НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім. О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

Трофимова Ірина Миколаївна

УДК 616. 13 - 004.6: 577. 152.344

: 577. 112.825

ВИВЧЕННЯ БАЛАНСУ ПРОТЕОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТІВ ТА ЇХ ІНГІБІТОРІВ У КРОВІ ТА СУДИННІЙ СТІНЦІ ПРИ ПОРУШЕННЯХ КИСЛОТНО-ОСНОВНОГО СТАНУ

14.03.04 - патологічна фізіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ - 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі патологічної фізіології Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця (м. Київ)

Науковий керівник: |

доктор медичних наук, професор,

член-кореспондент АПН України,

Биць Юрій Вікторович,

Національний медичний університет ім. О.О.Богомольця, завідувач кафедри патологічної фізіології

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор

Попова Лариса Олександрівна,

Київська міжрегіональна академія післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика, професор кафедри спортивної медицини та санології

доктор медичних наук, професор

Гуляр Сергій Олександрович,

Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України,

провідний науковий співробітник відділу експериментальної кардіології

Провідна установа - | Науково-дослідний інститут кардіології

ім. акад. Миколи Стражеска АМН України

Захист відбудеться 13.01. 2004 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України.

Автореферат розіслано 11.12.2003 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук

З.О. Сорокіна-Маріна

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Добре відомо, що від концентрації іонів водню залежить і активність ферментів, і проникність мембран, і багато інших показників як життєдіяльності окремих клітин, так і організму в цілому. Тому рН крові коливається в дуже вузькому діапазоні – за нормального рівня рН у межах від 7.35 до 7.45 концентрація іонів водню змінюється тільки на 10 некв/л. Зв’язок між змінами рН крові та ураженням судинної стінки є одночасно очевидним і загадковим, оскільки конкретні механізми її ушкодження залишаються маловивченими. Давно встановлено, що активність переважної більшості ферментів, у тому числі і протеїназ, залежить від концентрації іонів водню. Наприклад, оптимальний рН для трипсину становить 7.4 – 8.0, еластази нейтрофілів – 8.0 – 8.1 тощо [Веремєєнко К.М., 1988; Сологуб Л.І., 1992]. Незважаючи на наявність такого зв’язку, у літературі обмаль даних про вплив порушень кислотно-основного стану (КОС) на активність протеолітичних систем крові та тканин. При цьому роль протеолітичних ферментів як фактора регуляції біологічних процесів, з одного боку, та важливого механізму ушкодження клітин та позаклітинних структур при патології, з іншого, важко перебільшити Веремєєнко К.М. 1988; Дин Р.Т., 1981; Локшина Л.А., 1994.

Доведено велике значення ацидозу в патогенезі артеріосклерозу та захворювань, що прискорюють його розвиток (цукровий діабет, нефропатії та ін.) [Жалко-Титаренко В.Ф., 1989; Балаболкін М.І., 1998; Кришталь М.В., 1993; Tizianello M et al., 1996]. Ще у роботах Вalo J. (1938) наводяться докази того, що при моделюванні ацидозу введенням хлористого амонію відбуваються склеротичні зміни в аорті та інших судинах. Найбільше при цьому ушкоджується внутрішня еластична мембрана. Саме ці досліди і дозволили висунути ідею про існування специфічного ферменту – еластази, що зумовлює ураження еластичних структур. Контроль за активністю цієї агресивної протеїнази здійснюється переважно двома білковими інгібіторами – 1-інгібітором протеїназ (1-ІП) та 2-макроглобуліном (2-М), а порушення балансу між еластазою та її інгібіторами розглядається як вузловий момент патогенезу артеріосклерозу Веремєєнко К.М., 1990; Биць Ю.В. та ін., 1999.

Набагато більшу увагу дослідники звертали на ацидоз як патологічний процес, що має велике клінічне значення та зустрічається значно частіше, ніж алкалоз. Однак, зміни рН крові в лужний бік можуть мати не менше патогенетичне значення, в тому числі, внаслідок порушення балансу у системах протеолізу.

Важливу проблему сучасної ангіології становить вивчення патогенетичних механізмів розвитку різних форм артеріосклерозу – атеросклерозу та артеріосклерозу менкебергівського типу. Досі не з’ясовано, який патологічний процес набуває розвитку при порушеннях КОС. Проте добре відомо, що активність еластолізу збільшується як при атеросклерозі, так і при артеріосклерозі Менкеберга Биць Ю.В. та ін., 1999.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Роботу виконано в рамках тематики кафедри патологічної фізіології Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця: держбюджетних науково-дослідних робіт: "Вивчення системи “протеоліз-інгібітори протеолізу” в крові, тканинах судин і серця при різних пошкоджуючих впливах" і “Вивчення показників системи протеоліз – інгібітори протеолізу та ліпопротеїнового обміну в крові та судинній стінці при макроангіопатіях різного генезу”.

