НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ

ім. Д.К.ЗАБОЛОТНОГО

САМОЙЛЕНКО ВАДИМ АНАТОЛІЙОВИЧ

УДК 579.252.5+582.232.2

ДОСЛІДЖЕННЯ СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНОЇ ОРГАНІЗАЦІЇ ПЛАЗМІДИ pSM1 ТА СТВОРЕННЯ ВЕКТОРА ДЛЯ ЦІАНОБАКТЕРІЇ PLECTONEMA BORYANUM

03.00.07 – мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі вірусів водоростей Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного Національної Академії Наук України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Менджул Михайло Іванович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України, завідувач відділу вірусів водоростей.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, член-кор. НАН України Мацелюх Богдан Павлович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу генетики мікроорганізмів

кандидат біологічних наук Михальський Леонід Олександрович, Національний Університет “Києво-Могилянська академія”, доцент кафедри біології природничого факультету

Провідна організація: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ

Захист дисертації відбудеться “17” вересня 2003р. о 1000 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 по захисту докторських дисертацій при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154.

Автореферат розісланий 12.08.2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник Л.М.Пуріш

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Ціанобактерії є найбільш поширеними в навколишньому середовищі прокаріотичними мікроорганізмами з фотоавтотрофним типом живлення. Їх клітини поєднують в собі унікальні фізіологічні, біохімічні та морфологічні особливості. Саме тому ціанобактеріальні системи є цінними об’єктами як для фундаментальних досліджень так і для практичного використання.

Завдяки своїй убіквітарності та широкій розповсюдженості ціанобактерії використовуються для екологічного моніторингу. Невибагливість до умов культивування та здатність до синтезу біологічно активних речовин дозволяють створювати на їх основі перспективні технології виробництва ряду препаратів медико-біологічного напрямку (Patterson, 1996). В той же час, для цих мікроорганізмів характерна прокаріотична організація клітини в поєднанні з досконалим фотосинтетичним апаратом та нітрогеназним ферментативним комплексом (Patterson, 1996; Houmard, 1995). Тому ціанобактерії можуть бути унікальними об’єктами для фундаментальних досліджень в області оксигенного фотосинтезу та азотфіксації. Ці дослідження значною мірою гальмуються відсутністю ефективних векторних систем для клонування та експресії ціанобактеріальних генів. Останніми ж роками спостерігається певний прогрес у цьому напрямку. Так, не зважаючи на те, що майже всі виявлені ціанобактеріальні плазміди є криптичними (Forterre, 1999), деякі з них були використані для конструювання шатл-векторів. Ці конструкції несуть зручні маркерні гени стійкості до антибіотиків проте, лише невелика кількість таких векторів здатна деякий час реплікуватися в клітинах окремих штамів ціанобактерій та Escherichia coli. Слід зазначити, що всі ці системи мають ряд суттєвих недоліків, серед яких великі розміри вектора та, як правило, його нестабільність в клітинах господарів. Тому їх використання значно ускладнює методологію досліджень генетики ціанобактерій.

Отже, актуальним є дослідження саме невеликих плазмід ціанобактерій та створення на їх основі більш ефективних та зручних векторних конструкцій. Крім того наявність відповідних шатл-векторів забезпечує можливість молекулярно-генетичних досліджень ціанофагів в системі P.boryanum.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась згідно плану наукових робіт Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного за темою “Створити генно-інженерні конструкції з використанням функціональних елементів геномів ціанофагів для клонування чужорідних генів” - державний реєстраційний номер 01002004336 (виконавець). А також в рамках проекту науково-дослідної роботи за темою “Створення мобільного вектора на основі репліконів ціанобактеріальних і колійних плазмід з метою одержання технологічно важливих штамів ціанобактерій для розвитку фотобіотехнології”, яка була підтримана грантом НАН України для молодих вчених, договір № 43 від 16. 02. 2002 (керівник).

Мета і завдання дослідження. Метою дослідження є вивчення структурно-функціональної організації ендогенної плазміди pSM1 та створення нової системи вектор-господар для ціанобактерії P.boryanum. Відповідно до поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

1. Встановити кількість та розмір плазмід, які може містити ціанобактерія P.boryanum. Відібрати серед них найбільш придатну для створення шатл-вектора. Побудувати для неї фізичну карту.

2. Визначити локалізацію, розмір та функції основних структурно-функціональних елементів плазміди та встановити межі мінімального реплікону, який міг би самостійно підтримуватись в ціанобактеріальних клітинах.

3. На основі плазмідного міні-реплікону створити повноцінну шатл-векторну конструкцію для клонування та експресії практично важливих генів в ціанобактеріальній системі.

4. Підібрати ефективний і невибагливий метод переносу вектора до клітин ціанобактерії P.boryanum та визначити його оптимальні умови.

5. Дослідити здатність шатл-вектора підтримуватись в клітинах P.boryanum і E.coli та зберігати в них свою структурно-функціональну цілісність.

Наукова новизна результатів дослідження.

- вперше детально досліджено структурно-функціональну організацію ендогенної плазміди pSM1, що відноситься до особливої групи майже ідентичних плазмід ціанобактерій родів Plectonema та Phormidium;

- продукт експресії гена rep плазміди pSM1 віднесено до Rep-білків надродини І, що було зроблено вперше для реплікативних білків ціанобактеріальних плазмід;

- вперше на основі природного міні-реплікону – плазміди pSM1, було створено новий шатл-вектор, який є найменшим серед відомих на сьогодні ціанобактеріальних векторів;

- вперше показана принципова можливість застосування метода непрямого кон’югативного переносу для введення генетичної інформації в клітини ціанобактерії P.boryanum. Його ефективність перевищує існуючі методи введення генетичної інформації в нитчасті ціанобактерій.

