АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ
АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГІЇ ТА ТОКСИКОЛОГІЇ
Тишкін Сергій Михайлович
УДК 612.13:612.273.2
Механізми і фармакологічна корекція порушень скорочувальної активності судин, ІНДУКОВАНИХ іонізуючИМ g-ВИПРОМІНЮВАННЯМ
14.03.05 - фармакологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеню
доктора біологічних наук
КИЇВ-2003
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Інституті фармакології та токсикології АМН України
Науковий консультант: доктор медичних наук,
Соловйов Анатолій Іванович
Інститут фармакології та токсикології АМН України
головний науковий співробітник відділу експериментальної терапії
Офіційні опоненти:
доктор біологічних наук Левицький Євген Леонідович, Інститут фармакології та токсикології АМН України, головний науковий співробітник відділу біохімічної фармакології
доктор медичних наук, професор, академік НАН і АМН України
Мойбенко Олексій Олексійович, Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, завідувач відділу експериментальної кардіології
доктор біологічних наук Зима Валентин Леонідович, Національний університет ім. Т.Г. Шевченка, професор кафедри біофізики
Провідна установа:
Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця, кафедра фармакології, МОЗ України, м. Київ.
Захист відбудеться “_22__” ________01_________ 2003 р. о _13_ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради – Д 26.550.01 у Інституті фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Е.Потьє, 14.
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фармакології та токсикології АМН України (03057, м. Київ, вул. Е.Потьє, 14).
Автореферат розіслано “__18_” ______12______ 2002 р.
Вчений секретар
Спеціалізованої вченої ради
Д 26.550.01, кандидат біологічних наук І.В. Данова
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Велику кількість серцево-судинних розладів пов'язують із порушеннями ендотеліальної функції кровоносних судин. Відомо, наприклад, що при гіпертензії, гіперхолестеринемії, ішемії/гіпоксії дилататорні реакції на стимуляцію ендотелію зменшені, і це пов'язано в першу чергу з порушенням механізмів, що визначають виділення й утилізацію оксиду азоту [Jayakody R.L. et al., 1985; Lusher T.F., Vanhoute P.M., 1986; Verbeuren T.J. et al., 1990; Soloviev A.I. et al., 1993; Giordano E. et al., 1999]. Внаслідок цього виникає схильність судинної стінки до скорочення або її надлишкова чутливість до вазоконстрикторних впливів, які у ряді випадків спроможні призвести до розвитку довгострокового і стійкого скорочення гладеньких м'язів судин (вазоспазму), що є підгрунтям для цілої низки захворювань серцево-судинної системи, таких як гіпертонічна хвороба, інфаркт міокарду, порушення мозкового кровообігу.
Останнім часом з'явилися експериментальні дані, які переконливо свідчать, що порушення ендотеліальної функції судинної стінки, а також зміни її чутливості до біологічно активних речовин спостерігаються також при впливі іонізуючого опромінення [Qi F. et al., 1998; Beckman J.A. et al., 2001]. Дані клінічних і експериментальних досліджень указують на те, що іонізуюча радіація викликає суттєві зміни вазомоторної активності, яка супроводжується вираженими порушеннями реактивності судин до різноманітних фармакологічних агентів. Проте, головним чином, ці дослідження стосуються вивчення загальних гемодинамічних або морфологічних показників. Результати цих експериментів є досить суперечливими, а картина участі судин у розвитку променевого ураження організму залишається не до кінця з"ясованою [Воробьев В.И., Степанов Р.П., 1985]. Морфологічними дослідженнями встановлено, що ендотелій є достатньо радіочутливою структурою, проте питання про кореляцію радіаційних ушкоджень ендотеліоцитів і скоротливої активності судинної стінки залишається дотепер відкритим.
Дані медичної статистики свідчать, що судинні розлади займають чільне місце в переліку хвороб, пов'язаних із Чорнобильськими подіями [Бебешко В.Г. та ін., 1995, 1996; Хомазюк І.М., 1991-1997; Смирнова И.П. и др., 1991; Симонова Л.Н. та ін., 1995; Горбась И.М. и др., 1995; Зубовський Г.А. та ін., 1999]. Найбільш серйозні з них, що призводять до зниження працездатності і якості життя – гіпертонічна хвороба та ішемічна хвороба серця - займають більш ніж 80% від загальної кількості серцево-судинних захворювань. У структурі смертності постраждалих серцево-судинні патології становлять 55-60%. Загальновизнано, що однією із головних мішеней дії іонізуючої радіації на організм є кровоносні судини. Клітинні механізми індукованих радіацією серцево-судинних уражень дотепер не встановлені, але дані сучасних досліджень усе більш вказують на те, що чинники ендотеліального походження відіграють значну роль у формуванні патологічних станів при дії іонізуючої радіації. Насьогодні ці питання ще малодосліджені, що зумовлює актуальність подальшого вивчення клітинних механізмів розвитку індукованих радіацією судинних патологій, пов'язаних з порушеннями як синтезуючої, так і екскреторної функцій ендотелію кровоносних судин.
Клінічні спостереження вказують на те, що проблема лікування пацієнтів після радіаційного впливу значно ускладнена зниженням ефективності дії багатьох серцево-судинних препаратів. Медична практика постчорнобильского періоду засвідчує, що терапевтичні донори NO, загальновживані для лікування судинних розладів, виявляють невисоку ефективність при лікуванні пацієнтів, що зазнали іонізуючого опромінення. Така ситуація перешкоджає ефективній терапії стенокардії, інфаркту міокарда, гіпертонічної хвороби й інших серцево-судинних патологій у значного контингенту населення. Ця обставина і визначає актуальність вивчення механізмів зменшення ефективності терапевтичних донорів оксиду азоту після променевого впливу і визначення можливостей її фармакологічної корекції. Крім того, є реальні підстави вважати, що радіація може змінювати реактивність гладеньких м'язів судин й до інших біологічно активних речовин. Це робить вивчення змін судинної реактивності при дії радіації життєво необхідним.
