національний аграрний університет

ШАРАНДАК ВАЛЕНТИНА ВАСИЛІВНА

УДК 619:616.98:579.842.14:615.371:636.2.053

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ОБГРУНТУВАННЯ ПЕРОРАЛЬНОГО

МЕТОДУ ІМУНІЗАЦІЇ ТЕЛЯТ ПРОТИ САЛЬМОНЕЛЬОЗУ

16.00.03 – ветеринарна мікробіологія та вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

Київ – 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Білоцерківському державному аграрному університеті

Міністерства аграрної політики України.

Науковий керівник – доктор ветеринарних наук, професор

Івченко Василь Мусійович,

Білоцерківський державний аграрний університет, завідувач кафедри лабораторної діагностики інфекційних захворювань сільскогосподарських тварин

Офіційні опоненти:

доктор ветеринарних наук, професор Скибіцький Володимир Гурійович, Національний аграрний університет, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та біотехнології;

кандидат ветеринарних наук, Павленко Микола Степанович, директор Центральної державної лабораторії ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України

Провідна установа: Інститут ветеринарної медицини УААН, лабораторія ветеринарно-санітарної експертизи продуктів тваринництва, м. Київ

Захист дисертації відбудеться “19” лютого 2003 р. о 10оо год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.03 в Національному аграрному університеті за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв Оборони, 15, навчальний корпус 3, ауд. 65.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв Оборони, 13, навчальний корпус № 4, к. 41.

Автореферат розісланий “17” січня 2003 р.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради ––––––––––––––––––––––––––– Міськевич С.В.

загальна характеристика роботи

Актуальність теми. В Україні у 90-х рр. ХХ ст. відбулося переформування у тваринницьких господарствах поголів’я тварин із колективних ферм у приватні, що ускладнює проведення заходів профілактики. У комплексі заходів, спрямованих на боротьбу із сальмонельозом і профілактику його в телят, важливе значення належить вакцинопрофілактиці. Проте якість вакцинних препаратів поки що не задовольняє спеціалістів ветеринарної медицини (Литвин В.П., 1975; Бортишвили М.П., 1986; Литвин В.П., Поживил А.И., 1991; Ушкалов В.О., 2002). Тому вдосконалення існуючих і створення нових ефективних засобів профілактики сальмонельозу в телят є одним із напрямків досліджень ветеринарної науки.

Загальні та місцеві реакції у телят при парентеральному методі імунізації антигенами ентеробактерій стримують проведення масових щеплень. Концентрована формолвакцина проти сальмонельозу, яка використовується, у 5% телят, щеплених у 10-добовому віці, викликала сильну алергічну реакцію, що закінчувалася летально (Степанюк В.Д., Пластун Ю.Т., 1967). У зв’язку з цим постала необхідність розробки нових підходів до вирішення цієї проблеми.

Ефективність імунізації залежить не лише від доз і якості антигену, а й від способу і місця його введення (Wray C., 1987).

У Комітеті експертів ВООЗ [1991] по боротьбі із сальмонельозом наголошувалось, що після парентерального введення інактивованих корпускулярних або живих вакцин іноді спостерігаються небажані реакції на ендотоксин, особливо у великої рогатої худоби. Пероральне введення вакцини безпечніше за парентеральне і є практично нешкідливим. Пероральна імунізація тварин живими або інактивованими вакцинами створює місцевий кишковий імунітет, суттєво знижує виділення сальмонел інфікованими тваринами. Поряд з удосконаленням вакцин дослідники ведуть пошуки нових методів імунізації, які б не викликали побічних реакцій і забезпечували можливість масової і ефективної імунізації. Сучасні уявлення про тропізм сальмонел до клітин кишечнику та місцевий імунітет сприяли вивченню можливостей застосування перорального методу імунізації (Cohen M.B., Giannella R.A., 1987; Riikonen P., 1992; Zhou Z.X., Deng Z.P., Ding J.V., 1995;).

Проникнення антигену в органи, які є природними воротами збудника інфекції, підтверджені багатьма дослідженнями (Першин Б.Б. с сосавт., 2001; Волинець Л.К., Олійник Л.В. та ін., 2001). У практиці ветеринарної медицини офіційно затверджений метод перорального застосування вірус-вакцин із штамів В1 та Ла-Сота (Селиванов А.В., Хасанов Ч.Г., 1983).

Метод пероральної імунізації є простим і нешкідливим, не потребує спеціального обладнання і не супроводжується різким пригніченням факторів природного захисту, що є особливо важливим при імунізації телят.--При пероральному введенні антигену відбувається поступове проникнення його субстанції з подальшим поширенням її у всьому організмі (Коромыслов П.Ф., 1983). Однак про це зустрічаються лише поодинокі повідомлення. На сьогодні ще не вивчено значення місцевої імунної системи в резистентності організму щодо збудників сальмонельозу. Відсутні комплексні дослідження, присвячені швидкості проникнення антигену через слизову

кишкового каналу та розподілу його в організмі. Не з’ясовано досі й те, якими фак

торами зумовлений розвиток імунітету – місцевими імунологічними реакціями чи

загальною імунною реакцією. Не досліджена імунореактивність телят, перорально імунізованих сальмонельозним антигеном у різному віці після народження.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана згідно з кафедральною тематикою науково-дослідної роботи “Удосконалення методів діагностики і профілактики збудників бактеріальних інфекцій великої рогатої худоби” Білоцерківського державного аграрного університету, є фрагментом держбюджетної угоди №1/16 з Міністерством аграрної політики України, номер держреєстрації 0100U001534.

Мета роботи. Метою дисертаційної роботи було експериментальне обгрунтування перорального методу імунізації телят сальмонельозним антигеном.

