НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О.В.ПАЛЛАДІНА

Сломінський Олександр Юрійович

УДК: 577.157.2:612.017.1

Індукція каталітичної активності плазміногену

моноклональним антитілом IV-1c

03.00.04. - Біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ-2003

Дисертація є рукописом.

Роботу виконано у Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Науковий керівник – доктор біологічних наук, старший науковий

співробітник ВОЛКОВ Георгій Леонідович,

завідувач відділу структури та функцій білка

Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

КІБІРЄВ Володимир Костянтинович,

завідувач відділу хімії білка Інституту біоорганічної

хімії та нафтохімії НАН України;

кандидат біологічних наук, старший науковий

співробітник ЛУГОВСЬКИЙ Едуард Вітальович,

провідний науковий співробітник відділу

молекулярної імунології Інституту біохімії

ім. О. В. Палладіна НАН України.

Провідна установа – Київський національний університет

імені Тараса Шевченка, кафедра біохімії.

Захист відбудеться 22 грудня 2003 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д .240.01 в Інституті біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, 01601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України за адресою: Київ, вул. Леонтовича, 9.

Автореферат дисертації розіслано 21 листопада 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук О. В. КірсенкоЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Плазміноген – плазмінова система є однією з найважливіших позаклітинних протеолітичних систем ссавців. Вона бере участь у регуляції багатьох фізіологічних і патофізіологічних процесів, а саме: підтримання рідинного стану крові; загоювання ран, овуляції та імплантації запліднених яйцеклітин, перебудові тканин, у запальних, інфекційних, алергійних та імунних реакціях; інвазії та метастазуванні злоякісних пухлин, тощо.

Не зважаючи на високу лабільність молекули, плазміноген-плазмінова система виявляє довершені механізми щодо специфічності активації, високу протеолітичну активність, вибірковість і стабільність за різноманітних умов. Головним у виконанні протеолітичної функції є здатність до перетворення плазміногену (Пг) у плазмін (Пм) під дією активаторів плазміногену. За фізіологічних умов перетворення проферменту плазміногену в плазмін відбувається внаслідок конформаційної перебудови у протеїназному домені проферменту після розщеплення Арг561-Вал562 пептидного зв’язку плазміногену з подальшим формуванням каталітично активного центру ферменту, що є типовим для серинових протеїназ.

На сьогодні, крім "прямого" ферментативного шляху активації, описано також так званий "непрямий" або некаталітичний через утворення активаторного комплексу плазміногену з деякими екзогенними білками. До них належать зокрема продуковані патогенними мікроорганізмами стрептокіназа (СК) та стафілокіназа. Особливістю їхньої дії є здатність індукувати каталітичну активність у локусі активного центру плазміногену без гідролітичного розщеплення активаційного зв'язку виключно через конформаційні зміни. Оскільки термін “активація” проферменту зазвичай застосовують у випадку каталітичного шляху, до негідролітичного шляху було запропоновано термін “індукція каталітичної активності”.

Дослідження механізмів проникнення мікроорганізмів в організм хазяїна через використання плазміноген-плазмінової системи має велике значення. Окрім того, препарати стрептокінази є майже єдиними доступними у державах СНД тромболітиками, тож вивчення механізмів їхньої дії дасть змогу поліпшити якість тромболітичної терапії. Суттєвим недоліком нинішньої терапії є те, що екзогенні активатори є дуже сильними антигенами та спричинюють появу пулу антитіл не тільки до власної молекули, а і до молекули профермента або фермента чи до комплексів активатор–(про)фермент. Наявність таких антитіл виявлено у плазмі крові хворих на гострий інфаркт міокарда, яким вводили препарат стрептокінази. Це вказує на можливість появи антитіл, подібних до IV-1c.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тему дисертаційної роботи було затверджено на засіданні вченої ради Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, протокол №1 від 17.01.1997 р. Дисертаційна робота безпосередньо зв’язана з плановими дослідженнями відділу за бюджетними темами: “Вивчення структурної організації та функції тромбоцитарного інтегрину GPIIb-IIIa та інших білків системи гемостазу” (1995-1997рр.), № ДР 0195U002946; “Вивчення механізму активації ключових проферментів системи фібринолізу та гемостазу активаторами непрямої дії”, (1998-2000рр.), №ДР 0198U00345.

Мета та задачі дослідження. Метою роботи було вивчення процесу негідролітичної індукції каталітичної активності у проферментах серинових протеїназ на моделі плазміноген – антиплазміногенове моноклональне антитіло IV-1c (МКА IV-1c). На досягнення мети нами було сформульовано такі задачі:

1.

2.

3.

4.

Об’єкт дослідження. Профермент плазми крові плазміноген у Глу- та Ліз-формах. Моноклональне антиплазміногенове антитіло IV-1c, яке здатне, під час утворення комплексу з антигеном, викликати конформаційні перебудови, що ведуть до індукції каталітичної активності проферменту. Специфічна та неспецифічна регуляція взаємодії плазміногену та антитіла IV-1c.

Предмет дослідження. Індукція каталітичної активності плазміногену антиплазміногеновим моноклональним антитілом IV-1c. Вплив різних фізико-хімічних умов, концентраційні залежності процесу індукції каталітичної активності та регуляція цього процесу специфічними інгібіторами плазміну.

