидат біологічних наук Гаташ Сергій Васильович, Харківський національний универсітет ім. В.Н.Каразіна МОН України, доцент кафедри біологічної і медичної фізики, м. Харків.

Провідна установа: Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця МОЗ України, кафедра медичної і біологічної фізики, м. Київ.

Захист відбудеться 15.04.2003 р. о 13-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23)

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23)

Автореферат розіслано 14.03.2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук, професор Гольцев А.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність роботи. При дії на клітини низьких температур, включаючи заморожування, їхня структура і функції піддаються істотним змінам [Pegg D.E. et al., 1998]. Оскільки плазматична мембрана являє собою бар'єр, що забезпечує сталість внутрішньоклітинного середовища, то порушення її цілісності в процесі охолодження може призводити до зниження життєздатності клітин. На сьогодні первинними факторами кріопошкодження вважаються зміни температурних і осмотичних умов середовища, в якому знаходяться клітини в процесі охолодження. Вивчення осмотичної й температурної залежностей змін структури і функції клітин, що викликані дегідратацією, є актуальною кріобіологічною задачею, оскільки механізм ушкодження клітин за певних умов багато в чому залишається не з'ясованим.

Відомо, що перенесення клітин у висококонцентровані сольові середовища супроводжується їхнім зневоднюванням і порушенням цілісності плазматичної мембрани, що може призводити до появи дефектів у її структурі [Білоус А.М., Грищенко В.І., 1994]. Як експериментальна модель для вивчення механізмів розвитку змін структури і функції клітин, викликаних дегідратацією, використовуються еритроцити людини. Механізм гіпертонічного шоку еритроцитів дотепер залишається не до кінця вивченим. Труднощі в розумінні цього явища пов'язані з браком знань про механізми формування трансмембранних пор у ділянках, які є первинними зонами пошкодження плазматичної мембрани. Вважається, що утворення й розвиток трансмембранних дефектів у мембранах еритроцитів, що знаходяться у висококонцентрованих сольових середовищах, пов'язані з порушенням організації та динаміки молекул ліпідного бішару [Рantaler E. et al., 2000]. Причиною таких змін при гіпертонічному впливі може бути порушення асоціації білків цитоскелету з мембраною і супровідна зміна структури ліпідного бішару в ділянках з порушеною асоціацією цитоскелетних білків [Tsuji A., et al., 1998].

Існує два підходи до підвищення збереженості еритроцитів під час змін осмотичних і температурних умов середовища. Перший підхід пов'язаний з модифікацією стану цитоскелет-мембранного комплексу на етапах, що передують гіпертонічному впливу. Так, у роботах [Поздняков В.В., 1989, Бабийчук Л.А., 2001] показано, що попереднє часткове зневоднювання клітин істотно підвищує їхню стійкість до подальшого перенесення у висококонцентровані сольові середовища. Вважається, що в основі зазначеного захисного ефекту лежать процеси, пов'язані у першу чергу зі збільшенням концентрації білків в об’ємі внутрішньоклітинного розчинника при зневоднюванні клітин. За певних умов збільшення числа структурних зв'язків білків цитоскелету з мембраною та між собою стає фактором, що стабілізує плазматичну мембрану.

Інший підхід враховує значний об’єм експериментальних даних, які зазначають, що деякі хімічні сполуки ефективно впливають на процес розвитку гемолізу безпосередньо в момент дії гіпертонічного стресу. Зокрема, показано, що присутність у гіпертонічному середовищі амфіфільних речовин різної структури і природи дозволяє значно знизити рівень осмотичного ушкодження еритроцитів [Орлова Н. В. та ін., 2001]. При цьому, ряд амфіфільних сполук забезпечують збереження цілісності клітин

також при гіпотонічному, постгіпертонічному й індукованому лізисі. Ефективність дії амфіфільних речовин при різних типах гемолізу еритроцитів значною мірою обумовлена їхнім впливом на ліпідний компонент мембрани [Marc le Maire et al., 2000]. При використанні у певних концентраціях ці сполуки змінюють структурний стан мембрани, викликаючи, зокрема, трансбішарний перерозподіл фосфоліпідів і впливаючи на поділ фаз у площині бішару. У той же час питання про вплив цих сполук на білки висвітлено недостатньо повно. Виходячи з того, що провідна роль у формуванні стійкості клітин до гіпертонічного впливу приділяється стану цитоскелет-мембранного комплексу [Бондаренко В.А., 1988], захисна дія речовин амфіфільної природи, крім впливу на ліпідний компонент, може опосередкуватися їхнім впливом як на інтегральні білки, так і на білки цитоскелета клітини. З урахуванням того, що осмотична й температурна чутливість еритроцитів істотно залежить від вихідного стану клітин, амфіфільні сполуки можуть проявляти свою дію вже на ранніх етапах осмо- і температурозалежних змін їхнього стану.