Для досягнення мети необхідно було вирішити наступні завдання:

- визначити локалізацію сальмонельозного антигену при пероральному методі імунізації;

- на білих мишах і телятах вивчити вплив дози сальмонельозного антигену на показники імунореактивності при застосуванні його перорально;

? з’ясувати вплив колострального імунітету на показники імунної відповіді телят, перорально імунізованих сальмонельозним антигеном у різному віці після народження;

- розробити рекомендації щодо вдосконалення методів імунопрофілактики захворювання телят на сальмонельоз.

Об’єкт дослідження – телята 3–5; 13–15 та 20–25-добового віку, отримані від неімунізованих корів та імунізованих сальмонельозним антигеном у сухостійний період і лабораторні тварини (білі миші та кролі).

Предмет дослідження – кров, фекалії телят чорно-рябої породи та органи кролів.

Методи досліджень: клінічний, гематологічний, радіобіологічний, бактеріологічний, імунологічний, гістологічний, статистичний.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше в Україні теоретично й екcпериментально обгрунтована необхідність пероральної імунізації телят сальмонельозним антигеном, вивчено розподіл його при пероральному застосуванні. Встановлена основна локалізація сальмонельозного антигену в тканинах кишечнику при його пероральному застосуванні. Накопичення антитілоутворюючих клітин в тканинах кишечнику є основою місцевої імунної реакції на сальмонельозний антиген. Показано значення реакції лімфоїдної тканини кишкового каналу в формуванні резистентності проти збудників сальмонельозної інфекції. Відмічено інтенсивніший вплив антигену на імунологічні показники телят, імунізованих перорально, порівняно з парентеральним введенням. Експериментально обгрунтована і розроблена методика виготовлення еритроцитарних діагностикумів для постановки РНГА (реакції непрямої гемаглютинації) на основі танізованих і сенсибілізованих еритроцитів барана антигенами S.dublin і S.typhimurium. З’ясована роль клітинних і гуморальних факторів імунітету в захисті телят від збудників сальмонельозу при пероральному методі імунізації їх у різному віці після народження.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено методику перорального застосування полівалентного сальмонельозного антигену для профілактики сальмонельозної інфекції у телят, яка затверджена вченою радою факультету ветеринарної медицини Білоцерківського ДАУ (протокол №8 від 23.03.2000 р.). Визначено оптимальний вік імунізації телят. Доведена висока ефективність перорального методу імунізації. Виготовлено і апробовано еритроцитарний діагностикум для РНГА, який запропоновано для практики. Акт комісійної апробації діагностикуму затверджений директором Центральної державної лабораторії ветеринарної медицини України М.С.Павленком 4.04.2000 р.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є завершеною науково-дослідною роботою з вивчення перорального методу імунізації телят сальмонельозним антигеном. Здобувач особисто розробила і провела у практичних умовах усі експериментальні дослідження з теми дисертаційної роботи, формувала дослідні і контрольні групи, виконала всі імунологічні дослідження, статистичну обробку і аналіз отриманих результатів, зробила висновки і пропозиції виробництву. При вивченні розподілу сальмонельозного антигену в організмі кролів науково-методичну допомогу в організації і проведенні досліду надавав кандидат біологічних наук М.М.Лазарєв (Український НДІ сільськогосподарської радіології).

Апробація результатів дисертації. Матеріали досліджень доповідалися на наукових конференціях професорсько-викладацького складу та аспірантів БДАУ (1999–2002 рр.), науковій конференції докторантів та аспірантів “Тиждень науково-дослідної роботи молодих учених та студентської молоді” (13–17 травня 2002 р. Біла Церква), на міжнародній науково-практичній конференції “Досягнення та перспективи розвитку ветеринарної медицини” (19 – 20 вересня 2002 р., м. Полтава), на Всеукраїнській науково-практичній конференції молодих учених ”Проблеми патології тварин та шляхи їх вирішення” (11 жовтня 2000 року, м. Київ).

Публікації. За результатами досліджень опубліковано 8 наукових статей, у тому числі у “Віснику Білоцерківського державного аграрного університету” – 5, журналі “Ветеринарна медицина України” – 1, “Наукові праці Полтавської державної аграрної академії” – 1, “Матеріали Всеукраїнської науково-практичної конференції молодих вчених” – 1.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, висвітлення результатів власних досліджень, їх аналізу та узагальнення, висновків і пропозицій виробництву, списку використаних джерел і додатків. Робота викладена на 156 сторінках комп’ютерного тексту, ілюстрована 44 таблицями та 30 рисунками. Список використаних джерел включає 213 найменувань. У додатку наведено 10 документів.

Вибір напрямів досліджень, матеріал та методи

виконання роботи

Робота виконувалась протягом 1999–2002 років на базі агрофірми “Матюші” Білоцерківського району Київської області. Дослідження крові виконані в лабораторії кафедри лабораторної діагностики інфекційних захворювань сільськогосподарських тварин ІПНКСВМ при Білоцерківському ДАУ. Матеріалом для дослідження були миші (163 шт.), кролі (42 гол.), корови чорно-рябої породи (93 гол.), телята (92 гол.).

Робота виконувалася в наступній послідовності: а) вивчення розподілу сальмонельозного антигену в організмі кролів; б) вивчення імунологічних показників крові телят, вмісту імунокомпетентних клітин у периферійній крові; в) визначення титрів протисальмонельозних антитіл у сироватці крові і копрофільтратах; г) вивчення лейкопоезу, індексу міграції лейкоцитів (ІМЛ) та шкірної реакції телят; д) дослідження бактерицидної активності сироватки (БАС), лізоцимної активності сироватки (ЛАС) та опсоно-фагоцитарної реакції (ОФР) телят, отриманих від невакцинованих і вакцинованих корів та імунізованих у різному віці після народження.

Другу серію дослідів провели на двох групах телят. У першому досліді використовували телят, які народилися від неімунізованих корів, а в другому – телят, отриманих від корів, імунізованих сальмонельозним антигеном у сухостійний період. У міру розтелу корів обох груп за принципом аналогів сформували дві групи телят: одну – для пероральної, а другу – для парентеральної імунізації. Крім того, кожну групу телят імунізували у: 3–5-; 13–15-; 20–25-добовому віці.

