НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ

УЛАНОВ МИХАЙЛО МИКОЛАЙОВИЧ

УДК 576.8; 577.15

РОЗРОБКА ТЕХНОЛОГІЇ ДЕНІТРИФІКАЦІЇ ПІДЗЕМНОЇ ВОДИ У РЕАКТОРІ З ФІКСОВАНОЮ БІОПЛІВКОЮ

03.00.20 – Біотехнологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата технічних наук

Київ – 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Національному університеті харчових технологій

Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: кандидат технічних наук, доцент,

Стабнікова Олена Всеволодівна.

Офіційні опоненти: доктор технічних наук, професор,

Циганков Сергій Петрович

Інститут харчової хімії і технології НАН України,

заступник директора з питань науки і нової техніки

доктор технічних наук,

Мітченко Тетяна Євгенівна

фірма Українські системи очищення води “ECOSOFT”,

директор

Провідна установа: Український науково-дослідний інститут спирту і біотехнології продовольчих продуктів Міністерства аграрної політики України, м. Київ

Захист відбудеться:”_24_”_вересня_2003 р. о _1600_годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.058.03 в Національному університеті харчових технологій за адресою:

01033, м. Київ-33, вул. Володимирська, 68, корпус А, аудиторія А-311.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного університету харчових технологій

за адресою: 01033, м. Київ-33, вул. Володимирська, 68.

Автореферат розісланий “_22_”_серпня_2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради, к.т.н., доцент___________________Поводзинський В.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Дисертаційна робота присвячена питанням розробки біотехнології очищення підземних вод від нітратів із застосуванням денітрифікуючих бактерій, які закріплені у вигляді біоплівки на поверхні носія.

В усьому світі і в Україні існує проблема недостачі якісної питної води. Це пов'язано із забрудненням основних джерел водопостачання внаслідок інтенсивного розвитку промисловості та сільського господарства. Тому в багатьох країнах поряд з поверхневими джерелами питної води (озера та ріки) використовують і підземні води. Погіршення екологічної обстановки веде до забруднення не тільки поверхневих, але й підземних джерел водопостачання. Підвищена концентрація сполук азоту в підземній воді – одна з найважливіших проблем сучасного господарсько-питного водопостачання. Основним джерелом сполук азоту в підземних водах є сільськогосподарські добрива, комунально-побутові і промислові забруднення.

Очистити підземну воду від нітратів можливо фізико-хімічними і біологічними методами. До фізико-хімічних методів відносять іонний обмін, електродіаліз і зворотний осмос. Разом із значною ефективністю очищення підземної води від нітратів дані методи мають певні недоліки. Для іонного обміну - це відсутність високоселективної смоли по нітратах і складність утилізації відпрацьованих регенераційних розчинів; для електродіалізу – проблема утилізації концентрату, що утворюється; для зворотнього осмосу – відсутність селективної мембрани по нітратах і демінералізація очищеної води.

Найбільш перспективним є біологічний метод денітрифікації води за допомогою бактерій. В залежності від джерела вуглецю і субстрату розрізняють гетеротрофну й автотрофну денітрифікації. Автотрофна денітрифікація характеризується низькою швидкістю, що вимагає збільшення об’єму біореактора і перебування підземної води в ньому. Тільки гетеротрофна денітрифікація позбавлена всіх перерахованих недоліків.

Тому актуальним є розроблення методу формування стійкої біоплівки на поверхні вибраного носія в технології гетеротрофної денітрифікації підземної води у реакторі з фіксованою біоплівкою.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до державних програм України, що стосуються охорони навколишньго середовища, у рамках постанови Верховної Ради України “Про концепцію розвитку водного господарства України”, №1390 – XIV, 14.01.2000 р., Державної науково-технічної програми Міністерства України у справах науки і технології “Відновлення якості природних вод України”, а також у рамках наукового напряму кафедри біотехнології мікробного синтезу Національного університету харчових технологій “Удосконалення мікробіологічних і біохімічних процесів у біотехнології та охороні навколишнього середовища”.

Автор особисто приймав участь в проведенні лабораторних та напівпромислових досліджень, обробці та аналізі отриманих результатів.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи є розробка технології біологічного очищення води підземних джерел від підвищеного вмісту нітратів з використанням іммобілізованих на поверхні носія денітрифікуючих бактерій.

У відповідності з метою визначені такі задачі досліджень:

- розробити сучасні методи аналізу для дослідження біологічних систем, заснованих на використанні мікробних біоплівок;

- вивчити за допомогою розроблених методів існуючих біоплівок з систем очищення підземної води;

- вивчити процес формування біоплівки на поверхні носія;

- розробити нові способи формування біоплівки в системі біологічної денітрифікації підземної води;

- розробити рекомендації до технології очищення підземної води методом біологічної денітрифікації у реакторі з фіксованою біоплівкою.

Об’єкт дослідження. Бактерії Paracoccus denitrificans в процесі денітрифікації підземної води з підвищеним вмістом нітратів.

Предмет дослідження. Біоплівка.

Методи досліджень. Культивування клітин мікроорганізмів; мікробіологічні методи визначення кількості колоній утворюючих одиниць (КУО); фізико-хімічні методи визначення концентрації нітратів і амонію за допомогою іонного хроматографа, концентрації біомаси (у культуральній рідині та у біоплівці) і гідрофобності поверхні на люмінесцентному спектрометрі; методи статистики.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено можливість використання розроблених методів флуоресцентного аналізу для дослідження структури та взаємодії між носієм і клітинами в мікробних біоплівках з систем біологічного очищення підземної води, що дозволяє обирати найбільш перспективний носій для формування на його поверхні біоплівки.

