АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ
АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ
НАУКОВИЙ ЦЕНТР РАДІАЦІЙНОЇ МЕДИЦИНИ
ТИЩЕНКО ОКСАНА ВІТАЛІЇВНА
УДК:573.4:616-001.28:616.36+616.379-008.64
ДІЯ РОЗМЕЛЕНИХ ПЛОДІВ РОЗТОРОПШІ ПЛЯМИСТОЇ НА ФУНКЦІОНАЛЬНИЙ СТАН ПЕЧІНКИ ТА ПІДШЛУНКОВОЇ ЗАЛОЗИ ПРИ РАДІАЦІЙНОМУ І ТОКСИЧНОМУ УРАЖЕННІ
03.00.01 – радіобіологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Київ - 2003
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Інституті експериментальної радіології Наукового центру радіаційної медицини Академії медичних наук України та Національній фармацевтичній Академії України
Науковий керівник: | Доктор медичних наук, професор
Порохняк – Гановська Людмила Андріївна, пенсіонер
Офіційні опоненти: | Доктор медичних наук, старший науковий співробітник
Білько Надія Михайлівна,
Національний університет “Києво - Могилянська Академія”, професор кафедри біології природничого факультету
Доктор медичних наук, старший науковий співробітник
Овсяннікова Людмила Михайлівна,
Науково-координаційне управління Президії АМН України,
Старший науковий співробітник відділу докторантури і аспірантури, наукової інформації та наукової власності
Провідна установа: Інститут експериментальної патології, онкології і радіології ім. Р.Е. Кавецького АМН України
Захист дисертації відбудеться “_____”_________________2003 р. о ______ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.562.01 при Науковому центрі радіаційної медицини АМН України за адресою: 03115, м. Київ, проспект Перемоги, 119-121
З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Наукового центру радіаційної медицини АМН України за адресою: 04050, м. Київ, вул. Мельникова, 53.
Автореферат розісланий “_____”_________________2003 року
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради |
________________ к. б. н. Л.О. Ляшенко
ВСТУП
Актуальність теми. Сьогодні світова спільнота науковців визнала, що катастрофа на Чорнобильській атомній станції 26 квітня 1986 року за своїми масштабами та нанесеним збитком є самою великою, яка будь-коли відбувалась. Незважаючи на тривалий період з моменту аварії, проблеми її радіоекологічних, медико-біологічних, соціально-психологічних, економічних та інших наслідків не втратили свою актуальність. Крім того, якщо у перші роки основні наукові дослідження були присвячені уособленій дії іонізуючого опромінення, то сьогодні особливу увагу привертають дослідження комбінованого впливу на організм іонізуючого опромінення та інших патологічних чинників, зокрема, інтоксикації ксенобіотиками [Романенко А.Е. и соавт., 1987, 2001; Бебешко В. Г. и соавт., 1996, 2001; Зозуля Ю. П. и соавт., 1998, 2001; Тронько Н. Д. и соавт., 1997; Гуськова А. К. и соавт., 1989; Ильин Л. А. и соавт., 1973].
Прогнозовані біологічні ефекти, спричинені тривалим впливом малих доз радіації та дією антропогенних забруднювачів, зумовлюють необхідність пошуку засобів для профілактики та корекції негативних наслідків для здоров’я населення [Руднев М. И. и соавт., 1991, 2001; Порохняк-Гановская Л. А. и соавт., 1998, 2001; Чеботарев А. Ю. и соавт., 2000; Овсянникова Л. М. и соавт., 1980, 2001]. Тим більше, що впроваджені у 50-70-х роках ХХ століття радіопротекторні препарати, ефективні при летальному та сублетальному опроміненні, виявилися непридатними для тривалого використання населенням, яке зазнало впливу іонізуючого випромінення. Найбільш перспективними для дослідження у цьому напрямку є засоби природного походження, перш за все завдяки широкому спектру дії, який виявляється тільки на тлі дії ушкоджуючих чинників, що призводять до напруження фізіологічних систем організму [Корзун В. Н. и соавт., 1997; Карпенко П. А. и соавт., 1999, 2000].
По-друге, рослинні субстанції здатні слугувати джерелом нутрієнтів, брак яких спостерігається у харчових раціонах населення (нестача вітамінів, каротину, пектину, харчових волокон) і може сприяти порушенню обмінних процесів, накопиченню радіонуклідів цезію та стронцію і, як наслідок, погіршувати стан здоров’я населення України [Ваннамейкер ІІІ В.В. и соавт., 2001].
По-третє, природні рослинні сполуки спричиняють повільний біологічний ефект, який не супроводжується різкими змінами гомеостазу та побічними ефектами, характерними для більшості фармакологічних препаратів [Venkataramanan R. et al., 2000].
Доцільним для корекції патогенетичних змін, які виникають на тлі дії іонізуючого випромінення та інтоксикації ксенобіотиками, є використання такої рослини як розторопша плямиста (Silybum marianum), яка здавна вирощується на території України.
До хімічного складу плодів розторопші входить біологічно активна субстанція “сілімарин”, що стала основою для створення біологічно активної добавки. При цьому, є необхідність створення з плодів помелу для досягнення найбільшої біодоступності у зв’язку з низькою розчинністю біоактивних сполук у воді і неможливістю одночасного екстрагування всіх біологічно активних речовин. Отже, біологічно активна добавка повинна визначатись як розмелені плоди розторопші плямистої [Чекман И. С., 2000; Гельмиярова Ф. Н. и соавт., 1997; Скакун Н. П. и соавт., 1985, 1995; Batakov2001; Crocenzi F.A.et al., 2000].
Перспективність використання розмелених плодів з розторопші плямистої зумовлена широким та успішним використанням фармацевтичних аналогів, створених на основі цієї рослини, які мають гепатопротекторні властивості. При цьому, природній вміст у розмелених плодах розторопші плямистої цілої низки вітамінів (А, Е, К), мікроелементів (селен, калій, кальцій, магній, марганець, мідь, цинк, хром, залізо, алюміній, ванадій тощо) та жирних кислот (мирістинової, пальмітинової, стеаринової, олеїнової, лінолевої, нонадецилової, арахідонової, бегенової та лігноцеринової) може спричиняти синергічну біологічну дію [Попова Н.В. и соавт., 1999; Румянцева Ж.Н., 1991].
