НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИКИ

Теплюк Надія Миколаївна

УДК 577.152.28

ГЛУТАТІОНТРАНСФЕРАЗНА АКТИВНІСТЬ І ДНК-АДДУКТИ В ПЛАЦЕНТІ ЛЮДИНИ У РАДІАЦІЙНО ТА ХІМІЧНО ЗАБРУДНЕНОМУ ДОВКІЛЛІ

03.00.03 – молекулярна біологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ – 2003

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі механізмів трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ.

Науковий керівник: доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник

Оболенська Марія Юріївна,

Інститут молекулярної біології і генетики

НАН України,

провідний науковий співробітник відділу

механізмів трансляції генетичної інформації.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник

Лукаш Любов Леонідівна,

Інститут молекулярної біології і генетики

НАН України,

завідувач відділу генетики людини;

доктор біологічних наук, професор

Матишевська Ольга Павлівна,

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка,

професор кафедри біохімії.

Провідна установа: Інститут фармакології та токсикології АМН України,

м. Київ.

Захист дисертації відбудеться 27 січня 2004 року о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного, 150.

Автореферат розіслано “ 25 ” грудня 2003 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук О.В. Підпала

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Своєчасний захист дітей від несприятливих чинників довкілля набув значної актуальності в Україні у зв’язку з особливостями екологічної ситуації. Забруднення радіонуклідами значної частини території України після Чорнобильської катастрофи стало додатковим чинником на фоні раніше сформованого забруднення хімічного характеру. Змішаний характер забруднення в Україні є однією з причин погіршення стану здоров’я населення. Це стосується зростання частоти відхилень від фізіологічного перебігу вагітності, пологів та зростання дитячої захворюваності (зокрема, на лейкози). Захист дитини від антропогеного навантаження стає важливим від самого моменту зачаття.

Об’єктом нашого дослідження було обрано плаценту, оскільки вона є кінцевим бар’єром на шляху чужорідних речовин від матері до плода. Єдиною перешкодою проходженню більшості ксенобіотиків через плаценту є їхній метаболізм системою детоксикації, який зумовлює їхню інактивацію, повернення у кровотік матері із подальшим виведенням з її організму. Значення плацентарної детоксикації, однак, мало досліджене. Зокрема, невідомо, яким чином різна ефективність детоксикації в плаценті позначається на генотоксичному ушкодженні тканини ксенобіотиками, на перебігу вагітності та на здоровї дитини.

Плацента як об’єкт дослідження має декілька переваг. Більша частина плаценти є тканиною плода, тому показники, які досліджені в плаценті, є сурогатними показниками для плода. Отримання цієї тканини людини в достатній кількості не ускладнене обмеженнями методичного та етичного характеру. На відміну від інших тканин, у плаценті експресуються лише окремі ферменти детоксикації ксенобіотиків. Перша стадія детоксикації в плаценті представлена переважно цитохромом Р450 1А1 (CYP1A1), друга стадія – глутатіонтрансферазою класу Р (GSTP1) і, меншою мірою, класу М (GSTM1). У зв’язку з цим плацента є зручною моделлю для вивчення співвідношення ефективності детоксикації на різних стадіях.

Генотипування ферментів детоксикації в плаценті можна розглядати як складову генетичної паспортизації дитини. З різними генотипами CYP1A1, GSTP1 та GSTM1 пов’язана схильність до злоякісних новоутворень, зокрема до раку легень. Тому генотип цей важливий у майбутньому житті дитини – при профорієнтації, виборі фармакотерапії, тощо. Дослідження ролі генотипу при дії токсичних факторів на здоров’я людини нещодавно надало підставу для виокремлення дисципліни токсикогеноміки. Визначення ж ролі поліморфізмів одиничних нуклеотидів у розвитку полігенних захворювань, на рівні з протеомікою, є наступним необхідним завданням сучасної науки після секвенування геному людини.

Дослідження захисної ролі детоксикаційної системи плаценти, а також залежності ефективності детоксикації в плаценті від індивідуального генотипу та від чинників навколишнього середовища необхідні для розуміння можливих шляхів захисту плода від несприятливих впливів довкілля.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження проводили в рамках бюджетного тематичного плану відділу механізмів трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології і генетики НАН України “Молекулярні основи компартменталізації білкового синтезу у вищих еукаріотів” (номер державної реєстрації – 2.28.2.5, шифр 2.2.4.9), за підтримки грантів: “Чорнобиль” Міністерства охорони здоров’я України, “Біомоніторинг генотоксичного ушкодження в плаценті людини в екологічно несприятливих районах України” (ICRETT №580) Міжнародного союзу проти раку (IUAC) та фонду ім. Йозефа Мяновського у Польщі.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було визначення функціонального стану детоксикаційної системи та генотоксичного ушкодження в плаценті носіїв різних генотипів ферментів детоксикації в умовах радіаційно та хімічно забрудненого довкілля.

Для досягнення мети необхідно було вирішити такі завдання:

1. Встановити особливості функціонального стану детоксикаційної системи в зразках плаценти людини з різними генотипами ферментів детоксикації – CYP1A1, GSTP1 та GSTM1.

2. Дослідити особливості детоксикаційного, окисно – відновного стану та рівень генотоксичного ушкодження поліциклічними ароматичними вуглеводнями в плаценті людини з районів із різним ступенем забруднення довкілля радіонуклідами та ксенобіотиками.

3. З’ясувати, чи узгоджена в плаценті людини робота основних ферментів двох послідовних стадій детоксикації – CYP1A1 та GSTP1.

4. Кількісно оцінити як впливає генотип ферментів детоксикації, ступінь забруднення довкілля хімічними речовинами та радіонуклідами на глутатіонтрансферазну активність у плаценті в умовах спільної дії цих факторів.