Розроблено спосіб формування біоплівки на збагаченому поживними речовинами середовищі, який забезпечує досягти концентрації клітин в обсязі носія 0.3 мг/см3 при товщині біоплівки 264 мкм.

Розроблено спосіб біологічної денітрифікації, що включає в себе формування біоплівки з чистої культури денітрифікуючих бактерій Paracoccus denitrificans в штучних умовах на поверхні обраного оптимального носія, що дозволяє досягти ефект очищення підземної води від нітратів 94% при терміні перебування води в біореакторі 5 годин і швидкості денітрифікації 1.7 мг NO3-N/см3 за добу, що на 20% вище, ніж у відомих технологіях гетеротрофної денітрифікації.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено спосіб очищення ґрунтової води від нітратів методом біологічної денітрифікації у реакторі з фіксованою біоплівкою (Патент України №35515 А, МПК С02F3/30, C02F3/34), застосування якого дасть можливість зменшити кількість нітратів у питній воді;

Пропозицію по застосуванню комплексної технології очищення підземної води від нітратів методом біологічної денітрифікації прийнято до використання при проектуванні очисних споруд водопостачання із збільшеним вмістом нітратів в Державному науково-дослідному і проектно-вишукувальному інституті УкрНДІВодоканалпроект (м. Київ, Україна) та в ЗАТ “Єко-Атом” (Санкт -Петербург, Росія).

Запропонована технологія очищення підземної води від нітратів методом біологічної денітрифікації у реакторі з фіксованою біоплівкою успішно пройшла дослідно-промислові випробування на базі Дослідного центру енергетики та навколишнього середовища (Кванджунський інститут науки та технології K-JIST, Республіка Корея) та на ЗАТ “Зовнішньоторговельна науково-виробнича фірма “КОЛО”” (м. Кривий Ріг, Україна).

Особистий внесок здобувача. Автором особисто проведено: розробку методів флуоресцентного аналізу для дослідження біологічних систем, заснованих на використанні мікробних біоплівок; визначення концентрації біомаси в суспензії та у біоплівці; визначення гідрофобності клітин, носія та біоплівки в цілому; аналіз мікробної асоціації в установці біологічного очищення модельної підземної води; експериментальне визначення залежності між гідрофобністю поверхні носія та процесом формування біоплівки; розробку способів швидкого формування біоплівки на основі чистої культури денітрифікуючих бактерій; постановку і проведення експериментів та обробку їх результатів; формулювання висновків та пропозицій. Спільно з науковим керівником проведено аналіз та узагальнення результатів досліджень, розробку структури дисертаційної роботи.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були викладені та обговорені на шостій Міжнародній науково-технічній конференції “Проблеми і перспективи створення і впровадження нових ресурсо- і енергозберігаючих технологій, устаткування в галузях харчової і переробної промисловості” (м. Київ, 2000р.); 66-й і 67-й наукових конференціях студентів, аспірантів та молодих вчених Українського державного університету харчових технологій 2000-2001р.

Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 7 друкованих праць, з них: 3 – публікації в фахових виданнях, затверджених ВАК України; 1 – патент України на винахід; 1 – тези доповідей на міжнародній науково-технічній конференції, 2 – тези доповідей на наукових конференціях студентів, аспірантів і молодих вчених УДУХТ.

Структура та обєм роботи. Дисертаційна робота складається зі вступу, 6 розділів, загальних висновків, списку використаних джерел, що включає 150 найменувань, з яких 140 закордонних авторів, та додатків. Робота викладена на 137 сторінках основного тексту, містить 12 таблиць та 29 рисунків.

Робота виконана на базі кафедри біотехнології мікробного синтезу Національного університету харчових технологій і кафедри охорони навколишнього середовища Кванджунського інституту науки і технології (Республіка Корея).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обгрунтовано актуальність теми дисертаційної роботи, сформульовано мету та задачі досліджень, визначено наукову новизну та практичну цінність роботи.

У першому розділі Підземна вода як джерело водопостачання обґрунтовано актуальність вибраного напрямку досліджень, розглянуто стан питання використання підземної води в якості питної; наведено основні джерела забруднень підземної води; розглянуто існуючі фізико-хімічні методи очищення підземної води від нітратів; проаналізовано дані методи з точки зору їхніх переваг і недоліків; розглянуто існуючі біотехнологічні методи очищення підземної води від нітратів; проведено аналіз автотрофної та гетеротрофної денітрифікації; наведено переваги використання гетеротрофної денітрифікації для очищення підземної води від нітратів в порівнянні з автотрофною і зазначено недостатню вивченість біологічних систем, що засновані на використанні мікробних біоплівок та процесу формування біоплівки на поверхні носія.

В другому розділі Обєкти і методи досліджень наведено характеристику мікробіологічних об'єктів та подано перелік методів, якими користувалися при виконанні роботи.

У роботі використовувалися п'ять прокаріотичних штамів бактерій з Корейської колекції типових культур (ККТК, Республіка Корея).

Культивування мікроорганізмів проводили на середовищі, що містить дріжджовий екстракт, триптон, глюкозу і деіонізовану воду. Денітрифікуючі бактерії вирощували на спеціальному синтетичному середовищі, що містить як джерело вуглецю гліцерин. Вирощування мікробних популяцій проводили при температурі – 282С в колбах на качалці (150 об/хв).