Отже, зважаючи на можливий позитивний вплив розмелених плодів розторопші плямистої на патогенетичні ланки ушкоджуючої дії іонізуючого опромінення та ксенобіотиків, а також недостатній обсяг наукових досліджень, проведених у цьому напрямку, існує нагальна необхідність експериментального їх вивчення.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота пов’язана з науковою тематикою Інституту екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя в рамках Державної науково-дослідної програми № 327-0100U002416 за темою: “Наукове обґрунтування комплексу лікувально-оздоровчих заходів для профілактики захворюваності робітників ДАК “Титан”: співвиконавець.
Мета дослідження - визначити біологічну дію розмелених плодів розторопші плямистої як біологічно активної добавки шляхом дослідження її антиоксидантної, антитоксичної, жовчосинтетичної і гіпоглікемічної дії на лабораторних тваринах для розробки засобів профілактики та корекції негативних наслідків іонізуючого опромінення та інтоксикації ксенобіотиками печінки та підшлункової залози.
Задачі дослідження:
1. Дослідити біологічну дію розмелених плодів розторопші плямистої за умов іонізуючого опромінення організму.
2. Визначити особливості впливу розмелених плодів розторопші плямистої на біохімічні показники щурів, отруєних ксенобіотиками (тетрахлорметан, атофан, тетрациклін, алоксан, дексаметазон).
3. Дослідити характер впливу розмелених плодів розторопші плямистої за умов комбінованої дії іонізуючого випромінення та тетрахлорметану.
4. Визначити особливості впливу розмелених плодів розторопші плямистої на рівень цукру в крові за умов експериментальної гіперглікемії (ініційованої введенням глюкози у черевну порожнину, інтоксикацією алоксаном та дексаметазоном).
5. Розробити рекомендації щодо використання розмелених плодів розторопші плямистої для корекції порушень в організмі, викликаних іонізуючим опроміненням та інтоксикацією ксенобіотиками.
Обєкт дослідження – біологічна дія розмелених плодів розторопші плямистої за умов іонізуючого опромінення та дії ксенобіотиків.
Предмет дослідження – зміни функціонально-біохімічних показників, які відбулися під впливом розмелених плодів розторопші плямистої.
Методи дослідження – біохімічні (визначення в крові піддослідних тварин вмісту відновленого глутатіону, ТБК-активних продуктів, дієнових кон’югатів, холестерину, глюкози та активності аланінамінотрансферази, аспартатамінотрансферази, лужної фосфатази, лактатдегідрогенази, визначення в печінковому гомогенаті вмісту відновленого глутатіону, ТБК-активних продуктів, дієнових кон’югатів, загальних ліпідів та активності супероксиддисмутази, каталази; визначення в еритроцитах активності супероксиддисмутази; визначення в жовчі вмісту білірубіну, жовчних кислот, холестерину), функціональні (визначення швидкості секреції жовчі), радіобіологічні (тотальне опромінення щурів зовнішнім джерелом 137Cs в дозі 2 Гр та 60Со в дозі 0,5 Гр), моделювання токсичного гепатиту (інтоксикація тетрахлорметаном, атофаном, тетрацикліном), моделювання цукрового діабету І типу (інтоксикація алоксаном), моделювання цукрового діабету ІІ типу та інсулінорезистентності (інтоксикація дексаметазоном), статистичні (визначення основних статистичних параметрів: перевірка нульової гіпотези, визначення похибки середньої величини за критерієм Ст’юдента).
Наукова новизна одержаних результатів:
1. Представлено результати впливу розмелених плодів розторопші плямистої на стан біохімічних показників за умов дії іонізуючого опромінення та ксенобіотика (тетрахлорметану).
2. Зазначено, що введення розмелених плодів розторопші плямистої призводить до корекції рівня цукру в крові при експериментальній гіпоглікемії, що викликана навантаженням глюкозою.
3. Принципово новим є успішне застосування розмелених плодів розторопші плямистої на експериментальній моделі алоксанового діабету для виявлення їх гіпоглікемічного ефекту.
4. Вперше, завдяки використанню розмелених плодів розторопші плямистої, досягнуто гіпоглікемічного ефекту за умов інсулінорезистентності, експериментально викликаної дексаметазоном.
5. Визначено окремі ланки механізму антитоксичного, антиоксидантного та гіпоглікемічного ефекту розмелених плодів розторопші плямистої.
6. Експериментально підтверджено позитивний ефект розмелених плодів розторопші плямистої як радіозахисного засобу при дії іонізуючого випромінення.
Практичне значення одержаних результатів:
1. Запропоновано використання розмелених плодів розторопші плямистої як допоміжного засобу для профілактики та лікування наслідків негативної дії іонізуючого випромінення та ксенобіотиків.
2. Доведено, що розмелені плоди розторопші плямистої у лабораторних тварин позитивно впливають на зміни біохімічних показників за умов поєднаної дії іонізуючого випромінення та ксенобіотика (тетрахлорметану).
3. Доведено доцільність використання розмелених плодів розторопші плямистої та розроблено рекомендації щодо їх застосування для профілактики та підвищення ефективності лікування гіперглікемічних станів різного генезу.
Розмелені плоди розторопші плямистої були застосовані як біологічно активна добавка до їжі у дітей, які постраждали від інтоксикації невідомою отрутою в Первомайському районі Миколаївської області (наказ Міністерства України з питань надзвичайних ситуацій та у справах захисту населення від наслідків чорнобильської катастрофи від 22.09.2000 року та розпорядження медико-санітарного управлін-ня МНС України).
