НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

ТЄЛЄЖКІН ВСЕВОЛОД СЕРГІЙОВИЧ

УДК 612.73:577.352.4:546.172.6

ПРИРОДА МОДУЛЮЮЧОЇ ДІЇ ОКСИДУ АЗОТУ

НА ЕЛЕКТРОГЕНЕЗ У ГЛАДЕНЬКИХ М’ЯЗАХ ОСНОВНОЇ ЛЕГЕНЕВОЇ АРТЕРІЇ ТА ЇХ СКОРОЧЕННЯ-РОЗСЛАБЛЕННЯ

03.00.02 - Біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ-2003

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі нервово-м’язової фізіології

Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Науковий керівник: академік НАН України, доктор медичних наук

Шуба Михайло Федорович,

завідувач відділу нервово-м’язової фізіології

Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Курський Михайло Дмитрович,

головний науковий співробітник

Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України

доктор медичних наук

Соловйов Анатолій Іванович,

керівник сектору центру доклінічних випробувань лікарських засобів Державного фармакологічного центру МОЗ України

Провідна установа: кафедра біофізики біологічного факультету Національного Університету імені Тараса Шевченка,

м. Київ.

Захист відбудеться “27” травня 2003 р. о “1400” годині на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д-26.198.01 при Інституті фізіології

ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: м. Київ, 01024,

вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології

ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: м. Київ, 01024,

вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий “26” квітня 2003 р.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Організація мережі кровоносних судин малого кола кровообігу в організмі ссавців в значній мірі обумовлена функцією газообміну у цьому колі – оксигенацією венозної крові та видаленням з неї надлишку вуглекислого газу. У порівнянні з судинами великого кола кровообігу (системними) легеневі судини є унікальними за своїми реакціями на дію фізіологічно активних речовин, будовою стінок, локалізацією між двома інтенсивно працюючими відділами серця, тісним зв’язком з легеневою паренхімою (що здійснює безперервні респіраторні рухи), малою густиною еферентної інервації. У людини у малому колі кровообігу відносно низький артеріальний тиск та спостерігається сильна залежність розподілу кров’яного струму від сили тяжіння (Ткаченко 1984).

Останнім часом інтерес дослідників до судин малого кола кровообігу підвищівся, але переважна більщість робіт була присвячена вивченню властивостей резистивних легеневих артерій (Madden, 1992; Weir, 1995; Yuan, 1995). В роботах, присвячених вивченню кондуктивних легеневих артерій автори, як правило, описували їх як судини з суто провідною функцією. Проте відомо, що легеневі артерії великого діаметру мають щільнішу інервацію, ніж легеневі артерії середнього та малого діаметру (Ткаченко, 1984). Розслаблюючий фактор ендотеліального походження, що був ідентифікований як оксид азоту (NO), розслаблює кондуктивні легеневі артерії ефективніше, ніж резистивні (Archer, 1996).

Протягом останніх десяти років такий агент, як NO, привертає особливу увагу фізіологів, біофізиків та молекулярних біологів. Така зацікавленість пов’язана з тим, що NO відіграє дуже важливу роль в організмі ссавців, зокрема людини. На сьогоднішній день відомо, що в гладеньких м’язах артерій NO є важливим ендогенним вазодилятатором, котрий здатний істотно впливати на судинний тонус (Ignarro, 1987; Palmer, 1987). Він утворюється в судинному ендотелії з L-аргініну за участю фермента NO-синтази (Palmer, 1987). Дисфункція ендотелію легеневих артерій, що пов’язана зі зменшенням продукування NO, збільшує імовірність виникнення легеневої гіпертонії (Giaid, 1995) та інших серцево-судинних захворювань (Zapol, 1994). Відомо, що викликана NO вазодилятація опосередкована активацією розчиненого в цитозолі ГМК фермента гуанілатциклази, що призводить до зростання внутрішньоклітинної концентрації циклічного гуанозин монофосфату (cGMP). Підвищення рівню cGMP призводить до активації cGMP-залежної протеїнкінази (PKG), котра активує кальційзалежні калієві канали великої провідності (КСа-канали), викликає гіперполяризацію плазматичної мембрани, пригнічує активність потенціалзалежних кальцієвих каналів (Са2+-каналів) L-типу (Зима, 1994; Зима, 1996; Blatter, 1995), підсилює поглинання Са2+ саркоплазматичним ретикулумом (СР) та/або стимулює активне видалення Са2+ з ГМК.

Таким чином, на теперишній час накопичені певні відомості про феномени, що викликаються дією NO у гладеньких м’язах судин малого кола кровообігу. Це дозволяє висунути гіпотезу про можливі механізми дії NO, але ці механізми остаточно не ідентифіковані, і питома вага дії того чи іншого механізму у сумарному ефекті невідома. Зокрема, уявлення про роль різних типів калієвих каналів у регуляції мембранного потенціалу спокою (МПС) ГМК основної легеневої артерії містять багато протиріч. Враховуючи такі невизначеності, ми вважали за доцільне провести комбіновані дослідження дії NO на гладенькі м’язи основної легеневої артерії шляхом реєстрації електричної та скорочувальної активності гладеньком’язових багатоклітинних препаратів за допомогою методу “сахарозний місток”, а також шляхом реєстрації інтегральних трансмембранних іонних струмів та струмів через поодинокі іонні канали ізольваних ГМК за допомогою методу “patch-clamp”.

Наші дослідження проводились відповідно до планів наукової роботи відділу нервово-м’язової фізіології Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України за темами “Механізми метаболічної регуляції іонних каналів та скорочення гладеньком’язових клітин”, “Мембранні та внутрішньоклітинні механізми регуляції скорочення і активності іонних каналів гладеньком’язових клітин нейромедіаторами”.