Для визначення концентрації біомаси (у культуральній рідині та у біоплівці) і гідрофобності поверхні використовували синхронне флуоресцентне сканування на люмінесцентному спектрометрі LS50B (Perkin Elmer, UK). Концентрацію біомаси в культуральній рідині визначали додаванням 0.1 % розчину пропідіуму йодиду, 0.1 % Hoechst № 33258 або одночасного додавання обох цих хроматорів. Концентрацію біомаси в біоплівці визначали додаванням 0.1 % розчину акридинового жовтогарячого. Про ступінь гідрофобності судили по адсорбції фенантрена на поверхні клітин, носія і біоплівок.

Підрахунок кількості колоній утворюючих одиниць (КУО), що виросли на носії та у культуральній рідині, проводили шляхом висіву 0.1 мл аналізованого зразка із розведення від 101 до 105 на тверді поживні середовища в чашках Петрі. Товщину біоплівки встановлювали за допомогою мікрознімків, виконаних на мікроскопі Microphot-SA. Біоплівку фарбували 25 відсотковим барвником сафранін.

Процес формування спонтанної біоплівки денітрифікуючих бактерій на поверхні носія проводили таким чином: вирощували денітрифікуючі бактерії Paracoccus denitrificans протягом 2 діб на мінеральному середовищі; потім стерильний носій інкубували спільно з отриманою культуральною рідиною протягом 12 годин при температурі 282С на качалці – термостаті (100 об/хв); відмивали носій від залишків культуральної рідини в стерильній деіонізованій воді і розміщували з іммобілізованими клітинами у свіже поживне середовище для спільного інкубування протягом 7 діб.

Формування біоплівки із препарату іммобілізованих клітин у грузлому розчині альгинату натрію проводили таким чином: зважені зразки носія розміщували в 1 % чи 4 % розчині альгинату натрію з іммобілізованими клітинами і ретельно перемішували, надлишок грузлого розчину видаляли, носій з шаром альгинатного розчину інкубували в 2% розчині CaCl2 для гелеутворення.

Біологічне очищення модельної стічної води, яка забруднена амонієм і нітратом, здійснювали на установці, що складалась з одного анаеробного денітрифікуючого і двох аеробних нітрифікуючих біореакторів. Концентрацію нітратів і амонію в очищеній воді визначали за допомогою іонного хроматографа DX-120 ( Dionex Corp. CA, USA ).

У третьому розділі Розробка флуоресцентних методів аналізу біологічних систем очищення підземної води заснованих на використанні біоплівок приведені результати дослідження біологічних систем очищення підземної води на основі розроблених флуоресцентних методах аналізу. Нові методи дозволяють визначати концентрацію мікробної біомаси в суспензії і біоплівці, а також гідрофобність поверхні в системах біологічного очищення підземної води.

Показано, що концентрацію мікробної біомаси в суспензії можливо визначати по кількості ДНК в клітинах. Для кількісного визначення ДНК клітин використовували барвники Hoecht № 33258 і пропідіум йодид. Фарбування ДНК флуоресцентними барвниками проводили тільки у фіксованих клітинах з порушеною цілісністю клітинної стінки, що забезпечує вільне проникнення барвника в клітини.

В результаті експериментів встановили, що флуоресценція біомаси, яка пофарбована Hoechst № 33258, давала широкий пік, починаючи від 402 нм, на відміну від біомаси, пофарбованої пропідіумом йодидом, пік флуоресценції якої був значно меншим: максимум емісії спостерігався при 568 нм. Як точний метод визначення біомаси в суспензії було обрано метод з пропідіумом йодидом, тому що пік флуоресценції більш вузький, що полегшує і спрощує визначення концентрації біомаси (рис. 1).

Рис.1. Залежність між концентрацією біомаси бактеріальних штамів та флуоресцентною емісією: а - Hoechst №33258, б - пропідіума йодиду, зв’язаного з ДНК біомаси ( = 402 нм та = 568 нм, відповідно).

Показано, що концентрацію біомаси в біоплівці можливо визначити тільки по зменшенню кількості барвника з його розчину після контакту з мікробною біоплівкою. Як флуоресцентний барвник використовували акридиновий жовтогарячий, який зв'язується з ДНК і РНК клітин.

В результаті експериментів встановили, що для акридинового жовтогарячого характерний один пік максимум емісії при 500 нм. Кількість акридинового жовтогарячого, який зв'язується з РНК, становить близько 50% його загальної кількості, зв'язаної з біомасою.

Таким чином, флуоресцентну спектрометрію можливо використовувати для експресного визначення концентрації суспендованої бактеріальної біомаси, яка пофарбована пропідіумом йодидом, або біомаси біоплівки по зв'язуванню акридинового жовтогарячого мікробними клітинами.

Показано, що гідрофобність поверхні можливо визначити по адсорбції фенантрена на поверхні клітин. Вибір фенантрена як маркера гідрофобності обґрунтований простотою його флуоресцентного визначення, а також тим, що його молекула - тверда, має плоску структуру, її гідрофобна взаємодія з поверхнею клітин мало залежить від умов середовища.

В результаті експериментів встановили, що для розчину фенантрена характерні два максимуми емісії при 324 і 334 нм. У визначеннях використовували пік 324 нм. Висота піка флуоресцентної емісії лінійно залежить від концентрації фенантрена (рис.2).

Рис. 2. Залежність кореляція між концентрацією фенантрена та флуоресцентною емісією.

Як контрольний метод виміру гідрофобності клітинної поверхні використовували метод Розенберга по зменшенню концентрації клітин у суспензії після змішування її з гексадеканом.

При розробці флуоресцентного методу визначення гідрофобності досліджували вплив терміну інкубації клітин і рН мікробної суспензії на зв'язування фенантрена поверхнею клітин, а також наявності розходження зв'язування фенантрена живими і фіксованими клітинами мікробної суспензії.