При пероральній імунізації сальмонельозний антиген випоювали телятам уранці з молоком у дозі 400 млрд м.к. 3 доби підряд і повторно через 14 діб.

При парентеральному методі антиген вводили два рази в дозах, передбачених настановою.

Реакцію організму телят на введений сальмонельозний антиген оцінювали за загальним станом тварин, показниками температури, пульсу та дихання протягом трьох діб після його застосування. Кров для дослідження в телят брали з яремної вени вранці.

Імунологічні показники крові телят визначали за вмістом лейкоцитів (меланжерним методом), абсолютною кількістю лімфоцитів, Т- і В-лімфоцитів та їхніх субпопуляцій (Новиков Д.К., Новикова В.И.,1976; Івченко В.М. із співавт., 1977); ОФР ставили за методикою И.М.Карпуть, (1993) і Ю.Н.Фёдоров (1999); коефіцієнт бактерицидності вираховували за методикою З.Е. Матусіс (цит. за Івченко В.М., 1997).

Уміст антитіл у сироватці крові визначали в РНГА, у копрофільтратах – за методикою Л.И. Краснопрошиної (1979), активність Т-лімфоцитів – у (реакція гальмування міграції лейкоцитів) РГМЛ та за шкірною реакцією на (фітогемаглютинін) ФГА.

Лізоцимну активність сироватки крові – фотонефелометричним методом (Козлюк А.С. із співавт., 1987); бактерицидну активність сироватки крові – за методикою В.Ю.Чумаченка, (1992).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Розподіл сальмонельозного антигену в організмі кролів при

пероральному методі імунізації

Пероральна імунізація телят сальмонельозним антигеном пов’язана з розвитком вакцинального процесу в органах первинної аплікації антигену, а саме – у системі органів травлення.

У дослідах на кролях методом радіоактивних індикаторів вивчали проникнення сальмонельозного антигену через стінку шлунково-кишкового тракту та розподіл його в органах при пероральній імунізації, порівнюючи його з парентеральним методом застосування (табл. 1).

Таблиця 1– Показники радіометрії органів кролів, перорально і підшкірно імунізованих сальмонельозним антигеном, міченим 137Cs (400 кБк/мл)

Орган | Метод імунізації | Термін дослідження після введення антигену ( у годинах)

3 | 6 | 12 | 24

Показники радіометрії (імпульсів/хв)

Печінка | перорально

підшкірно | 20

40 | 200

160 | 2600

1800 | 6200

2600

Селезінка | перорально

підшкірно | 80

60 | 220

200 | 3200

2400 | 4000

2900

Нирка |

перорально

підшкірно | 60

30 | 620

840 | 2100

1800 | 2000

2000

Товстий кишечник | перорально

підшкірно | 800

20 | 4200

20 | 3800

80 | 4200

240

Тонкий кишечник | перорально

підшкірно | 8200

- | 7500

20 | 4800

30 | 3800

80

Шлунок |

перорально

підшкірно | 9200

- | 7400

- | 2640

- | 2000

20

Брижовий лімфовузол | 30

- | 3000

60 | 3000

120 | 1200

100

Кров |

перорально

підшкірно | 5800

4000 | 3800

4000 | 2400

3200

Фекалії | перорально | перорально

підшкірно | 300 | 4200 | 8400

Місце введення | підшкірно |

360000 | 280000 | 160000 | 60000

Передлопатк.

лімф. вузол | підшкірно | 1200 | 2800 | 6400 | 5200

Аналіз матеріалів таблиці показує, що сальмонельозний антиген, мічений радіоактивним 137Cs, через 3 год. проникав через стінку шлунково-кишкового тракту і виявлявся в брижових лімфатичних вузлах, печінці, селезінці, але найбільша кількість його містилась у тканинах шлунка (9200 ім/хв) і тонкого відділу кишечнику (8200 ім/хв). У печінці, селезінці і крові виявлялась незначна кількість антигену.

У тварин з парентеральним застосуванням сальмонельозного антигену найбільша кількість його на час досліджень виявлялася на місці введення, у регіонарному лімфатичному вузлі (1200 ім/хв) і крові (400 ім/хв).

Через 6 годин після перорального застосування сальмонельозного антигену його кількість у брижових лімфатичних вузлах збільшилася в 100 разів, у крові – у 72 рази, печінці – у 10 разів, у тканинах товстого кишечнику – більше ніж у 5 разів, у селезінці – більше ніж у 2,5 рази, порівняно з показниками через три години.

При парентеральному введенні антигену найбільша його кількість виявлялась у передлопатковому лімфатичному вузлі (2800 ім/хв), у крові вона збільшилася в 10 разів, печінці – в 4 рази, селезінці – у 3 рази. Проте ці показники були меншими, ніж при пероральному методі імунізації.

У подальшому (через 12 годин) у динаміці показників розподілу сальмонельозного антигену при пероральному методі введення спостерігалося його зростання: у печінці – в 11,25 разів, селезінці – в 14,5, фекаліях – у 14, у нирках – у 3,4 рази.

Після парентерального застосування сальмонельозного антигену через 12 годин відбувалось накопичення його в регіонарному передлопатковому лімфатичному вузлі – до 6400 ім/хв, печінці – до 1800, селезінці – до 2400, нирках – до 1800 ім/хв.

Динаміка розподілу сальмонельозного антигену в організмі через 24 години після перорального методу імунізації показала, що найбільша його кількість містилася в печінці, селезінці та фекаліях і значно знизилась у тканинах тонкого кишечнику, тоді як при парентеральному застосуванні кількість його в печінці, селезінці та нирках продовжувала зростати, а в інших органах дещо знижувалася.