Розмелені плоди розторопші плямистої використовують як біологічно активну добавку до їжі у дітей, які постраждали внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС у Березнівському, Рокитнівському, Володимирецькому, Сарненському, Дубровицькому, Зарічнянському районах Рівненської області (наказ Міністерства України з питань надзвичайних ситуацій та у справах захисту населення від наслідків чорнобильської катастрофи № 100 від 24 квітня 2001 року та розпорядження медико-санітарного управління МНС).
Особистий внесок здобувача полягає у плануванні експериментальних досліджень, підборі та аналізі даних літератури, одержанні та узагальненні результатів досліджень, формулюванні основних положень дисертаційної роботи та висновків (за участю наукового керівника), в оформленні дисертації.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були викладені на науково-практичній конференції “Експериментальна радіобіологія”, яка відбулася 21-22 травня 2002 року в м. Києві; конференції “Репродуктивне здоров’я молоді – важлива складова загального здоров’я населення. Багатосекторна відповідальність за збереження репродуктивного здоров’я молоді” 5-6 вересня 2002 р. у м. Первомайську (Миколаївської області).
Результати дисертаційної роботи доповідались на семінарах: “Підготовка тренерів з профілактики раку молочної залози” 14-17 вересня 2002 року в м. Судак (АРК Крим); “Здоровий спосіб життя” 25-28 жовтня 2002 року в м. Кузнєцовську (Рівненської області); семінарі для співробітників аптеки “Матері та дитини” 21.12.2002 р. у м. Києві.
Публікації: За результатами дисертації опубліковано 7 наукових праць: 1 – розділ в монографії, 3 – оригінальні статті в наукових профільних журналах та збірниках, 3 – тези доповідей.
Структура та обсяг роботи. Дисертація викладена на 123 сторінках машинописного тексту і складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів, двох розділів з результатами власних досліджень та їх обговорення, узагальнення результатів досліджень, висновків.
Список використаних джерел містить 173 найменування, з них вітчизняних – 126, іноземних – 47.
Робота ілюстрована 3 рисунками та 15 таблицями.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи досліджень
Дослідження проводилися в літній період на 410 білих нелінійних щурах-самцях різного віку: молодих з масою тіла 150 – 200 г та старих з масою тіла 300 - 430 г. Для реалізації поставлених завдань було використано 8 експериментальних моделей.
Для моделювання негативного впливу зовнішнього іонізуючого опромінення використовували установку “ІГУР” з джерелом 137Cs при потужності дози 1,06 Гр/хвилину, експозиційна доза становила 2 Гр. Дослідна група за 2 дні до опромінення та протягом 5 наступних днів отримувала з їжею розмелені плоди розторопші плямистої в дозі 10, 25 та 50 мг/кг. За аналогічними показниками досліджувалась група контрольних щурів, група опромінених тварин та група щурів, які одержували фармацевтичний препарат силібор у дозі 25 мг/кг.
Наступною моделлю був гострий гепатит. Його спричиняли шляхом перорального введення 50% масляного розчину тетрахлорметану в дозі 0,5 мл на 100 г маси тіла протягом 7 діб. Тварини дослідної групи за 2 дні до отруєння та протягом 5 наступних днів отримували з їжею розмелені плоди розторопші плямистої в дозі 10, 25 та 50 мг/кг. За аналогічними показниками досліджувалась група контрольних щурів, група отруєних тварин та група щурів, які одержували фармацевтичний препарат силібор у дозі 25 мг/кг.
З використанням аналогічної моделі також проведено вивчення жовчосинтетичної функції печінки. Після отруєння тварин вищезазначеним способом тварини дослідної групи за 2 дні до отруєння та протягом 5 наступних днів одержували розмелені плоди розторопші плямистої в умовнотерапевтичній дозі 25 мг/кг чи препарат порівняння силібор у дозі ЕД30 - 25 мг/кг протягом 7 діб. Після закінчення експерименту для вивчення жовчовидільної функції печінки тварин наркотизували 1% розчином барбамілу, який не впливає на процеси жовчоутворення, та збирали секретовану жовч порціями протягом однієї години. За аналогічними показниками досліджувалась група контрольних щурів, група отруєних тварин та група щурів, які одержували фармацевтичний препарат силібор у дозі 25 мг/кг.
Для моделювання внутрішньопечінкового холестазу застосовували підшкірне введення атофану в дозі 500 мг/кг протягом 7 діб. Дослідна група за 2 дні до отруєння та протягом 5 наступних днів отримувала з їжею розмелені плоди розторопші плямистої в дозі 10, 25 та 50 мг/кг. За аналогічними показниками досліджувалась група контрольних щурів, група отруєних тварин та група щурів, які одержували фармацевтичний препарат силібор у дозі 25 мг/кг.
Для моделювання цитолітичного синдрому було використано тетрациклін, який вводили до шлунку щодня протягом 7 діб в дозі 500 мг/кг. Дослідна група за 2 дні до отруєння та протягом 5 наступних днів отримувала з їжею розмелені плоди розторопші плямистої в дозі 10, 25 та 50 мг/кг. За аналогічними показниками досліджувалась група контрольних щурів, група отруєних тварин та група щурів, які одержували фармацевтичний препарат силібор у дозі 25 мг/кг.
Для вивчення одночасної дії іонізуючого опромінення та токсиканта (тетрахлорметану) щурів одноразово опромінювали від гамма-джерела випромінювання 60Со на установці "РОКУС". Доза опромінення – 0,5 Гр, потужність дози – 1,23 Гр/хв. У той же день опроміненим щурам вводили тетрахлорметан. За 2 дні до отруєння і опромінення та протягом 5 наступних днів тваринам вводити перорально розмелені плоди розторопші плямистої в умовнотерапевтичній дозі 25 мг/кг. Досліджувалась за аналогічними показниками також група контрольних щурів та група тварин, які були опромінені та отруєні.