Встановлено, що термін інкубації від 15 до 60 хвилин не впливає на сорбцію фенантрена поверхнею клітин Micrococcus luteus. Так, середнє значеннястандартне відхилення для флуоресцентної емісії були в межах 27.90.4 у контролі і 24.80.7 в експерименті при інкубації 15, 30, 45 і 60 хвилин при коефіцієнті варіювання сорбції фенантрена на поверхні клітин не більш 3%. Показано, що адсорбція фенантрена на поверхні живих і фіксованих клітин однакова і для Micrococcus luteus адсорбція фенантрена складала 6.8 мкг/мг сирої біомаси для живих і фіксованих клітин. Зміна рН мікробної суспензії не впливає на адсорбцію фенантрена на поверхні клітин, наприклад при значенні рН мікробної суспензії 9.0, 6.8, і 4.5 для Saccharomyces cerevisiae адсорбція фенантрена складала 0.5, 0.7 і 0.5 мкг/мг сирої біомаси, відповідно.

Показано, що розроблений новий метод виміру гідрофобності поверхні має ряд переваг у порівнянні з гексадекановим тестом: адсорбція фенантрена не залежить від рН мікробної суспензії і фіксації клітин (табл.1). Запропонований метод адсорбції фенантрена на поверхні можна використовувати для виміру гідрофобності клітин, носія і біоплівки в цілому.

Таблиця 1

Порівняння адсорбції фенантрена на поверхні клітин з гексадекановим тестом

Зразок для аналізу | Гідрофобність, яка визначалась як

Адсорбція фенантрена, мкг/мг біомаси клітин | Відсоток клітин, які перейшли з води до гексадекану

Paracoccus denitrificans,

нефіксовані клітини | 10.3 | 6.6

Paracoccus denitrificans,

фіксовані клітини | 11.1 | 3.6

Micrococcus luteus,

нефіксовані клітини | 5.8 | 25.0

Micrococcus luteus,

фіксовані клітини | 5.8 | 15.8

Saccharomyces cerevisiae,

нефіксовані клітини | 6.8 | 25.0

Saccharomyces cerevisiae,

фіксовані клітини | 6.8 | 21.4

Paracoccus denitrificans,

2 доби культивування | 3.3 | 6.2

Paracoccus denitrificans,

3 доби культивування | 7.2 | 10.7

Micrococcus luteus,

2 доби культивування | 2.7 | 7.2

Micrococcus luteus,

3 доби культивування | 3.8 | 17.6

Saccharomyces cerevisiae,

рН 9.0 | 0.5 | 16.1

Saccharomyces cerevisiae,

рН 6.8 | 0.7 | 4.5

Saccharomyces cerevisiae,

рН 4.5 | 0.5 | 0

Примітка: коефіцієнт варіабельності для одного виміру складає 10%.

У четвертому розділі Дослідження біоплівки стаціонарної пілотної установки з біологічного очищення модельної підземної води описана робота лабораторної установки за допомогою розроблених флуоресцентних методів аналізу біологічних систем.

Біологічне очищення модельної підземної води, яка забруднена амонієм і нітратом, здійснювали на лабораторній установці, що складається з одного анаеробного денітрифікуючого і двох аеробних нітрифікуючих біореакторів .

В зразках нітрифікуючої і денітрифікуючої біоплівки, яка була взята з реакторів, визначали гідрофобність розробленим флуоресцентним методом аналізу (табл.2).

Таблиця 2

Гідрофобність біоплівки та її компонентів

Зразок для аналізу,

біоплівка | Гідрофобність, мкг фенантрена / мг сирого матеріалу

Інтактна біоплівка | Матеріал носія | Біомаса

Денітрифікуюча |

1.17 0.56 | 0.51 0.18 | 3.16 0.74

Нітрифікуюча |

0.13 0.04 | 0.29 0.12 | 5.38 1.11

Показано, що гідрофобність інтактной біоплівки і поверхні клітин вище, ніж гідрофобність поверхні носія.

Для характеристики гідрофобної взаємодії всередині біоплівки були використані два індекси: індекс Iс/f, показує рівень гідрофобної взаємодії між клітинами і волокном носія; індекс Ic/e, що показує рівень гідрофобної взаємодії між клітинами і навколишнім середовищем (табл. 3).

Таблиця 3

Характеристика гідрофобної взаємодії в середині біоплівки

Зразок для аналізу, біоплівка | Індекси, які характеризують біоплівку

Ic/f | Ic/e

Денітрифікуюча

| 2.5 | 0.94

Нітрифікуюча

| 1.7 | 0.23

Індекс Iс/f, показує число клітинних моношарів на поверхні носія, що для денітрифікуючої і нітрифікуючої біоплівки дорівнює 1.7 і 2.5, відповідно. Тобто, умовна глибина для обох біоплівок складає приблизно два шари мікробних клітин. Інший індекс, Iс/е, показує частину гідрофобних місць на поверхні клітини, які відкриті для гідрофобної взаємодії з навколишнім середовищем. Цей індекс дорівнює 0.23 для нітрифікуючої біоплівки, тому що біоплівка покрита слизом, який захищає клітини від гідрофобної взаємодії. Денітрифікуюча біоплівка має високий індекс Iс/е (0.94). Це вказує на те, що гідрофільний матеріал не екранує гідрофобні ділянки поверхні клітин і вони можуть брати участь у взаємодії між клітинами і гідрофобними субстратами навколишнього середовища. Запропоновані індекси гідрофобної взаємодії в середині біоплівки можуть бути використані для характеристики біоплівки і взаємодії між носієм і клітинами. Індекси можуть бути використані при виборі носія для біоплівки і для контролю її фізико-хімічного стану.