У зв'язку з цим, актуальною є задача вивчення впливу на клітини амфіфільних сполук як на прелімінарних етапах перед осмотичним і температурним впливом, так і безпосередньо на етапах зміни осмолярності й температури середовища.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано відповідно до наукового напрямку роботи відділу кріофізіології клітини ІПКіК НАН України за темами: “Клітинні механізми контролю холодової й осмотичної чутливості”, “Фактори й механізми регуляції стійкості клітини до змін температурних й осмотичних параметрів середовища” (№ держ. реєстрації 0101И003472), де автор виконувала самостійні розділи.

Мета і задачі дослідження.

Мета роботи - вивчити характер розвитку гіпертонічного гемолізу еритроцитів у залежності від вихідного стану клітин у температурних й осмотичних умовах середовища, що змінюються, а також при дії на клітини амфіфільних сполук різної природи.

Задачі дослідження

1.

2.

3.

4.

5.

6.

Об'єкт дослідження – гіпертонічний гемоліз еритроцитів.

Предмет дослідження – осмотична й температурна чутливість еритроцитів у присутності катіонних амфіфільних сполук трифторпіразину і лідокаїну, неіонних сполук алкілглюкопіранозидів; антигемолітична активність амфіфільних сполук при різному початковому стані еритроцитів (часткове зневоднювання, обробка діамідом, фенілгідразином, протеолітичними ферментами, нейрамінідазою).

Наукова новизна отриманих результатів. Уперше з використанням оптико-електронної системи телевізійного типу отримані дані про динаміку змін форми клітин, а також про часові інтервали морфологічних змін еритроцитів у процесі гіпертонічного гемолізу. Проведене дослідження дозволяє виділити два типи лізису клітин у гіпертонічному розчині NaCl – гемоліз без зміни об’єму клітини (час гемолізу до 1 сек) і гемоліз, опосередкований переходом еритроцита у сферу (час гемолізу 4 – 5 сек).

Виявлено, що антигемолітичний ефект трифторпіразину (ТФП) при гіпертонічному гемолізі еритроцитів є температурозалежним, він визначається початковим станом клітин і реалізується на рівні клітинної мембрани в момент дії стресового фактора.

В експериментах з модифікацією клітин нейрамінідазою отримано нові дані про те, що стан глікокалікса еритроцитів не впливає на здатність ТФП знижувати рівень лізису еритроцитів у гіпертонічному розчині NaCl. Зазначений ефект виявляється в меншому ступені у випадку еритроцитів, які були попередньо інкубовані в 0,7 Моль/л розчині NaCl.

Уперше з використанням протеолітичних ферментів показано, що ефективність трифторпіразину при перенесенні еритроцитів у 4,0 Моль/л розчин NaCl практично не змінюється при модифікації білків, а залежить від початкових осмотичних і температурних умов, у яких знаходилися еритроцити. Попередня інкубація еритроцитів у 0,7 Моль/л розчині NaCl, коли досягається максимальне початкове зневоднювання клітин, супроводжується зниженням здатності амфіфільних сполук зменшувати рівень гіпертонічного гемолізу еритроцитів при температурі 37 °С.

Виявлено, що ефективність представників гомологічного ряду похідних глюкопіранозиду визначається довжиною алкільного ланцюга амфіфільної молекули: зі збільшенням його довжини протектуюча дія цих сполук зростає, а ефективна концентрація знижується. Відзначено явище індукції температурної залежності антигемолітичної активності алкілглюкопіранозидів при гіпертонічному гемолізі еритроцитів із модифікованим фенілгідразином цитоскелетом, що не виявляється в немодифікованих клітинах.

Уперше на прикладі лідокаїну продемонстровано відсутність зв'язку між здатністю амфіфільних сполук змінювати форму клітин і проявом їх антигемолітичної активності.

Практичне значення роботи. Результати, отримані в роботі, можуть бути використані при розробці нових підходів корекції осмотичної й температурної чутливості еритроцитів з використанням амфіфільних сполук. Дані, представлені в

дисертації, можуть бути використані також у навчальному процесі за спеціальностями біологічного напрямку.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійним дослідженням здобувача. Автором сформульовано мету і визначено задачі роботи, проведено і проаналізовано експерименти, статистично оброблено результати, сформульовано висновки роботи. Роботи, опубліковані у співавторстві з к.б.н. Шпаковою Н.М., Дунаєвською О.М. і к.т.н. Стрєлковою Т.О., відбивають результати спільного планування, проведення експериментів та обговорення результатів.