Мета і завдання роботи. Метою роботи було з’ясування механізмів дії NO на ГМК основної легеневої артерії кроля. Для досягнення цієї мети були поставлені такі завдання:

1. Дослідити шляхи впливу NO на електричні властивості гладеньком’язових препаратів основної легеневої артерії кроля та їх скорочення, викликані дією гіперкалієвого розчину та блокаторів калієвих каналів.

2. З’ясувати внесок вивільнення іонів Са2+ з внутрішньоклітинних Са2+-депо в ефекти NO.

3. Оцінити роль калієвих каналів у формування мембранного потенціалу спокою ГМК основної легеневої артерії кроля.

4. Визначити амплітудо-кінетичні характеристики та фармакологічні властивості вихідного трансмембранного іонного струму і потенціалзалежного Са2+-струму ізольованих ГМК, а також оцінити дію NO на ці струми.

5.

Наукова новизна отриманих результатів. 1. Вперше досліджені механізми розслаблюючої дії екзогенного NO, донором якого був нітрогліцерин, на ГМК основної легеневої артерії кроля. 2. Показано, що властивості КСа-каналів великої провідності і потенціалзалежних калієвих каналів (КV-каналів) в ГМК багатоклітинних препаратів, що досліджувались із застосуванням методу “сахарозний місток”, відрізняються від властивостей цих каналів поодиноких ізольованих ГМК основної легеневої артерії кроля, досліджених за допомогою методу “patch-clamp”. 3. Виявлено значний внесок КСа-каналів великої провідності у вихідний трансмембранний струм поодиноких ізольованих ГМК і у формування мембранного потенціалу спокою (МПС) ГМК багатоклітинних прпаратів основної легеневої артерії кроля. Блокування КСа-каналів за допомогою тетраетиламонію (ТЕА) викликає значну деполяризацію мембрани ГМК, що близька до порога генерації потенціалів дії (ПД). 4. NO збільшує амплітуду вихідного трансмембранного струму шляхом активації КСа-каналів великої провідності. Досліди, проведені на поодиноких КСа-каналах, показують, що NO підвищує вірогідність відкритого стану (P0) КСа-каналів, не впливаючи на величину провідності окремого каналу. 5. Показаний пригнічуючий вплив NO на активність потенціалзалежних Са2+-каналів L-типу у мембрані ГМК основної легеневої артерії кроля (дослідження на поодиноких ізольованих ГМК при зменшенні амплітуди потенціалзалежного Са2+-струму, а також на багатоклітинних препаратах під час пригнічення викликаних ПД). 6. NO пригнічує вивільнення Са2+ з інозитолтрифосфат- (ІР3-) чутливого Са2+-депо, але не впливає на вивільнення Са2+ з ріанодинчутливого Са2+-депо.

Теоретичне та практичне значення роботи. Отримані дані мають здебільшого теоретичне значення. Вони висвітлюють певні особливості формування МПС ГМК кондуктивних артерій малого кола кровообігу, дозволяють краще зрозуміти процеси регуляції кровотоку в легенях, а також показують механізми диляторного впливу NO на легеневі судини. Згідно з результатами нашої роботи, NO викликає розслаблення гладеньких м’язів основної легеневої артерії через, щонайменше, чотири механізми: 1) стимуляцію активності КСа-каналів великої провідності, 2) пригнічення активності потенціалкерованих Са2+-каналів L-типу у плазматичній мембрані ГМК, 3) пригнічення вивільнення іонів Са2+ з ІР3-чутливого компонента СР, та 4) вплив на скоротливий апарат ГМК (4). Крім того, результати нашої роботи вказують на те, що електрофізіологічні властивості і, відповідно, реакції ізольованих ГМК істотно відрізняються від властивостей і відповідей ГМК багатоклітинних препаратів. Отже, наша робота свідчить про важливість комплексного підходу до вивчення фізіології та біофізики гладеньких м’язів, з використанням методів дослідження як багатоклітинних препаратів, так і ізольованих ГМК і поодиноких іонних каналів.

З’ясування механізмів дії донорів NO може бути відправним пунктом для синтезу ефективніших фармакологічних агентів та створення нових методів терапії серцево-судинних захворювань, котрі пов’язані з пороками серця та ушкодженням або дисфункцією артеріального ендотелію.

Особистий внесок. Конструювання та калібрування електрофізіологічних установок для дослідів з використанням методик “сахарозний місток” і “patch-clamp”, виділення функціонально повноцінних препаратів гладеньких м’язів та ГМК, всі експерименти, описані в дисертаційній роботі, аналіз та узагальнення експериментального матеріалу були виконані особисто автором. У розробці концепції роботи, обговоренні її результатів та написанні опублікованих статей брали участь керівник та співробітники відділу нервово-м’язової фізіології.

Апробація роботи. Основні положення роботи доповідались на ІІ конференції Українського товариства нейронаук (Донецьк, 2001), на міжнародній конференції “78th Physiological days – First Multilateral Conference of Physiologists from the Central Europe” (Пештяни, Словакія, 2002), на XVI з’їзді Українського фізіологічного товариства (Вінниця, 2002), на ІІ українсько-польському симпозіумі “Богомолець-Ненцкі” (Київ, 2002), на III з’їзді Українського біофізичного товариства (Львів, 2002), на семінарах сектору молекулярної фізіології Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України (2001, 2002).

Публікації. Основні матеріали роботи опубліковані в чотирьох журнальних статтях і чотирьох тезах доповідей.