5. Дослідити залежність між активністю ферментів детоксикації в плаценті та ступенем ушкодження геномної ДНК плаценти поліциклічними ароматичними вуглеводнями.

6. Визначити, чи існує залежність між глутатіонтрансферазною активністю в плаценті та величиною коефіцієнтів Апгара, а також частотою найпоширеніших відхилень від фізіологічного перебігу вагітності.

Об’єктом дослідження була плацента людини, предметом дослідження – стан детоксикаційної системи в плаценті людини залежно від генотипу, а також радіаційного та хімічного навантаження з боку довкілля. У роботі використовували методи: визначення ферментативної активності, вмісту відновлених низькомолекулярних тіолів та продуктів перекисного окислення ліпідів, полімеразна ланцюгова реакція, рестрикційний аналіз фрагментів ДНК, секвенування ДНК за методом Сенгера, культивування клітин, Нозерн - та Вестерн - гібридизація, конкурентна хемолюмінесцентна імунодетекція, статистична обробка даних.

Наукова новизна одержаних результатів. У роботі вперше показано, що глутатіонтрансферазна активність та інтенсивність перекисного окислення ліпідів залежать від генотипу CYP1A1; ці показники вищі в плаценті гетерозигот – носіїв 462Ile/Val форм CYP1A1, ніж у гомозигот – носіїв 462Ile форми. Таким чином вперше виявлено, що в плаценті робота ферментів послідовних стадій детоксикації узгоджена: генетично зумовлена вища активність ферменту першої стадії CYP1A1 супроводжується вищою активністю ферментів другої стадії глутатіонтрансфераз. У роботі вперше встановлено, що ксенобіотик бензо(а)пірен є біфункціональним індуктором, який індукує експресію ферментів CYP1A1 та GSTP1 у клітинах хоріокарциноми людини.

Доведено існування зворотньої кореляції між глутатіонтрансферазною активністю та вмістом ПАВ-аддуктів у геномній ДНК плаценти, що характеризує генотоксичне ушкодження. Виявлено, що глутатіонтрансферазна активність у плаценті людини корелює із величиною коефіцієнтів Апгара, які характеризують стан новонароджених. Отже, глутатіонтрансферазна активність є інтегральним показником спроможності детоксикаційної системи.

Вперше отримано дані щодо зниження глутатіонтрансферазної активності в зразках плаценти людини в районах України, які є екологічно найбільш несприятливі. Показано дискоординацію роботи ферментів послідовних стадій детоксикації в умовах тривалої дії ксенобіотиків.

Виявлено, що в плаценті людини із районів, де переважає забруднення радіонуклідами, відбувається зниження експресії GSTP1 на претрансляційному рівні, тоді як у районах із переважним забрудненням хімічного характеру значну роль відіграє зворотнє інгібування ферментативної активності при підвищеному рівні GSTP1-специфічної мРНК.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані дані свідчать, що величина глутатіонтрансферазної активності в плаценті є неспецифічним інтегральним показником ефективності функціонування детоксикаційної системи плаценти та ступеня ризику для здоров’я новонародженого.

Вміст ПАВ-ДНК аддуктів є специфічним показником навантаження індивідуума продуктами неповного згорання органічних субстратів, який може бути використаний при розробці засобів захисту людини в довкіллі та у житлі.

Дані про генотип ферментів детоксикації в плаценті доцільно враховувати протягом життя людини при профорієнтації та у виборі фармакотерапії. Ці дані є складовою індивідуальної генетичної паспортизації людини.

У роботі створено базу для подальшого дослідження регуляторних механізмів, що лежать в основі узгодженого функціонування ферментів двох послідовних стадій детоксикації, а також механізмів його порушення.

Дослідження особливостей функціонування системи детоксикації в плаценті в різних умовах довкілля є необхідною основою для розробки засобів підвищення ефективності захисту плода від несприятливих умов довкілля.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційну роботу виконано під керівництвом д. б. н., пров. н. сп. відділу механізмів трансляції генетичної інформації ІМБіГ НАН України М.Ю. Оболенської. Здобувачем особисто виконано визначення глутатіонтрансферазної, глутатіонредуктазної активності, вмісту відновлених низькомолекулярних тіолів та сполук, що реагують з тіобарбітуровою кислотою, а також генотипування поліморфізмів 462Ile/Val CYP1A1, 104Ile/Val GSTP1 та подвійної делеції GSTM1 у зразках плаценти людини, отриманих у 1995-2002 рр. у різних районах України, Білорусії та Польщі. Особисто здійснено культивування клітин хоріокарциноми людини лінії BeWo, інкубацію клітин з бензо(а)піреном, клонування GSTP1 кДНК у pBlueScript вектор, синтез GSTP1-специфічного РНК-зонда, Вестерн- та Нозерн- гібридизацію, клонування та секвенування фрагмента 7-го екзону гена CYP1A1. Проведено визначення кінетичних параметрів глутатіонтрансферазної реакції та досліди з відновлення глутатіонтрансферазної активності плацентарного цитозоля дитіотреітолом. Особисто проаналізовано літературні дані та виконано статистичну обробку результатів. Обговорення результатів проводили спільно з науковим керівником та із співробітниками дослідницької групи. В отриманні зразків плаценти та у визначенні ферментативної активності у 1991 – 93 рр. брали участь співробітники ІМБіГ НАН України, к. б. н. Чайковська Т. Л., Мацевич Л. Л. та к. б. н. Лебедєва Л. М.; визначення ПАВ – аддуктів у ДНК виконано спільно з д. б. н. Оболенською М. Ю., радіометрію зразків плаценти, отриманих в 1999 р., виконав співробітник Гомельського медичного університету, д. мед. н. Перепльотчиков А. М. Визначення етоксикумариндіетилазної активності було виконано спільно з д. б. н. Оболенською М. Ю. та д-ром М. Пасанен (Фінляндія). Результати роботи опубліковано в спільних працях. Усім цим фахівцям автор висловлює щиру подяку.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідалися на: XII Міжнародному симпозіумі “Мікросоми та метаболізм ліків” (Moнтпельє, Франція, 1998 р.), XVI Конференції Європейської асоціації дослідження раку “EACR XVI” (Халкідікі, Греція, 1999 р.), на Конференціях молодих вчених, аспірантів і студентів з молекулярної біології та генетики при Інституті молекулярної біології і генетики НАН України (Київ, 2001 та 2003 рр.), на VIII та IX Науково-практичних конференціях “НаУКМА” (Київ, 2002 та 2003 рр.), на VIІІ Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002 р.), на I Всеукраїнській науково – практичній конференції студентів, аспірантів та молодих вчених “Біотехнологія: освіта, наука” (Київ, 2003 р.), на IV Міжнародній конференції “Дети Чернобыля – медицинские последствия и социально-психологическая реабилитация” ООН, ВОЗ та асоціації “Лікарі Чорнобиля” (Київ, 2003 р.), на EU-US школі з молекулярних маркерів стресових реакцій, що індукуються ушкодженням ДНК (Кортона, Iталія, 2003 р.).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 5 статей, 4 з яких у фахових виданнях, та тези 10-ти доповідей на вітчизняних та міжнародних конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, отриманих