Для моделювання гіперглікемічного стану щурам було проведене навантаження глюкозою, шляхом введення її у черевну порожнину. У дослідженнях використовувалися щури-самці масою 130-160 г. Після нічного голодування дослідним і контрольним тваринам вводили до черевної порожнини 40% глюкози в дозі 2,5 г/кг. Дослідним тваринам за одну годину до вуглеводного навантаження вводили розмелені плоди розторопші плямистої у дозах 25, 30, 60, 100, 125, 150 і 200 мг/кг. У ході експерименту визначали рівень цукру в крові до вуглеводного навантаження і через 15 та 45 хвилин після нього глюкозооксидазним методом на аналізаторі глюкози “Ексан”.
Аналогічна модель використовувалась при визначенні впливу 10-денного профілактичного вживання розмелених плодів розторопші плямистої на гіперглікемію, викликану в здорових тварин вуглеводним навантаженням. Розмелені плоди розторопші плямистої вводили протягом 10-ти днів в дозі 150 мг/кг/день. Через десять днів було проведено глюкозне навантаження вищезазначеним способом та вивчення рівня цукру в крові через 15 та 45 хвилин глюкозооксидазним методом на аналізаторі глюкози “Ексан”.
Для моделювання інсулінзалежного цукрового діабету був використаний алоксан. Він вводився щурам після нічного голодування у свіжовиготовленому розчині в дозі 150 мг/кг маси тіла. За рівнем гіперглікемії тварин розділили на дві групи: 1 група - з вмістом цукру в крові 6,0-8,0 ммоль/л і 2 група тварин - з високим вмістом цукру в крові (15,0-25,0 ммоль/л). Такий розподіл на групи демонстрував легкий та середній ступінь цукрового діабету. Лікування розмеленими плодами розторопші плямистої починали на третю добу після введення алоксану. Дослідним тваринам першої групи (6,0-8,0 ммоль/л) вводили розмелені плоди розторопші плямистої в дозі 150 мг/кг, починаючи з третього дня розвитку патології. Тваринам другої групи (з базальною гіперглікемією - 15,0-25,0 ммоль/л) попередньо вводили інсулін у дозі 5 ОД/кг маси тіла протягом трьох днів, починаючи з першого дня розвитку патології. На четвертий день експерименту дослідній групі тварин, аналогічно як і тваринам групи контролю (отруєні щури), інсулін відмінили, а розмелені плоди розторопші плямистої продовжували вводити за тією ж схемою, що й тваринам першої групи.
Інсулінову резистентність моделювали підшкірним введенням дексаметазону в дозі 0,125 мг/кг протягом 15-ти днів. Розмелені плоди розторопші плямистої застосовували перорально в дозі 150 мг/кг протягом 15-ти днів одночасно з ін'єкціями дексаметазону. Група тварин контролю (отруєні щури) розмелених плодів розторопші плямистої не одержувала.
Об'єктом дослідження були: сироватка крові, жовч, тканина печінки.
Для характеристики стану процесів перекисного окислення ліпідів у сироватці крові вивчали концентрацію ТБК-активних продуктів (прикінцевого продукту процесів пероксидації) в сироватці крові - за Гавриловим В.П. та ін. (1987), та у печінковому гомогенаті - за Владимировим Ю.А., Арчаковим А.І. (1972). Метод ґрунтується на тому, що у кислому середовищі при температурі + °С ТБК - активні продукти з тіобарбітуровою кислотою утворюють триметиловий комплекс рожевого кольору при довжині хвилі ?=532 нм. Концентрацію ТБК-активних продуктів розраховували на білок проби. Вміст білка у гомогенатах тканин внутрішніх органів визначали за методом Лоурі (1951).
Стан антиоксидантної системи організму оцінювали, визначаючи активність мембранозв'язаної каталази в печінковому гомогенаті (пероксид водню оксидоредуктази, 1.11.1.6) за Aebi в модифікації Овсяннікової Л.М. (1994). Рівень відновленого глутатіону в печінковому гомогенаті та сироватці крові визначали за методом Стежка В.А. (1999). Вміст дієнових кон’югатів в сироватці та печінковому гомогенаті визначали за методом Стальної І.Д. (1977).
Концентрацію в сироватці крові холестерину, активність АЛТ - L-Аланін:2-оксоглутаратамінотрансферази (2.6.1.2); АСТ - L-Аспартат:2-оксоглутаратамінотрансферази (2.6.1.1); лужної фосфатази (ЛФ) - фосфогідролази моноефірів ортофосфорної кислоти (лужний оптимум) (3.1.3.1); лактатдегідрогенази (ЛДГ) - L-лактат: NAD+оксидоредуктази (1.1.1.27) визначали на автоматичному біохімічному аналізаторі, використовуючи біохімічні набори "КОНЕ Instruments Corporation"(Фінляндія). Супероксиддисмутазу (1.15.1.1.) в гепатоцитах та еритроцитах визначали за методом, описаним Misra H.P. (1972). Рівень глюкози в сироватці крові визначали орто-толуїдиновим та глюкозооксидазним методом на аналізаторі глюкози “Ексан”.
Порівняння результатів, одержаних за умов впливу різних чинників, проводили за допомогою загальноприйнятих методів: вірогідність різниці між середнім значенням показників (перевірка нульової гіпотези) визначали за критерієм Ст’юдента з урахуванням похибки середніх значень, яку позначали “±m” (Лакин Г.Ф., 1990). Нульова гіпотеза відхилялась у разі значення р<0,05.
Статистичну та математичну обробку здійснювали на персональному комп’ютері з використанням програмного прикладного пакету “Excel 98”.
Результати досліджень та їх обговорення
Результати спостереження за біохімічними показниками тварин, які зазнали впливу іонізуючого опромінення в дозі 2 Гр, виявили підвищення активності всіх цитолітичних ферментів, концентрації ТБК-активних продуктів та зменшення рівня відновленого глутатіону (табл. 1).