МЕТОДИКА

У дослідах використовувались кролі вагою 4.0 – 5.0 кг, які забивалися шляхом створення повітряної емболії. Для отримання препаратів основної легеневої артерії вирізалась її ділянка від правого шлуночка серця до біфуркації на ліву та праву гілки. Зовнішній діаметр досліджуваної судини складав 5 – 8 мм. Досліди з використанням тензометричного методу та методу “сахарозний місток” проводились на деендотелізованих препаратах гладеньком’язових смужок. Судини очищувались від сполучної тканини та нарізались на кільця, котрі потім розрізались. Довжина одержуваних смужок дорівнювала приблизно 10 мм, товщина – до 1 мм. За допомогою шовкових лігатур смужка закріплювалась у проточній (2 мл/хв) термостатованій (37.0±0.5 оС) експериментальній камері об’ємом 500 мкл. Відведення електричних потенціалів від гладеньком’язових смужок здійснювалось за допомогою хлорованих срібних електродів, які з’єднувались з розчинами в камері через містки, що були заповнені агаром, приготованим на 2.0 M KCl. Один з електродів занурювали у ділянку камери, заповнену ізотонічним розчином KCl (167.0 мМ), а інший – в проточну тест-ділянку “сахарозного містку” з розчином Кребса. Відведену електричну активність подавали на вхід підсилювача, вихід якого з’єднували з одним з каналів автоматичного самописця Н3021-3. Реєстрація скорочувальної реакції гладеньком’язових смужок проводилась в режимі, наближеному до ізометричного, за допомогою механотрону 6МХ1С. Вихідне навантаження на гладеньком’язову смужку встановлювалося одразу ж після її закріплення у камері і складало приблизно 5 мН, що вважалося за умовний нуль. Електричні сигнали з механотрону подавались на другий канал самописця. Електричні та механічні відповіді гладеньком’язових препаратів нормалізувались; за еталонні значення (100 %) бралися значення деполяризації та скорочення, викликаних дією гіперкалієвого розчину Кребса (що містив 60 мМ KCl), окремо для кожної досліджуваної смужки. Як вихідний розчин використовувався нормальний розчин Кребса, що мав такий склад (в мМ): NaCl –120.4; KCl – 5.9; NaHCO3 – 15.5; NaH2PO4 – 1.2; MgCl2 – 1.2; глюкоза – 11.5; CaCl2 – 2.5; (pH 7.4). Ізотонічний розчин сахарози (318.0 мМ) готували, розчиняючи хімічно чисту сахарозу у деіонізованій воді. Питомий опір розчину сахарози складав 0.8 – 1.0 МОм/см.

Поодинокі ГМК основної легеневої артерії кроля отримували за допомогою методу ферментативно-механічної ізоляції (Clapp, 1991). Отримані кільцеві гладеньком’язові фрагменти основної легеневої артерії кроля переносились у спеціальний розчин такого складу (мМ): NaCl 110.0; KCl 5.0; CaCl2 0.16; глюкоза 10.0; MgCl2 2.0; NaHCO3 10.0; NaH2PO4 0.5; KH2PO4 0.5; HEPES 10.0; таурин 10.0; рН 7.0 (NaOH). До цього розчину додавали 1.5 – 2 мг/мл папаїну та 1 мг/мл бичачого сироваткового альбуміну. В такому розчині фрагменти тканини витримували протягом 20 год при температурі 5 – 7 оС. Потім до розчину додавали 0.5 мг дитіотреітолу і інкубували при 36 – 37 оС протягом 10 хв. Для отримання ізольованих ГМК фрагменти гладеньком’язової тканини переносились до свіжого розчину, що містив 0.03 % бичачого сироваткового альбуміну, і 10 – 20 разів пропускались через пастерівську піпетку. Це призводило до отримання суспензії поодиноких функціонально повноцінних ГМК.

Для дослідження трансмембранних іонних струмів ізольованих поодиноких ГМК використовувався стандартний метод фіксації потенціалу “patch-clamp” (Hamill, 1981). Мікропіпетки витягували із заготовок з молібденового скла; після заповнення внутрішньопіпетковим розчином їх опір складав 1 – 4 МОм. Для дослідження інтегральних іонних струмів мембрани цілої ГМК використовували конфігурацію “whole-cell”, в основі якої полягає утворення щільного (гігаомного) контакту між стінками мікропіпетки і мембраною ГМК (конфігурація “cell-attached”) і наступне руйнування фрагменту клітинної мембрани під піпеткою за допомогою поштовху від’ємного тиску, в результаті чого забезпечувався безпосередній доступ вмісту мікропіпетки до цитоплазми. Внаслідок дифузії відбувалась заміна іонного складу внутрішньоклітинного середовища розчином з мікропіпетки.

Відведення активності поодиноких іонних каналів здійснювалось у конфігураціях “cell-attached” та “outside-out”. При використанні конфігурації “cell-attached” для усунення проблем, пов’язаних з відсутністю прямого контакту з цитоплазмою ГМК, використовували гіперкалієвий зовнішній розчин. Конфігурацію “outside-out” утворювали з конфігурації “whole-cell” за допомогою різкого відведення мікропіпетки від клітини. При цьому фрагмент мембрани на кінчику піпетки відокремлювався від клітини без порушення гігаомного контакту.