Практичне значення отриманих результатів. Шатл-векторна конструкція, створена на основі реплікону pSM1, є повноцінним вектором для клонування та експресії чужорідних генів в ціанобактеріальній системі. Тому розроблена система вектор-господар є методологічним інструментом для дослідження структурно-функціональної організації генів ціанобактерій та їх вірусів – ціанофагів. Векторна система також може бути перспективним базисом для розробки новітніх методів біотехнології з використанням ціанобактерій групи LPP.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора. Автором дисертації критично опрацьовані літературні джерела та самостійно виконані всі основні експериментальні дослідження, проаналізовані і узагальнені їх результати та обґрунтовано науково-практичні висновки. Автором самостійно здійснена математична обробка експериментальних даних, підготовка публікацій за результатами досліджень і їх представлення на наукових конференціях. Дослідження проводились у відділі вірусів водоростей Інституту мікробіології і вірусології НАН України.

Експерименти по визначенню нуклеазного бар’єру клітин ціанобактерії P.boryanum проводились спільно з провідним інженером відділу вірусів водоростей Н.В. Цимбал, а визначення нуклеотидної послідовності ціанобактеріальної плазміди pSM1 проводилось на кафедрі мікробіології, вірусології та імунології Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця спільно з к.б.н. Г.В. Панасенком, за що автор роботи висловлює свою глибоку вдячність. Автор також висловлює щиру подяку за плідне співробітництво своїм колегам: кандидатам біологічних наук С.О. Сирчіну, Т.Г. Лисенко, інженерам І.Д. Мошинському, О.О. Шаїнській та І.Д.Бусахіній.

Автор висловлює особливу подяку науковому керівнику д.б.н. проф. М.І. Менджулу за всебічну допомогу при плануванні експериментів та обговоренні одержаних результатів.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень та положення дисертації доповідались та обговорювались на засіданні II (IX) з’їзду Мікробіологічного товариства України (Чернігів 2000); на конференції з генетики та молекулярної біології для студентів та молодих науковців, присвяченій сторіччю генетики (Львів 2000); на конкурсі експериментальних робіт молодих дослідників ІМВ НАНУ (Київ 2000); на III Міжнародній конференції “Біоресурси та віруси” (Київ 2001); на конкурсі експериментальних робіт молодих дослідників ІМВ НАНУ, присвяченому 135-й річниці з дня народження Д.К. Заболотного (Київ 20001); на конференції для студентів, аспірантів та молодих науковців по молекулярній генетиці (Київ 2001); на конкурсі експериментальних робіт молодих дослідників ІМВ НАНУ (Київ 2002); в матеріалах спільного засідання відділів біохімії мікроорганізмів, фізіології промислових мікроорганізмів, фітопатогенних мікроорганізмів, загальної та ґрунтової мікробіології, вірусів мікроорганізмів, вірусів водоростей, молекулярної біології вірусів, мікоплазмології Інституту мікробіології і вірусології НАНУ (Київ 2003)

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 9 наукових робіт з них 5 статей у фахових журналах та 4 в інших виданнях.

Структура і обсяг дисертаційної роботи. Дисертаційна робота викладена на 133 сторінках машинописного тексту і складається з таких структурних одиниць: “Вступ”, “Огляд літератури”, “Матеріали та методи досліджень”, “Результати досліджень”, “Аналіз та узагальнення результатів дослідження”, “Список літератури”, який містить 140 посилань (з них 124 іноземні видання).

Робота містить 4 таблиці, 33 рисунки та 2 додатки.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

У п’яти підрозділах огляду літератури розглянуті сучасні уявлення про біологію ціанобактерій та їх придатність для створення системи вектор-господар. Докладно висвітлено відомості про ціанобактеріальні плазміди, можливість конструювання на їх основі векторів та шляхи їх введення в клітини ціанобактерій.

РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Об’єктом досліджень була аксенічна культура ціанобактерії P.boryanum Gom, штам CALU 465 (Rippka et al., 1979). Вирощування культури проводили на середовищі Фітцджеральда або BG-11 при температурі 26-280С та освітленні 1200-1800 лк. В роботі також використані штами E.coli: XL-1, DH1 та J53, які вирощували в стандартних умовах на агаризованому чи рідкому середовищі LB.

Плазмідну ДНК із клітин E.coli виділяли, використовуючи метод лужної екстракції (Плазмиды, 1990). Плазмідну ДНК з клітин P.boryanum виділяли методом лужної та фенольної екстракції (Grant et al., 1982), а також модифікованим методом висолювання 1М NaCl, після попередньої деградації клітин розчином лізоциму та додецилсульфату натрію. (Bauer et al., 1995; Grant et al., 1982; Haumard et al., 1988). При необхідності виділення плазмідної ДНК з транскон’югантів, ціанобактеріальну культуру попередньо перевіряли на контамінацію донорними клітинами E.coli, кількість яких не повинна була перевищувати 10х101 кл/мл. Додаткову очистку препаратів ДНК проводили шляхом ізопікнічного центрифугування в градієнті концентрації CsCl з додаванням бромистого етидію (Sambrook et al., 1993). Препарати ДНК зберігали при -200С.

Визначення резистентності до антибіотиків клітин P.boryanum проводили за стандартних умов вирощування ціанобактерії. Нуклеазну активність цілісних клітин P.boryanum оцінювали за ступенем гідролізу ДНК плазміди pUC19.