У лабораторних тварин, що вживали розмелені плоди розторопші плямистої (РПРП) у дозі 25 мг/кг, спостерігалось гальмування процесу цитолізу, а саме зниження активності АЛТ та АСТ майже удвічі (р<0,05) порівняно з опроміненими тваринами. Також зменшилась активність ЛФ та ЛДГ. Крім того, під дією розмелених плодів розторопші плямистої відновився стан окисного гомеостазу: підвищилась концентрація відновленого глутатіону (р<0,05), нормалізувалась концентрація ТБК-активних продуктів в сироватці крові. У групі, де тварини поряд з опроміненням вживали розмелені плоди розторопші плямистої в дозі 10 та 50 мг/кг, позитивні зміни були менш вираженими.
Таким чином, доза 25 мг/кг розмелених плодів розторопші плямистої достатня для нормалізації біохімічних показників процесів цитолізу та окисного гомеостазу при дії іонізуючого опромінення.
Таблиця 1
Вивчення впливу розмелених плодів розторопші плямистої та силібору на біохімічні показники печінки щурів за умов радіаційного опромінення (n=10)
Показники | Контроль
(M±m) | Опромінені щури, 2 Гр
(M±m) | Опромінені щури, 2 Гр + силібор, 25мг/кг
(M±m) | Опромінені щури, 2 Гр + РПРП, 10 мг/кг
(M±m) | Опромінені щури, 2 Гр + РПРП, 25 мг/кг
(M±m) | Опромінені щури, 2 Гр + РПРП, 50 мг/кг
(M±m)
АЛТ, ммоль/г·л | 0,31±0,04 | 1,04±0,09 * | 0,61±0,08 */** | 1,02±0,04 * | 0,39±0,06 * * | 0,67±0,14 */**
АСТ, ммоль/г·л | 0,59±0,09 | 1,05±0,06 * | 0,87±0,03 */** | 0,94±0,08 * | 0,71±0,11 */** | 0,90±0,07 *
ЛФ, мкмоль/сек·л | 6,06±0,39 | 17,66±1,98 * | 12,63±1,43 | 14,71±1,26 * | 11,14±1,89 */** | 13,32±1,74 *
ТБК-активні продукти, мкмоль/г | 82,3±8,85 | 184,36±26,44 * | 119,45±18,31 | 164,66±13,32 * | 124,8±14,34 * | 134,6±18,09 *
Відновлений глутатіон, мг% | 71,6±5,64 | 34,80±14,24 * | 58,1±14,24 | 65,3±14,41 | 78,7±8,13 * * | 61,4±8,98
ЛДГ, умовн.од. | 93,3±10,81 | 299,3±28,51 * | 164,3±12,54 */** | 286,4±8,16 * | 144,8±5,87 */** | 160,4±13,15 */**
Примітки: 1)* - відхилення вірогідне стосовно групи контролю, р0,05;
2)** - відхилення вірогідне стосовно групи опромінених щурів, р0,05.
Подальші дослідження впливу розмелених плодів розторопші плямистої на негативні зміни біохімічних показників при дії іонізуючого опромінення (в дозі 0,5 Гр) було проведено як у молодих, так і в старих щурів (табл. та 3). Вживання розмелених плодів розторопші плямистої в дозі 25 мг/кг призводило до зменшення концентрації ТБК-активних продуктів та активності каталази печінки молодих щурів, що вказує на гальмування процесів пероксидації. У старих щурів спостерігали лише тенденцію до зниження цих показників.
Під час дослідження особливостей антиоксидантного впливу розмелених плодів розторопші плямистої за умов поєднаної дії тетрахлорметану та опромінення (0,5 Гр) в старих та молодих щурів також було виявлено, що більш чіткий антиоксидантний ефект спостерігався у молодих тварин. Низька ефективність розмелених плодів розторопші плямистої у старих щурів може бути пов’язана з приєднанням до патологічних процесів, спричинених впливом ксенобіотика та іонізуючого випромінення, інволютивних змін, які самостійно можуть сприяти підвищенню активності процесів пероксидації.
Для визначення ефективності розмелених плодів розторопші плямистої при інтоксикації різними ксенобіотиками та з’ясування умовнотерапевтичної дози в цих умовах було використано такі токсичні сполуки як тетрахлорметан, атофан та тетрациклін. Ці хімічні речовини викликали негативні зміни в окисному гомеостазі, призводили до стимуляції цитолізу.
Застосування розмелених плодів розторопші плямистої в дозах 10, 25 та 50 мг/кг за умов впливу атофану та тетрацикліну спричинило вірогідну нормалізацію активності маркерних ферментів цитолізу – АЛТ та АСТ. При цьому, їх ефективність за умов інтоксикації тетрахлорметаном мала змінний характер. На першій лінії досліджень, коли були використані дози 10, 25 та 50 мг/кг розмелених плодів розторопші плямистої, рівень активності АСТ та АЛТ не був вірогідно змінений у порівнянні з аналогічними показниками отруєних тварин. Це можна пояснити неспецифічною затримкою нормалізації ферментів цитолізу, яка часто зустрічається на практиці.
Таблиця 2
Вплив розмелених плодів розторопші плямистої в дозі 25 мг/кг на показники процесів пероксидації в печінці щурів за умов радіаційного опромінення (n = 6)
Умови досліду | Показники
Активність каталази,
мМ Н202/мг білка/хв.
(M±m) | ТБК - активні продукти, нМ /мл
(M±m)
Молоді щури
Контроль | 9,74±1,10 | 3,72±0,21
РПРП, 25 мг/кг | 8,72±1,57 | 2,71±0,86
Іонізуюче опромінення, 0,5 Гр | 7,30±1,68 | 7,63±1,39*
Іонізуюче опромінення, 0,5 Гр + РПРП, 25 мг/кг | 3,18±0,52*/** | 2,87±0,79**
Старі щури
Контроль | 4,25±0,80 | 6,14±0,026
РПРП 25 мг/кг | 2,62±0,42 | 4,55±0,77
Іонізуюче опромінення, 0,5 Гр | 3,19±0,33 | 8,12±1,17
Іонізуюче опромінення, 0,5 Гр + РПРП, 25 мг/кг | 2,62±0,20 | 2,39±0,35*/**
Примітки: 1)* - відхилення вірогідне стосовно відповідної контрольної групи, р 0,05;
2)** - відхилення вірогідне стосовно опромінених тварин, р0,05.