результатів, їх обговорення, висновків та переліку використаних літературних джерел. Текст дисертації проілюстровано 14 таблицями і 30 рисунками. Перелік використаних літературних джерел охоплює 338 найменувань. Дисертаційну роботу викладено на 133 сторінках машинописного тексту.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали і методи дослідження. Матеріалом для досліджень були зразки зрілої плаценти людини (дитячої частини), отримані в пологових будинках різних районів центральної України, південної Білорусії та південно-східної Польщі. Одразу після пологів або кесаревого розтину шматки тканини вирізали з центральної частини органа, промивали у холодному фізіологічному розчині і заморожували в рідкому азоті. Зразки зберігали в рідкому азоті до визначення ферментативної активності та при - 70С для проведення інших досліджень. Зразки збирали за узгодженням із породіллями. Детальні персональні та клінічні дані отримували при опитуванні породіль та із медичних карток.

Визначення ферментативної активності. Функціональний стан системи детоксикації визначали за 7-етоксикумарин О-діетилазною активністю, яка зумовлена CYP1A1, та глутатіонтрансферазною активністю цитозолю, зумовленою переважно GSTP1. Активності визначали за початковою швидкістю реакцій із субстратами 7-етоксикумарином та хлординітробензолом (ХДНБ), відповідно (Greenlee et al., 1978, Habig et al., 1974). Глутатіонредуктазну активність цитозолю визначали за швидкістю окислення NADPH2 в реакції відновлення окисленого глутатіону (Мартинчик, 1986). Питому 7-етоксикумарин О-діетилазну активність розраховували у пмоль продукту, утвореного за 1 хвилину реакції на 1 мг білка мікросомальної фракції плаценти. Глутатіонтрансферазну та глутатіонредуктазну активності розраховували у нмоль продукту, утвореного за 1 хвилину реакції на 1 мг білка цитозолю. Вміст білка визначали з реактивом Бредфорда (Bradford, 1976).

Визначення показників окисно-відновного стану. Вміст відновлених низькомолекулярних тіолів у плацентарному гомогенаті визначали в реакції з дитіонітробензойною кислотою – реактивом Елмана (Sedlak, 1968). Інтенсивність перекисного окислення ліпідів оцінювали за вмістом кінцевих продуктів перекисного окислення – сполук, що реагують з тіобарбітуровою кислотою (Гаврилов и др., 1987).

Виділення ДНК. Виділення та очищення препаратів ДНК плаценти здійснювали стандартними методами фенол-хлороформної екстракції з попередньою обробкою протеїназою К.

Визначення вмісту ПАВ-ДНК аддуктів. Генотоксичне ушкодження ксенобіотиками оцінювали за кількістю поліциклічних ароматичних вуглеводнів, які зв’язані з геномною ДНК плаценти (ПАВ-ДНК аддуктів). Для точного визначення концентрації дволанцюгової ДНК в препаратах було застосовано метод флуоресцентної детекції ДНК із барвником SYBR Green I (Vitzthum et al., 1999). Кількість аддуктів у ДНК визначали методом конкурентної хемілюмінесцентної імунодетекції – в реакції з антитілами до ПАВ з подальшим

використанням лужної фосфатази та люмінесцентного субстрату CDP-Star (Divi et al., 2002). Реакцію здійснювали в 96-лункових планшетах. Результат реакції кількісно визначали на люмінометрі TR717 Microplate Luminometer, PE Applied Biosystems.

Генотипування ферментів детоксикації. Поліморфізми А4889G 7-го екзону гена CYP1A1, А1403G 5-го екзону гена GSTP1 та подвійну делецію гена GSTM1 визначали за допомогою полімеразної ланцюгової реакції та рестрикційного аналізу (Shields et al., 1993, Harries et al., 1997, Comstock et al., 1990). Відповідність ампліфікованого продукту фрагменту 7-го екзону гена CYP1A1 визначали клонуванням продукту в ТОРО-вектор із подальшим його секвенуванням в автоматичному секвенаторі ABI PRISM 310 Genetic Analyser (Applied Biosystems).

Культивування клітин. Клітини хоріокарциноми людини лінії BeWo культивували у флаконах із 30 мл середовища Ham’s F12 в умовах, рекомендованих Американською колекцією культур тканин. Клітини пересівали кожні 5-7 діб. Для стимуляції бензо(а)піреном клітини висівали на чашки Петрі та інкубували 48 годин у культуральному середовищі із 50 мкМ бензо(а)піреном у 0,001% ДМСО.