Результати дослідів показали, що пероральне введення сальмонельозного антигену супроводжується швидким проникненням його через слизову оболонку шлунково-кишкового тракту, звідки він потрапляє в інші органи.

Отже, основні відмінності в розподілі сальмонельозного антигену при пероральному і парентеральному методах імунізації полягають у накопиченні антигену переважно в тканинах кишечнику і брижових лімфатичних вузлах при пероральному введенні та переважній його локалізації в регіонарному лімфатичному вузлі і крові при парентеральному застосуванні.

Імуноморфологічні зміни в органах кролів при імунізації їх сальмонельозним антигеном перорально

Результати розподілу сальмонельозного антигену в органах підтвердилися виявленими імуноморфологічними змінами у внутрішніх органах кролів.

Сальмонельозний антиген, введений в організм перорально, викликав найбільш виражені морфологічні зміни у тканинах кишкового каналу, що проявлялося

значним накопиченням у лімфоїдній тканині плазматичних клітин.

У підслизовій кишечнику виявляли скупчення лімфоцитів і плазматичних клітин, а в гермінативній зоні – інтенсивне розмноження плазматичних клітин.

У селезінці сальмонельозний антиген викликав накопичення лімфоцитів, утворення реактивних центрів і злиття фолікулів.

Отримані результати свідчать про те, що шлунково-кишковий тракт є одним із органів імунної системи, який забезпечує імунну відповідь на пероральне введення сальмонельозного антигену.

Формування захисних властивостей організму телят при імунізації їх

сальмонельозним антигеном перорально

Дослідження були спрямовані на вивчення вікових особливостей імунної відповіді організму телят при введенні їм сальмонельозного антигену.

Проведені нами дослідження показали, що в телят, отриманих від невакцинованих корів та імунізованих у різному віці після народження, більший уміст імунокомпетентних клітин був у телят старшої вікової підгрупи (табл. 2). Крім того, вищими також були показники у тварин, імунізованих перорально.

У телят, отриманих від невакцинованих корів та імунізованих у 3–5-добовому віці сальмонельозним антигеном, на 7-му добу після реімунізації виявляли вірогідно (р<0,001) вищий уміст Т-лімфоцитів – на 0,54 Г/л. І в подальшому ці показники залишалися вищими, ніж у телят, імунізованих парентерально.

У тварин, яких імунізували у 13–15-добовому віці, уміст абсолютної кількості лімфоцитів після реімунізації вірогідно зростав і був на 1,2 Г/л вищим, ніж у телят із парентеральним методом імунізації (р<0,01).

Більш інтенсивнішою клітинна реакція була в телят старшої вікової підгрупи, яких імунізували перорально; уміст імунокомпетентних клітин був вірогідно вищим від показників другої дослідної групи (р<0,001).

Корелятивний зв’язок між стимулюючою дією сальмонельозного антигену на показники імунокомпетентних клітин, залежно від методу введення антигену і від віку телят, був сильним між підгрупами тварин, імунізованих у 3–5- і 13–15-добовому віці за абсолютною кількістю Т-лімфоцитів у периферійній крові (r=0,90) та В-лімфоцитів (r=0,91), а між групами телят, імунізованих у 3–5- і 20–25-добовому віці – за абсолютною кількістю Т-лімфоцитів (r=0,92) і В-лімфоцитів (r=0,98).

Індекс міграції лейкоцитів крові телят, імунізованих сальмонельозним

антигеном перорально

Функціональну активність клітинного ланцюга імунітету на сальмонельозний антиген, введений телятам перорально, оцінювали в РГМЛ за показниками ІМЛ.

У телят, отриманих від невакцинованих корів, перорально імунізованих сальмонельозним антигеном у 13–15-добовому віці, на 7-му добу після введення антигену тенденція до гальмування міграції лейкоцитів спостерігалася лише у 25% тварин.

На 14-ту добу виявляли сенсибілізацію лімфоцитів до сальмонельозного антигену, яка спостерігалася у телят усіх вікових підгруп.

При обох методах імунізації сенсибілізація лімфоцитів периферійної крові була більше вираженою в телят старших вікових підгруп, що проявлялося гальмуванням міграції лейкоцитів.

В організмі телят, отриманих від корів, вакцинованих у сухостійний період і

Таблиця 2 – Динаміка показників імунокомпетентних клітин у периферійній крові телят, отриманих від невакцинованих корів та імунізованих сальмонельозним антигеном

Термін досліджень | Імунізовані у 3–5-добовому віці | Імунізовані у 13–15-добовому віці | Імунізовані у 20–25-добовому віці

лімфоцити, Г/л | Т-лімфоцити, Г/л | В-лімфоцити, Г/л | лімфоцити, Г/л | Т-лімфоцити, Г/л | В-лімфоцити, Г/л | лімфоцити, Г/л | Т-лімфоцити, Г/л | В-лімфоцити, Г/л

Контрольна група

До імунізації

Через 7 діб після імунізації

Через 14 діб після імунізації

Через 7 діб після реімуніз.

Через 14 діб після реімуніз.

Через 1 міс. після реімуніз. |

3,77±0,05

4,2±0,05

4,08±0,05

3,87±0,05

3,58±0,05

3,7±0,02 | 0,37±0,02

0,47±0,02

0,42±0,02

0,4±0,04

0,37±0,02

0,38±0,02 | 0,15±0,01

0,13±0,01

0,15±0,01

0,15±0,01

0,14±0,02

0,14±0,01 | 3,1±0,2

3,2±0,2

3,2±0,2

3,0±0,2

3,12±0,6

3,1±0,9 | 0,13±0,02

0,14±0,04

0,13±0,01

0,14±0,02

0,16±0,02

0,16±0,09 | 0,06±0,008

0,05±0,004

0,05±0,008

0,04±0,002

0,04±0,001

0,05±0,002 | 4,2±0,14

3,9±0,24

3,7±0,05

3,75±0,8

3,7±0,4

3,8±0,9 | 0,18±0,02

0,18±0,02

0,19±0,06

0,19±0,03

0,2±0,04

0,2±0,03 | 0,1±0,01

0,12±0,04

0,1±0,02

0,1±0,02

0,1±0,02

0,12±0,04

До імунізації

Через 7 діб після імунізації

Через 14 діб після імунізації

Через 7 діб після реімуніз.