Мета дослідження: визначити патогенетичне значення порушень кислотно-основного стану у виникненні дисбалансу між еластазою та її інгібіторами у сироватці крові та тканинах аорти.

Задачі дослідження:

1.

2.

3.

4.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше на сучасному методичному рівні отримано експериментальні докази порушення балансу еластази та її інгібіторів у тканинах артеріальних судин на ранніх стадіях моделювання як ацидозу, так і алкалозу. Встановлено, що порушення балансу в системі еластазаінгібітори при ацидозі та алкалозі відбувається за рахунок різних показників – за умов ацидозу більше значення має зменшення вмісту інгібіторів, а при алкалозі - підвищення активності еластази. Виявлені особливості змін в еластолітичній системі в динаміці розвитку порушень КОС. Доведено, що між ступенем порушення КОС та активністю протеолітичних ферментів крові та тканин аорти існує тісний кореляційний зв’язок.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Проведені дослідження були спрямовані на з’ясування значення порушень КОС як фактора ушкодження структур судинної стінки. За результатами проведеного дослідження реалізація патогенної дії ацидозу та алкалозу відбувається внаслідок порушення балансу між еластазою та її інгібіторами в сироватці крові та тканинах судин. Факт підвищення активності еластази та зменшення вмісту інгібіторів на ранніх стадіях як експериментального ацидозу, так і алкалозу свідчить про значну роль порушень балансу між еластазою та її інгібіторами як фактора ураження сполучної тканини аорти, насамперед, фібрилярного білка еластину. Аналіз балансу між еластазою та її інгібіторами в сироватці крові та в тканинах судин дає можливість об’єктивно оцінити стан цієї протеолітичної системи за умов ацидозу чи алкалозу, а також створює передумови для проведення відповідних клінічних досліджень. Доведення зв’язку між порушенням КОС та активацією еластолізу зумовлює необхідність розробки, експериментального та клінічного випробування не тільки засобів корекції порушень КОС, але і препаратів з антипротеїназними властивостями для запобігання руйнівної дії протеолітичних ферментів у судинній стінці та тканинах інших органів.

Особистий внесок здобувача. Автором проведено ретельний аналіз літературних джерел, виконано необхідні еспериментальні дослідження, статистично оброблено, проаналізовано та узагальнено отримані результати. Дослідження змін еластолітичної системи при моделюванні алоксанового цукрового діабету проведено сумісно з аспірантом Борисюк М.В.

Апробація роботи. Результати роботи було представлено на ІІІ Національному конгресі патофізіологів України (м. Одеса, 24 – 27 травня 2000 р.), ІV Міжнародному конгресі з патофізіології (м. Будапешт, 29 червня – 5 липня 2002 р.), Пленумі товариства патофізіологів України (м.Одеса, 19 - 21 вересня 2002 р.), засіданні апробаційної ради “Теоретична медицина” Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця (6 червня 2003 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 7 праць, у тому числі 3 статті у наукових фахових журналах.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, викладення результатів та їх обговорення, висновків і списку використаних джерел (168 найменувань). Робота викладена на 129 сторінках, містить 13 таблиць та ілюстрована 31 рисунком.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Об’єктами дослідження були аорта та сироватка крові 234 щурів-самців лінії Віcтар (маса - 230.96 4.64 г) віком від 6 до 8 місяців.

У роботі відтворювали наступні види ацидозу: гострий гіперхлоремічний ацидоз (інтрагастральне одноразове введення 20 ммоль хлористого амонію на 1 кг маси), підгострий гіперхлоремічний ацидоз (питний режим з 0.25 % NH4Cl протягом 14 діб), молочнокислий ацидоз (20 ммоль лактату на 1 кг маси), метаболічний кетоацидоз (харчова депривація протягом однієї та трьох діб), кетоацидоз при алоксановому діабеті (інтраперитонеальне введення алоксану в дозі 100 мг/кг маси, тривалість експерименту 28 діб). Гострий негазовий алкалоз моделювали введенням 20 ммоль NaHCO3 на 1 кг маси тіла, а підгострий негазовий алкалоз - використанням питного режиму із 0.15 % розчином NaHCO3 протягом 14 діб. Для визначення нижчезазначених показників матеріал для дослідження забирали у тварин з гострими варіантами порушень КОС через 1 год після введення відповідних речовин.