Вестерн – гібридизація. Виділення та електрофорез білків з клітин BeWo проводили за стандартними протоколами (Sambrook et al., 1989). Після електропереносу білків фільтри гібридизували з антисироваткою кроля, специфічною до CYP1A1 людини (BIOTREND Chemikalien GmbH) у розведенні 1:1000. Результати гібридизації визначали за допомогою методу підвищеної хемілюмінесценції (ECL+, Amersham) із пероксидазою хрону.

Нозерн – гібридизація. Тотальну РНК із клітин BeWo виділяли гуанідинтіоцианатним методом (Chomczynski, 1987). Здійснювали електрофорез РНК та капілярний перенос її на фільтри за стандартними протоколами (Sambrook et al., 1989). Гібридизацію здійснювали з GSTP1-специфічним РНК зондом, міченим діоксигеніном. Зонд отримували транскрипцією GSTP1-кДНК, клонованої у pBlueScript вектор. Результати гібридизації визначали за допомогою системи флуоресцентної детекції діоксигеніну з CSPD тa лужною фосфатазою.

Статистична обробка результатів. Статистичний аналіз здійснювали за допомогою програми Statistica 6.0, StatSoft Inc. Для порівняння параметричних даних застосовували t-критерій Стьюдента, для порівняння частот генотипів та ускладнень вагітності – критерій ?2. Для визначення зв’язку між показниками використовували кореляційний аналіз, моделі нелінійної та множинної регресії. Результати Вестерн- та Нозерн - гібридизації розраховували за допомогою програми Gel-Pro Analyser 3.1, Media Cybernetics.

Результати досліджень та їх обговорення.

Дослідження детоксикаційного та окисно-відновного стану плаценти носіїв різних алельних варіантів генів CYP1A1, GSTP1 та GSTM1. З метою з’ясування залежності стану системи детоксикації в плаценті від індивідуальних особливостей генотипу, основні ферменти детоксикації були прогенотиповані в досліджених зразках плаценти. Для дослідження обрали типи поліморфізму, для

яких відомий їхній вплив на активність відповідних ферментів та асоціація із підвищеним ризиком онкологічних захворювань: CYP1A1 A4889G (Ile462Val), GSTP1 A1403G (Ile104Val) та GSTM1 +; null (ген наявний або делетований). Отримані частоти генотипів у досліджених вибірках населення України та Білорусії не відрізнялися суттєво від частот, відомих для інших європейських популяцій.

Фенотипічні показники детоксикаційного та окисно-відновного стану плаценти було згруповано залежно від генотипів CYP1A1, GSTP1 та GSTM1. Було виявлено, що в плаценті гетерозигот – носіїв 462Ile/Val форм CYP1A1 глутатіонтрансферазна активність цитозолю достовірно (р < 0,01) вища, ніж у гомозигот – носіїв 462Ile форми (рис. 1).

СYP1A1 Ile/Ile

СYP1A1 Ile/Val

Рис. 1. Порівняння глутатіонтрансферазної (ГТаза), глутатіонредуктазної (ГРаза) активності, вмісту відновлених низькомолекулярних тіолів (ВНМТ) та сполук, що реагують із тіобарбітуровою кислотою (ТБК-РС) в плаценті носіїв двох генотипів CYP1A1.

За 100% прийнято значення відповідних показників у носіїв генотипу СYP1A1 462Ile/Ile

Літературні дані щодо активності різних форм CYP1A1 суперечливі, але більшість досліджень підтверджує вищу активність або експресію Val форми (Petersen et al., 1991, Landi et al., 1994, Crofts et al., 1994, Kawajiri et al., 1993, Taioli et al., 1995 та ін.). Таким чином, генетично зумовлена вища активність Val форми CYP1A1, ферменту першої стадії детоксикації, супроводжується вищою активністю ферменту другої стадії глутатіонтрансферази.

Узгодженість роботи цих ферментів у плаценті було нами підтверджено також in vitro на культивованих клітинах хоріокарциноми людини лінії BeWo. Інкубація клітин з бензо(а)піреном, типовим представником поліциклічних ароматичних вуглеводнів, призводила до індукції експресії генів CYP1A1 та GSTP1 в 3,4 та 4,8 раза, відповідно (рис. 2, 3).

Рис. 2. Результати Вестерн-блот аналізу із виявлення білка CYP1A1 в клітинах BeWo після їх культивування з бензо(а)піреном і без нього:

1, 2 – клітини BeWo інкубували з 0,001% диметилсульфоксидом протягом 48 год; 3, 4 – клітини BeWo інкубували з 50 мкМ бензо(а)піреном у 0,001% диметилсульфоксиді протягом 48 год; 5 – клітини HepG2 як позитивний контроль

Рис. 3. Результати Нозерн-блот аналізу із виявлення GSTP1-специфічної мРНК у клітинах BeWo після їх культивування у присутності бензо(а)пірену і без нього:

1 – клітини BeWo інкубували з 0,001% диметилсульфоксидом протягом 48 годин; 2 – клітини BeWo інкубували з 50 мкМ бензо(а)піреном у 0,001% диметилсуль-фоксиді протягом 48 годин; 3 – клітини HepG2 як негативний контроль

Таким чином, нами вперше було показано, що бензо(а)пірен є біфункціональним індуктором експресії ферментів детоксикації. Остаточно не з’ясовано, за яким механізмом відбувається біфункціональна індукція ферментів детоксикації, за паралельним чи послідовним. Отже, завданням подальших досліджень могло б бути з’ясування процесів, які зумовлюють узгодженість роботи ферментів послідовних стадій детоксикації в плаценті.