Апробація результатів дисертації. Результати проведених досліджень було представлено на II-ому з'їзді Українського біофізичного товариства (Харків, 1998), конференції молодих учених ІПКіК (Харків, 1999, 2002), II-ому з'їзді трансплантологів України (Київ, 2000), конференції молодих учених (Київ, 2001), IV-ому з'їзді гематологів і трансфузіологів України (Київ, 2001), III-ому з'їзді Українського біофізичного товариства (Львів, 2002).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 12 робіт, з них у фахових наукових журналах – 7, у збірниках матеріалів конференцій – 5.

Обсяг і структура дисертації. Дисертацію викладено на 126 сторінках машинописного тексту, вона складається зі вступу, огляду літератури, двох розділів власних досліджень (що містять 5 підрозділів), висновки. Перелік використаної літератури містить 233 джерела. Роботу ілюстровано 21 рисунком та 2 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Об'єктом дослідження були еритроцити, отримані зі свіжої або свіжоконсервованої крові II-ої групи чоловіків-донорів, наданою Харківською станцією переливання крові. Виділені еритроцити у вигляді щільного осаду зберігали при 4 °С і використовували протягом 4 годин.

Гіпертонічний вплив здійснювали перенесенням рівних аліквот суспензій контрольних клітин і клітин, які зазнавали попереднього зневоднювання в помірно гіпертонічних розчинах, у висококонцентрований розчин NaCl (2,0, 3,0 або 4,0 Моль/л) при заданих температурах.

Рівень лізису клітин, які зазнавали впливу висококонцентрованих сольових середовищ, визначали за світлорозсіюванням гемоглобіну в супернатанті на спектрофотометрі СФ-4А з проточною кюветою при довжині хвилі 543 нм. Вихід гемоглобіну з клітин розраховували у відсотках відносно 100 %-го гемолізу еритроцитів у присутності 0,1 % розчину тритона Х-100. Кількість повторень у серії експерименту - не менше 6 у двох паралельних пробах. Для всіх зразків робили обчислення середнього арифметичного значення і значення середньоквадратичного відхилення значення гемолізу. Кожний із представлених у роботі графіків відбиває результати із серії дослідів одного експерименту, виражені в середньому арифметичному значенні рівня гемолізу еритроцитів з відповідним розкидом значень цієї величини.

Для вираження ефективності амфіфільної сполуки використовували поняття антигемолітичної активності. Значення максимальної антигемолітичної активності (АГmax) амфіфільної сполуки в серії дослідів одного експерименту являє собою середню арифметичну величину зі значень максимальної антигемолітичної активності даної сполуки, розраховану за формулою:

, де Г - величина гемолізу еритроцитів за даних експериментальних умов при відсутності амфіфільної речовини; Гамф - мінімальна величина гемолізу еритроцитів у присутності амфіфільної речовини.

Для реєстрації динаміки гіпертонічного гемолізу еритроцитів у роботі було використано установку для виміру малокутового світлорозсіювання клітинних суспензій, створену на базі монохроматора СФ-4А.

Морфологічні зміни еритроцитів у процесі гіпертонічного гемолізу. Для вирішення задачі реєстрації й аналізу морфологічних змін клітин у процесі гемолізу було обрано оптико-електронну систему, описану в роботі [Стрелков А.И., 2001].

Модифікацію еритроцитів трифторпіразином здійснювали за методом [Лакович Д, 1986] в оптимальній для температури експерименту концентрації.

Модифікацію еритроцитів діамідом проводили за методом, запропонованим авторами роботи [Haest C. et al., 1977].

Модифікацію цитоскелета еритроцитів фенілгідразином здійснювали відповідно до методу [Arduini A. et al., 1989].

Ферментативна обробка еритроцитів

Модифікацію клітин папаїном проводили за методом [Jennings M.L. et al., 1981], трипсином і проназою - [Hsu L. et al., 1983], нейрамінідазою здійснювали за методом, описаним в [Maeda N. et al., 1990].

Дослідження бар'єрних властивостей еритроцитарної мембрани. Кількість іонів калію, що вийшли з еритроцитів в експериментальних умовах, визначали методом атомно-абсорбційної спектрофотометріїПрайс В., 1967].

Статистичну обробку результатів робили за методом Стьюдента-Фішера [Карасаев А.И., Шенк Х., 1972].