Вихідний зовнішній розчин, що використовувався в експериментах, проведених у конфігурації “whole-cell” для дослідження калієвих струмів та у конфігурації “outside-out”, був такого складу (мМ): NaCl 135.0; KCl 5.9; CaCl2 2.5; глюкоза 5.0; MgCl2 1.2; HEPES 10.0; рН 7.4 (NaOH). У дослідах потенціалзалежного Са2+-струму до цього розчину додавались блокатори калієвих каналів тетраетиламоній (ТЕА) і 4-амінопіридин (4-АР), кожен в концентрації 5 мМ. В експериментах, проведених у конфігурації “cell-attached”, склад зовнішнього розчину був такий (мМ): KCl 140.0; CaCl2 0.1; EGTA 0.6; HEPES 10.0; рН 7.4 (КOH). Внутрішньопіпетковий розчин для всіх експериментів по дослідженю К+-струмів містив (мМ): KCl 134.0; KH2PO4 5.0; HEPES 10.0; MgSO4 1.0; EGTA 0.3; ATP 1.0; рН 7.4 (КOH), тоді як при дослідженні потенціалзалежного Са2+-струму склад внутрішньопіпеткового розчину був такий (мМ): CsCl 140; HEPES 10; MgSO4 2; EGTA 1; ATP 2; GTP 0.5; рН 7.4 (CsOH). Досліди проводились при кімнатній температурі (20 – 25 оС).

Як донор NО використовувався відомий вазоділятатор нітрогліцерин (НГ).

Фіксація потенціалу та реєстрація іонних струмів здійснювалися за допомогою підсилювача з фіксацією потенціалу типу AXOPATCH-1D (з опором зворотнього зв’язку перетворювача струм-напруга 500 МОм) та фільтрувались за допомогою фільтру низьких частот (Бесселя 2-го порядку) з частотою зрізу 2 кГц. Для генерації імпульсів напруги, а також для оцифрування іонних струмів використовувалися аналогово-цифровий перетворювач Digidata 1200 А (Axon Instruments) та комп’ютер IBM PC/AT. Реєстрацію та аналіз даних здійснювали за допомогою програм pClamp 6.01 (Axon Instruments, Inc.,Фостер Сіті, США) та MicroCal Origin 5.0, або 6.1 (MicroCal Software, Inc., Норсхемптон, США).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дія нітрогліцерину на гладенькі м’язи основної легеневої артерії кроля у стані “спокою” та на фоні дії гіперкалієвого розчину. Додавання НГ до нормального розчину Кребса викликало зменшення базального тонусу гладеньком’язової смужки нижче рівня умовного нуля в середньому на 3.7±0.5 % (n=13), але не призводило до гіперполяризації мембран ГМК препарату. Аплікація 10 мкМ НГ на фоні дії гіперкалієвого розчину (60 мМ KCl) пригнічувала викликане скорочення на 19.3±2.1 % (n=14) (рис. 1, А, В). Для того, щоб обмежити вхід іонів Са2+ до ГМК з суперфузату, під час дії 60 мМ KCl, було використано блокатор Са2+-каналів L-типу ніфедипін. Ніфедипін в концентрації 1 мкМ зменшував “гіперкалієве” скорочення на 71.5±2.4 % (n=6), а аплікація на цьому фоні 10 мкМ НГ цілком усувала скорочення, розслаблюючи м’язову смужку нижче рівня умовного нуля на 0.5±2.4 % (n=6) (рис. 1, Б, В). Той факт, що 1 мкМ ніфедипіну повністю не пригнічував “гіперкалієве” скорочення, вказує на те, що внутрішньоклітинна концентрація іонів Са2+ ([Са2+]і) в ГМК залишалась достатньо високою для того, щоб підтримувати скорочення. Розслаблюючий ефект NО при цьому навряд чи пов’язаний з пригніченням активності незаблокованих Са2+-каналів. Розслаблення нижче рівня умовного нуля, вірогідно, зумовлене впливом NО на скоротливий апарат ГМК основної легеневої артерії кроля.

Вплив нітрогліцерину на скорочення гладеньких м’язів основної легеневої артерії кроля, викликані вивільненням Са2+ з саркоплазматичного ретикулуму. В наступних дослідах ми досліджували механізми дії NO на ефекти, викликані фенілефрином та кофеїном. Останні є агентами, котрі забезпечують вивільнення Са2+ з ІР3- та ріанодинчутливого компонентів СР, відповідно.

В нормальному розчині Кребса фенілефрин викликав скорочення м’язової смужки, що складалось з двох компонентів: початкового фазного та наступного тонічного, амплітудою 51.3±8.9 % та 96.5±1.3 % (n=35), відповідно (рис. 2, А). Кофеїн викликав невелике однофазове скорочення м’язової смужки амплітудою 13.0±1.5 % (n=9), після якого спостерігалось зниження базального тонусу препарату нижче рівня відносного нуля на 6.3±0.5 % (n=15) (рис. 2, Б).

У номінально безкальцієвому розчині Кребса (НБКР) двофазова форма скорочення на аплікацію фенілефрину залишалась такою самою, як і у нормальному розчині Кребса, проте амплітуда фазного компоненту зменшувалась на 20.2±3.6 %, а тонічного – на 32.1±8.6 %, (n=11) відносно еталонних значень. “Кофеїнове” скорочення зменшувалось з 13.0±1.5 % (n=9) у контролі до 8.2±0.8 %, (n=11) у НБКР. Отже, “фенілефринове” скорочення залежить від вмісту зовнішньоклітинного Са2+ приблизно на 30 %, тоді як скорочення, викликане кофеїном, – лише на 5 %.