Встановлено, що фосфатидилхолінові ліпосоми можуть відновлювати ендотеліальну функцію судинної стінки при деяких судинних патологічних станах у модельних експериментах [Soloviev A.I. et al., 1993]. Було продемонстровано, що ліпосоми виявляють антиоксидантні і мембранотропні властивості [Стефа- нов А.В. и др., 1990]. Ці дані визначили новий напрямок для досліджень можливості фармакологічного відновлення ендотеліальної функції кровоносних судин після оксидативного стресу, викликаного іонізуючою радіацією.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тему дисертаційної роботи затверджено на засіданні вченої ради Інституту фармакології та токсикології АМН України. Вона є частиною досліджень, в яких автор дисертації був відповідальним виконавцем та співвиконавцем наведених нижче програм та тем. Тема НДР: "Исследовать изменения сократительных и электрофизиологических свойств сердечной мышцы и коронарных сосудов, биохимические и ультраструктурные особенности сарколеммы при хронической коронарной недостаточности и определить возможности фармакологической коррекции выявленных нарушений", 1985-1988 рр. Тема НДР: "Исследование механизмов действия некоторых антиангинальных препаратов на сосудистую систему в условиях ионизирующей радиации", держреєстраційний № 5/174 (Державний фонд фундаментальних досліджень, 1992-1993 р.). Тема НДР: "Нестохастичні ефекти низьких рівнів іонізуючої радіації: дослідження механізмів розвитку патологічних змін серцево-судинної системі та шлунково-кишкового тракту для розробки шляхів корекції виявлених порушень", держреєстраційний № 0193 U0323340 (Українська державна програма мінімізації наслідків Чорнобильської катастрофи (1993-1995 рр.)).Тема НДР: "Изучение действия факторов эндотелиального происхождения на сократительную активность гладких мышц сосудов", держреєстраційний № 0195U010052, 1995-1997 рр. Тема НДР: "Сравнительное изучение эффективности вазодилататорных препаратов (доноров оксида азота) на сократительную активность кровеносных сосудов в условиях нормальной и пониженной оксигенации" держреєстраційний № 0197U004797, 1997-1999 рр. Тема НДР: " Changes in vasorelaxant activity of therapeutic nitric oxide donors after whole body irradiation and its relevance to the Chornobyl disaster”, № 055168/z/98/z, (Wellcome Trust, 1999-2001). Тема НДР: " Роль факторів ендотеліального походження (оксиду азоту, гіперполяризуючого фактору, пероксинітриту) у формуванні вазоспастичних станів в умовах нормальної та зниженої оксигенації", держреєстраційний № 0100U000303, 2000-2002 рр.
Мета роботи полягала у визначенні характеру та механізмів порушень скорочувальної активності судин при дії іонізуючого випромінювання для обгрунтування коригуючих заходів фармакологічного спрямування.
Завдання дослідження: 1. Визначити основні закономірності впливу іонізуючої радіації на констрикторні і дилататорні властивості грудної аорти і сонної артерії кролів;
2. Провести порівняльне дослідження пошкоджуючої дії різних джерел випромінювання (джерела 137Cs і 60Co) у різні пострадіаційні терміни;
3. Визначити дію іонізуючої радіації на складові компоненти ендотелій-залежного розслаблення судин;
4. Визначити вплив радіації на процес індукованого звільнення дилататорних ендотелій-залежних чинників;
5. Визначити ефективність терапевтичних донорів оксиду азоту при дії іонізуючого випромінення;
6. Дослідити процес відновлення чутливості судин до NO-донорів протягом пострадіаційного періоду;
7. Визначити можливість фармакологічної корекції індукованих радіацією порушень реактивності судинної стінки за допомогою фосфатидилхолінових ліпосом і a-токоферолу.
Об'єкт дослідження: порушення скорочувальної активності кровоносних судин тварин, що зазнали іонізуючого опромінення, та експериментальне обгрунтування методів фармакологічної корекції виявлених змін.
Предмет досліджень: судини експериментальних тварин (кролів, щурів).
Методи дослідження: фармакологічні, фізіологічні, електрофізіологічні, хемілюмінесцентні, статистичні.
Наукова новизна роботи: Вперше показано, що іонізуюча радіація викликає дозо-залежне пригнічення ендотелій-залежних реакцій і збільшення чутливості судинної стінки до констрикторних впливів. Встановлено, що ступінь зміни реактивності судинної стінки залежить від виду судин, дози опромінення, природи джерела випромінювання і тривалості пострадіаційного періоду. Показано, що пригнічення дилататорної спроможності ендотелію корелює із збільшенням рівня вільно-радикальних процесів у плазмі крові і судинній стінці для широкого діапазону доз іонізуючого опромінення.
Вперше показано, що пригнічення дилататорної функції ендотелію виникає внаслідок пригнічення NO-залежного компоненту розслаблення, що пов'язаний з ендотеліальною NO-синтазою. Встановлено, що компонент розслаблення, що зв'язаний з ендотелій-залежним гіперполяризуючим чинником, у меншому ступені піддається впливу іонізуючої радіації і майже цілком визначає ендотелій-залежне розслаблення судин опромінених тварин.
Вперше встановлено, що незважаючи на пригнічення NO-залежної компоненти розслаблення при дії іонізуючої радіації, звільнення дилататорних чинників при стимуляції ендотелію опромінених судин не зменшується. Показано, що чутливість до оксиду азоту стінки судин підвищується після опромінення і не залежить від наявності ендотелію, тоді як чутливість до NO здорової судини підвищується при видаленні ендотелію.