Методи дослідження. В роботі застосовано методи очищення білкових препаратів антитіл, плазміногену різних форм, плазміну, стрептокінази з сироватки крові та клітинних супернатантів. Визначення амідолітичної активності плазміногену, комплексів плазміноген–стрептокіназа та плазміноген–МКА IV-1c за різних умов активації провадилося спектрофотометрично у мікропланшетах для ридера–спектрофотометра. Для визначення процесів зв’язування було застосовано метод імуноферментного аналізу з використанням детектування за допомогою лужної фосфатази. Визначення ступеню очищення білкових препаратів та контролю гідролізу білків проводили електрофоретично за різних умов. Обчислення результатів проводили з використанням спеціалізованих програмних продуктів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено дослідження механізмів процесу індукції каталітичної активності плазміногену моноклональними антитілами. Обгрунтовано використання моноклональних антитіл відповідної специфічності як моделі вивчення механізмів індукції каталітичної активності проферментів серинових протеїназ. Остаточно підтверджено гіпотезу щодо необхідності двоцентрової взаємодії плазміногену з негідролітичними активаторами, що вказує на певну просторову спрямованість молекул комплексу та на загальні механізми процесу експонування каталітичної тріади серинових протеїназ. У роботі виконано ряд досліджень стосовно впливу фізико-хімічних факторів на процес індукції каталітичної активності, що дає змогу провести аналогії з відомими фактами, визначити стабільність комплексу до зовнішнього впливу та стандартизувати процес індукції відносно впливу на нього певних факторів. Продемонстровано залежність швидкості індукції від концентрації протонів у середовищі, характер якої дещо відмінний від рН-залежності індукції каталітичної активності плазміногену стрептокіназою, обумовлену, очевидно, відмінністю у будові активного центру комплексів СК–Пг та Пг–МКА IV-1c. Доведено неможливість індукції каталітичної активності плазміногену за відсутності міцної взаємодії С-кінцевого залишку лізину важкого ланцюга моноклонального антитіла з лізин-зв’язуючими ділянками плазміногену. Продемонстровано необхідність переходу Глу-плазміногену до відкритої, Ліз-подібної конформації, як початкової стадії процесу індукції. Виявлено залежність цього процесу від катіонного складу середовища. За допомогою визначення енергії активації процесу доведено наявність значних конформаційних перебудов комплексу плазміноген–МКА IV-1c, які передують індукції каталітичної активності. Продемонстровано одночасний перебіг декількох багатостадійних реакцій великими значеннями енергії активації під час цього процесу. За допомогою визначення можливості інгібування індукції фізіологічним інгібітором плазміну a2-антиплазміном показано наявність експонованої “класичної” каталітичної тріади (Сер-Гіс-Асп) активного центру плазміну на початку швидкої (другої) фази реакції активації. Оскільки на той час вільний плазмін ще не фіксується, названий факт можна розглядати як підтвердження існування плазміногену з експонованим під впливом МКА IV-1c активним центром. Той факт, що рівень інгібування відрізняється від такого у плазміну вказує на наявність певної різниці щодо конформації активного центру.

Показано експоненційне наростання швидкості індукції каталітичної активності за умов підвищення концентрації обох компонентів реакції до еквімолярних концентрацій. Подальше збільшення концентрації плазміногену не спричинює зміни швидкості індукції, тоді як збільшення концентрації МКА IV-1c призводить до зниження швидкості індукції, найімовірніше внаслідок конкуренції надлишкових С-кінцевих залишків лізинів гамма-ланцюгів моноклональних антитіл за лізин-зв’язуючі ділянки плазміногену.

На основі дослідження механізмів індукції каталітичної активності плазміногену моноклональним антитілом IV-1c вперше запропоновано схему реакції, яка, можливо, є універсальною для активаторів непрямої дії. Схему можна представити як ряд реакцій, які відбуваються послідовно та частково одночасно: утворення комплексу Глу-Пг–МКА за механізмом взаємодії антитіла з епітопом, перехід плазміногену до відкритої конформації, взаємодія лізин-зв’язуючої ділянки плазміногену з С-кінцевим залишком лізину гамма-ланцюга МКА, експозиція активного центру, здатного гідролізувати активаційний зв’язок молекули плазміногену. Схема враховує можливість наявності проміжних активаторних комплексів та існування позитивного зворотного зв’язку.

Практичне значення одержаних результатів. Запропоновано схему індукції каталітичної активності для активаторів серинових протеїназ непрямої дії. Згідно зі схемою, індукція є рядом конформаційних перебудов молекули протеїнази під впливом асоціації з молекулою активатора. Схема враховує можливість наявності проміжних активаторних комплексів та існування позитивного зворотного зв’язку. Практичне значення роботи обумовлено можливістю утворення в разі антитромботичної терапії стрептокіназою аутоантитіл до плазміногену. Дослідження активації некаталітичним моноклональним антитілом плазміногену за механізмом індукції каталітичної активності дає змогу спрогнозувати можливі ускладнення антитромботичної терапії та розробити методи їм запобігання.