Концентрацію біомаси в біоплівці визначали по інтенсивності зв'язування акридинового жовтогарячого. Встановлено, що біомаса в біоплівці нітрифікуючого реактора складає 23±1 мг сухої біомаси/г носія (контрольний ваговий метод) і 26±3 (флуоресцентний метод). Біомаса в біоплівці денітрифікуючого реактора складає 21±2 мг сухої біомаси/г носія (контрольний ваговий метод) і 21±4 (флуоресцентний метод) мг сухої біомаси/г носія, тобто значення біомаси, яка визначена по зв'язуванню з акридиновим жовтогарячим, відповідають дійсному значенню. Відсоток сирої біомаси в масі біоплівки складає 49% і 15% для денітрифікуючої і нітрифікуючої біоплівок відповідно. Низький вміст сирої біомаси в нітрифікуючій біоплівці обумовлений високим вмістом слизу (екзополісахаридів).

Показано можливість використання розроблених флуоресцентних методів аналізу для опису існуючих біотехнологічних систем, заснованих на роботі мікроорганізмів у біоплівках. При використанні даного методу можна одержати швидку і чітку характеристику досліджуваної біологічної системи, що дає можливість керувати процесами, які протікають у денітрифікуючій біоплівці.

В результаті мікробіологічного аналізу, мікробної асоціації в установці біологічного очищення модельної підземної води, встановлено, що в досліджуваній біоплівці присутня різноманітна мікрофлора. Ця мікрофлора значно підвищує ризик накопичення і потенційно небезпечних бактерій, які спонтанно розвиваються, чи їхніх метаболітів у біоплівці, а також постійного чи випадкового потрапляння неідентифікованих мікроорганізмів у систему водопостачання. Згідно з отриманими даними, запропоновано для зменшення цього ризику використовувати чисту культуру мікроорганізмів для формування біоплівки. Надалі в роботі використовували чисту культуру денітрифікуючих бактерій Paracoccus denitrificans.

У п'ятому розділі Розробка способу біологічної денітрифікації підземної води показана ефективність використання чистої культури денітрифікуючих бактерій Paracoccus denitrificans у технології гетеротрофної денітрифікації підземної води. Вибір бактерій Paracoccus denitrificans ґрунтується на тому, що вони здатні здійснювати автотрофну і гетеротрофну денітрифікації, є факультативними автотрофами, які здатні до активної анаеробної і аеробної денітрифікації і спільній гетеротрофній нітрифікації-денітрифікації. Дані бактерії не є патогенними для людей і тварин, не виділяють шкідливі метаболіти в навколишнє середовище і широко використовуються в процесах денітрифікації підземної води.

Для процесу іммобілізації клітин денітрифікуючих бактерій досліджували чотири зразки носіїв з розвинутою поверхнею контакту, які найбільш часто використовуються в процесах біологічного очищення води (табл.4). Носії, які були використані для бактеріальної колонізації, попередньо стерилізували протягом 15 хвилин при 121C.

Таблиця 4

Фізичні властивості носіїв

Показник | Носій“

волокно”“ | мережа”“ | пластини”“ | кубики”

Щільність носія,

г/см3 | 0.022 | 0.200 | 0.150 | 0.018

Питома поверхня,

см2/г носія | 1034 | 41 | 10 | 1100

Питома поверхня,

см2/ см3 носія | 23.3 | 8.1 | 1.4 | 20.3

Досліджували залежність між адсорбцією клітин і гідрофобністю поверхні носія. В результаті експериментів встановили, що гідрофобність поверхні носіїв складає 74, 56, 18 і 46 мкг фенантрена /см3 для “мережі”, “волокна”, “пластин” і “кубиків”, відповідно. В процесі природного формування біоплівки протягом 20 діб на середовищі, яке моделює склад підземної води, відзначена лінійна кореляція між адсорбцією клітин P. denitrificans і гідрофобністю поверхні носіїв (коефіцієнт кореляції 0.99) (рис.3.а). При цьому кількість клітин, які виросли на поверхні носія експоненціально залежить від гідрофобності (рис.3.б). Але сформована біоплівка на середовищі, яке було використано в експерименті, має незначну товщину і поверхнева щільність колонізованих клітин складає 3.5, 3.5, 1.4 і 1.2106 КУО/см3для носіїв “мережа”, “волокно”, “пластини” і “кубики”, відповідно.

Рис. 3. Адсорбційна ємність носія (а) і біомаса біоплівки на носії (б) в залежності від гідрофобності поверхні.

Якість сформованої біоплівки визначаємо по відношенню концентрації клітин в об'ємі носія і в модельному середовищі, яке розглянуто як міра прикріпленості клітин під час росту. Цей показник складає 0.26, 0.15, 0.93 і 0.04 для носіїв “мережа”, “волокно”, “пластини” і “кубики”, відповідно. “Мережа” і “волокно” характеризується високою гідрофобністю поверхні, адсорбційною ємністю клітин в об'ємі носія і швидкістю денітрифікації (табл.5). Тому ці носії є найбільш ефективними для адсорбції і формування біоплівки клітинами P. denitrificans і були обрані для подальших досліджень.

В залежності від ступеня гідрофобності поверхні носія виявлено два типи формування біоплівки. Перший тип специфічний для носіїв з низькою гідрофобністю. У цьому випадку відзначено формування біоплівки протягом 10 діб, а потім клітини денітрифікуючих бактерій починали лізірувати як на поверхні носія, так і в середовищі. (рис.4.а). Другий тип характеризувався тим, що концентрація клітин постійно збільшувалася як на поверхні гідрофобного носія, так і в навколишнім середовищі (рис.4.б). Найкращий приріст біомаси в об'ємі носія і найбільша швидкість денітрифікації спостерігалася для біоплівки, яка сформована на носії “мережа” (табл.5).