Під час аплікації фенілефрину на фоні дії НГ форма і динаміка скорочення залишались такими самими, як у відсутності НГ. Величина початкового фазного компоненту скорочення практично не змінювалась, тоді як амплітуда тонічного компоненту в нормальному розчині Кребса зменшувалась від 96.5±1.3 % (n=35) до 53.1±3.8 % (n=13) (рис. 3, А), а в НБКР – від 64.4±8.6 % (n=11) до 25.3±5.4 % (n=7) (рис. 3, Б). Таким чином, як у нормальному розчині Кребса, так і в НБКР НГ пригнічував тонічний компонент “фенілефринового” скорочення приблизно на 40 %. НГ не забезпечував істотного пригнічення “кофеїнового” скорочення, зменшуючи його амплітуду в нормальному розчині Кребса від 13.0±1.5 % (n=9) (рис. 3, А) до 10.7±1.8 % (n=6), а в НБРК – від 8.2±0.8 %, (n=11) до 6.1±1.0 % (n=6) (рис. 3, Б).

Дія блокаторів калієвих каналів та NO на електричну і скорочувальну активність гладеньких м’язів основної легеневої артерії кроля. Для з’ясування ролі КСа- та КV-каналів у формуванні МПС ГМК основної легеневої артерії кроля ми використовували блокатори таких каналів ТЕА та 4-АР. З метою визначення ефективної концентрації цих блокаторів було досліджено дозові залежності. ТЕА в концентрації 1 мМ викликав деполяризацію і скорочення гладеньком’язових смужок на 10.6±1.4 % (n=7) та 4.8±1.9 % (n=7) відносно еталонних значень деполяризації і скорочення викликаних дією 60 мМ KCl, відповідно. Збільшення концентрації ТЕА до 3 мМ викликало деполяризацію на 15.4±1.9 % (n=6) і скорочення на 23.6± 4.9 % (n=6). 5 мМ ТЕА збільшувало деполяризацію до 26.6±2.2 % (n=19), а скорочення – до 65.5±7.2 % (n=11) (рис. 4, А). При підвищенні концентрації ТЕА до 15 мМ деполяризація зростала до 29.5±8.0 % (n=6), а амплітуда скорочення сягала 74.0±8.7 % (n=6). 4-АР в концентрації 1 мМ викликав деполяризацію та скорочення на 12.9±1.9 % (n=6) і 2.7±1.0 % (n=6), відповідно. При концентрації 4-АР 3 мМ деполяризація збільшувалась до 15.3±1.8 % (n=6), а скорочення зростало до 34.0±6.2 % (n=10). Додавання до розчину Кребса 5 мМ 4-АР підвищувало деполяризацію лише до 16.8±2.1 % (n=14), в той час як скорочення складало 46.7±5.5 % еталонного значення (n=11) (рис. 4, Б).

Тестування послідовної дії 5 мМ ТЕА та 5 мМ 4-АР на гладеньком’язові смужки показали відмінності в ефектах цих блокаторів. Аплікація ТЕА виникала деполяризацію, що супроводжувалась розвитком тонічного скорочення. Наступне додавання до розчину Кребса з ТЕА 4-АР призводило до генерації ПД і зростання деполяризації до 46.1±4.5 % (n=20), а також до майже максимального скорочення гладеньком’язової смужки, амплітудою 97.4±4.6 % (n=18), (рис. 5, А). Коли ж до розчину Кребса з 4-АР додавали ТЕА, деполяризація повільно збільшувалась до досягнення порогу генерації ПД, після чого відбувався стрімкий розвиток деполяризації та тетанічного скорочення (рис. 5, Б).

НГ (10 мкМ) пригнічував ПД, викликані дією ТЕА (5 мМ), але лише незначно впливав на рівень деполяризації, тоді як амплітуду скорочення пригнічував більш, ніж удвічі (рис. 6). В умовах одночаснї аплікації ТЕА (5 мМ) та 4-АР (5 мМ) на гладеньком’язові препарати НГ зменшував викликане скорочення з 97.4±4.6 % (n=18) до 37.2±9.0 % (n=10) і пригнічував ПД, але деполяризація при цьому зменшувалась лише від 46.1±4.5 % (n=20) до 35.2±2.5 % (n=11).

Вплив нітрогліцерину на вихідний трансмембранний іонний струм і на поодинокі Са2+-залежні калієві канали великої провідності гладеньком’язових клітин основної легеневої артерії кроля. Дослідження трансмембранного вихідного іонного струму здійснювались за допомогою ступінчастих зрушень мембранного потенціалу тривалістю 500 мс від підтримуваного рівня –60 мВ з інкрементом 10 мВ у діапазоні від –80 мВ до +70 мВ (рис. 7). Поріг активації вихідного струму у контролі складав приблизно –40 мВ. Зі збільшенням рівня деполяризації вихідний струм поступово зростав, і при потенціалах +60 – +70 мВ його амплітуда сягала 400 – 500 пА. Вихідний трансмембранний струм активувався приблизно за 50 мс, і протягом наступних 450 мс його амплітуда залишалась на тому ж рівні. При позитивних потенціалах виникали осциляції, що нагадують спонтанні швидкі вихідні струми (“STOCs”). ТЕА значно пригнічував трансмембранний струм та його осциляції. Так, при потенціалі +70 мВ ТЕА зменшував струм на 52.7±8.3 % (n=7). 4-АР також пригнічував трансмембранний вихідний струм у межах мембранного потенціалу від –40 до +50 мВ, але при більш позитивних потенціалах він збільшував амплітуду вихідного струму у порівнянні з контролем і значно посилював його осциляції. При потенціалі +70 мВ 4-АР збільшував трансмембранний струм на 18.3±14.8 % (n=7). Але під час одночасної аплікації ТЕА та 4-АР трансмембранний струм при потенціалі +70 мВ пригнічувався на 74.8±3.6 % (n=7), а поріг активації струму зсувався від –40 мВ до –10 мВ (рис. 7).