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

ВПЛИВ трифторпІразинУ НА розвиток гіпертонічного гемолізу еритроцитів У залежності від температури Й початкового стану клітин

З метою одержання інформації про морфологічні зміни еритроцитів у процесі гіпертонічного гемолізу в роботі була використана оптико-електронна система реєстрації змін форми клітин. Реєстрацію й аналіз змін клітин проводили на персональному комп'ютері. Еритроцити переносили в 4,0 Моль/л розчин NaCl при кімнатній температурі. Після перемішування суспензії пробу у вигляді краплі розташовували на предметному склі мікроскопа. Морфологічні дослідження починали через 12-15 секунд після внесення клітин у гіпертонічне середовище. На початку реєстрації всі еритроцити були значно зневоднені і являли собою сплощені креновані клітини і сфероцити, зморщені по всій поверхні. Лізис еритроцитів відбувався з різною швидкістю. Аналіз змін, що спостерігалися, дозволяє говорити про те, що гемоліз у висококонцентрованому сольовому розчині відбувався двома різними способами. У першому випадку клітина, яка являє собою зневоднений сфероцит, за короткий

проміжок часу (до 1 сек) перетерплює ряд змін, що призводять до втрати цілісності мембрани і виходу гемоглобіну. В другому випадку, при формуванні сплощеного кренованого еритроцита, має місце згладжування його мембрани з поступовим збільшенням площі і трансформацією клітини у сферу. Спостереження за клітинами, що мають форму сплощеного диска, показує, що процес лізису завершується протягом 4-5 секунд. Таким чином, гемоліз еритроцитів у висококонцентрованому сольовому розчині, очевидно, відбувається по двох різних типах: швидкий лізис, пов'язаний з розривом мембрани зневодненої клітини, повільний – зі зміною бар'єрних властивостей еритроцитарної мембрани при перенесенні клітин у висококонцентрований сольовий розчин.

На Рис. 1 представлені дані про залежність гіпертонічного гемолізу еритроцитів від концентрації ТФП у гіпертонічному середовищі й температури цього середовища. Видно, що температура впливає на концентраційну залежність і ступінь антигемолітичної дії трифторпіразину в умовах розвитку гіпертонічного гемолізу еритроцитів. Дані Рис.1 показують, що максимальна чутливість еритроцитів до дії гіпертонічного стресу для інтервалу концентрацій трифторпіразину 10–6 – 10– 4 Моль/л спостерігається при температурі 0 С, і мінімальна – при температурі 37 С.

Попереднє часткове зневоднювання клітин може призводити до підвищення збереженості еритроцитів при їхньому наступному перенесенні у висококонцентровані сольові середовища. Результати спільної дії дозованого зневоднювання клітин і трифторпіразину на рівень гіпертонічного ушкодження еритроцитів представлені на Рис. 2. З наведених даних можна зробити висновок про те, що зміни, викликані інкубацією еритроцитів у помірно гіпертонічних розчинах, впливають на ступінь захисної дії амфіфільної речовини.

В експерименті ми використовували підхід, який дозволяє виявити етап реалізації антигемолітичної дії трифторпіразину. Трифторпіразин включали до середовища на різних етапах експерименту. На I-ому етапі еритроцити інкубували у

фізіологічному розчині протягом 10 хв при температурі 37 °С. На II-ому етапі клітини зневоднювали протягом 2 хв у середовищах, що містять 0,45 і 0,70 Моль/л NaCl. III-ій етап - гіпертонічна інкубація в 4,0 Моль/л розчині NaCl. Трифторпіразин вносився до середовища на етапах експерименту відповідно до схеми (Рис. 3), де “+” відбиває присутність цієї речовини в середовищі. Як видно з отриманих даних, антигемолітична дія трифторпіразину реалізується в момент дії стресового фактора (4,0 Моль/л розчину NaCl).

Можна припустити, що ступінь протекції еритроцитів катіонним похідним фенотіазину трифторпіразином може визначатися швидкістю його вбудовування у клітинну мембрану. Зменшення поверхневого заряду еритроцитів у результаті обробки клітин нейрамінідазою не впливає на прояв антигемолітичної активності ТФП, що несе позитивний заряд (Рис.4). Для еритроцитів, попередньо зневоднених у 0,7 Моль/л розчині NaCl, антигемолітичний ефект трифторпіразину знижується.