Через 14 діб після реімуніз.

Через 1 міс. після реімуніз. |

Перорально імунізовані

4,4±0,6

4,2±0,2

4,4±0,08х

3,9±0,4

4,6±0,2хх

4,9±0,4х | 0,5±0,02хх

0,8±0,01*ххх

1,0±0,04**ххх

1,1±0,02***ххх

1,5±0,08***ххх

2,1±0,08***ххх | 0,3±0,04х

0,5±0,1х

0,7±0,08*хх

0,7±0,2х

1,0±0,2 х х

1,3±0,2 х х |

3,6±0,08*

4,1±0,4

4,4±0,2* х х

4,4±0,28** х х

5,0±0,2 х

4,94±0,2 | 0,48±0,08 х х

0,9±0,08 х х х

1,16±0,04*** х х х

1,3±0,13** х х х

1,38±0,12 х х х

1,9±0,2* х х х | 0,2±0,03 х х

0,5±0,05* х х х

0,7±0,04*** х х х

0,8±0,04*** х х х

1,1±0,08** х х х

1,5±0,4 х | 4,2±0,05***

4,4±0,05***

4,1±0,05*** х х

4,7±0,03***

4,6±0,05***

4,6±0,05*** | 0,7±0,02** х х х

0,8±0,04 х х х

1,1±0,04** х х х

1,4±0,04*** х х х

2,1±0,04*** х х х

2,2±0,04*** х х х |

0,3±0,05 х

0,5±0,01*** х х х

0,7±0,04*** х х х

0,96±0,04*** х х х

0,97±0,04*** х х х

1,1±0,04*** х х х

До імунізації

Через 7 діб після імунізації

Через 14 діб після імунізації

Через 7 діб після реімуніз.

Через 14 діб після реімуніз.

Через 1 міс. після реімуніз. |

Парентерально імунізовані

3,8±0,4

3,08±0,8

3,6±0,4

3,1±0,8

3,8±0,6

3,8±0,4 | 0,5±0,08

0,47±0,1

0,6±0,1

0,56±0,08

0,7±0,1 х

1,1±0,04 х х х | 0,26±0,04 х

0,24±0,08

0,4±0,04 х х

0,4±0,04 х х х

0,7±0,08 х х х

0,9±0,05 х х х | 3,4±0,02

3,6±0,08

3,78±0,02 х

3,2±0,02

4,7±0,02 х

4,6±0,02 | 0,3±0,02 х х

0,6±0,02 х х х

0,69±0,02 х х х

0,69±0,01 х х х

1,3±0,08 х х х

1,2±0,1 х х х | 0,2±0,01 х х х

0,36±0,01 х х х

0,4±0,03 х х х

0,4±0,03 х х х

0,7±0,03 х х х

0,6±0,01 х х х | 3,1±0,02

3,2±0,04

3,2±0,04

3,3±0,02

3,3±0,02

3,3±0,02 | 0,57±0,02 х х х

0,67±0,04 х х х

0,74±0,06 х х х

0,89±0,02 х х х

0,98±0,01 х х х

0,98±0,01 х х х | 0,2±0,02 х х

0,33±0,01 х х

0,41±0,01 х х х

0,53±0,02 х х х

0,5±0,01 х х х

0,53±0,02 х х х

Примітки: 1. *р< 0,05; **р< 0,01; ***р< 0,001 – відносно показників другої дослідної групи;

2. хр< 0,05; ххр< 0,01; хххр< 0,001 – відносно показників контрольної групи

перорально імунізованих сальмонельозним антигеном у різному віці після народження, гальмування міграції лейкоцитів було вірогідно вираженим, порівняно з показниками телят, імунізованих парентерально (р<0,001).

Вплив сальмонельозного антигену, введеного телятам перорально, на показники гуморальної імунної відповіді

При вивченні титрів антитіл у сироватці крові та копрофільтратах телят, отриманих від невакцинованих корів, виявлено, що вміст протисальмонельозних антитіл у сироватці крові телят, імунізованих у 3–5- і 13–15-добовому віці був нижчим, ніж у копрофільтратах. Так, на 7-му добу після імунізації середньогеометричні титри антитіл у копрофільтратах телят були вищими в молодшій віковій підгрупі: до антигену S.dublin вони становили 80,6, а S.typhimurium – 203,2, а в сироватці крові – відповідно 80,6 і 64,0. Реімунізація викликала подальше зростання титрів антитіл у копрофільтратах тварин молодших вікових підгруп.

Пероральне введення сальмонельозного антигену телятам, отриманим від невакцинованих корів, стимулює розвиток локальної імунної відповіді, порівняно з парентеральним методом імунізації.

При парентеральному введенні сальмонельозного антигену телятам, отриманим від невакцинованих корів, на 7-му добу після імунізації спостерігалося зростання середньогеометричних титрів антитіл у сироватці крові тварин старшої вікової підгрупи (20–25-добового віку), а в телят, імунізованих у 3–5-добовому віці, мала місце тенденція до підвищення титру антитіл лише після реімунізації. У копрофільтратах телят, імунізованих сальмонельозним антигеном парентерально, антитіла з’являлися лише після реімунізації.

Імунологічні показники крові телят, отриманих від вакцинованих корів та перорально імунізованих сальмонельозним антигеном у різному віці

Результати досліджень показали, що наявність в організмі телят специфічних антитіл не пригнічує імунної відповіді на перорально введений сальмонельозний антиген. Після перорального застосування сальмонельозного антигену, у телят молодшої вікової підгрупи спостерігається вищий уміст імунокомпетентних клітин.