Таблиця 5

Гідрофобність поверхні носія, адсорбція та активність клітин P. denitrificans на поверхні носіїв

Показник | Носій“

волокно”“ | мережа”“ | пластини”“ | кубики”

Гідрофобність носія,

мкг фенантрену/см3 | 565 | 745 | 182 | 465

Адсорбційна ємність,

мкг біомаси/см3 | 614 | 11912 | 293 | 243

Кількість клітин в об’ємі носія, 106 КУО /см3 | 3.51.2 | 3.50.8 | 1.40.6 | 1.20.6

Концентрація клітин в модельному середовищі,

106 КУО /см3 | 24.04.3 | 13.33.3 | 1.50.4 | 28.04.8

Швидкість денітрифікації,

мг NO3- -N/см3 за добу | 0.060.01 | 0.060.01 | 0.030.01 | 0.030.01

Примітка: швидкість денітрифікації визначали як середнє за 20 діб очищення модельного середовища при 28С; кількість клітин визначали на 20 добу культивування; експериментальне значення помилка середньоарифметична.

Рис. 4. Ріст бактерій на поверхні носіїв і в культуральній рідині: а - носій “волокно”; б - носій “мережа”. 1 - кількість клітин в об'ємі носія; 2 - концентрація клітин у культуральній рідині.

Для підвищення концентрації біомаси на поверхні носія запропоновано прискорене формування біоплівки. Як показали результати експериментів прискореного формування біоплівки на збагаченому поживними речовинами середовищі, щільність колонізації клітин складає 14.23.2107 КУО/см3 для носія “мережа” і 3.81.2107 КУО/см3 для “волокна”. Щільність клітин у біоплівці, яка сформована на збагаченому поживними речовинами середовищі, значно вища, ніж на середовищі з низькою концентрацією поживних речовин. Так, наприклад, кінцева концентрація клітин в біоплівці, яка сформована на поверхні носія “мережа”, у збагаченому поживними речовинами середовищі за 7 діб у 41 раз більша, ніж у біоплівці, яка сформована за 20 діб на середовищі з низькою концентрацією поживних речовин. При цьому товщина бактеріальної біоплівки складає 264 мкм, а середня швидкість денітрифікації в 20 раз вища, ніж швидкість денітрифікації біоплівки, яка сформована на середовищі з низькою концентрацією поживних речовин. По ступені закріпленості клітин на поверхні, найбільш перспективним є носій “мережа”, для якого міра прикріпленості складає 1.29, у той час як для “волокна” тільки 0.05 (табл.6).

Таблиця 6

Колонізація клітин P. denitrificans на поверхні носія та активність біоплівки сформованій на середовищі збагаченому поживними речовинами

Показник | Носій“

волокно”“ | мережа”

Кількість клітин в об'ємі носія,

107 КУО /см3 | 3.81.2 | 14.23.2

Концентрація клітин у модельному середовищі,

107 КУО/см3 | 76.514.7 | 11.01.4

Швидкість денітрифікації,

мг NO3- -N/см3 за добу | 0.310.03 | 1.20.04

Ефективність очищення,

% | 340.9 | 942.5

Примітка: швидкість денітрифікації визначали як середню за 7 діб очищення модельного середовища при 28С; кількість клітин - на 7 добу культивування; експериментальне значення помилка середньоарифметична.

Запропонований метод одержання біоплівки денітрифікуючих бактерій P. denitrificans на поверхні носія має ряд переваг: по-перше, досягається швидке формування біоплівки; по-друге, отримана таким чином біоплівка характеризується підвищеною концентрацією клітин на поверхні носія, а отже, і більшою товщиною. Це сприяє підвищенню швидкості денітрифікації ґрунтової води, яка забруднена нітратами.

Іншим способом швидкого формування могутньої біоплівки денітрифікуючих бактерій може бути іммобілізація клітин у гелі альгинату натрію, який прикріплений до поверхні носія. Досліджено можливість іммобілізації клітин P. denitrificans у гелі альгинату натрію, який закріплений на поверхні носія “мережа”. Як показали результати експериментів, швидкість денітрифікації такої біоплівки при 20С однакова зі швидкістю денітрифікації біоплівки, яка сформована на збагаченому поживними речовинами середовищі і складає 1.7 мг NO3 – N /см3 за добу (рис.5.а). Але для остаточного вибору методу формування біоплівки досліджували можливість вилучення з неї клітин у воду, яка очищується. Цей показник має велике значення для якості питної води і тому він строго регламентується. Встановлено, що концентрація клітин P. denitrificans в очищеній модельній воді в 3 рази менша при використанні біоплівки, яка сформована на збагаченому поживними речовинами середовищі, ніж при використанні біоплівки іммобілізованих клітин в гелі альгинату натрію, який закріплений на поверхні носія (рис.5.б). Тобто такий спосіб іммобілізації клітин P. denitrificans не запобігає вимиванню і наступному росту бактерій у воді, яка очищується.

Рис.5. Вплив температури на концентрацію клітин у модельному середовищі, яке очищується, (а) і на швидкість денітрифікації (б): 1 – “мережа” з біоплівкою, яка отримана шляхом іммобілізації клітин P. denitrificans у гелі альгинату натрію, який прикріплений до поверхні носія; 2 – “мережа” з біоплівкою, яка сформована на збагаченому поживними речовинами середовищі. Швидкість денітрифікації визначали як середнє за 4 доби очищення модельного середовища при різних значеннях температури; кількість клітин визначали на 4 добу культивування.