Нами вперше було виявлено, що інтенсивність перекисного окислення ліпідів у плаценті достовірно вища у носіїв 462Ile/Val форм CYP1A1 порівняно з гомозиготами за 462Ile формою (p < 0,01; рис. 1). Відомо, що мікросомальні цитохроми, зокрема CYP1A1, паралельно з основною реакцією трансформації ксенобіотиків здатні генерувати супероксидний радикал, і за рахунок цього ініціювати перекисне окислення. АМК 462 Ile/Val розташована в гем-зв’язувальній ділянці поруч з активним центром ферменту. Наявність Val теоретично може змінювати гідрофобність мікросередовища і через це впливати на каталітичні властивості ферменту. Наші результати щодо інтенсивності перекисного окислення у носіїв різних генотипів CYP1A1 узгоджуються з раніше відомим фактом, що носійство Val форми CYP1A1 пов’язане із високим ризиком

новоутворень.

Ми спостерігали достовірне зниження глутатіонтрансферазної активності до субстрату ХДНБ у низки носіїв генотипів GSTP1 Ile/Ile, Ile/Val та Val/Val (285,0±20,0; 225,5±15,8 та 167,6±21,2 нмоль*мг білка цитозолю-1*хв-1, відповідно, p < 0,05). Вищу активність 104Ile форми GSTP1 було показано раніше in vitro (Zimniak et al., 1994, Hu et al., 1997, Ali-Osman et al., 1997, Hu et al., 1999). Не було виявлено залежності досліджених показників від генотипу GSTM1, ймовірно за рахунок невисокої експресії цієї ізоформи в плаценті (Mannervik, 1985).

Різниця глутатіонтрансферазної активності підсилюється при порівнянні граничних комбінацій генотипів – СYP1A1 Ile/Val + GSTP1 Ile/Ile + GSTM1 (+) проти СYP1A1 Ile/Ile + GSTP1 (Ile/Val+Val/Val) + GSTM1 null (371,0210,8 та 184,1713,9 нмоль*мг білка цитозолю-1*хв-1, відповідно; р=0,0065).

Стан системи детоксикації в плаценті людини із різних за екологічними умовами регіонів. Формування та характеристика груп дослідження. Досліджені зразки плаценти було розподілено на групи залежно від характеру забруднення районів проживання породіль (табл. 1).

У кожному з розглянутих районів породіллі зазнавали вплив складного комплексу екологічних факторів, зокрема радіаційної та хімічної природи, а також соціальних. Детальні дані щодо забруднення довкілля ксенобіотиками, радіонуклідами та розраховані СЕЕРДЕ дозволяють, натомість, виокремити райони із забрудненням переважно радіаційного (групи I-III), змішаного (групи IV-V) та переважно хімічного характеру (групи VI-VII), а також умовно чисті райони (групи VIII-IX).

За даними опитування, досліджені породіллі не курили, не вживали алкоголю та наркотиків, не мали професійного контакту з ксенобіотиками протягом вагітності. Мешканки України та Білорусії мали середній достаток, схожий спосіб життя та харчування. Мешканки Польщі мали вищий рівень життя. Обстежені з усіх груп, окрім евакуйованих, мешкали не менше трьох років на вказаних територіях. Середній вік породіль був вищим серед киянок (групи IV та V) – 28-29 років проти 22-25 років для решти груп. За масою тіла новонароджених групи достовірно не відрізнялись.

Зразки, об’єднані в групу V, було отримано у відділі патології вагітності НДІ ПАГ у м. Києві з метою з’ясування стану детоксикаційної системи плаценти при найпоширеніших ускладненнях під час вагітності. Усі породіллі цієї групи мали патологічні синдроми, серед яких найпоширенішими були загроза переривання вагітності, пізні токсикози та анемія вагітних, а також мертвонародження в анамнезі. Серед решти досліджених максимальну частоту випадків патології вагітності спостерігали у породіль, які перебували у радіаційних зонах I та II (група I, 78%), а мінімальна – у породіль сільських районів радіаційної зони IV (група II, 24%). В інших групах загальна частота випадків патології вагітності складала близько 50%.

Таблиця 1

Забруднення ізотопами цезію і бензо(а)піреном районів проживання породіль

Г

Р

У

П

И | Райони проживання або тимчасового перебування породіль | N | Період отри-мання зразків (Т) | Забру-днення ґрунту 134+137Cs кБк/м2, 1986 | СЕЕРДЕ**,

мЗв | Концентрація бензо(а)пірену у повітрі, нг/м3, Т

1986 | Т

Се-редня | Макси-мальна

I | Радіаційна зона I* Радіаційна зона II | 18 | 1992-93 | >1480 >550 | ~123нв | 1,7

1,7 | <1,0

<1,0 | <1,0

<1,0

II | Радіаційна зона IV (центральна Україна) | 17 | 1991-93 | 37-185 | <0,1 | 0,3-0,4 | <1,0 | <1,0

III | Радіаційна зона IV

(м.Гомель та область) | 26 | 1999 | 37-185 | нв | нв | <1,0 | <1,0

IV | Радіаційно та хімічно забруднений район (м. Київ) | 20 | 1991-93 | <37 | 4,9 | 0,1-0,2 | 4,1 | 12,8

V | 21 | 1995-96 | <37 | 4,9 | нв | нв | нв

VI | Район, забруднений переважно хімічно

(м. Запоріжжя) | 21 | 1992 | <3,7 | <0,1 | <0,1 | 12,3 | 33,3

VII | 13 | 2002 | <3,7 | <0,1 | <0,1 | 3,0 | 9,8

VIII | Умовно чистий район (м. Полтава) | 10 | 1992-93 | 3,7-37 | <0,1 | <0,1 | 4.6 | 6.4