Уміст абсолютної кількості Т- і В-лімфоцитів у перорально імунізованих телят був вищим протягом усього періоду досліджень, порівняно з показниками телят імунізованими парентерально.

У телят, отриманих від вакцинованих корів, до імунізації сальмонельозним антигеном протисальмонельозні антитіла виявляли як у сироватці крові, так і в копрофільтратах.

Сальмонельозний антиген, перорально введений телятам у 3–5- і 13–15-добовому віці, стимулював значне зростання протисальмонельозних антитіл у копрофільтратах, порівняно з телятами імунізованими парентерально. Проте між підгрупами спостерігалася різниця в титрах.

При вивченні показників ОФР у телят, отриманих від вакцинованих корів та імунізованих сальмонельозним антигеном, виявили, що ФА і бактерицидна активність фагоцитів були більш вираженими у групі телят із пероральним методом імунізації. Причому, у тварин старшої вікової підгрупи коефіцієнт бактерицидності становив 0,99±0,002 протягом майже усього періоду дослідження, а найвищою ФА була на 14-й день після реімунізації і становила 40,6±0,2%.

Узагальнюючим інформативним показником при оцінці неспецифічної резистентності організму є бактерицидна і лізоцимна активність сироватки крові.

Таблиця 2 – Показники ФА периферійної крові телят, отриманих від вакцинованих корів та перорально імунізованих сальмонельозним антигеном у різному віці після народження

Термін дослідження | Імунізовані у 3–5-добовому віці | Імунізовані у 13–15-добовому віці | Імунізовані у 20–25-добовому віці

ФА, %

M±m | ФІ, мікробн. кл.,

M±m | Коеф. бактериц.,

M±m |

ФА, %

M±m | ФІ, мікробн. кл.,

M±m | Коеф. бактериц.,

M±m |

ФА, %

M±m | ФІ, мікробн. кл.,

M±m | Коеф. бактериц.,

M±m

До імунізації

Після імунізації, через:

7 діб

14 діб

Після реімунізації, через:

7 діб

14 діб

1 міс.

2 міс.

3 міс. | 8,6±0,6

17,8±0,3

24,6±0,6

33,0±0,4

39,0±0,9

28,9±0,6

11,2±0,7

7,0±0,4 | 6,57±0,6

8,2±0,7

9,97±0,2

10,5±0,5

11,4±0,15

10,0±0,9

9,7±0,6

9,1±0,04 | 0,8±0,09

0,99±0,002

0,99±0,002

0,99±0,002

0,97±0,03

0,99±0,002

0,99±0,002

0,99±0,002 | 7,9±0,6

18,0±0,75

29,4±1,4

33,1±2,4

32,0±2,3

29,1±1,05

12,7±0,45

7,0±0,8 | 6,7±0,36

8,95±0,4

10,1±0,36

11,5±0,27

11,3±0,2

10,3±0,4

8,5±0,4

6,03±0,2 | 0,88±0,09

0,9±0,06

0,99±0,002

0,99±0,002

0,99±0,002

0,99±0,03

0,97±0,03

0,99±0,002 | 7,8±0,56

16,5±1,1

26,3±1,9

25,8±0,56

28,8±1,7

15,3±0,56

9,0±0,8

9,0±0,8 | 2,4±0,13

7,1±0,34

11,8±1,6

10,2±0,9

12,8±0,9

8,9±0,5

7,1±0,4

7,1±0,4 | 0,57±0,1

0,66±0,1

0,49±0,09

0,78±0,1

0,8±0,2

0,86±0,2

0,86±0,2

0,66±0,1

Сальмонельозний антиген, введений телятам як перорально, так і парентерально, викликав зростання БАС і ЛАС крові тварин.

Так, у телят, отриманих від невакцинованих корів і перорально імунізованих сальмонельозним антигеном у 3–5-добовому віці, БАС зростала на 0,4%, а ЛАС – на 1,3% , і ці показники були вищими, ніж у телят другої дослідної групи.

У телят, імунізованих у 13–15-добовому віці, БАС і ЛАС зростали відповідно на 4,9 % і 0,3%.

У тварин старшої вікової підгрупи спостерігалось більш інтенсивне зростання БАС – на 15,6%, а ЛАС – на 0,5%. Обидва показники були вищими, ніж у телят молодших вікових підгруп, а також парентерально імунізованої групи тварин.

Таблиця 3 – Динаміка показників БАС та ЛАС крові телят, отриманих від вакцинованих корів і перорально імунізованих сальмонельозним антигеном у 20–25-добовому віці

Термін дослідження | Контроль | Пероральне введення | Парентеральне введення

БАС,%

M±m | ЛАС, %

M±m | БАС,%

M±m | ЛАС, %

M±m | БАС,%

M±m | ЛАС, %

M±m

До імунізації

Після імунізації, через:

7 діб

14 діб

Після реімунізації, через:

7 діб

14 діб

1 місяць |

60,2±1,3

62,1±1,7

63,1±2,2

62,0±1,7

60,1±2,6

60,1±2,6 | 5,4±0,6

5,2±0,5

5,16±0,6

5,5±0,8

5,3±0,32

5,0±0,7 | 61,1±6,6

76,7±5,4

77,5±3,6?

80,2±4,2?

85,3±1,3*???

83,4±1,3*?? | 5,3±0,2

5,8±0,9

6,35±0,9

8,4±0,9*

10,0±1,0

5,8±2,2 | 60,5±2,1

70,0±1,3*?

68,4±1,3

69,6±1,3*?

61,5±1,3

64,7±1,3 | 5,3±0,3

5,4±1,3

5,9±1,3

6,2±0,3

6,4±0,9

6,4±0,9

Примітки: 1. *р< 0,05, **р< 0,01 – відносно показників до імунізації;

2. ?р< 0,05, ?? р< 0,01, ??? р< 0,001 – відносно показників контрольної групи

У тварин, отриманих від вакцинованих корів та перорально імунізованих сальмонельозним антигеном, показники БАС та ЛАС крові були порівняно вищими, ніж у парентерально імунізованих телят. У старшій віковій підгрупі на 7-й день після імунізації виявляли суттєве зростання БАС – на 19% (p<0,01).