Подальші дослідження з використанням тетрахлорметану виявили вірогідне зниження активності цитолітичних ферментів під впливом розмелених плодів розторопші плямистої в дозі 25 мг/кг. Активність ЛДГ, як показника цитолізу, вірогідно зменшувалась практично у всіх моделях з використанням ксенобіотиків.
Антиоксидантний вплив розмелених плодів розторопші плямистої було виявлено нами протягом практично всіх досліджень. За умов їх застосування у дозах 10, 25 та 50 мг/кг на моделях інтоксикації атофаном, тетрацикліном та тетрахлорметаном спостерігалось гальмування процесів пероксидації та відновлення елементів антиоксидантної системи (зменшення концентрації ТБК-активних продуктів та підвищення відновленого глутатіону). Не завжди ці зміни були вірогідними, але практично повсякчас спостерігалась позитивна тенденція.
Після аналізу результатів досліджень на моделях з використанням ксенобіотиків (атофану, тетрацикліну та тетрахлорметану) стало очевидно, що дози 25 та 50 мг/кг мали найбільшу дію. Для виявлення умовнотерапевтичної дози в цих умовах було проведено подальші дослідження з використанням тетрахлорметану. Результати дослідження інтенсивності окислювальних процесів (рівень ТБК-активних продуктів та дієнових кон’югатів в сироватці та печінці), стану ферментної ланки антиоксидантної системи (активність каталази печінки, супероксиддисмутази в еритроцитах і печінковому гомогенаті та рівень відновленого глутатіону в сироватці та печінці), ферментів цитолізу (АЛТ та ЛФ) та синтезу жовчі (швидкість секреції жовчі та вміст в ній жовчних кислот та холестерину) свідчили про перевагу у ефективності розмелених плодів розторопші плямистої в дозі 25 мг/кг. По-перше, це стосувалось системи глутатіону, де нормалізувався рівень відновленого глутатіону в печінці. У отруєних тварин він складав 19,38±3,02 мг/%, а в тварин, які вживали розмелені плоди розторопші плямистої в дозі мг/кг – 68,45±9,61 мг/% (р<0,05). По-друге, порівняно з групою отруєних щурів відновився рівень активності СОД як в печінці (з 5,40±0,58 до 2,22±0,39 умовн.од. (р<0,05), так і в еритроцитах (з 3,74±0,26 до 2,50±0,24 умовн.од. (р<0,05).
Таблиця 3
Вплив тетрахлорметану та розмелених плодів розторопші плямистої в дозі 25 мг/кг на рівень ТБК-активних продуктів в сироватці крові щурів за умов іонізуючого опромінення та дії ксенобіотиків (n = 6)
Умови досліду | ТБК-активні продукти, нМ /мл
(M±m)
Молоді щури
Контроль | 4,84±0,27
CCl4, 0,5 мл/100 г маси тварини 50розчину | 4,72±0,73
CCl4, 0,5 мл/100 г маси тварини 50розчину + іонізуюче опромінення, 0,5 Гр | 4,50±0.02
CCl4, 0,5 мл/100 г маси тварини 50розчину + РПРП, 25 мг/кг | 2,10±0,08 * *
CCl4, 0,5 мл/100 г маси тварини 50розчину + іонізуюче опромінення, 0,5 Гр + РПРП, 25 мг/кг | 1,97±0,04 * * *
Старі щури
Контроль | 6,50±0,96
CCl4, 0,5 мл/100 г маси тварини 50розчину | 8,52±0,93
CCl4, 0,5 мл/100 г маси тварини 50розчину + іонізуюче опромінення, 0,5 Гр | 4,48±1,50
CCl4, 0,5 мл/100 г маси тварини 50розчину + РПРП, 25 мг/кг | 2,18±0,21 *
CCl4, 0,5 мл/100 г маси тварини 50розчину + іонізуюче опромінення, 0,5 Гр + РПРП, 25 мг/кг | 3,44±0,70 *
Примітки: 1) * - відхилення вірогідне стосовно контрольної групи, р0,05;
2)**- відхилення вірогідне стосовно групи отруєних тетрахлорметаном тварин, р0,05.
3) ***- відхилення вірогідне стосовно групи “тетрахлорметан + іонізуюче опромінення, 0,5 Гр”, р0,05.
Зменшилась концентрація дієнових кон’югатів в печінці. У групі тварин, які вживали тільки тетрахлорметан, цей показник становив 3,41±1,03 мкмоль/г, а в тварин, які вживали розмелені плоди розторопші плямистої у дозі мг/кг – 0,91±0,34 мкмоль/г (р<0,05).
Дослідження рівня холестерину в сироватці крові цих груп тварин свідчило про гіпохолестеринемічну дію розмелених плодів розторопші плямистої як у старих, так і в молодих тварин.
Рівень глікемії зменшився в основному у старих щурів, зокрема, при поєднаній дії іонізуючого опромінення та ксенобіотика (від 6,55±1,13 ммоль/л до 5,62±0,47 ммоль/л).
Позитивні зміни відбулися також у системі синтезу жовчі. У групі тварин, що вживали 25 мг/кг на добу розмелених плодів розторопші плямистої, швидкість секреції жовчі підвищилась з 2,44±0,36 (отруєні тварини) до 3,86±0,43 мг/хв. на 100 г маси тварини (р<0,05). Вживання розмелених плодів розторопші плямистої також вірогідно підвищило концентрацію жовчних кислот жовчі від 77,36±17,24 мг% (у отруєних щурів) до 333,86±95,43 мг% (у дослідних тварин). Інші показники вірогідно змінені не були, але, наприклад, активність АЛТ, концентрація ТБК-активних продуктів печінки, відновленого глутатіону сироватки, дієнових кон’югатів печінки і сироватки, активність каталази печінки та ЛФ набули позитивної динаміки.