НГ (10 мкМ) збільшував амплітуду вихідного трансмембранного струму у порівнянні з контролем на 32.6±19.4 % (n=6) при +70 мВ, але не впливав на поріг його активації (–40 мВ). Амплітуда спонтанних осциляцій вихідного струму в присутності НГ також зростала (рис. 8, Б). Додавання до зовнішнього розчину на фоні дії НГ ТЕА в концентрації 1 мМ пригнічувало ефект НГ, зменшуючи амплітуду трансмембранного струму відносно контролю на 25.2±11.0 % (n=6), і усувало флуктуації струму (рис. 8, В). До того ж НГ у порівнянні з контролем, збільшував величину компоненту струму, що не підлягав потенціалзалежній інактивації, майже на 4 %, в той час, як ТЕА в концентрації 5 мМ, навпаки, зменшував цей компонент приблизно на 7 %.

Дослідження активності поодиноких КСа-каналів великої провідності мембрани ГМК основної легеневої артерії кроля у конфігурації “outside-out”

показали, що їх вольт-амперна характеристика була лінійною у межах потенціалів від +10 до +70 мВ. Провідність поодинокого КСа-каналу при концентрації іонів К+ у зовнішньому розчині 5.9 мМ складала 150.4±0.4 пС. ТЕА в концентрації 1 мМ при підтримуваному потенціалі фіксації +40 мВ повністю пригнічував активність КСа-каналів (рис. 9).

При дослідженні поодиноких КСа-каналів великої провідності у конфігурації “cell-attached” НГ використовувався в концентрації 100 мкМ. У цих умовах НГ підвищував активність поодиноких КСа-каналів, збільшуючи вірогідність знаходження каналу у відкритому стані (P0) в порівнянні з контролем до 180±5 %, а також підвищуючи можливість одночасного відкривання кількох КСа-каналів. При цьому НГ не змінював амплітуди струму поодинокого КСа-каналу великої провідності у мембрані ГМК основної легеневої артерії кроля (рис. 10).

Вплив нітрогліцерину на потенціалзалежний Са2+-струм у гладеньком’язових клітинах основної легеневої артерії кроля. Для дослідження вхідного потенціалзалежного Са2+-струму через мембрану ГМК основної легеневої артерії кроля використовували протокол ступінчатих зрушень мембранного потенціалу тривалістю 100 мс від підтримуваного рівня –60 мВ з інкрементом 10 мВ у діапазоні від –50 мВ до +40 мВ.

Потенціалзалежний Са2+-струм активувався при потенціалах –40 – –30 мВ і досягав максимуму при +10 мВ. При більш позитивних потенціалах Са2+-струм зменшувався (рис. 11, А). Максимальна амплітуда Са2+-струму ГМК основної легеневої артерії кроля у контролі складала 40 – 50 пА. Ніфедипін в концентрації 1 мкМ пригнічував потенціалзалежний Са2+-струм ГМК основної легеневої артерії кроля при потенціалі +10 мВ на 84.8±3.4 % (n=5), що вказує на те, що цей струм переноситься через високопорогові потенціалзалежні Са2+-канали L-типу (Зима, 1996).

При додаванні до зовнішнього розчину 100 мкМ НГ відбувалось пригнічення потенціалзалежного Са2+-струму. При протенціалі +10 мВ НГ пригнічував Са2+-струм у порівнянні з контролем на 18.5±11.0 % (n=5), при цьому NO не впливав на кінетику такого струму (рис. 11, Б).

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Головним завданням нашої роботи було виявлення можливих механізмів розслаблюючої дії NO на ГМК основної легеневої артерії кроля. Основна легенева артерія – найбільша за діаметром артерія організму ссавців – є класичною кондуктивною артерією. Її головними функціями є проведення крові до легень та амортизація пульсових хвиль тиску під час систоли шлуночків. Вважають, що ця артерія не бере істотної безпосередньої участі в регуляції легеневого кров’яного тиску. Проте наявність кількох типів іонних каналів та рецепторів у мембрані її ГМК, а також складна природа регуляції обміну [Са2+]і та інших вторинних посередників в цих клітинах, вказують на досить важливу ролі стану основної легеневої артерії в регуляції легеневого кровообігу.

Вплив оксиду азоту на гладенькі м’язи основної легеневої артерії кроля у стані “спокою” та під час “гіперкалієвого” скорочення. При використанні НГ утворення NO відбувається у цитоплазмі ГМК в результаті реакції гідролізу молекули НГ ферментом редуктазою глутатіон органічного нітрату. NO через гуанілатциклазний шлях стимулює cGMP-залежну протеїнкіназу (PKG), що пригнічує фосфорилювання міозину і зменшує чутливість скоротливого апарату до іонів Са2+. Не виключено, що вплив на скоротливий апарат ГМК також, може реалізуватись через циклічний аденозин монофосфат (cАMP)-залежну протеїнкіназу (РКА), яку cGMP у великих концентраціях здатний неспецифічно активувати (Chen, 1996). Активована РКА в присутності Са2+ та кальмодуліну фосфорилює кіназу легких ланцюгів міозину (КЛЛМ), що призводить до пригнічення активності цього ферменту.