Осмолярність середовища передінкубації також визначає характер відповіді еритроцитів на гіпертонічний стрес, у зв'язку з чим для подальших досліджень було обрано два варіанти середовища дегідратації. Перший варіант – 0,45 Моль/л NaCl – забезпечує підвищення осмотичної стійкості еритроцитів, другий – 0,70 Моль/л NaCl – викликає зниження осмотичної стійкості еритроцитів у порівнянні з фізіологічними умовами (0,15 моль/л NaCl). Дані, представлені на Рис. 5, демонструють вплив трифторпіразину на рівень гіпертонічного гемолізу еритроцитів, які зазнали попереднього зневоднення в сольових середовищах, що містять NaCl у зазначених концентраціях. В експерименті варіювали температуру і час гіпертонічного впливу. Видно, що ступінь ушкодження еритроцитів визначається обраним температурним режимом : при 37 °С (ближній ряд) рівень лізису клітин вище відповідних показників, відзначених при 0 °С. З підвищенням концентрації лізуючого розчину NaCl від 2,0 до 4,0 Моль/л, рівень гіпертонічного гемолізу еритроцитів при температурі 37 °С зростає.

Ступінь ушкодження еритроцитів при їхньому перенесенні в 4,0 М розчин NaCl залежить від того, в якому середовищі попереднього зневоднювання знаходилися клітини. Слід зазначити, що виразність захисної дії трифторпіразину визначається температурним режимом: при 0 °С (далекий ряд)
рівень гемолізу еритроцитів у присутності трифторпіразину перевищує відповідні показники, відзначені для 37 °С. Зміна стану еритроцитів на етапі попереднього зневоднювання в 0,45 Моль/л NaCl (Рис. 5-Б) і 0,70 Моль/л NaCl (Рис. 5-В) виявляється в тому, що найбільш стійкими до гіпертонічного впливу є еритроцити, попередньо

проінкубовані в присутності 0,45 Моль/л NaCl. Антигемолітичний ефект трифторпіразину найменш виражений у випадку з клітинами, максимально зневодненими на початковому етапі (у 0,70 моль/л розчині NaCl). Це підтверджує, що виразність антигемолітичної активності трифторпіразину визначається початковим станом еритроцитів.

Відомо, що при вбудовуванні трифторпіразину у внутрішній моношар мембрани відбувається просторове роз’єднання компонентів мембрани і білків цитоскелету [Tsuji A., et al., 1998]. Це погоджується з даними [Minetti M., 1987], які вказують, що ТФП і хлорпромазин збільшують рухливість спін-міченої стеаринової кислоти в еритроцитах та їхніх тінях, тоді як у везикулах, виснажених на предмет спектрину й актину, подібного ефекту не спостерігається. Отже, спектрин-актинову мережу та білки, які зв'язують цитоскелетну мережу з мембраною, попри ліпідного бішару, можна розглядати як можливі мішені для біологічно активних фенотіазинів.

На Рис. 6-А представлені дані про вплив протеолітичних ферментів (пронази, трипсину й папаїну) на клітини, перенесені в 4,0 Моль/л розчин NaCl при 37 С. У результаті обробки еритроцитів протеолітичними ферментами їхня стійкість до дії гіперосмотичного стресу незначно підвищується, а попереднє зневоднювання нівелює зазначений ефект ферментативної обробки клітин. Ступінь антигемолітичної активності трифторпіразину при дії гіпертонічного шоку на контрольні еритроцити (0,15 Моль/л

NaCl) не змінюється після протеолітичної обробки еритроцитів. Однак, якщо клітини після такої модифікації інкубуються в 0,70 Моль/л NaCl, а потім піддаються дії гіпертонічного стресу, то спостерігається зниження антигемолітичної активності трифторпіразину на 25-45 %. В останньому випадку стан мембранних білків, безперечно, впливає на захисний ефект амфіфільної сполуки при дії на клітини осмотичного стресу. Інша картина має місце при 0 °С (Рис.6-Б). Після ферментативної обробки спостерігається зростання стійкості еритроцитів до дії 4,0 Моль/л NaCl, причому воно більш виражене у випадку з клітинами, що попередньо знаходилися в ізотонічних умовах (0,15 М NaCl). Таким чином, в умовах, коли плинність ліпідного бішару досить висока (37 °С), модифікація мембранних глікопротеїнів не впливає на процеси, пов'язані з утворенням дефектів мембрани в умовах гіпертонічного шоку.