Нами було застосовано наступні біохімічні методики. Визначення активності еластази проводили за інтенсивністю гідролізу специфічного хромогенного субстрату сукциніл-(аланін)3-пара-нітроаніліду (синтезовано в НДІ молекулярної біології та генетики НАН України) [Веремєєнко К.М. та співавт., 1991]. Активність ферменту виражали в мікромолях пара-нітроаніліну (р-NA) за годину на 1 г білка у тканинах аорти і в мікромолях пара-нітроаніліну за годину на 1 л сироватки крові. Вміст 1-інгібітора протеїназ та 2-макроглобуліну визначали із використанням N-бензоїл-DL-аргінін-пара-нітроаніліду (НДІ молекулярної біології та генетики НАН України) та виражали в міліграмах на 1 г білка у тканинах судин і в грамах на 1 л у сироватці крові [Веремєєнко К.М., 1988]. Вміст білка визначали за методом Lowry O.H.

За допомогою газового аналізатора OP-215 “Radelkis” (Угорщина) визначали такі показники КОС: від’ємний логарифм концентрації іонів водню (рН), парціальний тиск кисню (рО2), парціальний тиск вуглекислого газу (рСО2), актуальний гідрокарбонат крові (НСО3-), загальний вміст вуглекислого газу та зсув буферних основ.

Для патогістологічних досліджень сегменти аорти контрольних та експериментальних тварин фіксували в нейтральному формаліні. Парафінові або заморожені зрізи аорти товщиною 10 мкм використовували для гістологічного дослідження за наступними методиками: забарвлення гематоксилін-еозином, за Ван Ґізоном (для оцінки стану колагенових і м’язових волокон), за Вейгертом (для оцінки стану еластичних структур), суданом III, IV з дофарбуванням гематоксиліном (для візуалізації ліпідів) та марціус-скарлет-блю (для додаткової оцінки стану сполучної тканини аорти).

Математичну обробку отриманих результатів здійснено на ПК ІВМ AMD 5x86 з використанням програм Sigma Plot 5.0, Excel 97. Вірогідність різниці середніх значень визначали за t-критерієм Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Результати проведених досліджень свідчать про те, що при моделюванні різних варіантів ацидозу та алкалозу відбуваються суттєві зміни показників КОС (табл. 1). Ступінь цих зрушень істотно відрізняється при різних видах ацидозу. Найбільш важкі, декомпенсовані порушення КОС спостерігалися при гострому, підгострому гіперхлоремічному ацидозі та при голодуванні протягом трьох діб. Компенсовані варіанти ацидозу були при голодуванні протягом однієї доби, молочнокислому ацидозі та алоксановому цукровому діабеті. Протилежні зміни показників КОС виникали при моделюванні алкалозу. Декомпенсований негазовий алкалоз виникав через 1 годину після введення гідрокарбонату натрію. Підгострий негазовий алкалоз мав субкомпенсований характер.

Зміни в еластолітичній системі при моделюванні ацидозу. Залежно від експериментальної моделі ацидозу баланс між еластазою та її інгібіторами в сироватці крові та тканинах аорти порушується за рахунок різних показників, результатом чого, в будь-якому разі, є зменшення інтегрального коефіцієнта інгібітори–еластаза (табл. 2, 3). У тканинах аорти при гострому гіперхлоремічному ацидозі це відбувається внаслідок зменшення вмісту 2-М; при лактат-ацидозі та однодобовому голодуванні – через підвищенння активності еластази; при кетоацидозі, що супроводжував алоксановий цукровий діабет, - внаслідок підвищення активності еластази та зниження активності 1-ІП; при підгострому ацидозі та тридобовому голодуванні – за рахунок підвищення активності еластази та зниження вмісту 2-М. Отже, в одних випадках вказаний коефіцієнт знижується внаслідок збільшення активності еластази, в інших – за рахунок зниження вмісту 2-М або 1-ІП. У деяких моделях спостерігалися комбіновані зрушення активності протеолітичного ферменту та одного з інгібіторів. Слід зазначити, що за жодної експериментальної моделі ацидозу не спостерігалось одночасного вірогідного зменшення вмісту 2-М та 1-ІП. Мабуть, це свідчить про розвиток компенсаторних реакцій, спрямованих на обмеження активності еластази за участю її природних інгібіторів. Це відбувається або за рахунок більш вагомого для тканин аорти 2-М, який, проте, має меншу константу асоціації з еластазою (4.1 · 107 моль-1 · с-1), чи 1-ІП, що поступається за вмістом, але є значно більш потужною антипротеїназою відносно еластази (константа асоціації - 6.5 · 107 моль-1 · с-1) Могилевич С.Е., 1991; Веремєєнко К.М. та ін., 2000; Bernstein P.R. et al., 1994.

Рис. 1. Зміни активності еластази (1), вмісту ?2-макроглобуліну (2) та ?1-інгібітора протеїназ (3) у сироватці крові (А) та тканинах аорти (Б) щурів при моделюванні гострого (введення NH4CІ одноразово) та підгострого (питний режим з додаванням NH4CІ протягом 14 діб) ацидозу (% від контролю, прийнятого за 100).