ВИСНОВКИ

1. У роботі теоретично й експериментально обгрунтовано метод пероральної імунізації телят сальмонельозним антигеном. Доведена імунологічна функція кишечнику та його реакція на сальмонельозний антиген. На експериментальній моделі кролів при пероральному і парентеральному застосуванні сальмонельозного антигену вивчено розподіл його в організмі. Виявлено інтенсивніший вплив перорально введеного сальмонельозного антигену на показники імунореактивності телят у порівнянні з парентеральним застосуванням його.

2. Сальмонельозний антиген через 3 години після перорального введення проникає через стінку кишкового каналу і виявляється в лімфоїдних органах кролів (тканинах тонкого кишечнику – 8200 імпульсів/хв, товстого – 800 імпульсів/хв). У подальшому зростання його відбувається в товстому кишечнику – 4200 імпульсів/хв, брижовому лімфатичному вузлі – 3000 імпульсів/хв. При парентеральному введенні через три години він локалізувався переважно на місці введення – 360000 імпульсів/хв. Сальмонельозний антиген, введений перорально, викликав створення гермінативних зон у пейєрових бляшках, що проявлялося скупченням плазматичних клітин.

3. Уміст імунокомпетентних клітин у периферійній крові телят, отриманих від невакцинованих корів та перорально імунізованих сальмонельозним антигеном, мав високу корелятивну залежність між групами, імунізованими у 3–5- і 20–25-добовому віці, за абсолютною кількістю Т-лімфоцитів (r=0,92) і В-лімфоцитів (r=0,98).

У телят, отриманих від вакцинованих корів та перорально імунізованих сальмонельозним антигеном, абсолютна кількість імунокомпетентних клітин була вищою, ніж у телят, імунізованих парентерально.

4. При пероральному і парентеральному методах імунізації телят, отриманих від невакцинованих корів, сенсибілізація лімфоцитів периферійної крові була більше вираженою в телят старших вікових підгруп, що проявлялося гальмуванням міграції лейкоцитів, проте ІМЛ у телят із пероральним методом імунізації був меншим (0,1±0,01), ніж у телят, імунізованих парентерально (0,6±0,09).

У телят, отриманих від вакцинованих корів, сенсибілізація лейкоцитів спостерігалась в усіх вікових підгрупах після імунізації, але ІМЛ був вірогідно вищим (р<0,001) у телят, імунізованих перорально.

5. Показники фагоцитозу в телят, отриманих від вакцинованих корів і перорально імунізованих сальмонельозним антигеном, були вищі від таких у парентерально імунізованих телят, а коефіцієнт бактерицидності становив 0,99±0,001 і був вищим, ніж у телят, вакцинованих парентерально (0,42±0,03).

6. Сальмонельозний антиген, перорально введений телятам, отриманим від невакцинованих і вакцинованих корів, стимулює підвищення середньогеометричних титрів антитіл у копрофільтратах телят молодших вікових підгруп, порівняно з парентеральним його введенням, що свідчить про локальну імунну відповідь організму на дію антигену.

7. Пероральна імунізація сальмонельозним антигеном сприяла підвищенню БАС та ЛАС крові телят, імунізованих у 20–25-добовому віці й отриманих від невакцинованих корів. В імунізованих телят, отриманих від вакцинованих корів, перорально введений сальмонельозний антиген викликав більш виразні зміни неспецифічних показників у тварин старших вікових підгруп.

8. Метод пероральної імунізації телят є простим, природним, нешкідливим, не потребує спеціального обладнання, не викликає стресу у тварин і не пригнічує фактори природного захисту.

Пропозиції виробництву

1.

2.

список основних праць, опублікованих за темою дисертації

1. Шарандак В.В. Показники реактивності білих мишей, перорально і парентерально щеплених сальмонельозним антигеном // Вісник Білоцерків. держ. аграр. ун-ту. – Вип. 11. – Біла Церква, 2000. – С. 143–148.

2. Шарандак В.В. Показники індексу міграції лейкоцитів (ІМЛ) у телят, перорально імунізованих проти сальмонельозу // Вісник Білоцерків. держ. аграр. ун-ту. – Вип. 14. – Біла Церква, 2000. – С.277–281.

3. Івченко В.М., Шарандак В.В., Глуховенко І.О. Показники титрів специфічних антитіл у сироватці крові телят, перорально імунізованих сальмонельозним антигеном // Вісник Білоцерків. держ. аграр. ун-ту. – Вип.16. – Біла Церква, 2001. – С.86–93.

Дисертантка проводила формування груп та імунізацію телят, всі імунологічні дослідження сироватки крові і копрофільтратів та узагальнила результати.

4. Івченко В.М., Шарандак В.В., Шарандак П.В. Неспецифічна резистентність телят, отриманих від корів, вакцинованих у сухостійний період і перорально імунізованих сальмонельозним антигеном // Вісник Білоцерків. держ. аграр. ун-ту. – Вип.18. – Біла Церква, 2001. – С.62–71.

Дисертантка проводила вакцинацію корів та імунізацію телят, дослідила всі показники неспецифічної резистентності й узагальнила результати.

5. Івченко В.М., Шарандак В.В. Імунізація кролів сальмонельозним антигеном та його органотропність // Вет. медицина України. – 2002. – №3. – С. 15–16.

Дисертантка експериментально дослідила розподіл сальмонельозного антигену в організмі кролів, вивчила імуноморфологічні зміни в їхніх органах та узагальнила результати.