Вперше встановлено, що дилататорна ефективність терапевтичних донорів оксиду азоту зменшується після іонізуючого опромінення, причому ступінь пригнічення дилататорної спроможності збільшується пропорційно експозиційній дозі. Показано, що ступінь пригнічення розслаблюючої ефективності різний для різних нітровазодилататорів.
Встановлено, що застосування a-токоферолу суттєво послаблює індуковані радіацією зміни реактивності судинної стінки і перешкоджає пригніченню NO-залежної компоненти ендотелій-залежного розслаблення.
Вперше показано, що введення фосфатидилхолінових ліпосом відразу після опромінення перешкоджає розвитку радіаційних змін реактивності судинної стінки.
Позитивний відновлюючий ефект при застосуванні ліпосом спостерігається як для ендотелій-залежних вазодилататорів, так і для нітросполук.
Встановлено, що профілактичне застосування фосфатидилхолінових ліпосом малоефективне, а їх ефективність виявляється лише в лікувальному режимі застосування.
Безпосередній вплив ліпосом на опромінені судини в умовах in vitro призводить до відновлення пригніченої радіацією NO-залежної компоненти ендотелій–залежного розслаблення, але не впливає на пригнічену чутливість судинної стінки до донорів оксиду азоту.
Практичне значення роботи: Результати проведених досліджень розкривають нові прояви пошкоджуючої дії іонізуючої радіації щодо кровоносних судин, які проявляються в суттєвому порушенні судинної реактивності до вазоактивних речовин. Встановлено основні закономірності розвитку цих порушень, що проявляються у появі схильності уражених судин до вазоконстрикції й ослаблення дилататорних властивостей судинної стінки. Отримані характеристики радіаційного впливу на вазодилататорну активність низки терапевтичних донорів оксиду азоту дозволять уточнити умови й ефективність їхнього застосування в умовах підвищеного радіаційного фону та оцінити доцільність використання нітровазодилататорів для пацієнтів, що зазнали опромінення.
Встановлені механізми ендотеліальної дисфункції і визначення ступеня радіочутливості різних компонент ендотелій-залежного розслаблення дозволять здійснити цілеспрямований пошук фармакологічних агентів, спроможних відновлювати або компенсувати ушкоджені радіацією ланки ендотеліального контролю судинного тонусу.
Запропоновано нову схему виникнення судинної дисфункції після опромінення, що включає як складові частини вільнорадикальні процеси, порушення ендотеліальної функції і зміни транспортних (дифузійних) властивостей ендотелію, а також процеси ушкодження м'язової компоненти судинної стінки. Передбачається, що цей механізм носить універсальний характер, притаманний, імовірно, не лише радіаційним, але і багатьом іншим судинним патологічним станам.
Для відновлення порушеної після променевого впливу ендотеліальної функції кровоносних судин запропоновано застосовувати фосфатидилхолінові ліпосоми (препарат "Ліпін", випускається в Україні). Одержано патент на винахід №50582. Встановлено позитивну протекторну дію вітаміну E при його застосуванні безпосередньо після променевого впливу.
Виявлена одна з особливостей дії фосфатидилхолінових ліпосом, - відновлення функціональної дилататорної активності ендотелію, що може визначити новий напрямок пошуку фармакологічних засобів для лікування пригніченої ендотеліальної функції при судинних патологіях різного походження. Отримані дані формують передумови для створення нового класу фармакологічних засобів, що взаємодіють із судинним ендотелієм і покращують або відновлюють його цілісність та безперервність - ендотеліотропних засобів.
Результати роботи впроваджено у навчальний процес на кафедрах фармакології Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця, Одеського державного медичного університету, Вінницького державного медичного університету ім. М.І. Пирогова, Луганського державного медичного університету, Львівського державного медичного університету ім. Д. Галицького, Національної фармацевтичної академії України, Української медичної стоматологічної академії, м. Полтава.
Особистий внесок здобувача. Автором дисертаційної роботи особисто розроблено програму наукових досліджень, самостійно здійснено дослідження, аналіз та узагальнення отриманого експериментального матеріалу, підготовка первинних даних для обробки ПЕОМ, порівняльний статистичний аналіз, дисперсійний та кореляційний аналізи на ПЕОМ, сформульовано основні положення та висновки роботи. Частину матеріалу було отримано під час спільних експериментів у лабораторії експериментальної кардіології Українського науково-дослідного інституту кардіології ім. акад. М.Д. Стражеска МОЗ України (завідувач – д. мед. н., проф. В.В. Братусь, матеріал по гіперхолестеринемії), відділі нервово-м'язової фізіології інституту фізіології ім О.О. Богомольця (керівник – д. мед. н., акад. М.Ф. Шуба, дані відносно дії апаміну та нітросполук на гладенькі м'язи), у співавторстві з к.б.н. Г.І. Плющ, з якими автор має спільні публікації.
Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень доповідались та обговорювались: на III съезде кардиологов УССР (Черновцы, 1988); 5th International symposium “Physiology and pharmacology of smooth muscle” (Varna, 1988); Всесоюзном симпозиуме патофизиологов (Кишинев, 1989); IV Всесоюзном съезде патофизиологов (Москва, 1989); Пленуме правления Украинского научного кардиологического общества “Нарушение ритма сердца и проводимости” (Запорожье, 1990); Украинской научно-практической конференции, УНЦРМ (Киев, 1992); Х научной конференции “Восстановительные и компенсаторные процессы при лучевых поражениях” (Санкт - Петербург, 1992); 2nd International Symposium "Endothelium - Derived Vasoactive Factors" (Basel. Switzerland. 1992); II Радиобиологическом съезде(Киев, 1993); IV съезде кардиологов Украины (15-17 сентября, Днепропетровск, 1993); Першому національному з"ізді фармакологів України "Сучасні проблеми фармакології" (Полтава, вересень 1995); 3-ем Симпозиуме ІДіагностика та профілактика негативних наслідків радіаціїІ (Київ, 16-17 грудня 1997 р); Конференции "Роль монооксида азота в процессах жизнедеятельности" (Минск, 1998); XV з"їзді Українського фізіологічного товариства (Одеса, 1998); V Российском национальном конгрессе ''Человек и лекарство'' (Москва, 1998); Second Workshop of Endothelium-Derived Hyperpolarizing Factor (Abbaye des Vaux de Cernay. France, 1998); Конференции "Роль нейромедиаторов и регуляторных пептидов в процессах жизнедеятельности" (Минск, 1999); III національному конгресі патофізіологів України (Одеса, 2000); First International Conference "Biology, Chemistry and Therapeutic Applications of Nitric Oxide" (Hyatt Regency Hotel. San Francisco. USA. 2000); Third Workshop on Endothelium-Derived Hyperpolarizing Factor. (Abbaye des Vaux de Cernay. France.-2000); Науково-практичної конференції "Експериментальна радіобіологія" (до 15-ї річниці Чорнобильскої катастрофи) (24-25 квітня 2001р, Київ); Международном симпозиуме "Функциональная роль монооксида азота и пуринов" (Минск, 2001); 2nd European Meeting on Vascular Biology and Medicine (Germany, September 27-29, 2001); II Національному з"ізді фармакологів України "Фармакологія 2001 – крок у майбутнє" (1-4 жовтня 2001 р. Дніпропетровськ); II Международной конференции "Микроциркуляция и ее возрастные изменения" (22-24 мая 2002 г. Киев); Науково-практичної конференції "Експериментальна радіобіологія" (21-22 травня 2002 р. Київ).
Публікації: За матеріалами досліджень опубліковано 50 наукових робот: 25 статей, із них 4 в зарубіжних виданнях та 21 у наукових фахових журналах, 24 тези конференцій, симпозіумів та з'їздів, одержано 1 патент на винахід і отримано позитивне рішення про видачу 1 патенту на винахід.
Структура та об'єм роботи. Дисертаційна робота викладена на 240 сторінках машинописного тексту і складається зі вступу, огляду літератури, восьми розділів, що містять матеріали і методи, результати власних досліджень, обговорення результатів, висновків, списку використаних джерел, який містить 423 джерела, в тому числі 298 англомовних публікацій. Робота ілюстрована 4 таблицями, 42 рисунками.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи досліджень. Предметом досліджень були кільцеві сегменти грудної аорти та сонної артерії кролів породи "Шиншила", кільцеві сегменти грудної аорти щурів лінії Wistar і спонтанно гіпертензивних щурів. В експериментах із гіпоксичними розчинами були використані кільцеві сегменти проксимальної частини епікардіальних коронарних артерій, що виділені із серця дорослих свиней.
Умови опромінення тварин. Експериментальні тварини піддавалися загальному, одноразовому зовнішньому g-опроміненню з використанням джерел "Ігур" (137Cs) і "ТГТ Рокус-М", Росія (60Co). Потужність дози при опроміненні кролів від джерела "Ігур" (137Cs) складала 0,307 Гр/хв, а при опроміненні джерелом "Рокус" (60Co) вона знаходилась у межах 0,80-0,845 Гр/хв для кролів і 0,833-1,0 Гр/хв для щурів у залежності від стану джерела на момент опромінення. Тварини опромінювались у дозах 1, 2 і 4 Гр при використанні джерела 137Cs і 2, 4 і 6 Гр при використанні 60Co. Гострий експеримент проводився на 7-9-й і 30-35-й дні після опромінення.
Реєстрація скоротливої активності. Реєстрація скоротливої активності м'язових сегментів здійснювалася в ізометричному режимі за допомогою датчиків напруги, у якості яких використовувались механотрони 6МХ1С, або перетворювачі type DY1 (Ugo Basile, Italy), чи спеціально сконструйовані калібровані датчики напруги ємнісного типу. Запис скорочення здійснювався за допомогою самописців моделей Н3031-4 або model 202, Cole-Parmer Instrument Company, USA.
Відпрепаровані судини розміщувались у робочій камері між стаціонарним гачком і штоком датчика напруги, де витримувались до початку експерименту не менш ніж 1 год під навантаженням 20-30 мН для грудної аорти кролів, 10-15 мН для сонної артерії кролів, 10-12 мН для аорти щурів і 30-40 мН для коронарних артерій свині. Перфузія препаратів здійснювалась термостатованим (36-37 oС) стандартним розчином Кребсу зі швидкістю 1 мл/хв. Під час перфузії розчином Кребсу кільцевих сегментів судин проводилась періодична (4-5 разів) їх стимуляція хлористим калієм у концентрації 60 ммоль до одержання стабільних скорочувальних відповідей. Гіперкалієвий розчин готувався заміщенням NaCl еквімолярною кількістю KCl, що дозволяло уникнути зміни осмотичності розчину.
Деендотелізація судин проводилась або шляхом механічної руйнації ендотелію, або хімічно при інкубації м'язових препаратів протягом 8-10 хв у розчині, що містив сапонін у концентрації 0.1 мг/мл. Якість видалення ендотелію оцінювалась по ступеню пригнічення реакцій на ацетилхолін для судин кролів і щурів, а також на А-23187 для коронарних артерій свині.