За нашими результатами, рівновага в системі еластазаінгібітори в аорті щурів порушується дуже швидко - вже через годину після введення відповідних речовин. Це, з одного боку, свідчить про високу мобільність еластолітичної системи, а з іншого, про чітку залежність між активністю еластази та рівнем рН. Так, при одноразовому введенні NH4Cl спостерігався розвиток декомпенсованого ацидозу, про що свідчить значне зниження рН порівняно з контролем (7.34 0.04 та 7.40 0.02 відповідно), вірогідне зменшення показників актуального гідрокарбонату крові (до 50% від вихідного вмісту НСО3-), загального вмісту вуглекислого газу та буферних основ (5.04 0.63 ммоль/л). Не менш важкий характер мали порушення КОС при моделюванні підгострого гіперхлоремічного ацидозу, однак, за ступенем порушень в еластолітичній системі аорти та сироватки крові поступаються таким при гострому ацидозі (рис. 1). Звичайно, слід враховувати те, що при моделюванні гострого ацидозу в організм тварини одночасно потрапляє велика кількість хлористого амонію в досить високій концентрації (20 ммоль/кг), а при підгострому ацидозі тварина певною мірою могла утримуватися від пиття 0,25% розчину хлористого амонію. Однак як ми зазначали, рН крові, вміст гідрокарбонату, парціальний тиск вуглекислого газу, загальний вміст СО2 та, нарешті, зсув буферних основ (-8.46 1.82 ммоль/л) при підгострому ацидозі свідчать про декомпенсований характер змін КОС. Отже, виникає протиріччя – при однаково виражених порушеннях КОС (при гострому та підгострому ацидозі) зміни в еластолітичній системі є менш виразними при хронічному впливі ацидогенного чинника. Поясненням цього може бути розвиток певних компенсаторних реакцій, а, можливо, і виснаження клітин, здатних до синтезу еластази.

Оскільки при пероральному введенні хлористого амонію чи молочної кислоти КОС порушується спочатку в крові, а потім в тканинах, можна припустити, що зміни в системі еластолізу тканин аорти є наслідком порушення балансу між еластазою та її інгібіторами в сироватці крові. Відомо, що нейтрофіли за умов норми вважаються основним джерелом еластази у сироватці крові, а при зниженні рН секретують значно більше протеолітичних ферментів у позаклітинний простір Smedly L.A. et al., 1986; Uehara Y. et al., 1998; Coakley R.J. et al., 2000. Аналіз наших результатів підтверджує ці факти. У сироватці крові спостерігається значне зниження співвідношення інгібітори/еластаза при моделюванні різних варіантів ацидозу. При гострому гіперхлоремічному ацидозі та при тридобовому голодуванні це відбувається внаслідок збільшення активності еластази та зниження вмісту 2-М; при кетоацидозі, що супроводжує алоксановий цукровий діабет, – за рахунок різкого підвищення активності еластази; при введенні молочної кислоти та підгострому ацидозі – внаслідок зниження вмісту 2-М; при однодобовому голодуванні – як наслідок підвищення активності еластази. Слід зазначити, що ступінь зменшення інтегративного показника стану еластолітичної системи, як правило, збігався з важкістю експериментального ацидозу.

Рис. 2. Зміни активності еластази (1), вмісту ?2-макроглобуліну (2) та ?1-інгібітора протеїназ (3) у сироватці крові (А) та тканинах аорти (Б) щурів при голодуванні (% від контролю, прийнятого за 100).

Найбільш яскраво це ілюструє дослід із моделюванням одно- та тридобового голодування (рис. 2). Якщо зсув буферних основ при однодобовому голодуванні становив –1.5 0.85 ммоль/л, то коефіцієнт інгібіториеластаза в сироватці крові був 148.9 ум. од. У разі тридобового голодування ці показники становили відповідно –7.2 2.49 ммоль/л та 94.3 ум. од. Це підтверджує нашу думку про щільний зв’язок між КОС та еластолітичною системою сироватки крові.