Очищення модельної підземної води проводили на стаціонарній пілотній установці з біологічного очищення води. Установка складається з поживного резервуара, який містить мішалку, анаеробного біореактора, який заповнений носієм з адгезованими клітинами денітрифікуючих бактерій, ємності прийому очищеної води і перистальтичного насосу (рис.6).

Як носій використовували обраний раніше по показниках гідрофобності та адсорбційної ємності і мірі прикріпленості клітин до поверхні носія, носій “мережа”. На поверхні носія формували біоплівку з чистої культури денітрифікуючих бактерій P. denitrificans в штучних умовах за запропонованою методикою прискореного формування біоплівки на збагаченому поживними речовинами середовищі. Процес проводили протягом 7 діб в асептичних умовах, кінцева концентрація клітин в об'ємі носія складала 0.3 мг/см3. Носій з біоплівкою розміщували в послідовно розташовані відсіки біореактора, які розділені між собою перетинками, коефіцієнт заповнення біореактора носієм складав 0.55.

Рис. 6. Схема стаціонарної пілотної установки з біологічного очищення води. 1 – поживний резервуар; 2 - мішалка; 3 – перистальтичний насос; 4 – анаеробний біореактор; 5 – носій з адгезованими клітинами денітрифікуючих бактерій; 6 – резервуар очищеної води.

У поживному резервуарі в підземну воду додавали гліцерин (125мг/дм3), як джерело вуглецю для нітрифікуючих бактерій, і фосфати (1.5 мг/дм3). Концентрація нітратів у підземній воді складала 150 мгNO3-/дм3.

Процес очищення підземної води проводили безперервним методом при температурі 20С, (температура, при якій спостерігалася максимальна швидкість денітрифікації). Залежність між ефективністю очищення і часом перебування підземної води в біореакторі показано в табл. 7.

Таблиця 7

Залежність між ефективністю очищення та часом перебування підземної води у біореакторі

Час перебування під-

земної води у біореакто-

рі, год | Концентрація нітратів у воді,

мгNO3-/дм3 | Ефективність очищення, %

Початкова | Кінцева

7 | 15011.2 | 8.90.6 | 942.4

5 | 15011.2 | 9.30.7 | 943.0

3 | 15011.2 | 48.53.4 | 681.9

1.5 | 15011.2 | 97.55.6 | 350.9

0.5 | 15011.2 | 139.58.9 | 70.2

Експериментальні дані, які отримані на стаціонарній пілотній установці по очищенню підземної води, показали, що максимальне вилучення нітратів з води, ефект очищення 94%, спостерігається при швидкості протоку 0.00225 м3/год, що відповідає 5 годинам перебування води в біореакторі. При даному режимі протікання процесу біологічної денітрифікації у біореакторі, швидкість денітрифікації складає 1.7 мг NO3-N/см3 за добу, що підтверджують дані, які отримані раніше. Цей показник на 20% вище в порівнянні з іншими відомими технологіями гетеротрофної денітрифікації підземних вод.

Подальше збільшення часу перебування води в біореакторі недоцільне, тому що не спостерігається підвищення ефективності очищення. Таким чином, оптимальний варіант біологічної денітрифікації питної води за допомогою клітин чистої культури P. denitrificans включає попереднє формування біоплівки на поверхні носія “мережа” у збагаченому поживними речовинами середовищі.

У шостому розділі Розробка апаратурно-технологічної схеми денітрифікації підземної води у реакторі з фіксованою біоплівкою розроблено апаратурно-технологічну схему очищення підземної води від нітратів методом біологічної денітрифікації. Обробка підземної води відбувається за наступною схемою (рис.7).

Воду із свердловини подають у збірник (З1), звідкіля вона насосом (ВН1) перекачується до змішувача. У змішувачі (ЗМ1) вносять гліцерин в якості джерела вуглецю для денітрифікуючих бактерій, з розрахунку 40 мг/л і фосфати в кількості 1.5 мг/л. Підготовлену воду насосом (ВН2) подають у біореактори (БР1,БР2) із закріпленим носієм. Носій містить біоплівку з іммобілізованими клітинами денітрифікуючих бактерій. Процес денітрифікації проходить при температурі 20С. Далі очищена підземна вода від нітратів із збірника (З2) подається насосом (ВН3) на стадію коагуляції, яка включає в себе гідравлічний змішувач (ЗМ2) та коагулятор (К1). У гідравлічному змішувачі вона змішується з коагулянтом Al2(SO4)3. Вода з коагулянтом подається у коагулятор, якій складається з камери пластівців утворення і відстійника, де відбувається адсорбція на колоїдних частках диспергірованних, колоїдних і зважених часток з води, які далі потрапляють у відстійник де вони затримуються. Швидкість руху води у відстійнику складає 0.3 м3/год. Далі очищена вода подається до збірника (З3) відкута насосом (ВН4) направляється на стадію очищення від залишкових зважених часток. Стадія очищення складається з швидкого піщаного фільтру (Ф1). Швидкість фільтрування складає 10 м3/год. Далі воду направляють на стадію дезінфекції, яка включає в себе озонатор (О1), де додають до води озон у кількості 2мг/л, після камери де озонування (Д1) вміст залишкового озону в очищеній воді не перевищує 0.1 мг/л. Оброблена за такою схемою підземна вода надходить у збірник (З4) чистої питної води.

ВИСНОВКИ

1. Розроблені методи флуоресцентного аналізу для дослідження біологічних систем, заснованих на використанні мікробних біоплівок, дозволяють визначити концентрацію біомаси в суспензії і в біоплівці та визначити гідрофобність поверхні клітин або носія.