АНТИГЕМОЛІТИЧНА АКТИВНІСТЬ АМФІФІЛЬНИХ СПОЛУК

В УМОВАХ РОЗВИТКУ ГІПЕРТОНІЧНОГО

ГЕМОЛІЗУ ЕРИТРОЦИТІВ

Характер вбудовування амфіфілів у ліпідний бішар визначається фізико-хімічними властивостями сполуки, у тому числі здатністю до міцелостворювання. Відомо, що критична концентрація міцелостворювання (ККМ) амфіфільних речовин може змінюватися при варіюванні умов середовища. Тому для оцінки здатності амфіфільних сполук впливати на стійкість еритроцитів до інкубації у висококонцентрованих сольових розчинах нами були обрані неіонні амфіфільні сполуки, ККМ яких не залежить від іонної сили розчину. Застосування цих сполук при

вивченні взаємодій детергентів з біологічними мембранами обумовлено, зокрема, високими значеннями їх ККМ. Ми досліджували дію представників гомологічного ряду похідних глюкопіранозиду з довжиною алкільного ланцюга 6, 8 і 10 вуглецевих атомів - гексил-,D-глюкопіранозиду, октил-,D-глюкопіранозиду і децил-,D-глюкопіранозиду (далі ГГП, ОГП і ДГП, відповідно) на еритроцити людини при перенесенні клітин у гіпертонічні середовища. Для зазначених алкілглюкопіранозидів були отримані концентраційні залежності їхнього впливу на рівень гіпертонічного гемолізу еритроцитів. Аналіз дії представників гомологічного ряду похідних глюкопіранозиду дозволяє зробити висновок, що зі збільшенням довжини алкільного ланцюга ефективність алкілглюкопіранозидів зростає, тобто їхня антигемолітична активність збільшується при зниженні значень ефективних концентрацій у ряді ДГП ОГП ГГП.

Температурна й осмотична чутливість клітин залежать від характеру асоціації компонентів цитоскелета з мембраною. Значення цього фактора особливо виявляється при дії на клітини деяких хімічних агентів, що змінюють чутливість клітин до охолодження і перенесення в гіпертонічні середовища. До таких модифікаторів відноситься, зокрема, діамід. Для того, щоб виявити взаємозв'язок між хімічною модифікацією цитоскелета еритроцитів та їхньою чутливістю до гіпертонічних сольових середовищ, були проведені експерименти, у яких еритроцити, оброблені діамідом (2,5, 5 і 10 мМоль/л) переносили в розчин, який містить 4,0 мМоль/л NaCl (Рис. 7). Видно, що

при підвищенні концентрації діаміда від 2,5 до 10 мМоль/л чутливість клітин до гіпертонічного впливу зростає, що корелює з утворенням міжмолекулярних зшивок у білковому кістяку еритроцитів. Як видно з представлених даних (див. Рис. 7), ОГП і ДГП мають досить виражену антигемолітичну активність також у випадку з клітинами, обробленими діамідом, причому величини антигемолітичної активності довголанцюгових алкілглюкопіранозидів не залежать від концентрації модифікатора. Здатність глюкопіранозидів знижувати гіпертонічний гемоліз еритроцитів, модифікованих високими концентраціями діаміда, знижується в міру зменшення довжини алкільного ланцюга (тобто ступеня гідрофобності) представників гомологічного ряду. Представлені дані свідчать про значну роль міжбілкових взаємодій у механізмі гіпертонічного гемолізу.

Амфіфільні сполуки мають виражену модифікуючу дію на клітинну мембрану, тому становило інтерес вивчити бар'єрні властивості еритроцитарної мембрани, оцінюючи вихід іонів К+ , у присутності алкілглюкопіранозидів. Виявлено, що при зниженні рівня гіпертонічного гемолізу еритроцитів глюкопіранозидами спостерігається збереження порушення бар'єрної функції мембрани для іонів калію. Це може свідчити про те, що амфіфільні речовини не впливають на формування дефектів мембрани, але перешкоджають їх розвитку до розмірів макроскопічної пори.

Захисний ефект амфіфільних сполук є функцією температури, і, відповідно, важливим фактором є температурна залежність гіпертонічного гемолізу еритроцитів у присутності глюкопіранозидів. Дані, представлені на Рис. 8-А, свідчать, що всі досліджені речовини в заданому діапазоні температур (5-20 °С) знижують рівень гіпертонічного гемолізу. Для представників гомологічного ряду з відносно довгим