Дослідження дилататорних реакцій проводилося на фоні попереднього скорочення ГМК коронарних артерій свині і судин щурів та кролів хлористим калієм (60 ммоль/л) і фенілефрином (10-5 моль/л), відповідно. Даний рівень тонусу приймався за вихідний (100%) і всі судинні реакції вимірювались щодо цього рівня. Опромінення тварин не впливало на максимальну величину скорочення на фенілефрин, тому процедура нормування дилататорних реакцій вважалася правомірною. Для того, щоб виключити участь простацикліну в ендотелій-залежному розслабленні на АХ, усі експерименти (крім спеціально обговорених випадків) були проведені на фоні індометацину (5Ч10-6 моль/л).
Електрофізіологічні методи досліджень. Кільцеві сегменти аорти виверталися ендотелієм назовні і закріплювалися на двох горизонтальних гачках із нержавіючої сталі в робочій камері, що постійно перфузувалась розчином Кребсу при температурі 37 оС. Скляні мікроелектроди заповнювались розчином хлористого калію (3 моль/л) і мали опір у діапазоні 60-80 МОм. Введення мікроелектродів здійснювалось з інтимальної сторони судинного сегменту за допомогою мікроманіпулятора М-360-90 (Newport, USA) з устроєм мікроподачі Model ESA-CSA (Newport, USA). Для реєстрації трансмембранного потенціалу використовувався мікроелектродний підсилювач MZ-4 (Nihon Kohden, Japan), сигнал із якого надходив на аналого-цифровий перетворювач Digidata 1200 (Axon Instruments, USA). Накопичення й обробка даних здійснювались за допомогою програми Axoscope 7.0 (Axon Instruments, USA). Введення АХ проводилось через 2-3 хв після одержання стабільного мембранного потенціалу. Потім препарат відмивали і додавали досліджувані блокатори ендотелій-залежного розслаблення, які діяли протягом 30-35 хв, після чого здійснювалося повторне введення мікроелектроду в клітину і реєстрація реакції на АХ.
Хемілюмінесцентні методи досліджень. Безпосередньо приготована сироватка крові (1 мл), або 25 мг подрібненої стінки судини в 1 мл фізіологічного розчину, поміщались у кювету хемілюмінометра ХЛМ 1Ц-01 і реєструвалось спонтанне світіння протягом 5 хв. Потім у кювету додавали 0,5 мл 3%-ного розчину пероксиду водню і знову записували хемілюмінограму протягом того ж відрізку часу. Рівень максимального піка світіння (Imax) свідчив про кількість вільних радикалів, що утворилися з органічних і неорганічних гідропероксидів. Рівень мінімального піка (Imin) давав можливість оцінювати вміст радикалів, що залишились у середовищі. Характер динаміки зниження інтенсивності світіння дозволяв оцінити активність усього процесу зв'язування вільних радикалів, т.с. рівень антиоксидантного захисту.
Приготування розчину оксиду азоту. Вихідний розчин оксиду азоту готувався розчиненням газоподібного NO у попередньо підготовленій бідистильованій деіонізованій воді. Процедура підготовки води полягала в повному витісненні із води кисню шляхом пропускання через неї протягом 2 год газоподібного аргону. Концентрація NO у базовому насиченому розчині складала 3,3 ммоль при 0 оС і 1,91 ммоль при кімнатній температурі (20 оС). Для визначення концентрації вільного NO використовувався амперометричний вимірювач NO (ISO-NO, World Precision Instruments, Inc.). Виміри проводились за допомогою датчика ISO-NOP діаметром 2мм. За звичай чутливість електроду складала 1пА=0,78 нмоль NO. Власний шум і ''дрейф'' електрода були близько 10 пА, а мінімальна концентрація NO складала 10-8 моль/л.
Методика "донор - детектор". Для реєстрації стимульованої секреції дилататорних чинників із ендотелію досліджуваних судин застосовувалася методика "донор - детектор" у конфігурації типу "сендвич". У якості донора використовувались сегменти грудної аорти контрольних і опромінених кролів (шириною 3 мм). Препарати закріплювались у робочій камері між двома вертикальними гачками з нержавіючої сталі діаметром 1,2 мм при початковій напрузі 30-35 мН. Один із гачків був закріплений стаціонарно на дні робочої камери, а другий з'єднувався зі штоком тензометричного датчика. Критерієм цілісності і функціональної повноцінності ендотелію судинних препаратів була наявність стабільних реакцій на ацетилхолін 10-5 моль/л. Попереднє скорочення донора проводилось за допомогою фенілефрину в концентрації 10-5 моль/л.
У якості детектора використовувалися сегменти сонної артерії здорових кролів (шириною 1-1,5 мм). Судинні препарати виверталися ендотелієм назовні і закріплювались при початковій напрузі 10-15 мН між двома вертикальними гачками з нержавіючої сталі діаметром 0,5 мм, один із яких був прикріплений до штоку ємнісного тензометричного перетворювача, а другий приєднувався до системи розтягу препарата. Вся система детектора монтувалась на мікроманіпуляторі MD4R (World Precision Instruments, Inc. USA), що дозволяло переміщувати препарат-детектор у будь-яке необхідне положення. Спочатку детектор розташовувався в окремій ванночці з розчином Кребсу при температурі 37 оС, у якій проводились всі необхідні процедури підготовки і кондиціонування. Потім проводилась хімічна деендотелізація судин за допомогою сапоніну в концентрації 0,1 мг/мл протягом 8-10 хв. Якість видалення ендотелію оцінювалась за ступенем пригнічення реакцій на ацетилхолін і появі при його дії констрикторних реакцій. Деендотелізований детектор за допомогою маніпулятора переносився в камеру з донором і при контролі мікроскопом поміщався усередину донорського судинного сегменту. У такій конфігурації додавання АХ у робочу камеру викликало розслаблення як донора, так і детектора. Ступінь розслаблення детектора приймався за міру кількості дилататорних чинників , що виділилися з ендотелію.