IX | Умовно чистий район (південно-східна Польща) | 20 | 2001 | <3,7 | <0,1 | <0,1 | <1,0 | <1,0

Примітки: N-кількість зразків;

*Залежно від вмісту 137Cs, 90Sr та ізотопів Pu у ґрунті постраждалі від аварії на ЧАЕС території розділені згідно офіційним документам на чотири зони радіаційного забруднення. I групу дослідження складають ліквідатори аварії на ЧАЕС, які працювали на станції вахтовим методом, мешканці м. Чорнобиль, евакуйовані у серпні 1986 р. та мешканці II зони (м. Славутич, Народичі, тощо);

**СЕЕРДЕ – сумарна ефективна еквівалентна річна доза експозиції, розрахована в Науковому центрі радіаційної медицини АМН України на підставі комплексу даних про забруднення території та продуктів харчування. Публікується в щорічному виданні “Дозиметрична паспортизація України”.

Глутатіонтрансферазна активність у плаценті людини із районів, які мають різні екологічні умови. Було виявлено, що глутатіонтрансферазна активність цитозолю різна у зразках плаценти мешканців різних районів. Вона достовірно нижча у зразках плаценти від жінок, які найбільш потерпіли внаслідок аварії на ЧАЕС (група I), а також від тих, які мешкають у хімічно найбільш забруднених районах (групи IV та VI). Висока інтенсивність перекисного

окислення ліпідів у зразках групи I свідчить про навантаження радіонуклідами (табл. 2).

Таблиця 2

Активність детоксикаційних ферментів, вміст ПАВ-ДНК аддуктів та ТБК-реагуючих сполук у зразках плаценти із різних груп дослідження

Групи | Глутатіонтрансфе-разна активність | ECOD активність | ПАВ-ДНК аддукти | ТБК-реагуючі сполуки

I | 150,6810,36* | 25,505,80 | 7,001,57 | 127,1016,26*

II | 271,8722,79 | нв | 4,400,99 | 52,584,68

III | 283,295,18 | нв | 4,610,80 | 56,643,77

IV | 169,4610,71* | 48,238,30 | 6,651,85 | 60,128,28

V | 204,2728,16 | 29,659,24 | 4,190,71 | 26,132,75*

VI | 164,8510,84* | 70,2713,74 | 5,981,45 | 69,195,85

VII | 309,9254,75 | нв | 2,050,42 | 80,382,75

VIII | 274,3732,11 | нв | нв | 55,797,86

IX | 311,9937,07 | нв | 3,950,77 | 84,753,44

Примітки: * імовірність відмінності від значень у групі порівняння (група VIII), P<0,01; глутатіонтрансферазна активність, нмоль*мг білка-1*хв-1, ECOD – 7-етоксикумарин О-діетилазна активність, пмоль *мг білка-1*хв-1, вміст ПАВ – аддуктів в ДНК, кількість аддуктів/ 109 нуклеотидів, вміст сполук, що реагують з тіобарбітуровою кислотою, нмоль/ г тканини; нв – не визначали.

Паралельні дослідження, проведені співробітниками нашої лабораторії (Прима и др., 1997), показали, що відносний вміст специфічної GSTP1 мРНК у зразках з радіаційно забрудненого району (група I) знижений, тоді як у хімічно забруднених районах – підвищений. Отже, зниження глутатіонтрансферазної активності плаценти в радіаційно забрудненому районі обумовлене процесами на претрансляційному рівні, тоді як у хімічно забруднених районах переважають інші механізми.

Обробка плацентарного цитозолю відновлювальним агентом дитіотреітолом призводила до зростання глутатіонтрансферазної активності у 2,5 раза в зразках із хімічно найбільш забрудненого району (група VI), тоді як у зразках з районів із переважним забрудненням радіонуклідами (групи I, II) відновлення активності було достовірно менше – в 1,3 - 1,5 раза. Таким чином, в районах із значним забрудненням довкілля складною сумішшю ксенобіотиків активність плацентарної глутатіонтрансферази знижується зворотньо. Відомо, що білок GSTP1 містить дві легко окислювальні сульфогідрильні групи (Сys 47 та 101), і при їхньому окисленні фермент зворотньо інактивується (Ricci et al., 1991, Tamai et al., 1990, Nishihira et al., 1992, Ploemen et al., 1996). Можна припустити, що такий механізм спрацьовує і в даному випадку. Виявити чинник, який здійснює окислення, становить як теоретичний, так і практичний інтерес.

Зниження глутатіонтрансферазної активності у зразках із району з переважним забрудненням ксенобіотиками (група VI) супроводжувалося іншими змінами глутатіонової системи – пригніченням глутатіонредуктазної активності та підвищенням вмісту відновленого глутатіону в плаценті. Зворотньоекспоненційну залежність між цими двома показниками спостерігали скрізь у дослідженій вибірці.

За значеннями глутатіонтрансферазної активності зразки від породіль із множинною патологією вагітності (група V) не відрізнялися від зразків, отриманих у цьому ж районі за принципом випадковості (група IV, де частота ускладнень вагітності складала 50%). За значеннями глутатіонтрансферазної активності інші групи (II, III, VII-IX) суттєво не відрізнялись між собою (табл. 2).

Експресія ферментів I та ІІ стадій детоксикації. Було проаналізовано, чи узгоджується робота ферментів першої та другої стадії детоксикації в розглянутих екологічних умовах (рис. 4).