Особистий внесок здобувача. Представлена дисертаційна робота – завершене дослідження, виконане автором відповідно до програми експериментальних досліджень, спланованих, проведених та узагальнених протягом 1997-2002 років. Експериментальну частину роботи виконано дисертантом особисто. Експерименти з впливу температури та визначення енергії активації виконано здобувачєм разом зі співробітником відділу структури та функцій білка Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАНУ Соколовською Л. І. Аналіз отриманих результатів, їхнє обговорення та інтерпретацію проведено спільно з науковим керівником. Друковані праці підготовано за безпосередньої участі автора.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи було продемонстровано на VII Українському біохімічному з’їзді (м. Київ, 1997р.); міжнародних конференціях – “XVth International Congress on Fibrinolysis & Proteolysis (Японія, Хамамацу, 2000р.); XVIII International Symposium Thrombosis and Haemostasis (Франція, Париж, 2001р.). Матеріали роботи було представлено на конкурсі молодих вчених (Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, м. Київ, 1999р.), доповідались на засіданнях відділу структури та функції білка та на науковому семінарі Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 3 статті в періодичних наукових спеціальних виданнях України, включених до переліку, затвердженому ВАК України та 3 тези доповідей у збірках наукових конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури (1 розділ, 5 підрозділів), експериментальної частини (3 розділи, 5 підрозділів), висновків та списку літературних джерел (210 найменувань). Роботу викладено на 132 сторінках, вона містить 34 рисунки, 3 схеми та 1 таблицю.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

В огляді літератури представлено сучасні дані щодо структури та властивостей молекули плазміногену, детально представлено інформацію щодо процесу активації проферменту. Представлено дані щодо компонентів системи фібринолізу, які виконують роль активаторів плазміногену за фізіологічних умов і некаталітичних індукторів каталітичної активності екзогенного походження.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

У роботі було використано такі матеріали та реактиви: трис(гідроксиметил)амінометан, хромогенний субстрат плазміну S-2251 (H-D-Вал-Лей-Ліз-pNa), a-казеїн, диізопропілфторфосфат (DFP, ДФФ) (“Merck”, Німеччина), п-нітрофеніловий ефір гуанідинбензойної кислоти (p-NFGB) (“Sigma”, США); стрептокіназа Kabikinase (“Pharmacia AG”, Швеція), Cibacron Blue-Sepharose, Sepharose CL 4B, Sephacryl S-200, Superose 12 HR, протеїн А-Sepharose (“Pharmacia”, Швеція; “Amersham Pharmacia Biotech”, США), альбумін сироватки крові бика (“Calbiоchem”, США). Неорганічні сполуки ступеню чистоти 'хч' або вищої. Планшети для ІФА (“Costar”, США; “Nunc”, Nalge Nunc International, США).

Одержання плазміногену. Глу-плазміноген одержували з донорської плазми на лізин – сефарозі. Ліз-форму плазміногену – з фракції ІІІ2,3 за Коном також на лізин – сефарозі. Проводили гель-фільтрацію на Sephacryl S-200. Препарати плазміногенів зберігали при –20oС. Одержані препарати плазміногену мали потенційну протеолітичну активність 18-22 казеїнолітичні одиниці на 1 мг білка. Спонтанну активність у препараті плазміногену не виявляли за інкубації протягом 6 годин з хромогенним субстратом S-2251. Чистоту одержаних препаратів контролювали електрофоретично в 10% ПААГ з ДС-Na, та в 11,5 % ПААГ з оцтовою кислотою і сечовиною за рН 3.2.

Одержання препаратів плазміну. Плазмін одержували з препаратів Глу-плазміногену за стандартною методикою з використанням імобілізованої на BrCN-сефарозі-4В урокінази. Плазміноген інкубували з імобілізованою урокіназою протягом 1 години при температурі 370С у 0,05 М трис-НCl буфері, рН 7.4, з вмістом 0,15 М NaCl і 25% гліцерину.

Вимірювання амідолітичної активності плазміну. Активність плазміну визначали за вивільненням паранітроаніліну з хромогенного субстрату S-2251 (H-D-Вал-Лей-Ліз-pNa) – 3 мМ, яке реєстрували в двохвильовому режимі за 405 та 492 нм на ридері-спектрофотометрі для мікропланшетів Titertek Multiskan МС (Фінляндія). Реакцію проводили в планшетах для імуноферментного аналізу в 0,05 М трис-НСІ буфері рН 7,4. який містив 0,15 М NaCI, при 37oС, концентрація плазміногену становила – 100 нМ (25 пмоль), стрептокінази – 10 IU/мл і S-2251- 0,3 мМ. Кінцевий об'єм проби – 250 мкл.

Вплив a2-антиплазміну на реакцію індукції каталітичної активності Глу–плазміногену моноклональним антитілом IV-Ic. У реакційне середовище вносили послідовно: Глу-плазміноген до кінцевої концентрації 100 нМ, a2-антиплазмін до кінцевої концентрації 30 нМ (7,5 пмоль), антиплазміногенове моноклональне антитіло IV-1c - 100 нМ (25 пмоль), 100 мМ фосфатний буфер рН 7.4, хромогенний субстрат S-2251 (0,3 мМ). Реагенти змішували при кімнатній температурі, реакцію проводили при 37оС.

Вплив двовалентних катіонів на індукцію каталітичної активності Глу-плазміногену моноклональним антитілом IV-1c. Хлориди двовалентних металів розчиняли у 0,1 М трис – HCl буфері, pН 7.4 до кінцевої концентрації 1,5 мМ. Цей буфер правив за основний під час реакції.

Вплив іонної сили розчину та аніонів на реакцію активації Глу-плазміногену моноклональним антитілом IV-Ic. Іонну силу розчину змінювали за допомогою хлориду натрію, вплив аніонів визначали, додаючи відповідні натрієві солі.