Експериментальна гіперхолестеринемія. Аліментарну гіперхолестеринемію (ГХЕ) відтворювали у кролів шляхом їх утримання на атерогенній дієті із розрахунку 0,2 г холестерину на 1 кг маси тіла на добу протягом всього експериментального періоду. Загальний рівень холестерину в крові визначали за допомогою автоаналізатора Technicon-AA-II (USA). Його величина складала 1,74±0,25, 9,05±0,60 і 17,21±2,5 ммоль/л у контролі і через 1 і 2 місяці ГХЕ відповідно. Опромінення тварин здійснювалось за 1 год до першого введення холестерину.
Методи досліджень у гіпоксичних умовах. Зниження оксигенації здійснювалось пропусканням через тестовий розчин Кребсу газоподібного азоту. Вже на 3-ей хв деоксигенації напруга розчиненого кисню знижувалась з 140-145 до 3-5 мм рт. ст., після чого концентрація О2 у розчині стабілізувалась і подальших змін не спостерігалось. Крім того, тестова камера з м'язовими препаратами постійно знаходилась в атмосфері азоту, що також перешкоджало зміні напруги розчиненого кисню протягом досліду за рахунок обміну з атмосферним О2. Напруга рО2 контролювалась протягом експерименту за допомогою полярографа ISO-O2 (World Precision Instruments, Inc. USA).
Гіпертензивні тварини. Досліди проводились на щурах із генетично детермінованою гіпертензією (300-350 г). Величина середнього артеріального тиску цих тварин складала 183±15 мм рт. ст. (83±8 мм рт. ст. у інтактних щурів). Вимір тиску здійснювався в хвостових артеріях за допомогою вимірювального комплексу Sphygmomanoneter S-2 (HSE, Germany).
Статистична обробка даних. Всі наведені дані подані у вигляді середнього арифметичного ± помилка середнього арифметичного. Залежності доза-ефект і значення максимальних величин реакцій при різноманітних впливах порівнювались за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу і наступних посттестів із використанням методу Бонферроні для множинних порівнянь і методу Тьюкі. Величини ЕД50 і амплітуд максимального розслаблення для залежностей доза-ефект були отримані із апроксимації експериментальних даних кривою Хілла, що була побудована за методом найменших квадратів. Порівняння отриманих величин проводилось за методом Стьюдента для непарних вимірів. У експериментах із NO-донорами для порівняння даних для тварин контрольної і опроміненої груп також користувались t-тестом Стьюдента. Розходження вважались статистично достовірними, якщо величина р була менше 0,05. Усі розрахунки проводили з використанням програм Origin 6.1 (OriginLab Corporation, USA) і EXEL 5.0 (Microsoft, USA) на персональному комп'ютері IBM HP Vectra Pentium.
Речовини і фармакологічні препарати. У експериментах використовувався розчин Кребсу наступного складу (у ммоль): NaCl 133; KCl 4.7; NaHCO3 16.3; NaH2PO4 1.38; CaCl2 2.7; MgCl2 1.1; глюкоза 7.77, р 7.3. У розчинах із підвищеним вмістом К+ замість NaCl додавали еквімолярну кількість KСl. рН 7.3 доводився титруванням розчину за допомогою HCl або NaOH.
В експериментах використовувались такі препарати: фенілефрин, ацетилхоліну гідрохлорид, нітропрусид натрію, SIN-1, нітрит натрію, Nw-нітро-L-аргінін, апамін, харибдотоксин та індометацин фірми Sigma (St. Louis, USA), нітрогліцерин фірми Bio-Therabel (Brussels, Belgium), A23187 фірми Calbiochem-Behring (La Jolla, USA), ліпін фірми Біолек (Харків).
РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ
Дослідження впливу іонізуючої радіації на констрикторні властивості судинної стінки. Величини фенілефринового скорочення грудної аорти і сонної артерії не змінювались при дії іонізуючої радіації аж до дози 4 Гр і 6 Гр при використанні джерела 137Cs і 60Co відповідно. На відміну від фенілефрину, при дослідженні скоротливих реакцій на інші вазоконстриктори була виявлена тенденція до їхнього збільшення в судинах опромінених тварин (рис. 1). Були вивчені скоротливі ефекти норадреналіну (НА), і гіперкалієвого розчину (KCl). Вже на 7-9-й день після опромінення джерелом 137Cs у дозі 2 Гр у грудній аорті і сонній артерії спостерігалось вірогідне збільшення скоротливих реакцій як на НА, так і на KCl. При використанні джерела 60Со також спостерігалась тенденція до збіль-
Рис. 1. Зміни реактивності грудної аорти кроля на 9-у добу після опромінення тварин джерелами 137Cs і 60Со у дозі 4 Гр. НА, АХ и НГ – норадреналін, ацетилхолін і нітрогліцерин, концентрація усіх речовин 10-5 моль/л, KCl – хлористий калій (60 ммоль/л).
шення констрикторних відповідей, але статистичний аналіз не виявив вірогідної зміни скорочувальних реакцій.
Таким чином, судини опромінених тварин набувають виражену схильність до підвищеної констрикції, причому ступінь цього підвищення збільшується зі збільшенням дози опромінення. У грудній аорті ці зміни проявляються сильніше в порівнянні із сонною артерією. Пошкоджуюча здатність джерела 137Cs щодо збільшення чутливості судин до вазоконстрикторів вище в порівнянні з джерелом 60Co при рівних дозах опромінення.