В наших дослідах донор NO НГ зменшував вихідний тонус гладеньком’язової смужки основної легеневої артерії кроля на 3.7±0.5 % (n=13) нижче рівня умовного нуля, але гіперполяризації мембрани ГМК смужки при цьому не відбувалось. Це вказує на те, що калієві канали плазматичної мембрани ГМК непричетні до цього розслаблення, що було підтверджено в експериментах на ізольованих ГМК і поодиноких КСа-каналах (які не виявляли активності при потенціалах, негативніших за –50 – –60 мВ, тобто значеннях, які відповідали МПС) (Гурковская, 1977; Casteels, 1977). Також малоімовірним здається вплив NO на внутрішньоклітинні Са2+-депо, зокрема на Са2+-АТРазу мембрани СР, тому що у стані спокою в ГМК легеневої артерії [Са2+]і складає менше 0.1 мкМ (ця концентрація є пороговою для активації скорочення) (Шуба, 1988). В той же час константа Міхаеліса для високоафінних Са2+-зв’язуючих субфрагментів різних Са2+-АТРаз варіює у межах 0.3 – 0.8 мкМ (Курский, 1987).

В дослідах на хвостовій артерії щура та на каротидній артерії свині було виявлено, що під час деполяризації, котра була викликана дією 30 мМ KCl, НГ розслаблював гладеньком’язову смужку без зміни [Са2+]і (Chen 1992). В наших дослідах НГ (10 мкМ) зменшував скорочення, викликане 60 мМ KCl, на 20 %, а під час дії блокатору Са2+-каналів L-типу ніфедипіну (що пригнічував “гіперкалієве” скорочення більше ніж на 70 %) НГ розслаблював гладеньком’язову смужку приблизно на 30 %, тобто нижче рівня умовного нуля. Згідно з результатами дослідів на ізольованих поодиноких ГМК, 1 мкМ ніфедипіну майже повністю пригнічував потенціалзалежний Са2+-струм, а додавання НГ не викликало подальшого зменшення цього струму. Таким чином, можна зробити висновок, що розслаблююча дія НГ (як щодо вихідного напруження, так і щодо “гіперкалієвого” скорочення гладеньком’язових препаратів основної легеневої артерії кроля) є досить переконливим свідченням впливу NO саме на скоротливий апарат ГМК основної легеневої артерії кроля.

Оксид азоту пригнічує вивільнення іонів Са2+ з IP3-чутливих, але не з ріанодинчутливих Са2+-депо ГМК основної легеневої артерії кроля. Обмін внутрішньоклітинного Са2+ в ГМК основної легеневої артерії відіграє важливу роль в регуляції легеневого вазомоторного тонусу. Наші експерименти, проведені в нормальному розчині Кребса та в номінально безкальцієвому розчині Кребса (НБКР), показують, що “фенілефринове” скорочення щонайменше на 25 % сильніше залежить від зовнішньоклітинного Са2+, ніж “кофеїнове”. Це можна пояснити тим, що, IP3, який утворюється під час аплікації фенілефрину, впливає не лише на внутрішньоклітинні Са2+-депо, а й на рецепторкеровані катіонні канали плазматичної мембрани ГМК (Шуба, 1988; Robinson, 1998). Тести, проведені в НБКР, також показують, що за амплітудою “кофеїнове” скорочення більш ніж удвічі поступається “фенілефриновому”. Це вказує, що ємність ріанодинчутливого Са2+-депо, вірогідно, набагато менша, ніж ємність IP3-чутливого Са2+-депо. Великі концентрації кофеїну виснажують ріанодинчутливе Са2+-депо протягом 1-2 хв, викликаючи швидке скорочення малої амплітуди, а малі концентрації кофеїну викликають лише локальні збільшення концентрації Са2+ у вигляді так званих “Са2+-спалахів”, що призводять до зростання КСа-струму, гіперполяризації та, відповідно, зменшення вихідного тонусу гладеньком’язової смужки (Nelson, 1995; Bae, 1999). Імовірно, цим і пояснюється розслаблення гладеньком’язових смужок нижче рівня вихідного тонусу після швидкого скорочення, що виникає при аплікації кофеїну. Крім того, кофеїн може викликати розслаблення шляхом інгібування активності ферменту cAMP-залежної фосфодіестерази. Таким чином, він сприяє накопиченню cAMP, який активує РКА, що фосфорилює КЛЛМ і завдяки цьому переводить її в неактивний стан, що, знову ж таки, викликає розслаблення (Adelstein 1978). Іншою можливістю є те, що cAMP безпосередньо впливає на взаємодію актину з міозином.

Дослідження дії NO показали, що в нормальному розчині Кребса та в НБКР НГ зменшував тонічний компонент “фенілефринового” скорочення приблизно на 40 % в кожному з розчинів. Це свідчить про те, що NO впливає на вивільнення Са2+ з IP3-чутливого компоненту Са2+-депо. Разом з цим, НГ пригнічував “кофеїнове” скорочення в нормальному розчині Кребса менше, ніж на 4 %, а в НБКР – приблизно на 2 %. Це значить, що NO істотно не впливає на кофеїніндуковане вивільнення Са2+ з СР в ГМК основної легеневої артерії кроля, а незначне принічення скорочення, очевидно, зумовлене впливом на скоротливий апарат ГМК.

Особливості калієвого струму в гладеньком’язових клітинах основної легеневої артерії кроля та вплив на нього оксиду азоту. При порівнянні даних, отриманих на багатоклітинних смужках і на ізольованих поодиноких ГМК основної легеневої артерії кроля, випливають певні розбіжності. Останнє, скоріше за все, зумовлене тим, що електрофізіологічні властивості ГМК у багатоклітинних препаратах помітно відрізняються від властивостей ізольованих поодиноких ГМК. З дослідів на ізольованих ГМК відомо, що чутливі до 4-АР КV-канали активуються при потенціалах, позитивніших за –45 мВ (Archer, 1996). Ці канали відіграють головну роль у формуванні трансмембранного вихідного струму у збудливих тканинах (Yuan, 1995; Smirnov, 1994; Michelakis, 2001; Murakoshi, 1999). КСа-канали великої провідності активуються при потенціалах, позитивніших за –30 мВ (Archer, 1996); крім того, активність КСа-каналів в значній мірі модулюється внутрішньоклітинною концентрацією іонів Са2+ (Bae, 1999). МПС в ГМК основної легеневої артерії кроля знаходиться в межах –50 – –60 мВ (Гурковская, 1977; Casteels, 1977), що набагато нижче порога активації як КСа-, так і КV-каналів.