Проте не можна виключати можливості того, що порушення балансу між еластазою та її інгібіторами в аорті відбувається внаслідок безпосереднього впливу ацидозу (або речовини за допомогою якої його моделювали) на клітини аорти (гладеньком’язові, ендотеліальні, фібробласти) та моноцити, що надходять в ушкоджену судинну стінку з циркулюючої крові. За умов ацидозу активність еластази може підвищуватися внаслідок активації макрофагів та інших клітин у стінці аорти і саме за рахунок діяльності цих клітин відбувається активація еластолізу. Слід зазначити, що активність еластази в стінці аорти перевищує активність цього ферменту в сироватці крові (у перерахунку на 1 г білка) в 18 - 20 разів. Цей факт ще раз підтверджує думку про те, що переважно еластаза синтезується безпосередньо в стінці аорти, а частково може надходити із циркулюючої крові. На питання, за рахунок яких факторів змінюється вміст інгібіторів еластази в стінці аорти, важко відповісти однозначно. Зменшення вмісту білків-інгібіторів у сироватці крові при ацидозі можна пояснити порушенням їх синтезу у печінці під дією глюкокортикоїдів, продукція яких значно збільшується при ацидозі. Ті інгібітори, що знаходилися в крові до початку патологічного процесу (ацидозу), швидко виводяться з циркуляції після взаємодії з еластазою (як ми вказували вище, рівень її підвищується при більшості експериментальних моделей ацидозу) або іншими протеїназами Веремєєнко К.М., 1988; May R.C. et al., 1992; Bernstein P.R. et al., 1994; Cai T.Q. et al., 1996. Відомо, що швидкість виведення з циркуляції активованого взаємодією з протеїназами 2-М не перевищує 4 - 8 секунд Веремєєнко К.М., 2000; Anchordoguy T.J. et al., 1993. Такий короткий термін напівжиття інгібіторів (після взаємодії з протеїназами) при активації протеолітичних ферментів зумовлює необхідність швидкого відновлення їх вмісту у сироватці крові внаслідок синтезу de novo у печінці. Але останнє стає неможливим за вищезгаданих умов. При голодуванні на синтез 2-М крім ацидозу негативно впливає і нестача амінокислот. Роль цього протеїну в патогенезі артеріосклерозу не обмежується його антипротеазними властивостями. Він може виконувати функцію кур’єра факторів росту, а після взаємодії з протеїназами здатний впливати на рецептори гладеньком’язових клітин (ГМК), фібробластів, гепатоцитів, що призводить до низки ефектів Биць Ю.В. та ін., 1999; Веремєєнко К.М., 2000; Bonner J.C. et al., 1995. Зокрема, активований взаїмодією с протеїназою 2-М стимулює проліферацію ГМК Weaver A. M. et al., 1995; Webb D.J. et al., 1995, що має значення в патогенезі артеріосклерозу.

Зміни вмісту інгібіторів в аорті та у сироватці крові, як правило, збігаються, що, безумовно, свідчить про взаємозв’язок сироваткових і тканинних антипротеїназних систем. Дійсно, як за умов норми, так і при ацидозі, що суттєво впливає на судинну проникність, певна кількість інгібіторів потрапляє до тканин судинної стінки, де ці білки продовжують виконувати свої функції з обмеження активності протеїназ. Але не можна забувати про джерела синтезу інгібіторів безпосередньо у тканинах судинної стінки, особливо у разі хронічного запального процесу Досенко В.Є., 1998; Lysiak J.J. et al., 1995. Макрофаги судинної стінки здатні до синтезу як 2-М, так і 1-ІП. За нашими результатами, вміст 2-М знижувався при усіх моделях ацидозу, за виключенням алоксанового діабету, де він істотно підвищувався у судинній стінці. Щодо 1-ІП, то його вміст міг і збільшуватися в аорті при моделюванні ацидозу, наприклад, при лактат-ацидозі та кетоацидозі внаслідок однодобового голодування. Встановлено, що при розщепленні 1-ІП макрофагальною еластазою він набуває властивостей хемоатрактанта нейтрофільних гранулоцитів, які є активними продуцентами еластази та інших протеолітичних ферментів і вільних радикалів Banda M.J. et al., 1988. Продукція останніх регулюється інсуліном Oldenborg P.A., 1999. За умов абсолютного дефіциту інсуліну, що виникає при алоксановому цукровому діабеті, нейтрофіли внаслідок генерації вільних радикалів можуть завдати значно більшої шкоди шляхом окиснення ліпідів мембран клітин крові та судинної стінки. Ушкодження ендотеліальних клітин і порушення проникності судинної стінки сприяє проникненню білків крові, в тому числі і 1-ІП, до тканин аорти та інших судин. Отже, вміст 2-М у тканинах аорти більшою мірою залежить від синтезу in situ, а 1-ІП – від надходження із циркулюючої крові.