Вплив іонізуючої радіації на дилататорні властивості судинної стінки. Було досліджено декілька дилататорних агентів, що мають різні механізми дії: 1. Ацетилхолін (АХ) - ендотелій–залежний вазодилататор; 2. Нітрогліцерин (НГ) - ендотелій–незалежний вазодилататор; 3. Ізопреналін - b-адреноміметик; 4. А-23187 - кальцієвий іонофор, що викликає розслаблення при взаємодії з мембранами ендотеліоцитів та утворення в них селективних пор, що сприяють входу в ендотеліоцит іонів Са++ з наступним виділенням ендотелієм вазоактивних субстанцій.
Опромінення тварин джерелом 137Cs у дозі 4 Гр уже на 7 –9-й день призвело до істотного пригнічення (більш ніж на 50%) дилататорних реакцій на ацетилхолін, нітрогліцерин і А-23187 як у грудній аорті, так і в сонній артерії (рис. 1). Реакція на ізопреналін вірогідно не змінювалась в обох типах судин. Дилататорні ефекти використаних вазодилататорів у більшому ступені ослаблені у грудній аорті в порівнянні із сонною артерією. Такі ж закономірності встановлені і для судин тварин, опромінених джерелом 60Co, хоча ступінь пригнічення дилататорних реакцій був дещо меншим (30-40%) у порівнянні з джерелом 137Cs. У цих умовах також не спостерігалося достовірної зміни величин розслаблення обох
Рис. 2. Реакції грудної аорти здорових і опромінених (137Cs, 9-й день після опромінення) кролів при дії ацетилхоліну (АХ) і кальцієвого іонофору А-23187. А - залежності концентрація-ефект для АХ, Еm = 54,0±3,0 і 39,6±3,4 %, pЕД50 = 6,63±0,10 і 7,09±0,16 для здорових і опромінених судин відповідно. Суцільні лінії - логістична апроксимація. Б - залежності доза радіації-ефект для АХ (10-5 моль/л) і А-23187 (10-6 моль/л). Розслаблення виражене у відсотках щодо скорочення на фенілефрин 10-5 моль/л; * - p<0,05, n = 15-17.
типів судин на ізопреналін. Зі збільшенням дози опромінення дилататорні реакції судин на А-23187 зменшувалися в тому ж ступені, що й ефекти АХ (рис. 2). Залежності доза опромінення-ефект для АХ і для А-23187 у даному діапазоні доз з високим ступенем точності описувалися лінійним рівнянням, причому нахили ліній регресії були однакові для обох вазодилататорів (близько 14% на 1 Гр). Факт однакового пригнічення рецептор-залежних і незалежних дилататорних реакцій, що мають загальний кінцевий ланцюг - виділення з ендотелію вазоактивних субстанцій - дозволяє зробити висновок, що радіаційний вплив не призводить до
істотних ушкоджень холінорецепторного апарату ендотеліальних клітин кровоносних судин.
Дія іонізуючої радіації викликала достовірне зменшення максимальної величини розслаблення на АХ, а також приводила до зміщення залежності доза-ефект вліво в область менших концентрацій АХ (рис. 2). Наявність зміщення кривих вліво дозволяє зробити висновок про те, що в результаті радіаційного впливу поряд з пригніченням максимального ефекту АХ, відбувається збільшення чутливості судинної стінки до цього вазодилататора.
Таким чином, дія іонізуючої радіації призводить до пригнічення дилататорних реакцій, у яких посередником є ендотелій і продукти його секреції. Радіація несуттєво впливає на дилататорні реакції, опосередковані адренорецепторною взаємодією. І, нарешті, в опромінених судинах у значній мірі пригнічені реакції, що опосередковані оксидом азоту.
Порівняльне дослідження впливу іонізуючої радіації на різні судини. Іонізуюча радіація викликає однонаправлені зміни реактивності як грудної аорти, так і сонної артерії. Ці зміни проявляються в підвищенні реактивності судинної стінки до констрикторних агентів і зменшенні її до дилататорних впливів. Проте зменшення ефективності вазодилататорів відбувається в різному ступені для різних судин. Ступінь пригнічення реакції розслаблення на ацетилхолін пропорційний дозі опромінення і з високою точністю описується лінійним рівнянням як для грудної аорти, так і для сонної артерії. Проте нахил цієї залежності вірогідно вищий для препаратів грудної аорти в порівнянні із сонною артерією (14,7±1,3 і 8,5±1,6 %/Гр відповідно, p<0,05, n=12-16). Цей факт указує на те, що ендотелій-залежні реакції більш чутливі до дії радіації в грудній аорті, що припускає більший ступінь ушкодження ендотелію цих судин. Зі збільшенням дози опромінення падає здібність іонофору А-23187 щодо ендотелій-залежного розслаблення, причому величина пригнічення корелює з величиною зменшення ефектів ацетилхоліну для обох типів судин. Проте відносне пригнічення реакцій на А23187 також більше в грудній аорті в порівнянні із сонною артерією (14,8±1.0 і 9,9±1.6 %/Гр відповідно, p<0,05, n=12-16).
Розслаблення судинної стінки у відповідь на b-стимуляцію ізопреналіном, що здійснює свій вплив без посередництва ендотелію і за рахунок прямої взаємодії з гладеньком'язовими клітинами, у меншому ступені підпадає під дію іонізуючої радіації в обох типах судин, ніж ендотелій-залежне розслаблення. Достовірного зменшення величин реакцій на ізопреналін не спостерігалось аж до дози 4 Гр (137Cs) як у грудній аорті, так і в сонній артерії.