Введення плазмідної ДНК в клітини E.coli проводили стандартними методами (Sambrook et al., 1993). Введення плазмідної ДНК в клітини P.boryanum проводилось двома методами: трансформації (Chauvat et al., 1986;. Grigorieva et al., 1982) та мобілізації (Elhai et al., 1988; Elhai et al., 1997) з деякими модифікаціями. Перед трансформацією клітини P.boryanum обробляли розчином CaCl2 в концентрації від 20 до 200 мМ.

Рестрикційний аналіз та молекулярне клонування фрагментів ДНК здійснювали за стандартними методиками. Нативні препарати ДНК та їх рестрикційні фрагменти розділяли методом електрофорезу в гелях агарози та ПААГ. Для електрофорезу були використані стандартні ТАЕ та ТБЕ буфери (pH8,0).

Послідовність нуклеотидів плазміди pSM1 була визначена з використанням автоматичного сиквенатора CEQ 2000 XL фірми “Beckman”.

Для комп’ютерного аналізу нуклеотидної та амінокислотної послідовності були використані наступні програми: BLАSTN та BLASTP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), BCM Gene Finder (http://searchlancher.bcm.tmc.edu/gene-finder/gf), Promoter Scan (http://www.bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/), Hopp and Woods (http://bioinformatics.weizmann.ac.il), SOPM (http://npsa-pbil.ibcp.fr), Graphical Phylogenetic trees (http://www.genebee.msu.su.clustal/basic), а також програми ClustalW.

РОЗДІЛ 3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Пошук ендогенної плазміди P. boryanum придатної для конструювання шатл-вектора та її фізичне картування

За допомогою метода висолювання 1М NaCl плазмідної ДНК після попередньої деградації клітин ціанобактерії розчином лізоциму та додецилсульфату натрію встановлено, що клітини P.boryanum містять три плазміди: велику – розміром біля 55 т.п.н., середню – 12 т.п.н. і малу – 1,5 т.п.н. (рис. 1).

Малу плазміду було позначено як pSM1. Керуючись тим, що саме невеликі плазміди є найбільш перспективними для створення векторів, в подальшому дослідження були сконцентровані саме навколо неї. Плазміду pSM1 вдалося клонувати в E.coli-вектор pBluescriptIISK(+) та отримати дві проміжні конструкції – pBSM1 і pBSM2. Ці конструкції виявились необхідними як для фізичного картування та визначення нуклеотидної послідовності ДНК плазміди, так і для конструювання шатл-вектора.

За допомогою рестрикційного аналізу було побудовано фізичну карту для pSM1, на якій вказано локалізацію 15 сайтів рестрикції для 8 рестриктаз. Встановлено, що ймовірність трапляння тетрапаліндромного PvuI-сайту в ДНК ціанобактеріальної плазміди в 42,9 рази перевищує теоретично очікувану.

Вибір і визначення оптимальних умов метода введення векторних конструкцій в клітини P. boryanum

Вектор, як необхідний атрибут системи вектор-клітина, повинен містити в своєму складі ряд зручних маркерних генів, здатних змінити фенотип господара, забезпечуючи тим самим ефективний відбір трансформованих клітин. Розроблені на сьогоднішній день ціанобактеріальні системи базуються, в основному, на чутливості ціанобактерій до широкого спектру антибіотиків. Проте, як маркерні використовуються не ціанобактеріальні гени антибіотикостійкості, наявність яких ще не було доведено, а гени в складі стандартних плазмідних E.coli-векторів. До них можна віднести гени резистентності до ампіциліну, тетрацикліну, хлорамфеніколу, канаміцину та деяких інших антибіотиків. Експериментально було встановлено, що саме до цих антибіотиків клітини P.boryanum є чутливими, що робить їх зручною моделлю для генноінженерних досліджень.

Так, при додаванні до культурального середовища ампіциліну в концентрації 0,01 мкг/мл і вище спостерігається повний лізис культури ціанобактерії. В той же час, під дією антибіотиків, для яких характерна цитостатична дія (хлорамфенікол, стрептоміцин, тетрациклін, канаміцин), наявним є виражений цитостатичний ефект (рис. 2). Так протягом 8 – 10 год. щільність клітин в культуральному середовищі значно зменшувалась в випадку використання високих концентрацій антибіотиків, проте повний лізис не спостерігався. Виключенням є тільки тетрациклін, який викликає в концентрації біля 5 мкг/мл повний лізис клітини P.boryanum.

Однак необхідно зазначити, що для ціанобактерії P.boryanum період подвоєння біомаси складає біля 24 год. Тому саме оцінка динаміки росту культури протягом декількох днів в присутності антибіотиків в концентрації від 1 до 500 мкг/мл, дозволила точно встановити їх робочі концентрації. Так, встановлено, що робочій дозі для ампіциліну відповідає концентрація 0,01 мкг/мл, тетрацикліну 2,5 – 5 мкг/мл, хлорамфеніколу – 5–25 мкг/мл, стрептоміцину – 10–50 мкг/мл і канаміцину – 25–100 мкг/мл.

Вибір метода трансформації вимагає якомога повної інформації про наявність нуклеазного бар’єру бактеріальної клітини. Нуклеазний бар’єр знижує ефективність трансформації чи навіть унеможливлює цей процес. Перепоною на шляху проникнення генетичної інформації в середину клітини може бути ДНК-азна активність культурального середовища.