Електрофорез у поліакриламідному гелі за присутності ДС-Na. Електрофорез проводили за методом Laemmli. Як маркери використовували LMW Calibration Kit (Amersham Biosciences, США) до якого входять такі білки: 94 кДа – фосфорилаза Б, 67 кДа – альбумін, 43 кДа – овальбумін, 30 кДа – карбоангідраза, 20,1 кДа – соєвий інгібітор трипсину, 14,4 кДа – a-лактальбумін.

Електрофорез у поліакриламідному гелі за низьких значень рН. Для визначення форм плазміногену людини використовували 7.5% ПААГ з вмістом 6.25 М сечовини з доведенням рН оцтовою кислотою до 3.2. За таких умов розділення Глу- та Ліз- плазміногенів відбувається за рахунок різниці зарядів молекули.

Одержання стрептокінази. Стрептокіназу одержували з комерційного препарату (Kabikinase, Швеція) афінною хроматографією на Cibacron Blue-Sepharose. Питома активність препаратів стрептокінази була не меншою за 97000 IU/мг білка. За даними електрофорезу препарати стрептокінази не містили домішок альбуміну та були гомогенними.

Очищення імуноглобулінів. Антиплазміногенове моноклональне антитіло IV-1c отримували з супернатантів гібридомних клітин, люб’язно наданих старшим науковим співробітником Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України Іриною Миколаївною Колесніковою. До клітинного супернатанту додавали сульфат амонію до кінцевої концентрації 45 – 50% і залишали на 10 годин при 4оС. По тому центрифугували протягом 30 хвилин за 2000 об./хв на центрифузі РС-6. Супернатант видаляли, а до преципітату додавали 0,05М трис-HCl буфер, рН 7,4, з вмістом 0,13М NaCl до повного розчинення осаду та діалізували проти того ж буферу.

Отримання моноклональних антитіл IV-lc методом афінної хроматографії з використанням протеїн А-Sepharose. На колонку з протеїн А-Sepharose наносили віддіалізовані імуноглобуліни, відмивали незв'язаний білок 0,05М трис-HCl буфером, рН 7,4, з вмістом 0,13М NaCl з відповідним спектрофотометричним контролем за довжини хвилі 280 нм. Елюцію проводили 0.1 М гліциновим буфером, рН 2,8. Елюат негайно нейтралізували 1М трис до pH 7.8. Фракції діалізували проти 0,05М трис-HCl буферу, рН 7,4, з вмістом 0,13М NaCl або 50 мМ натрій-фосфатного буферу, рН 7,4, протягом ночі при температурі 4оС.

Очистка антиплазміногенового моноклонального антитіла IV-1c методом афінної хроматографіі на колонці з Пг-Sepharose. Ha врівноважену 0,05М трис-HCl буфером, рН 7,4, з вмістом 0,13М NaCl або 50 мМ натрій-фосфатним буфером, рН 7,4, колонку з плазміноген-Sepharose наносили фракцію імуноглобулінів. Незв'язаний білок відмивали тим же буфером. Елюцію проводили послідовно 0.1 М гліциновим буфером, рН 2,8 та рН 2.2. Елюат нейтралізували 1М трис до рН 7,8. Отримані антиплазміногенові IgG діалізували протягом ночі при 4оС проти 0,05М трис-HCl буферу, рН 7,4, з вмістом 0,13М NaCl. Елюйовані за рН 2.2 антитіла IV-1c мали здатність інгібувати індукцію каталітичної активності плазміногену стрептокіназою та індукувати таку активність самі.

Контроль наявності домішок з амідолітичною активністю у препаратах моноклонального антитіла IV-1c. Чистоту фракції імуноглобулінів після плазміноген-Sepharose контролювали електрофоретично, наявності білкових домішок не виявлено. Можливість наявності амідолітичної активності перевіряли, інкубуючи препарат антитіл з урокіназою та S2251 за стандартних умов. Протягом 10 годин інкубації амідолітичної активності у препаратах не виявлено.

Інгібування моноклональним антитілом IV-1c індукції каталітичної активності плазміногену стрептокіназою. В комірку планшету для імунохімічних реакцій послідовно додавали плазміноген (25 пмоль), 0,05М трис-HCl буфер, рН 7,4, з вмістом 0,13М NaCl, розчин антитіла IV-1c концентрацією 0-85 пмоль, субстрат S-2251 (0,3мМ) до кінцевого об'єму 250 мкл. Реакцію індукції каталітичної активності плазміногену ініціювали стрептокіназою (10 IU/мл) при 37оС і реєстрували як сказано вище.

Визначення швидкості утворення активних центрів плазміногену у комплексі Пг-МКА IV-1c. Попередньо інкубовану суміш плазміногену та IV-1c в еквімолярних концентраціях додавали до розчину хромогенного субстрату S-2251 у 0,05М трис-HCl буфер, рН 7,4, з вмістом 0,13М NaCl до кінцевого об’єму 250 мкл та інкубували при 37оС. Виміри проводили протягом 10 хв з 0.5 - 1 хвилинним інтервалом. Швидкість індукції каталітичної активності визначали за рівнянням V=([Пм2]-[Пм1])/t, де [Пм2] – концентрація активних центрів (Пм) в момент переходу кривої до лінійного росту (t2), [Пм1] – їхня концентрація в момент закінчення лаг-фази (t1), t=t2-t1. Концентрацію Пм визначали за допомогою калібрувальної кривої активності плазміну, побудованої в координатах [Пм]tg , де tg є тангенсом кута зростання А405 за певної концентрації плазміну.