6. Івченко В.М., Шарандак В.В. Уміст загального білка та його фракцій у сироватці крові телят, імунізованих сальмонельозним антигеном // Вісник Білоцерків. держ. аграр. ун-ту. – Вип. 21. – Біла Церква, 2002. – С.87–94.

Дисертантка вивчила зміни білка і його фракцій у сироватці крові телят та узагальнила результати досліджень.

7. Шарандак В.В. Реакція організму телят, отриманих від вакцинованих корів, перорально імунізованих сальмонельозним антигеном у різному віці після народження / Наукові праці Полтавської держ. аграр. академії. – 2002. – Т.2(21). – С. 220–222.

8. Шарандак В.В. Реакція організму телят на ФГА, перорально імунізованих сальмонельозним антигеном // Матер. Всеукр. наук.-практ. конф. молодих вчених: “Проблеми патології тварин та шляхи їх вирішення” (м. Київ, 11 жовтня 2000 р.). – К., 2000. – С. 15–17.

Шарандак В.В. Експериментальне обгрунтування перорального методу імунізації телят проти сальмонельозу. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.03 – ветеринарна мікробіологія та вірусологія. – Національний аграрний університет, Київ, 2002.

Дисертаційна робота присвячена вивченню імунологічних показників телят, отриманих від невакцинованих і вакцинованих корів та перорально імунізованих сальмонельозним антигеном у різному віці після народження. Вивчено розподіл сальмонельозного антигену в організмі кролів при різних методах його застосування та імуноморфологічні зміни в органах при пероральному введенні його.

Реакцію організму телят на сальмонельозний антиген вивчали за показниками абсолютної кількості Т- і В-лімфоцитів, титрами протисальмонельозних антитіл, показниками ІМЛ, ОФР, БАС та ЛАС. Поява протисальмонельозних антитіл у копрофільтратах є локальною реакцією на перорально введений сальмонельозний антиген.

Ключові слова: антиген, імунокомпетентні клітини, пероральний метод імунізації, плазмоцити, сальмонельоз.

Шарандак В.В. Экспериментальное обоснование перорального метода иммунизации телят против сальмонеллёза. – Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата ветеринарных наук по специальности 16.00.03 – ветеринарная микробиология и вирусология. – Национальный аграрный университет, Киев, 2002.

Диссертационная работа посвящена изучению иммунологических показателей телят, полученных от невакцинированных и вакцинированных коров и перорально иммунизированных сальмонеллёзным антигеном в разном возрасте после рождения.

В работе теоретически и практически обоснован метод пероральной иммунизации телят против сальмонеллёза.

Для исследования были сформированы три группы телят, полученных от невакцинированных и вакцинированных коров, для перорального и парентерального методов введения сальмонеллёзного антигена и контрольная. Кроме того, телят всех групп в зависимости от возраста разделили на три подгруппы: 3–5; 13–15; 20–25-суток после рождения.

На первом этапе исследований изучали распределение сальмонеллёзного антигена в организме кроликов при пероральном и парентеральном его введении. При этом было установлено, что при введении сальмонеллёзного антигена перорально, он в основном локализируется в тканях тонкого и толстого кишечника, а также в брыжеечных лимфатических узлах. При подкожном его введении накопление меченого 137Cs антигена выявляли на месте введения и в предлопаточном лимфатическом узле. Таким образом, при пероральном применении антигена кишечник выполняет барьерно-защитную и иммунологическую функцию.

Гистологическое исследование реакции организма на пероральное введение сальмонеллёзного антигена показало скопление плазматических клеток в пейэровых бляшках кишечника кроликов.

При изучении показателей содержания иммунокомпетентных клеток в периферической крови телят, полученных от невакцинированных коров, было обнаружено значительное увеличение их у животных, иммунизированных сальмонеллёзным антигеном в 20–25-суточном возрасте. Кроме того, в этой возрастной подгруппе отмечали более высокие показатели БАС и ЛАС.

Результаты изучения ИМЛ крови в РТМЛ свидетельствуют о том, что сенсибилизация лимфоцитов у всех возрастных подгрупп телят развивается лишь после реиммунизации.

У телят, полученных от вакцинированных коров, высокое содержание иммунокомпетентных клеток отмечали у животных младшей (3–5 суток) возрастной подгруппы.

Сальмонеллёзный антиген, перорально введённый с молоком, стимулировал синтез антител в копрофильтратах телят, полученных как от вакцинированных, так и от невакцинированных коров. Это свидетельствует о локальном иммунном ответе на введённый сальмонеллёзный антиген.

Показатели неспецифической резистентности организма телят, полученных от вакцинированных коров, были значительно выше у телят, иммунизированных перорально в 20–25-суточном возрасте.

ФА и ФИ были выше у животных старшей возрастной подгруппы, а коэффициент бактерицидности составлял 0,99±0,001 и оставался таким в течение всего опытного периода.

Ключевые слова: антиген, иммунокомпетентные клетки, пероральный метод иммунизации, плазмоциты, сальмонеллёз.

Sharandak V.V. Experimental Basis of Peroral Method of Calves’ Immunization Against Salmonellosis. – Manuscript.

The thesis for candidate degree of veterinary sciences, specialty 16.00.03 – veterinary microbiology and virusology. – National agrarian university, Kijv.

The dissertation is devoted to studying the immunological indexes of calves, got from non vacctinated and vacctinated cows and peroral immunizated by Salmonella antigen in different ages after birth. It was studied the distribution of Salmonella antigen in rabbits’ organizm in different methods of it’s using and immunomorphological changes in organs in peroral introduction of it.

The organizm reaction on Salmonella antigen was studied by indexes of absolute quantity T- and B-lymphocytes, tytres of anti salmonella antibodies, indexes IML, OFR, BAS and LAS.

Appearance anti salmonella antibodies in coprofiltrates is a local reaction on peroral introducted Salmonella antigen.

Key words: antigen, immunocompetentive cells, peroral method of immunization, plazmocytes, Salmonelosis.