ECOD, GST,

%% %%

Рис. 4. Активність ферментів I та II стадій детоксикації та вміст GSTP1 мРНК (у відносних одиницях):

I стадія: ECOD (CYP1A1) активність;

II стадія: вміст GSTP1 мРНК;

II стадія: глутатіонтрансферазна активність;

II стадія: глутатіонтрансферазна активність після обробки цитозолю дитіотреітолом;

за 100% по лівій шкалі прийнято значення ECOD активності у зразках плаценти з умовно чистого регіону – м. Куопіо у Фінляндії (9,89±1,94 пмоль*мг білка-1*хв-1); за 100% по правій шкалі прийнято середньоарифметичні значення відносного вмісту GSTP1 мРНК і глутатіонтрансферазної активності для об’єднаних груп VIII та IX (із районів, що розглядаються як умовно чисті)

Виявлено, що в зразках із районів, найбільш радіаційно забруднених (група I) знижені відносний вміст GSTP1 – специфічної мРНК та глутатіонтрансферазна активність. Глутатіонтрансферазна активність не може бути відновлена дитіотреітолом до контрольного рівня, ймовірно, через нестачу ферменту. У зразках із району, забрудненого переважно хімічно (група VI) активність СYP1A1 значно підвищена, підвищений відносний вміст мРНК GSTP1, однак глутатіонтрансферазна активність знижена. Активність ця може бути відновлена дитіотреітолом до рівня вище контрольного. Таким чином, ми спостерігали дискоординацію роботи ферментів детоксикації в плаценті у зразках з району, який забруднений переважно хімічно (група VI).

Глутатіонтрансферазна активність та показники окисно-відновного стану плаценти у носіїв різних генотипів CYP1A1, GSTP1 та GSTM1 у різних групах дослідження. Щоб оцінити внесок кожного з розглянутих чинників у їхню сукупну дію, було застосовано множинний регресійний аналіз. Незалежними змінними в моделі множинної регресії були три досліджені генотипи, середня ефективна еквівалентна річна доза експозиції (мЗв), вміст бензо(а)пірену в повітрі районів проживання (нг/м3), а також вік породіль. Розраховані коефіцієнти регресії були достовірними для усіх факторів, окрім генотипу GSTM1 та віку породіль. Виявили, що серед досліджених чинників найбільший вплив на глутатіонтрансферазну активність має навантаження ксенобіотиками з боку довкілля (коефіцієнт лінійної регресії ? = - 0,45, Р<0,001), далі за силою впливу йде радіаційне навантаження (? = - 0,39, P<0,001), генотип CYP1A1 462Ile/Val (в = 0,33, P<0,001) та генотип GSTP1 104Ile/Val (в = - 0,22, P<0,019).

Для більшої наочності показники глутатіонтрансферазної, глутатіонредук-тазної активності, вмісту відновлених низькомолекулярних тіолів та ТБК-реагуючих сполук порівняли між групами дослідження у межах кожного з генотипів CYP1A1, GSTP1 та GSTM1. При такому розподілі кількість даних у кожній підгрупі була недостатньою для отримання достовірної різниці, але тенденція до усіх зазначених змін залежно від груп дослідження зберігалась у межах кожного з генотипів.

Зниження глутатіонтрансферазної активності в плаценті як чинник ризику для новонароджених. За даними кореляційного аналізу, чим нижча глутатіонтрансферазна активність, тим вище генотоксичне ушкодження поліциклічними ароматичними вуглеводнями в плаценті (рис. 5).

Рівень ПАВ-ДНК аддуктів у зразках із районів, забруднених бензо(а)піреном (групи IV та VI) вищий, ніж у зразках із хімічно чистих районів (групи II, III та IX) (табл. 2). Разом із тим, високий вміст ПАВ-аддуктів спостерігається в ДНК плаценти із районів з меншим забрудненням ПАВ, але найвищим забрудненням радіонуклідами (група I). Зважаючи на високу кореляцію між глутатіонтрансферазною активністю та вмістом ПАВ-ДНК аддуктів у плаценті, можна припустити, що недостатність детоксикаційної функції, а саме зниження глутатіонтрансферазної активності є основним чинником накопичення ДНК-аддуктів у зразках групи I. Отже, вміст ПАВ- аддуктів у ДНК плаценти є індикатором забруднення довкілля ксенобіотиками,

Рис. 5. Кореляція між глутатіонтрансферазною активністю та вмістом ПАВ – ДНК аддуктів в плаценті людини

і одночасно відображає детоксикаційну спроможність органа. Високий вміст активних метаболітів поліциклічних ароматичних вуглеводнів у плаценті є загрозою для плода, оскільки є велика ймовірність потрапляння цих мутагених сполук до плода. Показник ушкодження ДНК плаценти ксенобіотиками є, таким чином, сурогатним показником генотоксичного ушкодження плода.

Розгляд клінічних даних дозволив також виявити залежність: чим нижча глутатіонтрансферазна активність, тим вища частота загрози переривання вагітності (r = -0,21; р < 0,017), а також анемії та внутрішньоутробної гіпоксії плода (r = -0,24; р < 0,006). Можна припустити, що зниження глутатіонтрансферазної активності є одним із патогенетичних чинників цих поліетіологічних ускладнень. Виявлено пряму залежність між глутатіонтрансферазною активністю та коефіцієнтами Апгара, що характеризують стан здоров’я новонародженого (r = 0,34; р < 0,001).

Отримані дані свідчать, що глутатіонтрансферазна активність та вміст ДНК-аддуктів у плаценті відображають навантаження з боку навколишнього середовища, і одночасно стан здоров’я новонароджених. Це дає підставу розглядати показник глутатіонтрансферазної активності як неспецифічний, а вміст ПАВ-ДНК-аддуктів як специфічний біомаркер стану довкілля, а також використовувати ці показники для оцінки ступеня ризику для новонароджених. На підставі отриманих даних також запропоновано використовувати генотип основних ферментів детоксикації в плаценті як прогностичний чинник у подальшому житті дитини.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі досліджено функціональний стан детоксикаційної системи та генотоксичне ушкодження поліциклічними ароматичними вуглеводнями в плаценті людини у носіїв різних генотипів ферментів детоксикації в умовах радіаційно і хімічно забрудненого довкілля.