Повна відсутність гідролізу плазмідної ДНК під дією культурального середовища, свідчить про те що клітини P.boryanum за стандартних для культивування умовах не здатні секретувати вільну ДНКазу. Однак обробка ціанобактеріальних клітини буфером, який містить неіонний детергент Тритон Х-100, призводить до того, що в середовищі інкубації з’являється нуклеазна активність. Елюція нуклеази в таких умовах може свідчити про її асоціацію з біліпідною мембраною на поверхні клітин. Нуклеазна активність починає тестуватися вже після 5 хв. інкубації клітин в буфері з детергентом і досягає максимуму після 60 хв. (рис. 3). Досліджуваний фермент має ендонуклеазну активність, що призводить до переходу кільцевої ковалентно замкненої форми плазмідної ДНК в лінійну форму. З часом гідролізу піддається спочатку релаксована, а потім лінійна форми плазміди без утворення чітких дискретних фрагментів ДНК, що свідчить про неспецифічний характер дії ферменту.

Для введення генетичної інформації в клітини P.boryanum було випробувано два основних метода: трансформація і непрямий кон’югативний перенос. Останній метод дозволяє мобілізувати вектор з клітин E.coli в клітини реципієнта за участю двох плазмід: кон’югативної, наприклад, RP4 та хелперної – pGJ28. Тому в зв’язку з тим, що вектор не здатний самостійно мобілізуватися з причини відсутності в його складі всіх необхідних для цього детермінант, описаний варіант кон’югативного переносу є непрямим.

Закономірним виявилось питання про вибір типу векторних конструкцій для введення їх в ціанобактерію за допомогою зазначених методів. Так, для мобілізації векторна конструкція повинна містити в своєму складі специфічну послідовність нуклеотидів – bom-елемент. Цю послідовність впізнає, а потім нікує продукт експресії гена mob хелперної плазмід pGJ28. Тому для конструювання шатл-вектора в якості базисної була обрана плазміда pBR322 оскільки саме вона містить послідовність подібну до bom-елементу.

При перевірці можливості використання трансформації для введення векторних конструкцій ціанобактеріальні клітини обробляли CaCl2, з метою надання їм компетентності, а донорну ДНК – спермідином з метою захисту її від деградації. Щоб встановити придатність метода трансформації в якості донорної ДНК використовували конструкцію pBSM1, що містить ген стійкості до ампіциліну. Але, як показали всі проведені експерименти, трансформація не може забезпечити проникнення в ціанобактеріальні клітини чужорідної ДНК. Для того щоб впевнитися в негативних результатах була поставлена серія експериментів за різних умов. При цьому змінювали концентрацію донорної ДНК, час її експозиції з акцепторними клітинами під час темнової фази і на світлі, інтенсивність освітлення, а також концентрацію ампіциліну в селективному середовищі.

Відсутність стійких до антибіотика клітин P.boryanum після трансформації конструкцією pBSM1 свідчить про неспроможність ціанобактерій поглинати донорну ДНК безпосередньо з культурального середовища. Інша причина, а саме нездатність цієї конструкції підтримуватися в клітинах P.boryanum, була відкинута, оскільки непрямий кон’югативний перенос конструкції pSTS1 – похідної від pBSM1, дав позитивні результати.

Отже, метод непрямого кон’югативного переносу є саме тим методом, за допомогою якого можна обійти нуклеазний бар’єр ціанобактеріальних клітин. Всі експерименти по мобілізації pSTS1 проводились з фізіологічно активними клітинами, які знаходились в середині експоненціальної фази росту. Кон’югативний перенос на нітроцелюлозні фільтри дозволив відібрати ціанобактеріальні кон’юганти, які були резистентні до ампіциліну в концентрації 10 мкг/мл (рис.4). З метою перевірки того, що причиною резистентності клітин P.boryanum до ампіциліну є кон’югативний перенос саме pSTS1 було поставлено контрольний експеримент (рис.5).

Оптимальні умови кон’югативного переносу були визначені при допомозі серії спеціальних дослідів. Зокрема, для перевірки впливу віку клітин реципієнта на ефективність кон’югативного переносу використовували 4-х добову (ОГ600 =0,3) і 2-х тижневу (ОГ600 =1,2) культуру P.boryanum. Отримані результати дозволили зробити висновок, що вік культури не впливає на ефективність методу.

Для відповіді на питання чи може бути вік донорних клітин критичним параметром кон’югативного переносу, культуру клітин E.coli, відібрану в експоненціальній фазі росту, заміняли на клітини, які знаходяться в стаціонарній фазі росту (нічна культура). Незначна відмінність, яка спостерігалась при кон’югативному переносі векторної конструкції в клітини P.boryanum знаходилась в межах похибки метода. Отже, вік донорних штамів E.coli помітно не впливає на ефективність метода.

У дослідженнях впливу концентрації донорних клітин на кон’югативний перенос вектора, були використані штами клітин E.coli у експоненціальній фазі росту. Встановлено, що підвищення ефективності кон’югативного переносу носить нелінійний характер, тобто при збільшенні концентрації донорних клітин в 10 разів ефективність переносу збільшувалась не більше ніж в 1,5 – 2 рази.

Час, необхідний для переносу вектора в реципієнтні клітини P.boryanum і експресії гена стійкості до антибіотику, було визначено в наступній серії експериментів. Фільтри переносили на селективне середовище одразу після нанесення на них клітин, а також через 16, 24, 40 годин після попередньої їх інкубації на неселективному середовищі BG-11. У випадку, коли фільтри переносили на селективне середовище безпосередньо після нанесення на них клітин, ефективність кон’югативного переносу значно знижувалась. В варіантах з 16-, 24- і 40-годинною інкубацією фільтрів на неселективному середовищі ефективність кон’югації підвищувалась. Але, як показали досліди, збільшення тривалості інкубації фільтрів на неселективному середовищі більше доби значно погіршує умови відбору кон’югантів і тому стандартним часом попередньої інкубації клітин без антибіотика було обрано 24 години.