алкільним ланцюгом (ОГП і ДГП) рівень гіпертонічного гемолізу еритроцитів значно знижується і не залежить від температури, тоді як для ГГП захисна дія визначається температурою. Модифікація еритроцитарного цитоскелету фенілгідразином (0,2 мг/мол) викликає часткову деградацію спектрина. Ми виявили підвищення рівня гемолізу модифікованих цією речовиною еритроцитів у діапазоні температур 5 – 20 °С. Уведення похідних глюкопіранозиду в літичне середовище знижує рівень гемолізу еритроцитів, як контрольних, так і модифікованих фенілгідразином (Рис. 8-Б). У випадку модифікації клітин, дія всіх гомологів глюкопіранозиду, як показали експерименти, визначається температурою. При низькій температурі (5 С) розходження в здатності знижувати рівень гіпертонічного гемолізу модифікованих клітин у різних представників гомологічного ряду найбільш виражені. На відміну від умов, коли клітини інкубували при 20 С, при 5 С гемоліз модифікованих фенілгідразином еритроцитів знижується зі зменшенням довжини алкільного ланцюга речовини.

З даних, представлених на Рис. 8, випливає, що рівень гіпертонічного гемолізу як контрольних, так і модифікованих фенілгідразином еритроцитів в умовах варіювання температури від 10 до 20 С не змінюється. Однак швидкість гемолізу в зазначеному температурному діапазоні характеризується вираженою температурною залежністю. Як видно з даних, представлених на Рис. 9, при зниженні температури від 20 до 10 °С швидкість лізису клітин зменшується, причому модифіковані еритроцити гемолізують з більш високою швидкістю. Подальше зниження температури призводить до різкого зростання швидкості гемолізу модифікованих еритроцитів у 4,0 Моль/л NaCl.

Для контрольних клітин характерна відсутність низькотемпературної (в інтервалі 5 – 10 °С) компоненти збільшення швидкості лізису. Виявлені розходження в температурній залежності швидкості лізису еритроцитів у нормі і після модифікації фенілгідразином можуть указувати на модулюючу роль спектринового кістяка в контролі процесу поділу ліпідних фаз у площині мембрани, що визначає формування дефектів мембрани і, зрештою, лізис клітин.

При порівнянні ефективності алкілглюкопіранозидів також був проведений аналіз температурної залежності антигемолітичної активності цих речовин при перенесенні в гіпертонічні середовища нативних і модифікованих фенілгідразином еритроцитів. З даних, представлених на Рис. 10, видно, що у випадку немодифікованих клітин антигемолітична активність ОГП і ДГП не виявляє температурної залежності. Виключенням є ГГП, помітне зниження ефективності якого було відзначено при температурі 5 °С. Відночас у випадку клітин, модифікованих фенілгідразином, має місце виражена температурна залежність антигемолітичної активності для всіх гомологічних глюкопіранозидів. Дані, представлені на Рис. 10, свідчать про те, що антигемолітична активність цих сполук при гіпертонічному гемолізі залежить від вихідного стану клітин і температури гіпертонічного середовища (4,0 Моль/л NaCl).

Можна припустити, що гідрофільно-гідрофобний баланс молекул амфіфільної сполуки є основним чинником, що визначає розходження в антигемолітичній активності представників гомологічного ряду похідних глюкопіранозиду в умовах гіпертонічного стресу еритроцитів.

ВИСНОВКИ

Зниження рівня гіпертонічного гемолізу еритроцитів є важливою задачею кріобіологічних досліджень. Уведення деяких амфіфільних сполук у гіпертонічні середовища дозволяє значною мірою запобігти розвитку гіпертонічного гемолізу еритроцитів. Якщо дію різних амфіфільних сполук на ліпіди вивчено досить добре, то питання про вплив цих сполук на клітини в залежності від їх початкового стану висвітлено недостатньо. У зв'язку з цим, представлялося доцільним вивчити роль початкових температурних й осмотичних умов у реалізації антигемолітичної активності амфіфільних сполук при гіпертонічному гемолізі еритроцитів. Поставлені задачі вирішували із застосуванням методів малокутового світлорозсіювання, атомно-абсорбційної спектрофотометрії і реєстрації морфологічних змін за допомогою оптико-електронної системи телевізійного типу.

1.

2.

3.

Усі досліджені в роботі представники гомологічного ряду глюкопіранозиду знижують рівень гіпертонічного гемолізу еритроцитів, практично не впливаючи на осмотично індукований вихід із клітин іонів К+. У зазначених умовах ефективність алкілглюкопіранозидів підвищується зі збільшенням довжини алкільного ланцюга молекул, причому ефективні концентрації цих речовин

знижуються.

4.

5.

6.

За матеріалами дисертації опубліковані наступні роботи:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

використанням оптико-електронної системи телевізійного типу)

7.

8.

9.

10.

11.

12.