Імобілізація ліганда на BrCN-Sepharose 4B. Імобілізацію проводили за стандартною методикою (Amersham Biosciences, США).

Визначення концентрації білка за поглинанням в УФ-області спектру. Визначення концентрації білків проводили на спектрофотометрі СФ-46 (ЛОМО, Росія) у кюветах з довжиною пробігу променя 1 см. Для індівідуальних білків враховували коефіцієнти молярної екстинкції, а саме: для плазміногену – 17,0, для моноклонального антитіла IV-1c – 14,0 і для стрептокінази – 6,7.

Імуноферментний аналіз (ІФА/ELISA). Імуноферментний аналіз проводили за загальноприйнятою методикою з використанням субстрату лужної фосфатази – pNPP (п-нітрофеніл фосфат) у 0,01 М диетаноламіновому буфері, рН 9,5. Визначення оптичного поглинання проводили у двохвильовому режимі за довжини хвилі 405 та 492 нм на ридері-спектрофотометрі для мікропланшетів Titertek Multiskan МС.

Отримання донорської плазми крові. До роботи брали пул крові не менше ніж 10 донорів. Кров одержували пункцією ліктьової вени, натщесерце, з додаванням розчину лимоннокислого натрію (38 г/л) у співвідношенні 9:1 з подальшим центрифугуванням за 1500 g протягом 40 хвилин.

Математична обробка результатів досліджень. Математичну обробку та аналіз отриманих експериментальних даних виконували за допомогою пакету ORIGIN 6.1. До роботи включено лише результати експериментів, чия допустима похибка не перевищувала 5 відсотків (р < 0,05).

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Характеристика НЕКАТАЛІТИЧНОГО антиплазміногенового моноклонального антитіла IV-1c

Антиплазміногенове моноклональне антитіло IV-1c було одержано з використанням як антигена електрофоретично гомогенного Глу-плазміногену людини. Гомогенність очищеного препарату антитіл було підтверджено електрофоретично та доведено відсутність домішок з амідолітичною активністю стосовно субстрату S2251. Встановлено приналежність цього імуноглобуліну до ізотипу IgG1, який характеризується наявністю С-кінцевого залишку лізину -ланцюга. Епітоп моноклонального антитіла IV-1c розташовано на ділянці протеїназного домену Вал709-Глі718. Слід підкреслити співпадіння вказаного епітопу з послідовністю Цис710–Цис726 плазміногену, до якої входить і залишок Арг719, який відіграє важливу роль у зв’язуванні та індукції каталітичної активності плазміногену стрептокіназою та стафілокіназою.

Вплив рН інкубаційного середовища на швидкість реакції Індукції каталітичної активності

Як можна бачити з наведеної кривої (Рис. 1, А), швидкість індукції каталітичної активності набуває максимального значення за рН 6,4, що є відповідним константі іонізації (рК) імідазольної групи гістидину, яка становить 5,6 – 7,0. Вищі значення рН є відповідними рК a-аміногруп у білкових макромолекулах. За переходу від рН ~6,4 до рН 7,4 швидкість знижується у 1,6 рази та у 2,5 рази з рН 7,4 до рН 8,2. Загалом швидкість процесу індукції плазміногену антиплазміногеновим антитілом IV-1c знижується (від максимуму за рН 6,45) у 4 рази (від 1,3 нмоль плазміну до 0,3 пмоль плазміну на хвилину). Слід зазначити, що індукція каталітичної активності Глу-плазміногену стрептокіназою за різних значень рН відбувається дещо інакше. Лінійне наростання швидкості індукції відбувається за значень рН від 5,7 до 6,2 (рК відповідає іонізації імідазолу гістидину). В абсолютних значеннях утворення плазміну наростає з 5,25 пмоль до 16 пмоль на хвилину відповідно. Від рН 6,2 до рН 7,7 швидкість індукції каталітичної активності практично не змінюється, залишаючись на рівні 16 пмоль плазміну на хвилину (Рис 1, Б).

Значення рН 6,2 – 7,7, відповідні максимальній швидкості за індукції каталітичної активності плазміногену стрептокіназою, є наближеними до значень іонізації як імідазольної групи гістидину, так і рК термінальної аміногрупи.

Вплив іонної сили інкубаційного середовища на реакцію індукції каталітичної активності плазміногену МКА IV-1c.

Процес індукції каталітичної активності у молекулі Глу-плазміногену МКА IV-1c за різних концентрацій NaCl вивчали за розщепленням хромогенного субстрату S2251 (Рис. 2). Початкова швидкість реакції різко падає навіть за найнижчих концентрацій солі. Можливо, блокування якоїсь групи призводить до утруднень не лише первинної взаємодії, а й до подальших конформаційних перебудов молекули плазміногену. Загалом початкова швидкість реакції є дуже залежною від наявності солі в інкубаційному середовищі. Як уже сказано вище, вона різко падає за появи солі у розчині, надалі лінійно сповільнюючись в міру наростання концентрації хлориду натрію. Концентрація NaCl, що на 50% пригнічує швидкість індукції каталітичної активності Глу-плазміногену становить 0,3 М.

Вплив температури на швидкість реакції індукції каталітичної активності плазміногену МКА IV-1c.