Реакції на нітрогліцерин, який також є ендотелій-незалежним вазодилататором, істотно пригнічуються при дії іонізуючої радіації, причому ступінь пригнічення зростає зі збільшенням дози опромінення в обох типах судин. Проте нахил залежностей величин максимальних реакцій на нітрогліцерин від дози іонізуючої радіації вірогідно не відрізняється для грудної аорти і сонної артерії (15,7±4,5 і 8,7±3,7 %/Гр відповідно, p>0,05, n=12-16), що може свідчити про однаковий вплив іонізуючої радіації на процеси, які викликають розслаблення ГМК різних судин під дією NO і не пов'язані з ендотелієм.
Таким чином, іонізуюча радіація може по різному ушкоджувати різні судини однієї тварини. Грудна аорта більш чутлива до дії радіації, у порівнянні з сонною артерією. Ця різниця в першу чергу стосується ендотелій-залежних впливів, тоді як реактивність судин до ендотелій-незалежних вазодилататорів або не піддається впливу іонізуючої радіації (b-адреноміметики), або страждає в однаковій мірі в обох судинах (нітросполуки).
Опромінення різними джерелами іонізуючої радіації. Встановлено, що опромінення тварин різними джерелами призводить до кількісно різних результатів, хоча якісна спрямованість радіаційних ефектів однакова для 137Cs і 60Co. У обох випадках спостерігається посилення констрикторних і ослаблення дилататорних реакцій, проте ступінь зміни реактивності істотно різна. При опроміненні тварин джерелом 137Cs спостерігалася значно більш виражена зміна судинних реакцій на всі вивчені сполуки в порівнянні з опроміненням від джерела 60Co. На прикладі ендотелій-залежного розслаблення на ацетилхолін була вивчена порівняльна ефективність ушкоджуючої дії обох джерел іонізуючої радіації. Нахил залежностей доза іонізуючої радіації - ефект ацетилхоліну істотно і вірогідно вище для 137Cs у порівнянні з 60Co (14,7±2.1 і 7,98±1.1 %/Гр відповідно, p<0,05, n=12-16). Це означає, що опромінення джерелом 137Cs викликає в 1,5-2 рази більший пошкоджуючий ефект у порівнянні з 60Co при рівних дозах. Приблизно рівні і добре виражені ефекти зміни реактивності судин виявлялися при дозі опромінення 4 Гр для 137Cs і 6 Гр для 60Co. Саме при цих дозах іонізуючої радіації була проведена більшість експериментів. 137Cs і 60Co є джерелами g-випромінювання, проте енергії квантів цих джерел істотно відрізняються (660 кеВ і 1,21 МеВ відповідно). В даний час вважається, що незважаючи на значні відмінності енергій квантів, біологічна ефективність обох видів випромінювань однакова, а коефіцієнт біологічної ефективності дорівнює одиниці для обох джерел випромінювання. Проте проведені дослідження призводять до висновку про необхідність уточнення коефіцієнтів ОБЕ навіть у рамках випромінювань одного виду. Очевидно, необхідно з більшою обережністю ставитися до оцінки біологічної ефективності випромінювань різних джерел навіть однакової природи, але з різними енергіями квантів.
Таким чином, опромінення тварин джерелом 137Cs викликає більш виражений пошкоджуючий вплив на кровоносні судини і призводить до суттєвих змін судинної реактивності в порівнянні з джерелом 60Co. Рівні пошкоджуючі ефекти досягаються при дозах 4 Гр і 6 Гр для 137Cs і 60Co відповідно.
Скорочувальні властивості судинної стінки на різних пострадіаційних термінах. Отримані дані свідчать, що через 7-9 днів після одноразового загального опромінення спостерігається істотне пригнічення чутливості судинної стінки як до ендотелій-залежних, так і до ендотелій-незалежних вазодилататорів. Таке пригнічення не реєструється при вивченні судинних сегментів, узятих у тварин через 2 год після опромінення аж до доз 8 Гр (джерело 137Cs). Експерименти, проведені на 30-35 день після опромінення, показали, що подальший розвиток ушкоджень реактивності судинної стінки залежить у першу чергу від типу судини. У грудній аорті спостерігалося прогресуюче пригнічення відповіді на АХ у порівнянні з ранніми пострадіаційними строками, тоді як у сонній артерії не було зареєстровано подальшого зменшення цих реакцій, але і не спостерігалося їхнього відновлення. Пригнічення реакцій на нітрогліцерин після опромінення 137Cs у дозі 4 Гр також посилювалося і на 30-й день їхня величина ще більш зменшувалась у порівнянні зі значеннями, характерними для 7-9 дня. При опроміненні джерелом 137Cs у менших дозах (2 Гр), ефект прогресування не спостерігався і ступінь зменшення реакцій на АХ була однаковою на 9-у і 30-у добу. Реакції на нітрогліцерин у цих умовах також не змінювалися протягом дослідженого пострадіаційного періоду і не виявляли тенденції як до відновлення, так і до подальшого пригнічення. При опроміненні тварин джерелом 60Co спостерігалася дещо інша картина. Хоча реакції на АХ залишалися зменшеними на 30-й день після опромінення і не було виявлено достовірних відмінностей середніх величин АХ-індукованого розслаблення у порівнянні з 9-м днем, для частини судинних препаратів була виявлена тенденція до відновлення відповідей на АХ. На відміну від ендотелій-залежних реакцій, відповіді на нітрогліцерин відновлювались в значно більшому ступені. Хоча середні величини дилататорних реакцій на нітрогліцерин залишалися нижче контрольних, статистична обробка не виявила достовірних відмінностей їхніх значень від реакцій здорових судин.
Таким чином, можливість відновлення (репарації) пригнічених після опромінення дилататорних реакцій із часом залежить, очевидно, принаймні