На нашу думку, яка співпадає з дослідженнями та висновками більшості науковців [Венгеровский А.И. и соавт., 1987; Гельмиярова Ф.Н., 1997 та інших], ефект пригнічення цитолізу та мембраностабілізація, виявлена в цих дослідженнях у дії розмелених плодів розторопші плямистої, тісно пов’язані з антиоксидантною активністю субстанції “сілімарин”. Зокрема, зазначено, що біологічна дія розмелених плодів розторопші плямистої зумовлена не тільки “сілімарином”, а й іншими компонентами, що входять до її складу - селен, жирні кислоти, вітаміни Е та С тощо. Це визначає більш ефективний вплив розмелених плодів розторопші плямистої на деякі біохімічні показники порівняно з силібором.
Крім того, пригнічення процесів цитолізу можна пояснити також зменшенням проникності мембран через гальмування (що властиве флавоноїдам) гіалуронідази. Гальмування цього ферменту підвищує в’язкість мукополісахариду та веде до зменшення проникності біологічних мембран.
Про механізм антиоксидантної дії флаволігнанів однозначної думки немає. Але ми згодні з більшістю науковців, які вважають, що “сілімарин” нейтралізує вільні радикали, гальмує пероксидацію та відновлює деякі складові антиоксидантної системи [Чекман И.С., ] завдяки наявності в структурі “сілімарину” рухливого водню. Він взаємодіє з вільними радикалами (похідні кисню, які схильні до активного окислення біологічних субстратів), в результаті чого утворюється відновлений кисневий та семіхінонний радикали. В останнього дуже малий енергетичний запас і він не здатний агресивно окислювати субстрати. Отже, процес пероксидації гальмується [Барабой В.А., 1995; Логинов А.С. и соавт., ]. Деякі автори також вважають, що антиоксидантні властивості залежать не стільки від наявності рухливого водню, скільки від кількості гідроксильних груп та їх положення [Okawa M. et al, 2001].
Крім того, важливе місце в механізмі пригнічення пероксидації займає здатність поліфенолів утворювати кон’югати з металами змінної валентності в першу чергу з залізом. Іони Fе2+, як відомо, є одними з чинників запуску процесів пероксидації [Венгеровский и соавт. 1987].
Таким чином, розмелені плоди розторопші плямистої з одного боку пригнічують процеси окислення субстратів на різних рівнях, а з іншого боку підтримують резерв антиоксидантної системи та сприяють відновленню її складових [Гельмиярова Ф.Н. и соавт., 1997; Valenzuela A. et al., 1989].
Подальші дослідження стосувались впливу розмелених плодів розторопші плямистої на синтез жовчі, екскрецію її компонентів та оцінки енергозберігаючої функції печінки, завдяки визначенню вмісту глікогену в печінковому гомогенаті.
Аналіз отриманих нами результатів дослідження свідчить про те, що на моделі хронічного ураження печінки тетрахлорметаном в групі отруєних тварин спостерігалось ушкодження жовчоутворюючої та енергозабезпечуючої функцій печінки щурів (р 0,05).
Вплив розмелених плодів розторопші плямистої у дозі 25 мг/кг вірогідно збільшив швидкість секреції жовчі та вмісту в ній жовчних кислот (майже в 2 рази відносно до групи отруєних щурів та майже в 1,2 рази порівняно з групою контрольних тварин), білірубіну та холестерину (р 0,05).
Ці дані співпадають з результатами досліджень фармпрепаратів, що створені на основі флаволігнанів розторопші плямистої [Дроговоз С.М. и соавт., ].
Ми згодні з авторами, які пояснюють підвищення рівня жирних кислот, білірубіну та холестерину в жовчі нормалізацією роботи всіх синтетичних структур, яка відбувалася завдяки антиоксидантним властивостям розмелених плодів розторопші плямистої [Бышевский А.Б. и соавт., 1994; Скакун Н.П. и соавт., 1995]. В наших дослідженнях рівень холестерину в жовчі під дією розмелених плодів розторопші плямистої підвищувався. Інші науковці стверджують, що під дією ізомерів “сілімарину” пригнічується синтез холестерину, а не його екскреція з жовчю [Nassuato G. et al,1983; Crocenzi F.A. et al, 2000; Skottova N. et al, 1998].
При визначенні вмісту глікогену у печінковому гомогенаті виявлено відновлення його вмісту. Рівень глікогену в дослідній групі сягав рівня його в контрольних тварин. Це може бути пов’язано з відновленням біосинтетичних процесів, які відбуваються на біологічних мембранах гепатоцитів. Останнє є результатом антиоксидантного впливу “сілімарину” та інших компонентів розмелених плодів розторопші плямистої.
Подальші наші дослідження виявили поряд з глікогенсинтетичною дією розмелених плодів розторопші плямистої - гіпоглікемічну. На моделях одноразового та 10-денного профілактичного їх вживання з подальшим навантаженням глюкозою, а також при моделюванні цукрового діабету І типу (інтоксикація алоксаном) та ІІ типу (інтоксикація дексаметазоном) визначено, що розмелені плоди розторопші плямистої в дозі 150 мг/кг зменшують рівень цукру в крові та підвищують толерантність організму щурів до навантаження глюкозою.
Дослідження були розпочаті з визначення впливу одноразового та 10-денного профілактичного вживання розмелених плодів розторопші плямистої за умов навантаження глюкозою, яка була введена в черевну порожнину. Розмелені плоди розторопші плямистої застосовувались в дозах 25, 30, 60, 100, 125, 150 і 200 мг/кг. Аналітична оцінка отриманих результатів визначила умовнотерапевтичну дозу, яка пригнічує гіперглікемію – 150 мг/кг.