1. Встановлено, що у зразках плаценти людини глутатіонтрансферазна активність зворотньо корелює із ступенем ушкодження геномної ДНК поліциклічними ароматичними вуглеводнями.

2. Виявлено, що носійство Ile462Val форм цитохрому Р450 1A1 супроводжується підвищеною глутатіонтрансферазною активністю та інтенсивнішим перекисним окисленням ліпідів у плаценті людини.

3. Сформульовано положення про узгодженість експресії ферментів першої та другої стадії детоксикації в плаценті та про їхню дискоординацію в хімічно забрудненому довкіллі.

4. Обґрунтовано положення про те, що зниження експресії глутатіонтрансферази у зразках із радіоактивно забруднених районів відбувається, зокрема, на претрансляційному рівні, а в районі забрудненому переважно хімічно за рахунок інгібування ферментативної активності.

5. Вперше дано кількісну оцінку впливу радіаційного та хімічного чинників довкілля на глутатіонтрансферазну активність у носіїв різних генотипів цитохрому Р450 1А1 та GSTP1 в плаценті. Запропоновано використання показників глутатіонтрансферазної активності та вмісту аддуктів у ДНК плаценти як біомаркерів стану довкілля.

6. Виявлено кореляцію між глутатіонтрансферазною активністю і коефіцієнтом Апгара, і запропоновано використовувати показник глутатіонтрансферазної активності поряд із генотипом ферментів детоксикації як прогностичний фактор для новонародженого.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Оболенська М.Ю., Чайковська Т.Л., Лебедєва Л.М., Теплюк Н.М., Коломієць Л.І., Іванська Н.В., Діденко Л.В., Некрич В.В., Бурлак Г.Ф. Дезінтоксикаційна функція плаценти у породілей з екологічно несприятливих районів України // Укр. біохім. журн.–1998.–Т.70, №2.–C.89-97.

Особистий внесок дисертанта – визначення глутатіонтрансферазної та глутатіонредуктазної активності цитозолю, загального вмісту сульфогідрильних груп, вмісту відновлених низькомолекулярних тіолів та ТБК-реагуючих сполук у зразках плаценти, отриманих у 1991-93 рр. в різних районах України. Дослідження відновлення глутатіонтрансферазної активності цитозолю дитіотреітолом.

2. Теплюк Н.М., Лебедева Л.М., Коломиец Л.И., Буткевич Д.М., Хоронжи М.Р., Пуарье М.С., Оболенская М.Ю. Фено- и генотипирование дезинтоксикационной системы плаценты в экологически неблагоприятных районах Украины // Укр. біохім. журн.-2001.-Т.73, №3.-C.126-134.

Особистий внесок дисертанта – налагодження методів ПЛР та рестрикційного аналізу. Виділення ДНК та визначення поліморфізмів Ile462Val CYP1A1, Ile104Val GSTP1 та подвійної делеції GSTM1 у досліджених зразках плаценти 1991-93 рр.

3. Теплюк Н.М., Лебедєва Л.М., Сазонова Л.Я., Самойленко А.А, Щербина М.С., Перепелюк М.М., Оболенська М.Ю. Активність та експресія глутатіон S-трансферази Р1 у плаценті людини залежно від генотипу та рівня експресії цитохрому Р450 1А1 // Біополімери і клітина.-2002.-Т.18, №4.-C.307-311.

Особистий внесок дисертанта – культивування клітин хоріокарциноми людини лінії BeWo. Переклонування GSTP1-кДНК з pUC19 у pBlueScript вектор, синтез та мічення GSTP1-специфічного РНК-зонду. Аналіз експресії CYP1A1 та GSTP1 при стимуляції клітин бензо(а)піреном (методами Нозерн- та Вестерн- гібридизації).

4. Теплюк Н.М., Самойленко А.А, Лебедєва Л.М., Сазонова Л.Я., Щербина М.С., Перепелюк М.М., Оболенська М.Ю. Детоксикаційна функція плаценти людини та її особливості залежно від генотипів цитохрому Р450 1А1, глутатіонтрансферази Р1 та М // Наукові записки НаУКМА. Спеціальний випуск.-2002.-Т.20 (частина II).-C.445-447.

Особистий внесок дисертанта – аналіз даних, отриманих in vivo та in vitro щодо узгодженості роботи ферментів послідовних стадій детоксикації в плаценті. Клонування та секвенування фрагмента 7-го екзону гена CYP1A1.

5. Коломийцева А.Г., Диденко Л.В., Латышева З.М., Демченко В.Ф., Жабченко И.А., Бондаренко О.М., Теплюк Н.М. К вопросу о влиянии ионизирующего излучения и приоритетных ксенобиотиков на некоторые системы организма беременных и родильниц // Здоровье женщины.-2002.-Т.3, №11.-C.4-6.

Особистий внесок дисертанта – отримання зразків плаценти у НДІ ПАГ у 1995-96 рр. від осіб із множинною патологією вагітності. Визначення в зразках глутатіонтрансферазної, глутатіонредуктазної активності та вмісту ТБК-реагуючих сполук. Оцінка впливу радіаційного навантаження на стан системи детоксикації.

6. Obolenskaya M., Lebedeva L., Tepluk N., Butkiewicz D., Chorazy M. Pheno- and genotyping of detoxifying system in placentae from differently polluted regions of Ukraine // Abstract on XII International Symposium on Microsomes and Drug Metabolism.-Montpellier (France).-1998.-Р.87.

Особистий внесок дисертанта – генотипування CYP1A1 (Ile462Val), GSTP1 (Ile104Val) та GSTM1 (+, null) у зразках 1995-96 рр. Аналіз частоти досліджених генотипів