В наших дослідах, проведених на гладеньком’язових смужках основної легеневої артерії кроля з використанням методу “сахарозний місток”, аплікація блокаторів калієвих каналів ТЕА і 4-АР викликала деполяризацію мембрани ГМК, генерацію ПД і скорочення. Це свідчить про те, що в формуванні МПС ГМК основної легеневої артерії кроля беруть участь як КV-, так і КСа-канали, тобто вони є активними при рівні мембранного потенціалу порядку –50 мВ. Оскільки калієві канали обох цих типів є потенціалзалежними, блокування каналів одного типу призводить до деполяризації мембрани ГМК і, як наслідок, до активації незаблокованих калієвих каналів іншого типу. Це перешкоджає подальшому розвитку деполяризації. Ефекти ТЕА були істотнішими, ніж ефекти 4-АР; так, деполяризація, викликана 5 мМ ТЕА, перевищувала деполяризацію, що розвивалась під час аплікації 5 мМ 4-АР, майже на 10 %, а різниця у величині скорочення складала майже 20 %. Такі дані вказують на те, що активність КСа-каналів мембрани ГМК основної легеневої артерії кроля у стані, що приблизно відповідає МПС ГМК препарату, є більшою, ніж активність КV-каналів.

Наші дослідження трансмембранного іонного струму через поодинокі ізольовані ГМК основної легеневої артерії кроля за допомогою методу фіксації потенціалу (“patch-clamp”) у конфігурації “whole cell” показали, що при потенціалах –50 – –60 мВ вихідного струму не спостерігалось. Вплив ТЕА та 4-АР (взятих в концентраціях по 5 мМ) на вихідний трансмембранний струм спостерігався при потенціалах, позитивніших за –40 мВ. Ефекти блокаторів на вихідний трансмембранний струм значно відрізнялись: ТЕА в концентрації 5 мМ потенціалзалежно пригнічував струм більше, ніж удвічі та усував флуктуації по типу “STOCs”. В той же час 4-АР при потенціалах, позитивніших за +50 мВ, не тільки не пригнічував, а навіть збільшував амплітуду струму і посилював флуктуації струму. Таким чином, блокування КV-каналів стимулює активність КСа-каналів. Той факт, що ТЕА ефективніше, ніж 4-АР, пригнічує вихідний трансмембранний струм, говорить про те, що густина КСа-струму через мембрани ГМК основної легеневої артерії кроля більше, ніж густина КV-струму.

При одночасній аплікації ТЕА та 4-АР на гладеньком’язові смужки основної легеневої артерії кроля виникала деполяризація, яка активувала потенціалзалежні Са2+-канали L-типу, що відбивалось у генерації ПД і розвитку тетанічного скорочення. Одночасна дія 4-АР і ТЕА, згідно з характеристиками деполяризації і скорочення, була адитивною. Ефекти ТЕА та 4-АР при додаванні одного на фоні аплікації іншого дещо відрізнялись. Так, додавання до розчину Кребса 5 мМ 4-АР на фоні дії 5 мМ ТЕА одразу ж призводило до генерації ПД, деполяризації та тетанічного скорочення смужки, в той час, як аплікація 5 мМ ТЕА на фоні дії 5 мМ 4-АР спочатку збільшувала деполяризацію до порогового рівня, після досягнення якого відбувалась генерація ПД. Такий характер відповіді свідчить про те, що ТЕА, блокуючи КСа-канали, деполяризує мембрану ГМК до рівня, близького до порога активації Са2+-каналів L-типу, які активуються при потенціалах, позитивніших ніж –30 мВ (Gordienko, 1994). Таким чином, аплікація 5 мМ ТЕА зсуває МПС (що в ГМК основної легеневої артерії складає –50 мВ) до –30 мВ, тобто на 20 мВ.

Дія ТЕА та 4-АР на вихідний трансмембранний іонний струм, як і в дослідах на багатоклітинних препаратах, мала адитивний характер, оскільки в результаті одночасної аплікації цих блокаторів струм при потенціалі +70 мВ у порівнянні з контролем зменшувався приблизно на 75 %, а також відбувався зсув порогу активації цього струму від –40 мВ до –10 мВ. На підставі цих спостережень можна дійти висновку, що основним і найбільш потужним переносником вихідного трансмембранного струму в ГМК основної легеневої артерії кроля слугують саме КСа-канали великої провідності.

У дослідах з використанням “сахарозного містку” НГ (10 мкМ) ефективно пригнічував ПД, викликані дією ТЕА та 4-АР. Це свідчить, що NO впливає на високопорогові потенціалзалежні Са2+-канали L-типу (Зима, 1994; Blatter, 1995). Рівень деполяризації при цьому зменшувався і прямував до рівня, який спостерігався при ізольваній дії ТЕА (без 4-АР). Це теж підтверджує, що головним переносником вихідного трансмембранного струму в ГМК основної легеневої артерії кроля є КСа-канали великої провідності. НГ (10 мкМ) повністю пригнічував не тільки тетанічні, а й тонічні складові скорочення, викликаного одночасною дією ТЕА та 4-АР. Цей факт є непрямим свідченням того, що NO розслаблює