Зміни в еластолітичній системі при моделюванні алкалозу. Якщо проблема еластолізу при ацидозі піднімалася в роботах різних учених і, таким чином, слід було очікувати певних зрушень в системі еластазаінгібітори, то дослідження впливу алкалозу на стан цієї системи нами проведено вперше. Виявилося, що баланс між еластазою та її інгібіторами порушується і при алкалозі (див. табл. 1, 2). Зниження коефіцієнта інгібітори/еластаза в гомогенатах аорти як при гострому, так і при підгострому алкалозі відбувалося внаслідок підвищення активності еластази. Зниження вмісту інгібіторів, яке спостерігалося при ацидозі, не є характерним для алкалозу. Щодо сумарного вмісту інгібіторів, то він, навпаки, істотно збільшувався в гомогенатах аорти при гострому алкалозі, а вміст 1-ІП залишався на значно вищому, ніж у контролі, рівні і при підгострому алкалозі. Таким чином, порушення балансу в еластолітичній системі аорти при алкалозі відбувається виключно внаслідок підвищення активності еластази. Так, у тканинах аорти активність еластази при гострому алкалозі збільшилася більш ніж у 4 рази, а при підгострому алкалозі вдвічі (див. табл. 3). Ці зміни мали системний характер, про що свідчить підвищення активності еластази та порушення рівноваги між еластазою та її інгібіторами не тільки в тканинах аорти, а й у сироватці крові. При гострому алкалозі активність цієї протеїнази підвищилась у 1.5 раза, а вміст інгібіторів або залишався в межах норми (2-М), або зростав майже втричі (1-ІП). При підгострому алкалозі ситуація з станом еластолітичної системи сироватки крові дещо змінюється порівняно з гострим варіантом цього порушення КОС (рис. 3). Зменшення коефіцієнта відбувається внаслідок зниження вмісту 2-М, а активність еластази незначно збільшується порівняно з контролем. Слід відзначити, що коефіцієнт інгібіториеластаза як у тканинах аорти, так і у сироватці крові при гострому алкалозі зменшується значно більшою мірою, ніж при підгострому алкалозі. Тобто, відбувається пристосування організму до дії фактора, що спричинює розвиток алкалозу (в нашому випадку це NaHCO3).

Рис. 3. Зміни активності еластази (1), вмісту ?2-макроглобуліну (2) та ?1-інгібітора протеїназ (3) у сироватці крові (А) та тканинах аорти (Б) щурів при моделюванні гострого (введення NaHCO3 одноразово) та підгострого (питний режим з додаванням NaHCO3 протягом 14 діб) алкалозу (% від контролю, прийнятого за 100).

Отже, при алкалозі спостерігаються характерні зміни в еластолітичній системі, які суттєво відрізняються від таких при ацидозі. Пояснення цього феномену ми бачимо у певних гормональних змінах, що супроводжують розвиток алкалозу. З’ясовано, що синтез адренокортикотропного гормону та глюкокортикоїдів істотно знижується при алкалозі, та, навпаки, підсилюється при ацидозі Кришталь М.В., 1994. Глюкокортикоїди, як відомо, пригнічують активність мікро- та макрофагів, стабілізують їх мембрани та попереджують викид лізосомальних ферментів, у тому числі еластази England B.K. et al., 1995; Uehara Y. et al., 1998. Не виключено, що саме зниження вмісту кортикостероїдів при алкалозі спричинює підвищення активності еластази в аорті та сироватці крові щурів. З іншого боку, вміст інгібіторів протеїназ у тканинах аорти та сироватці крові при експериментальному алкалозі зберігається на вихідному рівні або навіть збільшується. Це, на нашу думку, також може бути пов’язано зі зниженням вмісту кортикостероїдів. За таких умов синтез у печінці протеїнів, зокрема, інгібіторів протеїназ, не порушується. Згідно з нашими результатами, як при одноразовому введенні гідрокарбонату, так і за умов подовженого до 14 діб експерименту, активність еластази у сироватці крові підвищується, а вміст 1-ІП збільшується порівняно з контролем. У тканинах аорти спостерігається аналогічна ситуація – вміст 2-М не змінюється порівняно з вихідним рівнем, а вміст 1-ІП багаторазово збільшується. Цей факт можна пояснити безпосереднім ушкоджуючим впливом алкалозу на ендотеліальні клітини артеріальних судин. Ушкодження останніх сприяє порушенню проникності судинної стінки із наступною інфільтрацією білками плазми крові. Ураження інших клітин аорти як при алкалозі, так і при ацидозі пов’язано з порушенням іонного, в першу чергу, внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу. Перенавантаження клітини кальцієм вважається одним з тригерних факторів апоптозу. При цьому апоптотичні ГМК здатні до генерації значної кількості протеолітичних ферментів Flynn P.D., 1997. Некротична загибель клітин аорти також може відбуватися при порушеннях КОС, а наслідком некрозу завжди є запалення, яке супроводжується активацією протеолізу як одного з провідних механізмів вторинної альтерації.

Наведені вище зміни з боку еластолітичної системи при порушеннях КОС досить органічно вписуються в сучасні концепції патогенезу артеріосклерозу. Неспецифічний характер дії потужних агентів, що спричинюють загибель клітин за некротичним типом, зумовлюють розвиток такого розповсюдженого виду артеріосклерозу, як артеріосклероз Менкеберга. Як відомо, морфогенез артеріосклерозу менкебергівського типу характеризується виникненням і розвитком двох груп змін в артеріальній стінці. З одного боку, це первинні дистрофічні зміни (розвиток набряку інтими та середньої оболонки артерій, дегенеративні зміни еластичних структур і гладеньком’язових елементів, кальцифікація ГМК, основної речовини та еластичних волокон), а з іншого, - неспецифічна мезенхімна реакція.