Отже ефективність метода непрямого кон’югативного переносу суттєво не залежить від таких параметрів як фаза росту культур, концентрація донорних та реципієнтних клітин, інтенсивність освітлення та тривалість передінкубаційного періоду. Це свідчить про його невибагливість. За стандартних умов ефективність кон’югативного переносу pSTS1 в клітини P.boryanum становить – 1·10-4-1,5·10-4

Однак слід зазначити, що відібрані транскон’юганти P.boryanum швидко втрачають стійкість до ампіциліну очевидно в зв’язку з нестабільністю в клітинах ціанобактерії конструкції pSTS1. Для створення стабільного вектора з’явилась потреба в детальній інформації стосовно структурно-функціональної організації плазміди pSM1, яка використовувалась як ціанобактеріальний міні-реплікон. Тому на наступному етапі досліджень було сиквеновано фрагмент ДНК ціанобактеріальної плазміди та проведено комп’ютерний аналіз отриманої послідовності.

Комп’ютерний аналіз нуклеотидної послідовності ДНК ціанобактеріальної плазміди pSM1.

Проведений сиквенс фрагмента ціанобактеріальної плазміди pSM1 (в складі проміжної конструкції pBSM1) та його комп’ютерний аналіз виявились достатніми для встановлення не тільки структурно-функціональної організації міні-реплікона, а й для виявлення його філогенетичної спорідненості з іншими плазмідами мікроорганізмів. Останнє може виявитись корисним для створення вектора з широким спектром господарів.

Отже, на першому етапі аналізу послідовності нуклеотидів була виявлена майже повна ідентичність ціанобактеріальної плазміди pSM1 з плазмідами pPF1 (Phormidium foveolarum штам М43), pGL3 (Plectonema boryanum (штам не вказаний), pBPLX (Plectonema boryanum штам UTEX 581) і pPB1 (Plectonema boryanum РСС 6306). Для зручності викладення матеріалу навмисне на цьому не акцентувалась увага. Однак слід зазначити, що структурно-функціональна організація цих плазмід буде також майже ідентичною. Це має важливе значення оскільки pGL3 та pPF1 зовсім майже не вивчались, в той час як літературних даних стосовно pBPLX і pPB1 взагалі немає.

На початковому етапі аналізу за допомогою програми Promotor Scan було встановлено, що досліджувана послідовність ДНК плазміди pSM1 не містить консенсусних мотивів промотору. Разом з цим показано, що послідовність нуклеотидів, так само як і амінокислотна послідовність, яку вона здатна кодувати, є, до певної міри, унікальними. На користь цього свідчить майже повна відсутність їх гомології з будь якими бактеріальними послідовностями нуклеотидів та амінокислот, що містяться в найбільш широко відомих базах даних. Отримані результати дещо ускладнюють подальший аналіз отриманої нуклеотидної послідовності, тому його проводили за схемою, викладеною нижче.

Так, аналіз з використанням бази даних Pfam, яка містить послідовності не окремих білків, а консенсусні послідовності їх сімейств, дозволив встановити, що один з продуктів умовної трансляції довжиною 336 а.з., є спорідненим з сімейством Rep-білків. Білки цього сімейства асоційовані з реплікацією плазмідної ДНК. Але низький ступінь гомології їх консенсусної послідовності з отриманою послідовністю амінокислот не дозволяє з впевненістю стверджувати, що pSM1 містить ген Rep-білка.

На наступному етапі необхідно провести пошук консервативних мотивів характерних для сімейства Rep-білків в дедукованій амінокислотній послідовності плазміди pSM1. Для цього була зроблена спроба використати якомога більше Rep-білків ціанобактеріальних плазмід. Однак виявилось, що база даних нуклеотидних послідовностей містить ряд плазмід, для яких не встановлено наявність гену rep.

Нуклеотидну послідовність цих плазмід було умовно трансльовано, і один з отриманих амінокислотних ланцюгів за ознакою наявності в ньому консервативних мотивів використовували для подальшого порівняльного аналізу. Їх здатні кодувати такі ціанобактеріальні плазміди як pSY10 (Synechococcus sp. NKBG 042902) pMA4 (Synechococcus sp. штам MA4) та pRF1 (Plectonema sp. штам PCC 6402). В аналізі також були використані Rep-білки інших, вже досліджених ціанобактеріальних плазмід: pCA2.4 (Synechocystis PCC 6803), pNostoc (Nostoc sp. PCC 6705) та pMA1 (Microcystis aeruginosa Kutsing), а також Rep-білки плазміди pUB110 (Staphilococcus aureus) та двох плазмід архей pHGN1 (Haloarchaeal coccus) та pGRB1 (Halobacterium sp). За допомогою програми ClustalW було проведено вирівнювання досліджуваної амінокислотної послідовності та послідовностей вище вказаних Rep-білків. Результати такого вирівнювання дозволили виділити щонайменше три консервативних мотиви, які, розміщені в однаковому прядку у всіх проаналізованих амінокислотних послідовностях (рис.6). Перший мотив – мотив заякорювання, другий – мотив зв’язування з катіоном двухвалентного металу, третій мотив містить амінокислоти, які безпосередньо входять до складу активного центру Rep-білків. Таким чином, досліджувану амінокислотну послідовність, отриману в результаті трансляції сиквенованого фрагменту ДНК плазміди pSM1, можна ідентифікувати як послідовність Rep-білка.