АНОТАЦІЇ

Синчикова О.П. “Вплив амфіфильних сполук на гіпертонічний гемоліз еритроцитів”. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за фахом 03.00.19. – кріобіологія.- Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2003.

Досліджували розвиток гіпертонічного гемолізу еритроцитів у залежності від початкового стану клітин при зміні температурних і осмотичних умов середовища, а також у присутності амфіфільних сполук.

У роботі було використано позитивно заряджені амфіфільні сполуки (трифторперазін і лідокаїн) і неіонні похідні глюкопіранозиду (гексил-,D-глюкопіранозид, октил-,D-глюкопіранозид і децил-,D-глюкопіранозид).

Вивчені амфіфільні сполуки істотно знижують рівень гіпертонічного гемолізу еритроцитів. Їхня антигемолітична активність визначається умовами гіпертонічного впливу на клітини, фізико-хімічними властивостями амфіфільних молекул і початковим станом клітин, сформованим на етапі попередньої інкубації в середовищах помірної тонічності при певних температурах.

Ключові слова: гіпертонічний гемоліз, еритроцитарна мембрана, початкові умови, модифікація еритроцитів, амфіфільні сполуки, антигемолітична активність

Сынчикова О.П. “Влияние амфифильных соединений на гипертонический гемолиз эритроцитов”. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19. – криобиология.- Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2003.

Диссертация посвящена исследованию развития гипертонического гемолиза эритроцитов в зависимости от исходного состояния клеток при изменении температурных и осмотических условий среды, а также в присутствии амфифильных соединений.

Уровень и динамику развития гипертонического гемолиза эритроцитов регистрировали методом малоуглового светорассеяния. Методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии оценивали барьерные свойства эритроцитарных мембран. Временные параметры морфологических изменений эритроцитов, перенесенных в 4,0 Моль/л раствор NaCl, оценивали с использованием оптико-электронной системы. Исходное состояние эритроцитов модулировали как частичным обезвоживанием клеток в солевых растворах умеренной тоничности и изменением температурного режима эксперимента, так и модификацией плазматической мембраны диамидом, фенилгидразином и протеолитическими ферментами.

В работе были использованы положительно заряженные амфифильные соединения (трифторперазин и лидокаин) и неионные производные глюкопиранозида (гексил-,D-глюкопиранозид, октил-,D-глюкопиранозид и децил-,D-глюкопиранозид).

Проведенные исследования морфологических изменений эритроцитов при гипертоническом гемолизе позволили выделить два возможных типа развития гемолитического процесса. К первому типу относится гемолиз эритроцитов без изменения их объема (время гемолиза не более 1 сек), а ко второму – лизис, опосредованный переходом клеток в сферу (время гемолиза 4 – 5 сек).

Полученные результаты свидетельствуют, что антигемолитический эффект трифторперазина при развитии гипертонического гемолиза эритроцитов реализуется на уровне клеточной мембраны. Способность трифторперазина снижать уровень гипертонического лизиса эритроцитов зависит от температуры, она определяется прежде всего осмолярностью среды, в которой исходно инкубировались клетки. Характер модификации плазматической мембраны протеолитическими ферментами не оказывает существенного влияния на проявление антигемолитической активности трифторперазина в указанных условиях.

Исследованные в работе представители гомологического ряда глюкопиранозида снижают уровень гипертонического гемолиза эритроцитов. По мере увеличения алкильной цепи их молекул антигемолитическая активность алкил-,D-глюкопиранозидов возрастает, а эффективные концентрации снижаются. В случае модификации клеток диамидом подобной зависимости антигемолитической активности этих соединений от длины алкильной цепи их молекул не установлено.

Для гексил -, D - глюкопиранозида , в отличие от октил -, D - глюкопиранозида и

децил-,D-глюкопиранозида, выявлена зависимость антигемолитической активности от температуры гипертонической среды. Модификация эритроцитов фенилгидразином приводит к появлению температурной зависимости антигемолитической активности для всех алкил-,D-глюкопиранозидов при гипертоническом гемолизе эритроцитов.

На примере лидокаина показано отсутствие прямой связи между проявленим антигемолитической активности амфифильным соединением и его способностью изменять форму клетки.

Результаты, полученные в работе, свидетельствуют о том, что антигемолитическая активность амфифильных соединений определяется условиями гипертонического воздействия на клетки, физико-химическими свойствами амфифильных молекул и исходным состоянием клеток, сформированным на этапе предварительной инкубации в средах умеренной тоничности при определенных температурах.

Ключевые слова: гипертонический гемолиз, эритроцитарная мембрана, исходные