Зміни в крові та судинній стінці, що відбуваються при ацидозі, збігаються з патогенетичними механізмами артеріосклерозу Менкеберга. До найбільш важливих слід віднести ушкодження клітин, активацію протеолітичних ферментів, порушення кальцієвого гомеостазу та додаткові фактори ушкодження у вигляді активації факторів системи зсідання крові, порушень ліпопротеїдного спектру та перекисного окиснення ліпідів. При алкалозі ці зміни не є настільки очевидними. Проведені нами гістологічні дослідження підтверджують гіпотезу про універсальний характер ушкодження судинної стінки внаслідок порушеня КОС. Як при ацидозі, так і при алкалозі були наявними ознаки деструкції еластичних структур медії аорти, явища медіасклерозу. Так, при забарвленні за Вейгертом в еластичних структурах аорти при підгострому ацидозі спостерігалися деструктивні зміни, їх набухання, витончення, розволокнення, порушення тинкторіальних властивостей, симетричності їх ходи. Характерною ознакою є сегментарний лізис і розриви внутрішньої еластичної мембрани та вікончастих мембран медії, що, на нашу думку, може бути свідченням неконтрольованого еластолізу внаслідок порушення рівноваги між еластазою та її інгібіторами. При гістологічному дослідженні зрізів аорти забарвлених за Ван Гізоном виявлено ознаки пікринофільної дегенерації структур середньої оболонки. Одночасно спостерігались і ознаки збільшеного новоутворення колагенових структур. Слід зазначити, що судан-позитивні структури в інтимі та медії аорти щурів при моделюванні ацидозу не виявлялися, тобто ліпідна інфільтрація аорти, що вважається характерною ознакою початкових стадій атеросклерозу, в цей термін експериментального ацидозу не спостерігається. Аналогічні дегенеративно-деструктивні зміни в аорті щурів спостерігалися і при моделюванні підгострого алкалозу. Патогістологічні зміни торкалися переважно еластичних і колагенових структур середньої оболонки. Забарвлення зрізів аорти за Ван Гізоном та марциус-скарлет-блю дозволило підтвердити новоутворення фібрилярних компонентів сполучної тканини в медії аорти, що було притаманно і патогістологічній картині при підгострому ацидозі. Гістологічне дослідження зрізів аорти із використанням судану-ІІІ, ІV показало, що ліпідна інфільтрація інтими аорти відсутня як у контрольних щурів, так і у тварин з експериментальним алкалозом.

Встановлені патоморфологічні зміни в судинній стінці при моделюванні підгострого ацидозу та алкалозу майже повністю відповідають змінам, що характерні для експериментального артеріосклерозу Менкеберга Биць Ю.В., 1973. Будь-яких ознак розвитку атеросклерозу у разі підгострого ацидозу чи алкалозу не виявлено. Ми не виключаємо, що при подовженні строку експерименту або при моделюванні ацидозу із використанням інших чинників патологічний процес у судинній стінці може набути і атеросклеротичного спрямування. Однак у будь-якому разі, дегенеративні зміни в медії аорти із подальшим розвитком неспецифічної мезенхімної реакції та, як наслідок, артеріосклерозу Менкеберга будуть передувати відкладанню ліпідів і формуванню атеросклеротичних бляшок в інтимі.

Проблема взаємозв’язку вказаних двох типів артеріосклерозу є надто складною взагалі, а при порушеннях КОС і поготів. Очевидно, що для її вирішення необхідні додаткові спеціальні дослідження.

ВИСНОВКИ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

Трофимова І.М. Вивчення балансу протеолітичних ферментів та їх інгібіторів у крові та судинній стінці при порушеннях кислотно-основного стану. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.04 – патологічна фізіологія. - Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України, Київ, 2003.

Дисертацію присвячено вивченню ролі порушень кислотно-основного стану у виникненні дисбалансу між протеолітичними ферментами та їх білковими інгібіторами в сироватці крові та тканинах аорти. Порушення балансу в еластолітичній системі сироватки крові та аорти при моделюванні гострого та підгострого гіперхлоремічного ацидозу відбувається за рахунок збільшення активності еластази та зменшення вмісту 2-макроглобуліну. При молочнокислому ацидозі рівновага між еластазою та її інгібіторами порушується за рахунок зменшення вмісту 2-макроглобуліну у сироватці крові та підвищення активності еластази в тканинах аорти. Метаболічний ацидоз, що набуває розвитку при голодуванні, спричинює збільшення активності еластази та зменшення вмісту 2-макроглобуліну, причому ступінь порушення балансу в еластолітичній системі сироватки крові та аорти підвищується зі збільшенням тривалості голодування. Коефіцієнт інгібіториеластаза у сироватці крові зменшується при гострому алкалозі внаслідок підвищення активності еластази, а при підгострому – за рахунок зниження вмісту 2-макроглобуліну. У тканинах аорти баланс в еластолітичній системі при негазовому алкалозі порушується внаслідок підвищення активності еластази, а вміст інгібіторів при цьому навіть збільшується. Патогістологічні зміни в стінці аорти дослідних тварин з різними варіантами підгострих порушень кислотно-основного стану свідчать про те, що патологічний процес в артеріальній стінці розвивається за типом артеріосклерозу Менкеберга. Отримані результати свідчать про те, що одним з механізмів ушкодження судинної стінки, що набуває розвитку при порушеннях кислотно-основного стану, є порушення балансу між еластазою та її інгібіторами в тканинах аорти та сироватці крові.