За ознакою наявності двох залишків тирозину в активному центрі реплікативного білка плазміди pSM1 його було віднесено до надродини І. Тому можна стверджувати, що цей Rep-білок під час реплікації плазміди знаходиться в мономерному стані на відміну від Rep-білків надродини ІІ. Таким чином реплікативний білок плазміди pSM1 так само як і гомологічний йому Rep-білок іншої плазміди pMA4 поки що єдині представники ціанобактеріальних Rep-білків надродини І.

Той факт, що перед першим мотивом – мотивом заякорювання, міститься лише один залишок метіоніну, який до того ж є першим в послідовності, дозволяє ідентифікувати його як стартовий. Місце цього залишку свідчить про те, що повна довжина досліджуваного білка становить 336 а.з., а гену, який кодує цю послідовність – 1008 п.н.

Отже, встановлена локалізація єдиного гену в плазміді pSM1 дозволяє контролювати його структурно-функціональну цілісність при створенні стабільного вектора для ціанобактерії P.boryanum. Однак для цілеспрямованої модифікації гену, з метою виведення вектора з під контролю клітини-господаря, та збільшення його копійності необхідно якомога повніше визначити структуру та особливості функціонування Rep-білка. Для цього було проведено детальний порівняльний аналіз вторинної структури та профілів гідрофобності амінокислотних ланцюгів Rep-білка плазміди pSM1 з деякими вище зазначеними Rep-білками інших RCR-плазмід.

В результаті аналізу було встановлено ряд спільних рис між білками різних за походженням плазмід. Так їх вторинна структура та гідрофобність амінокислотних залишків консервативних мотивів в основному виявились схожими. Основною відмінністю Rep-білка плазміди pSM1 є наявність унікальної послідовності амінокислот довжиною 50 а.з. в центральній частині амінокислотного ланцюга. Неупорядкована вторинна структура та одноманітність профілю гідрофобності цього фрагменту дозволяють виділити його в окремий структурний елемент білка з невідомою функцією. Слід зазначити, що цей фрагмент відсутній у всіх досліджуваних Rep-білках ціанобактеріальних плазмід грампозитивних бактерій та архей.

Парадоксальність такої спорідненості повторюється і на філогенетичному дереві Rep-білків (рис.7). Результати філогенетичного аналізу свідчать, що Rep-білки ціанобактеріальних плазмід pSM1 та pMA4 утворюють єдину гілку, відмежовуючись від Rep-білків п’яти інших ціанобактеріальних плазмід: pMA1, pRF1, pCA2.4, pSY10 та pRF1. Останні в свою чергу є спорідненими з Rep-білком плазміди pUB110. Реплікативні білки двох плазмід архей виявились спорідненими з Rep-білками pSM1 та pMA4.

Таким чином, проведений філогенетичний аналіз дозволяє визначити можливий спектр хазяїв для шатл-вектора на основі плазміди pSM1. Для встановлення більш детальної структури Rep-білка визначали можливі домени його амінокислотної послідовності, які беруть участь у специфічному впізнанні та зв’язуванні певних послідовностей ДНК. Результати аналізу за допомогою програми ProScan показали, що Rep-білок плазміди pSM1 містить два гіпотетичних ДНК-зв’язуючих домени (рис. 8). Перший домен довжиною біля 40 а.з розміщений ближче до С-кінця послідовності, другий – довжиною біля 50 а.з. – до N-кінця. Амінокислотна послідовність обох мотивів здатна утворювати по дві структури типу ?-спіралі. Наявність ?-спіралей є необхідною умовою для ефективного зв’язування дволанцюгової ДНК (Страйер, 1984). Аналіз літературних джерел дозволяє зробити припущення, що перший домен відповідає за специфічне впізнавання ori реплікації плазміди, другий – операторної області гену rep.

Висока ступінь гомології pSM1 із ціанобактеріальними плазмідами pGL3, pPF1, pBPLX та pPB1 дозволяє з високою ймовірністю встановити місце ori-сайту реплікації для них (рис. 9). Кожна з цих плазмід містить по чотири інвертовані повтори з кором у вигляді PvuI-сайтів. Вторинна структура, яку здатні утворювати такі послідовності ДНК, властива багатьом аналогічним плазмідам і виконує вона функцію ori реплікації. Тому фрагмент нуклеотидної послідовності плазміди pSM1, який містить сайти для рестриктази PvuI, було ідентифіковано як ймовірний ori реплікації (рис.9).

Вся отримана інформація відносно структурно-функціональної організації ціанобактеріальної плазміди pSM1 приймалась до уваги в ході конструювання шатл-вектора для P.boryanum.

Удосконалення векторних властивостей шатл-вектора

При створенні стабільного вектора необхідно було встановити функціональність гіпотетичного гена білка Rep та ori реплікації і визначити їх взаємне розміщення у складі конструкції. З цією метою було отримано ряд рекомбінантних плазмід pSTS-серії на основі як повнорозмірної pSM1 так і її окремих фрагментів. Векторні властивості цих конструкцій оцінювали за наступними критеріями: чутливість отриманих транскон’югантів до ампіциліну і тетрациклінну, ефективність кон’югації та наявність конструкції в клітинах транскон’югантів (табл.1).