2. Запропоновані індекси Iс/f і Iс/е для характеристики структури біоплівки і гідрофобної взаємодії з навколишнім середовищем. Дослідження біоплівки стаціонарної пілотної установки з біологічного очищення підземної води показали, що ці індекси були рівні для денітрифікуючої біоплівки 1.7 і 0.94, і для нітрифікуючої – 2.5 і 0.23, відповідно.

3. Обраний носій “мережа”, який вибирали по показниках: гідрофобності; адсорбційної ємності і міри прикріпленості клітин до поверхні носія є найбільш перспективним для формування біоплівки серед досліджених зразків носіїв (він характеризується наступними показниками: гідрофобністю – 745 мкг біомаси/см3; адсорбційною ємністю – 11912 мкг біомаси/см3 і мірою прикріпленості – 1.29).

4. Запропонований спосіб формування могутньої біоплівки на збагаченому поживними речовинами середовищі дозволяє досягти концентрації клітин в обсязі носія 0.3 мг/см3 при товщині біоплівки 264 мкм.

5. Розроблений спосіб біологічної денітрифікації, що включає в себе формування біоплівки з чистої культури денітрифікуючих бактерій Paracoccus denitrificans в штучних умовах на поверхні обраного оптимального носія “мережа”, що дозволяє досягти ефект очищення підземної води від нітратів 94% при терміні перебування води в біореакторі 5 годин і швидкості денітрифікації 1.7 мг NO3-N/см3 за добу, що на 20% вище, ніж у відомих технологіях гетеротрофної денітрифікації.

6. Розроблено технологічну та апаратурно-технологічну схеми очищення підземної води від нітратів методом біологічної денітрифікації у реакторі з фіксованою біоплівкою. Запропонована технологія очищення підземної води від нітратів методом біологічної денітрифікації успішно пройшла дослідно-промислові випробування на базі Дослідного центру енергетики та навколишнього середовища (Кванджунський інститут науки та технології K-JIST, Республіка Корея) та на ЗАТ “Зовнішньоторговельна науково-виробнича фірма “КОЛО”” (м. Кривий Ріг, Україна).

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Стабнікова О.В., Уланов М.М., Стабніков В.П. Визначення мікробної біомаси методом флуоресцентної синхронної спектрометрії // Наукові праці УДУХТ. - 2001. - №9. - С.45-47.

Особистий внесок – планування та виконання експериментів, участь у обробці та узагальненні результатів, підготовка матеріалу до публікації.

2. Иванов В.Н., Уланов М.Н., Стабникова Е.В. Денитрификация питьевой воды клетками Paracoccus denitrificans в природной и искусственно сформированной биопленках // Химия и технология воды. - 2001. - №2. - С.209-218.

Особистий внесок – планування експерименту, проведення експериментальних досліджень, участь у обробці та узагальненні результатів, формулювання основних висновків, підготовка матеріалу до публікації.

3. Стабнікова О.В., Уланов М.М., Іванов В.М. Вивчення нітрифікуючої та денітрифікуючої мікробної біоплівки в системі біологічної очистки води методами флуоресцентного аналізу // Науковий вісник Національного аграрного університету. - 2001. - №34. - С.279-284.

Особистий внесок – виконання експериментів і отримання експериментальних даних, участь у обговоренні й узагальненні результатів, підготовка до опублікування.

4. Спосіб очищення ґрунтової води від нітратів: Пат. №2000021166 Україна, МПК С02F3/30, C02F3/34 / В. М. Іванов, М. М. Уланов, О. В. Стабнікова, В. П. Стабніков - №35515 А; Заявл. 28.02.2000; Опубл. 15.03.2001, Бюл. №2.

Особистий внесок – проведення патентного пощуку, планування та участь у проведенні експериментів, оцінка і узагальнення результатів дослідів, підготовка матеріалів та написання заявки на патент України.

5. Уланов М.М., Стабнікова О.В., Іванов В.М. Новий метод визначення гідрофобності клітин у біоплівці // Тези доповідей шостої Міжнародної науково-технічної конференції “Проблеми та перспективи створення і впровадження нових ресурсо- та енергоощадних технологій, обладнання в галузях харчової і переробної промисловості”, К.: УДУХТ, 2000.- С.81.

Особистий внесок – участь в разробці нового методу, проведення експериментальних досліджень, участь у обробці та узагальненні результатів, підготовка матеріалу до публікації.

6. Стабнікова О.В., Уланов М.М. Очищення ґрунтової води від нітратів іммобілізованими клітинами Paracoccus denitrificans // Тези доповідей 66-ої студентської наукової конференції УДУХТ, 2000.- С.32.

Особистий внесок – проведення експериментів, участь у обговоренні й узагальненні результатів, підготовка матеріалу до опубліковання.

7. Стабнікова О.В., Уланов М.М. Розробка способу очищення підземної води за допомогою біологічної денітрифікації // Матеріали 67-ої наукової конференції студентів, аспірантів і молодих вчених УДУХТ, 2001. - С.74.

Особистий внесок – проведення експериментальних досліджень, участь у опрацюванні та узагальненні результатів, підготовка матеріалу до публікації.

Анотація.

Уланов М.М. Розробка технології денітрифікації підземної води у реакторі з фіксованою біоплівкою. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата технічних наук за спеціальністю 03.00.20 – біотехнологія, технічні науки. – Національний університет харчових технологій Міністерства освіти і науки України, Київ, 2003.

Дисертацію присвячено питанням розробки біотехнології очищення підземних вод від нітратів. Технологія базується на використанні денітрифікуючих бактерій Paracoccus denitrificans, які закріплені на поверхні обраного носія, що здатні здійснювати як автотрофну так