Ключові слова: еластаза, 1-інгібітор протеаз, 2-макроглобулін, ацидоз, алкалоз.

Трофимова И.М. Изучение баланса протеолитических ферментов и их ингибиторов в крови и сосудистой стенке при нарушениях кислотно-основного состояния. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученого степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.04 – патологическая физиология. - Институт физиологии им. А.А.Богомольца НАН Украины, Киев, 2003.

Диссертация посвящена изучению роли нарушений кислотно-основного состояния в развитии дисбаланса между протеолитическими ферментами и их белковыми ингибиторами в сыворотке крови и тканях аорты. С помощью современных энзимологических методов исследованы изменения в системе эластаза - ингибиторы эластазы при моделировании различных вариантов ацидоза (острый и подострый гиперхлоремический, молочнокислый, кетоацидоз вседствии голодания или введения алоксана) и алкалоза (острый и подострый негазовый). Установлено, что при моделировании различных видов ацидоза и алкалоза возникают нарушения баланса в системе эластаза – ингибиторы в тканях аорты и сиворотки крови крыс, причем степень этих сдвигов тесно связана с выраженностью изменений показателей кислотно-основного состояния. Нарушение баланса в эластолитической системе сыворотки крови и аорты при моделировании острого и подострого гиперхлоремического ацидоза происходит за счёт увеличения активности эластазы и уменьшения содержания 2-макроглобулина. При молочнокислом ацидозе равновесие между эластазой и её ингибиторами нарушается из-за уменьшения содержания 2-макроглобулина в сыворотке крови и повышения активности эластазы в тканях аорты. Метаболический ацидоз, развивающийся при голодании, приводит к увеличению активности эластазы и уменьшению содержания 2-макроглобулина, причем степень нарушения баланса в эластолитической системе сыворотки крови и аорты возрастает при увеличении длительности голодания. Характерной особенностью нарушения равновесия в системе эластаза–ингибиторы при диабетическом кетоацидозе является резкое увеличение активности эластазы в сыворотке крови и тканях аорты и уменьшение содержания 1-ингибитора протеиназ в сыворотке крови. Коэффициент ингибиторыэластаза в сыворотке крове уменьшается при остром негазовом алкалозе за счёт повышения активности эластазы, а при подостром – за счёт снижения содержания 2-макроглобулина. В тканях аорты баланс в эластолитической системе при негазовом алкалозе сдвигается вследствие увеличения активности эластазы, а содержание ингибиторов при этом даже увеличивается. Патогистологические изменения в аорте экспериментальных животных с различными вариантами подострых нарушений кислотно-основного равновесия свидетельствуют о том, что патологический процесс в артериальной стенке развивается по типу артериосклероза Менкеберга. Полученные данные указывают на то, что одним из механизмов повреждения сосудистой стенки, возникающего при нарушениях кислотно-основного состояния, является нарушение баланса между эластазой и её ингибиторами в тканях аорты и сыворотке крови.

Ключевые слова: эластаза, 1-ингибитор протеаз, 2-макроглобулин, ацидоз, алкалоз.

Trofimova I.N. Study of equilibrium between proteolytic enzymes and their inhibitors in blood serum and vessel wall in acid-base imbalance. – Manuscript.

Thesis for a candidate’s degree by speciality 14.03.04 – pathological physiology. – The O.O. Bogomolets Institute of Physiology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2003.

Dissertation is devoided to the study of the role of acid-base imbalance in disruption between proteolytic enzymes and their protein inhibitors in blood serum and tissues of aorta. Disbalance in elastolytic system in blood serum and in aorta during acute and subacute hyperchloremic acidosis occurs because of elastase activity increase and decrease in 2-macroglobulin level. In lactate-acidosis the balance between elastase and its inhibitors is disrupted due to decrease of 2-macroglobulin concentration in blood serum and increase of elastase activity in aorta tissues. Metabolic acidosis, which develops during starvation, leads to elastase activity increase and decrease of 2-macroglobulin contents, and degree