Таблиця 1

Векторні властивості плазмідих конструкцій серії pSTS

Конструкції серії pSTS |

Результати кон’югативного переносу

Чутливість транскон’югантів до антибіотику (мкг/мл) | Ефективність кон’югації | Наявність конструкції в клітинах транскон’югантів

ампіциліну | тетрацикліну

pSTS1 | 10 | не виявлено | 1·10-4 –1,5·10-4 | не виявлено

pSTS2 | 10 | 75 | 1·10-4 –1,5·10-4 | не виявлено

pSTS3 | не виявлено | не виявлено | 0 | не виявлено

pSTS4 | 40 | 125 | 1,5·10-4 – 1·10-3 | виявлено

Кон’югативний перенос конструкцій в ціанобактеріальні клітини і екстраполяція його результатів на характер розподілу клонованих фрагментів плазміди pSM1 відносно її фізичної карти дозволяє виділити ряд закономірностей (рис. 10). Так, звертає на себе увагу спільна риса конструкцій pSTS1, pSTS2 і pSTS4. Всі вони здатні переноситись в клітини P.boryanum і забезпечувати тимчасову резистентність транскон’югантів, які не втрачали здатності рости на селективному середовищі щонайменше після двох чи трьох пасажів. Якщо проаналізувати розміщення клонованих послідовностей ціанобактеріальної плазміди, можна виділити один спільний елемент – це фрагмент довжиною 410 п.н., який знаходиться між сайтами рестрикції AccI і HpaII і є гіпотетичним ori реплікації. Фрагмент pSM1, яким відрізняється конструкція pSTS4 від інших конструкцій серії pSTS містить ген rep. Саме цей фрагмент разом з ori реплікації забезпечує стабільність вектора в ціанобактеріальних клітинах.

Оскільки конструкція pSTS4, довжиною 5,6 т.п.н., вигідно відрізняється за векторними властивостями інших конструкцій, необхідно було з’ясувати, чи здатна вона зберігати з часом свою структурну цілісність в ціанобактеріальних клітинах. Для цього з транскон'югантів першого і сьомого пасажів виділяли плазмідну ДНК і проводили її ідентифікацію (рис. 11).

Електрофорез в агарозному гелі виділеної плазмідної ДНК дав змогу ідентифікувати плазміду, рухливість якої співпадала з рухливістю вихідної векторної конструкції. Виділену з агарози та очищену плазмідну ДНК використовували для дослідження. Спочатку вона піддавалась рестрикційному аналізу, результати якого співпали з рестрикційним аналізом вихідної конструкції pSTS4. Потім нею трансформували клітини E.coli, що спричинило утворення стійких до ампіциліну і тетрацикліну колоній. Це свідчить про присутність в плазміді генів стійкості до цих антибіотиків та ori реплікації E.coli. Виділену плазмідну ДНК з трансформантів E.coli методом рестрикційного аналізу ідентифіковано як вихідну конструкцію pSTS4. Отже векторна конструкція pSTS4 здатна в незмінному стані реплікуватися як в клітинах P.boryanum, так і в клітинах E.coli.

Таким чином, отримана нами конструкція pSTS4 має всі властивості повноцінного шатл-вектора. До них відносяться: невеликі розміри, стабільна реплікація в клітинах господаря та наявність, щонайменше, двох селективних маркерів з унікальними сайтами рестрикції. Саме використання плазміди pSM1 в якості ціанобактеріального міні-реплікона, який є одним з найменших серед відомих на сьогоднішній день природних репліконів, дозволило отримати шатл-вектор розміром 5,9 т.п.н. До особливостей шатл-вектора слід віднести те, що він є найменшим серед створених до сьогоднішнього часу ціанобактеріальних векторів. Стабільна реплікація вектора відбувається завдяки вірній орієнтації в ньому структурно-функціональних елементів ціанобактеріальної плазміди. Отже на основі шатл-вектора pSTS4 та ціанобактерії P.boryanum отримана нова система вектор-господар. Вона є перспективним і необхідним методологічним інструментом для проведення фундаментальних досліджень в області генетики ціанобактерій і створення біотехнологій нового покоління на основі цих мікроорганізмів.

ВИСНОВКИ

1. Ціанобактерія P.boryanum містить три ендогенні плазміди: велику розміром біля 55 т.п.н., середню – 12 т.п.н. та малу плазміду pSM1 – 1,5 т.п.н. Найбільш придатним методом для їх виділення є метод висолювання NaCl після попередньої обробки клітин лізоцимом та додецилсульфатом натрія.

2. Створена фізична карта ціанобактеріальної плазміди pSM1, яка є повною схемою розміщення 15 сайтів рестрикції для 8 рестриктаз: ClaI, AluI, Csp6I, Cfr13I, HpaII, PvuI, AccI і TaqI. pSM1 містить 4 унікальні сайти і є найменшою серед природних плазмід, що робить її перспективною для створення шатл-вектора.

3. Аналіз нуклеотидної послідовності плазміди дозволив визначити локалізацію, розмір та функції основних її структурно-функціональних елементів: гену rep, довжина якого складає 1008 п.н. та ori реплікації довжиною біля 500 п.н.

4. Продуктом експресії гену rep є білок, асоційований з реплікацією плазміди. Філогенетичний аналіз амінокислотної послідовності білка дозволив віднести його до надродини І, що було зроблено вперше для Rep-білків ціанобактеріальних плазмід.

5. Плазміда pSM1 є природним міні-репліконом і відноситься до класу RCR-плазмід, що реплікуються за механізмом розмотування кільця.

6. Вперше на основі реплікону pSM1 і плазміди pBR322 створено чотири векторні конструкції, одна з яких, pSTS4, є повноцінним шатл-вектором для клонування і експресії практично важливих генів в ціанобактеріальній системі.

7. Векторна конструкція pSTS4 ефективно переноситься в клітини P.boryanum і E.coli шляхом непрямої кон’югації і спричиняє стійкість ціанобактеріальних транскон’югантів до ампіциліну в 400 разів і тетрацикліну в 50 разів. Визначено оптимальні умови метода переносу вектора до клітин ціанобактерії та показана його невибагливість для використання.