Температурну залежність процесу індукції каталітичної активності Глу-плазміногену антиплазміногеновим моноклональним антитілом IV-1c проводили за стандартною методикою з використанням хромогенного субстрату S2251. Реакція індукції каталітичної активності Глу-плазміногену МКА IV-1c практично не проходила за температур нижчих ніж 20оС (Рис. 3). Швидкість реакції за температури 10оС і 19оС практично однакова та мало відмінна від нуля. При температурі 25-30оС реакція є досить повільною зі значним подовженням лаг-періоду. Наростання швидкості є особливо інтенсивним по досягненні температури інкубаційного середовища 30оС з максимумом при 37оС.

Швидкість першої фази реакції визначали як V = 1/t, другої фази (швидкої) за стандартним методом обчислювання. Швидкість реакції під час лаг-періоду лінійно зростає від температури 25 градусів за Цельсієм до температури 34оС майже з однаковим приростом у 8,9?10-4. Максимального значення швидкість першої фази реакції набуває при температурі 37 градусів за Цельсієм, при температурі 40оС вона падає до тих же значень, що і при 34оС. Натомість швидкість другої фази реакції є абсолютно незначною включно до температури 30оС, надалі різко зростаючи. Іншою відмінністю температурної залежності другої фази від першої є менша різниця між максимальною швидкістю при 37оС та швидкостями при 34оС і 40оС. Зниження швидкості розщеплення субстрату при 40оС, очевидно, спричинено насамперед інактивацією білкових макромолекул внаслідок часткової денатурації. Отже, температурний оптимум першої (лаг-фази) та другої (швидкої) фаз реакції співпадає та становить 37 градусів за Цельсієм.

Визначення енергії активації Е проводили графічно відповідно до рівняння Ареніуса. Для першої або повільної фази реакції індукції каталітичної активності Глу-плазміногену антиплазміногеновим моноклональним антитілом IV-1c уявне значення енергії активації дорівнює 19·ккал/моль, а для другої (швидкої) фази реакції 40 ккал/моль.

ВПЛИВ Іонного складу середовища на процес індукції каталітичної активності

Значного впливу аніонного складу середовища на реакцію індукції каталітичної активності плазміногену моноклональним антитілом IV-1c не зафіксовано.

Лаг-період реакції індукції каталітичної активності плазміногену МКА IV-1c значно скорочувався за наявності в інкубаційному середовищі іонів магнію, барію та стронцію (Рис. 4). Катіони кальцію практично не впливали на тривалість лаг-періоду, кобальту та нікелю – значно його подовжували. Тривалість другої фази реакції скорочувалася за наявності катіонів магнію, кальцію, барію та стронцію, подовжувалася – нікелю та кобальту. Внесення до інкубаційного середовища катіонів міді, цинку чи марганцю повністю пригнічувало реакцію.

Швидкість реакції індукції в лаг-періоді була максимальною, відповідно, за наявності у розчині катіонів барію та стронцію, дещо прискореною – магнію. Кальцій не впливав на швидкість реакції, тоді як нікель і кобальт значно її пригнічували. Дія катіонів на швидку фазу реакції є подібною та відбиває залежність описану вище для тривалості реакції. Єдиною відмінністю є незначне, недостовірне прискорення в разі наявності у розчині катіонів кальцію.

Наявність не лише інгібуючого, а й стимулюючого ефекту двовалентних катіонів на реакцію індукції каталітичної активності плазміногену МКА IV-1c, не описаного досі, спонукала нас до докладнішого вивчення впливу стронцію на перебіг реакції. Стронцій було обрано, оскільки його стимулюючий ефект є максимально вираженим. Тривалість як лаг-періоду, так і другої фази реакції скорочувалася з наростанням концентрації стронцію від 0,2 до 1,2 мМ. За низьких концентрацій стронцію – 0,2-0,4 мМ скорочення тривалості реакції було незначним, надалі, за 0,6 мМ, було зафіксовано значне скорочення часу, необхідного на індукцію каталітичної активності плазміногену комплексу. За подальшого зростання концентрації стронцію стимулюючий ефект зростав незначно з виходом на плато в районі 0,8-1,0 мМ.

Впливу стронцію на первинне зв’язування Глу-плазміногену з антиплазміногеновим моноклональним антитілом IV-1c у згаданому діапазоні концентрацій практично не зафіксовано. Можна говорити хіба за недостовірну тенденцію до стимуляції зв’язування. Швидкість реакції у лаг-періоді була незмінною в діапазоні концентрацій катіонів стронцію від 0 до 0,4 мМ. За концентрації 0,6 мМ було зафіксовано відчутне зростання швидкості, яка надалі не змінювалася, незважаючи на подальше зростання концентрації стронцію. Залежність швидкості другої фази реакції від концентрації стронцію в інкубаційному середовищі мала типовий сигмоїдальний характер з напівмаксимумом за концентрації 0,6 мМ та виходом на плато за концентрацій 0,8 – 1,0 мМ.