Для визначення наявності впливу розмелених плодів розторопші плямистої на рівень цукру в крові за умов моделювання інсулінозалежного цукрового діабету, було одноразово використано алоксан в дозі 150 мг/кг. Розмелені плоди розторопші плямистої зменшували рівень гіперглікемії в щурів з легким ступенем тяжкості цукрового діабету та підтримували сталий рівень цукру крові після відміни інсуліну в щурів з середнім ступенем тяжкості.
Під впливом розмелених плодів розторопші плямистої було також зменшено рівень глікемії та підвищено толерантність щурів до навантаження глюкозою за умов інсулінорезистентності, спричиненої дексаметазоном. Зокрема, розмелені плоди розторопші плямистої нормалізували інтенсивність метаболічних порушень, спричинених введенням дексаметазону: знижували рівень загальних ліпідів в 3,2 рази порівняно з групою отруєних тварин (р0,05) та вміст ТБК - активних продуктів в печінці.
Таким чином, отримані результати дозволяють зробити висновок про те, що застосування розмелених плодів розторопші плямистої в дозі 150 мг/кг спричиняє гіпоглікемічний ефект за умов введення глюкози в черевну порожнину, а також за умов гіперглікемії спричиненої введенням алоксану та дексаметазону. На нашу думку, механізм гіпоглікемічної дії полягає у відновлення синтетичних процесів на біомембранних структурах гепатоцитів завдяки антиоксидантним властивостям розмелених плодів розторопші плямистої.
Базуючись на результатах наших досліджень, можна рекомендувати застосування розмелених плодів розторопші плямистої у двох дозах. Розмелені плоди розторопші плямистої в дозі 25 мг/кг можуть вживатися для профілактики, а також як допоміжний засіб при лікуванні станів, пов’язаних з інтоксикацією ксенобіотиками різного хімічного складу, дії іонізуючого опромінення та при поєднаній дії токсикантів та іонізуючого опромінення.
Розмелені плоди розторопші плямистої в дозі 150 мг/кг можуть бути застосовані для профілактики, а також як допоміжний засіб при лікуванні хворих на цукровий діабет І та ІІ типу, пацієнтів з інсуліновою резистентністю та гіперглікеміями іншого генезу.
Таким чином, весь комплекс наших досліджень свідчить про те, що розмелені плоди розторопші плямистої мають значну біологічну дію за умов інтоксикації ксенобіотиками, дії іонізуючого опромінення та їх поєднаного впливу на організм щурів завдяки своїм цитопротекторним, антиоксидантним, жовчо- та глікогенсинтетичним ефектам, а також гіпоглікемічній дії їх складових.
ВИСНОВКИ
1. Представлене теоретичне обґрунтування для використання розмелених плодів розторопші плямистої за умов негативного впливу іонізуючого опромінення та ксенобіотиків на організм лабораторних тварин.
2. На підставі проведених експериментальних досліджень виявлено, що розмелені плоди розторопші плямистої в дозі 25 мг/кг зменшують явища цитолізу, вміст ТБК-активних продуктів та нормалізують вміст відновленого глутатіону за умов дії іонізуючого опромінення.
3. Виявлено, що розмелені плоди розторопші плямистої в дозі 25 мг/кг, вживані щурами на тлі отруєння тетрахлорметаном, атофаном та тетрацикліном, пригнічують активність цитолітичних ферментів, концентрацію ТБК-активних продуктів та підвищують вміст відновленого глутатіону.
4. Визначено позитивний вплив розмелених плодів розторопші плямистої в дозі 25 мг/кг на секрецію жовчі, екскрецію білірубіну та жовчних кислот за умов гепатиту, спричиненого тетрахлорметаном.
5. Встановлено гіпохолестеринемічну дію розмелених плодів розторопші плямистої та підвищення екскреції холестерину з організму щурів в складі жовчі.
6. Виявлено, що вживання розмелених плодів розторопші плямистої на тлі гепатиту, спричиненого тетрахлорметаном, відновлює окисний гомеостаз в молодих щурів більш ефективно ніж в старих.
7. Встановлено, що розмелені плоди розторопші плямистої в дозі 25 мг/кг відновлюють показники окисного гомеостазу за умов поєднаної дії іонізуючого опромінення та ксенобіотика.
8. На підставі вивчення динаміки змін вмісту глікогену в тканині печінки тварин визначено позитивний вплив розмелених плодів розторопші плямистої на енергозберігаючу функцію печінки.
9. Виявлено, що розмелені плоди розторопші плямистої в дозі 150 мг/кг зменшують рівень цукру в крові та підвищують толерантність інтактних тварин до навантаження глюкозою.
10. З’ясовано доцільність використання розмелених плодів розторопші плямистої як профілактичного та допоміжного засобу при лікуванні цукрового діабету І та ІІ типу, а також в умовах інсулінорезистентності.
11. Виявлено, що за ефективністю гепатопротекторної дії розмелені плоди розторопші плямистої мають перевагу над препаратом порівняння силібором. Це пов’язано з вмістом в розмелених плодах розторопші плямистої не тільки ізомерів “сілімарину”, які характерні для силібору, а й вітамінів, жирні кислоти, мікроелементів тощо. Природне поєднання цих складових спричиняє їх синергічний ефект.
12. Отримані результати можуть слугувати підґрунтям для розробки рекомендацій щодо застосування розмелених плодів розторопші плямистої в профілактиці та корекції патологічних змін, які виникають внаслідок негативного впливу іонізуючого випромінення та ксенобіотиків.
СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Эффективность гранул “Силисем” при экспериментальном аллоксановом диабете / Л.В. Яковлева, Е.Ю. Кошевая, Э.Н. Мирошниченко, О.В. Улянченко // Материали научно-практической конференции “Лекарства – человеку” 14 июля 2001 г. – Харьков, 2001. – Т.№ 1-2. - С. 561-567.
2. Улянченко О.В. Дослідження біологічної ефективності розторопші плямистої в умовах гострого токсичного гепатиту, викликаного тетрахлорметаном // Актуальні проблеми сучасної медицини: Вісник Української медичної стоматологічної академії. – 2002. – Т. 2, № 1. – С. 38-40.
3. Улянченко