8. Структурно-функціональна цілісність шатл-вектора pSTS4 в клітинах P.boryanum і E.coli підтримується протягом багатьох генерацій та послідовних переносів між клітинами господарями.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Менджул М.И., Сырчин С.А., Мошинский И.Д., Самойленко В.А., Цимбал Н.В. Выделение, очистка и клонирование плазмиды pSM1 из цианобактерии Plectonema boryanum // Микроб. журн. – 2000. – Т. 62, №2. – С. 38-44.

2. Сырчин С.А., Самойленко В.А., Цимбал Н.В., Менджул М.И. Физическое картирование плазмиды pSM1 из цианобактерии Plectonema boryanum Gom. штамм CALU // Микроб. журн. – 2001. – Т. 63, №4. – С. 76-84.

3. Самойленко В.А., Цимбал Н.В., Менджул М.И. Опредиление уровня естественной резистентности цианобактерии Plectonema boryanum. Gom. штамм CALU 465 // Бюл. Інст-ту сільськогосп. мікроб. – 2000. - №7. – С. 33-34.

4. Сырчин С.А., Самойленко В.А., Цимбал Н.В., Менджул М.И. Конструирование челночного вектора pSTS1 и отработка способа его введения в клетки цианобактерии Plectonema boryanum Gom. штамм CALU 465 // Микроб. журн. – 2001. – Т. 63, №5. – С. 49-58.

5. Самойленко В.А., Сирчін С.О., Цимбал Н.В., Менджул М.І. Вектори серії pSTS для ціанобактерії Plectonema boryanum Gom. штам CALU 465 // Вісник. Біологія. Київський національний університет імені Тараса Шевченка. – 2001. – Випуск 35. – С. 35-38.

6. Самойленко В.А., Цимбал Н.В., Сирчін С.О., Менджул М.І. Конструювання шатл-вектора для ціанобактерії Plectonema boryanum з метою вивчення структурно-функціональної організації ДНК ціанофагів // Тези міжнарод. конф. "Біоресурси та віруси" – Київ, Україна. – 2001. – С. 18.

7. SamoilenkoTsimbalFisical mapping and cloning of plasmid pSM1 from cyanobacterium Plectonema boryanum 465 // Conf. of genetics and molecular biology. – Lviv (Ukraine). – 2000. P. 53.

8. SamoilenkopSTS4 – vector for Plectonema boryanum 465 // Conf. for student, PhD students and young scientists on molecular biology and genetics. Kyiv (Ukraine). – 2001. P. 23.

9. TsymbalSamoilenkoConjuctive transfer of a shuttle vector for cyanobacterium Plectonema boryanum 465. Conf. of genetics and molecular biology. – Lviv (Ucraine). – 2000. P. 54.

АНОТАЦІЯ

Самойленко В.А. Дослідження структурно-функціональної організації плазміди pSM1 і створення вектора для ціанобактерії – Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеню кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2003.

В дисертаційній роботі представлено результати дослідження структурно-функціональної організації плазміди pSM1 та придатності ціанобактерії Plectonema boryanum CALU 465 для конструювання системи вектор-господар. Отримані результати дозволили створити нову ефективну та функціонуючу векторну систему.

При допомозі рестрикційного аналізу для pSM1 булa побудована фізична карта. Аналіз нуклеотидної послідовності плазміди дозволив встановити механізм її реплікації а також локалізацію і розміри гену rep та ori.

Показано, що клітини P.boryanum виявились чутливими до ампіциліну, тетрацикліну, хлорамфеніколу, стрептоміцину та канаміцину. Також встановлено, що ціанобактеріальним клітинам властива неспецифічна нуклеазна активність, асоційована на поверхні клітинної стінки. В зв’язку з цим, найбільш придатним шляхом введення вектора в ціанобактеріальні клітини є метод кон’югативного переносу. Визначені його оптимальні умови.

Створені конструкції pSTS-серії було введено в клітини P.boryanum з метою визначення їх векторних властивостей. Встановлено, що повноцінний вектор повинен містити повнорозмірну ціанобактеріальну плазміду з цілісними геном Rep-білка та ori. Таким вектором виявилась конструкція pSTS4, яка здатна підтримуватись як в клітинах ціанобактерії P. boryanum так і в клітинах E.coli.

Ключові слова: ціанобактерія, плазміда, фізична карта, первинна структура, вторинна структура, комп'ютерний аналіз, реплікація, шатл-вектор, кон'югативний перенос.

АННОТАЦИЯ

Самойленко В.А. Изучение структурно-функциональной организации плазмиды pSM1 и создание вектора для цианобактерии Plectonema boryanum. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 – микробиология. – Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 2003.

В работе изложены результаты исследований структурно-функциональной организации плазмиды pSM1, выделенной из цианобактерии P.boryanum CALU 465. Изучена культура цианобактерии относительно ее пригодности для создания системы вектор-хазяин. Исходя из особенностей организации плазмиды и свойств цианобактериальных клеток на их основе была создана функционирующая векторная система.

Установлено, что клетки P.boryanum содержат три эндогенные плазмиды, размер которых составляет около 55 т.п.н., 12 т.п.н. и 1,5 т.п.н. Малую плазмиду – pSM1, как наиболее перспективную для конструирования шатл-вектора, удалось клонировать в E.coli-вектор pBluescriptIISK(+) в результt чего было отобрано две промежуточные конструкции – pBSM1 и pBSM2. Эти конструкции оказались необходимыми как для физического картирования pSM1 и определения ее нуклеотидной последовательности, так и для конструирования шатл-вектора для P.boryanum.

В результате