Залежність швидкості реакції індукції каталітичної активності плазміногену МОНОКЛОНАЛЬНИМ АНТИТІЛОМ IV-1c від концентрації компонентів

З аналізу залежності швидкості індукції каталітичної активності Глу-плазміногену від його концентрації можна зробити висновок, що лізин-зв’язуючі ділянки вільного Глу-плазміногену не конкурують з такими плазміногену комплексу за С-кінцеві залишки лізину гамма–ланцюгів IV-1c (Рис. 5). Крива зростання швидкості утворення активних центрів у плазміногені за концентрації МКА IV-1c, меншій за концентрацію Глу-Пг, має експоненціальний характер. У цьому випадку концентрація комплексу Пг–МКА IV-1c менша за концентрацію вільного антитіла, тож швидкість індукції каталітичної активності комплексу Пг–МКА IV-1c дещо пригнічується, очевидно внаслідок конкуренції С-кінцевих залишків лізину вільних імуноглобулінів з МКА IV-1c комплексу за лізин-зв’язуючі ділянки кринглових структур плазміногену.

За еквімолярної чи більшої за концентрацію плазміногену концентрації МКА IV-1c “надлишок” C-кінцевих залишків лізину IV-1c помітно інгібує взаємодію лізин-зв’язуючих ділянок Пг з кінцевими залишками лізину антитіла комплексу Пг–IV-1c (Рис. 6). Відтак, крива залежності швидкості індукції каталітичної активності від концентрації МКА IV-1c має характерну куполоподібну форму. Можна сказати, що надлишок МКА IV-1c у цьому разі діє подібно до 6-АГК, займаючи лізин-зв’язуючі ділянки С-кінцевими залишками лізину своїх -ланцюгів. Відсутність інгібуючої дії надлишкових концентрацій Глу-плазміногену, імовірно, можна пояснити закритою конформацією Глу-Пг , в якій його лізин-зв’язуючі ділянки недоступні для С-кінцевих лізинів -ланцюгів IV-1c. Отже, зв’язування С-кінцевих залишків лізину з ЛЗД кринглових структур плазміногену має бути другою стадією формування комплексу.

Інгібування реакції індукції каталітичної активності плазміногену моноклональнИМ антитілОМ IV-1c a2-антиплазміном

Здатність a2-антиплазміну інгібувати комплекси плазміногену з некаталітичними активаторами є важливою характеристикою останніх. Скажімо, a2-антиплазмін не інгібує активність комплексу плазміногену зі стрептокіназою, тоді як зі стафілокіназою пригнічує практично до нуля. Таку різницю, імовірно, можна пояснити відмінностями механізмів індукції каталітичної активності плазміногену різними індукторами, насамперед ступенем експонованості та доступності активного центру плазміногенової компоненти комплексу.

Реакція індукції каталітичної активності Глу-плазміногену дуже ефективно пригнічується a2-антиплазміном (Рис. 7). Уже додавання 1,25 пмоль (5нМ) інгібітора до 25 пмоль (100 нМ) комплексу призводить як до затягування лаг-періоду, так і подовження тривалості швидкої фази реакції. 5 пмоль a2-антиплазміну пригнічують амідолітичну активність комплексу Глу-Пг–МКА IV-1c практично до нуля. Залежність швидкості інгібування a2-антиплазміном лаг-періоду реакції індукції каталітичної активності плазміногену моноклональним антитілом IV-1c є лінійною. Константа п’ятдесятивідсоткового інгібування – І50% – становить 3,5 пмоль. Таким же є характер інгібування і другої фази реакції, з тією різницею, що І50% становить 0,86 пмоль. Очевидно, під час другої фази реакції індукції взаємодія інгібітора з плазміногеном комплексу є специфічною за активним центром, тоді як під час лаг-періоду, найімовірніше, гальмування реакції відбувається внаслідок конкуренції за лізин-зв’язуючі ділянки плазміногену антитіла та інгібітора.

Загально відомим є, що повне пригнічення активності плазміногену, активованого фізіологічними активаторами, досягається за співвідношення фермент : інгібітор – 1:1,4-1,5. З кривої залежності швидкості реакції індукції каталітичної активності Глу-плазміногену МКА IV-1c від концентрації плазміногену ясно видно, що по досягненні еквімолярного співвідношення Пг-МКА IV-1c швидкість реакції перестає зростати. Зі сказаного можна зробити висновок, що комплекс плазміноген-антитіло має амідолітичну, але не активаторну активність, тобто наявний в інкубаційному середовищі вільний плазміноген не активується до плазміну. Отже, a2-антиплазмін у даному разі пригнічує амідолітичну активність власне комплексу. Відповідно, зі співвідношення концентрацій інгібітору та комплексу, можна зробити висновок, що індукція каталітичної активності плазміногену МКА IV-1c не є стовідсотковою, конформаційних перебудов, необхідних для експозиції активного центру плазміногену, зазнають приблизно 20% молекул плазміногену, зв’язаних з антиплазміногеновим моноклональним антитілом.

Швидкість утворення активних центрів плазміногенової складової під час індукції каталітичної активності плазміногену МКА IV-1c

За калібрувальною кривою активності плазміну з одержаної кривої залежності швидкості розщеплення субстрату комплексом Пг–МКА IV-1c можна розрахувати швидкість утворення активних центрів на хвилину процесу (Рис. 8). Форма одержаної кривої є типовою для вірогідності розподілу з симетричними початковою і кінцевою ділянками. Така залежність не є характерною для одностадійних реакцій, де швидкість визначено концентрацією реагентів і з її зниженням швидкість експоненційно падає. З її форми, очевидно, можна зробити висновок щодо багатостадійності процесу. Різке зростання амідолітичної активності комплексу може свідчити за появу плазміну та формування, так званого, “позитивного зворотнього зв’язку”, характерного, скажімо, для індукції каталітичної активності плазміногену стрептокіназою.

схема реакції індукції каталітичної активності плазміногену моноклональним антитілом IV-1c

Дослідження впливу фізико-хімічних умов середовища на реакцію індукції каталітичної активності плазміногену некаталітичним антиплазміногеновим моноклональним антитілом IV-1c дало змогу з’ясувати, що для індукції конформаційних перебудов молекули проферменту не є важливим тип зв’язку, а основним критерієм є його енергія. Скажімо для моноклонального антитіла IV-1c основним є гідрофобний зв’язок центру зв’язування антитіла з антигенною детермінантою, який за зростання іонної сили може лише посилюватися та мало залежить від іонного складу розчину. Водночас індукція стрептокіназою значною мірою модулюється тими чи іншими катіонами або аніонами, що вказує на якщо не превалювання іонного типу зв’язків, то принаймні їхній значний внесок до міжмолекулярної взаємодії.

Уявні значення енергії активації реакції індукції антитілом IV-1c є надзвичайно високими – 40 ккал/моль для швидкої фази. Спричинення конформаційних перебудов, які потребують таких високих енергій, накладають певні обмеження на вибір міжмолекулярних зв’язків, задіяних у процесі.

На одночасне протікання принаймні двох процесів протягом лаг-періоду індукції антитілом вказує характер залежності його тривалості від концентрації стронцію. Оскільки подібне скорочення лаг-періоду є і в разі індукції каталітичної активності Ліз-плазміногену порівняно до Глу-форми, можна припустити, що лімітуючою є взаємодія С-кінцевого залишку лізину гамма-ланцюга моноклонального антитіла IV-1c з лізин-зв’язуючими ділянками кринглових структур. Очевидно, первинний контакт антитіла IV-1c з плазміногеном є двостадійним. Спочатку відбувається взаємодія за антигенною детермінантою за механізмом розпізнавання антиген-антитіло. Лише потому С-кінцевий залишок лізину гамма-ланцюга антитіла контактує з лізин-зв’язуючою ділянкою кринглових структур плазміногену. Різниця тривалості лаг-періоду різних форм плазміногену, найімовірніше, можна пояснити закритою конформацією Глу-плазміногену, а відтак нижчою доступністю його лізин-зв’язуючих ділянок. Імовірність останньої взаємодії не є стовідсотковою, за що свідчать результати кінетики інгібування активності комплексу a2-антиплазміном. Різке падіння швидкості реакції дає змогу визначити вказану цифру точніше, як 5 пмоль або, приблизно, 20 відсотків від загальної кількості плазміногену. Це є зайвим підтвердженням неодномоментної взаємодії двох центрів зв’язування та значення орієнтації молекул відносно одна одної.

Оптимум рН індукції каталітичної активності плазміногену МКА IV-1c, принаймні, стосовно амідолітичної активності щодо синтетичного субстрату S2251, становить 6,4, що є відповідним нейтральному значенню. Слід підкреслити наявність зони так званого “переходу” на кривій залежності швидкості реакції від рН середовища у діапазоні рН 5,6 - 7,0, відповідному зоні іонізації імідазолу гістидину. Відтак, найлогічніше пояснити рН оптимум реакції індукції каталітичної активності впливом концентрації протонів безпосередньо на експонований активний центр плазміногену.

На підставі проведених експериментів було сформульовано схему індукції каталітичної активності плазміногену антиплазміногеновим моноклональним антитілом IV-1c (Рис 9). Початковою фазою реакції є взаємодія антитіла з плазміногеном за звичайним механізмом антигенного розпізнавання. Зв’язування антитіла з антигенною детермінантою спричиняє механічне напруження молекули Глу-плазміногену, що зрештою призводить до його конформаційних перебудов і переходу у відкриту, Ліз-подібну конформацію. Цей перехід полегшує доступність кринглових структур Глу-плазміногену та створює передумови зв’язування з однією з них С-кінцевого залишку лізину гамма-ланцюга імуноглобуліну. Остання взаємодія є ключовою у переході від лаг-періоду, коли молекула плазміногену амідолітичної активності не виявляє, до другої фази реакції. Швидкість конформаційної перебудови молекули плазміногену, яка призводить до експозиції активного центру свідчить, що для неї достатньо самого по собі факту одночасної взаємодії молекули антитіла з плазміногеном з протеїназним доменом і кринглами. Експонований активний центр плазміногену виявляє активаторну активність стосовно плазміногенів інших комплексів, що зрештою призводить до накопичення в інкубаційному середовищі плазміну та формування позитивного зворотнього зв’язку. Подібна вибірковість, коли активується лише плазміноген комплексу, вказує на неповну доступність активного центру та можливу участь антитіл комплексів в орієнтації молекул плазміногену одна відносно одної для активації.

ВИСНОВКИ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

Список опублікованих праць за темою дисертації.

1.

2.

Особистий внесок здобувача – одержання чистих антитіл, характеристика препарату антитіл, визначення впливу на процес індукції конформації проферменту та визначення швидкості некаталітичної активації, взято безпосередню участь в обговоренні, підготовано публікацію.

3.

Особистий внесок здобувача – одержання чистих антитіл, характеристика препарату антитіл, дослідження впливу фізико-хімічних умов середовища на індукцію каталітичної активності плазміногену моноклонального антитіла IV-1c, здатності a2-антиплазміну