Академія медичних наук України

ІНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГІЇ ТА ТОКСИКОЛОГІЇ

ВАЖНИЧА Олена Митрофанівна

УДК 315.21+616.15

ЕФЕКТИВНІСТЬ ЗАСОБІВ З НООТРОПНОЮ ДІЄЮ І РЕГУЛЯТОРНИХ ПЕПТИДІВ ПРИ СТРЕСІ

(експериментальне дослідження)

14.03.05-фармакологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Київ –2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі експериментальної та клінічної фармакології Української медичної стоматологічної академії МОЗ України, м. Полтава.

Науковий консультант: | доктор медичних наук, професор Дев'яткіна Тетяна Олексіївна, Українська медична стоматологічна академія МОЗ України, професор кафедри експериментальної та клінічної фармакології

Офіційні опоненти: | доктор медичних наук, професор Французова Стелла Борисівна, головний науковий співробітник лабораторії патофізіології та експериментальної кардіології Науково-дослідного лабораторного центру, Національний медичний університет ім. О.О. Бого-мольця МОЗ України;

доктор медичних наук, професор Ярош Олександр

Кузьмич, завідувач відділу фармакокінетики, Інститут фармакології та токсикології АМН України;

доктор медичних наук, професор Киричок Людмила Трохимівна, професор кафедри фармакології з медичною рецептурою, Харківський державний медичний університет МОЗ України

Провідна установа: Одеський державний медичний університет МОЗ України, кафедра загальної та клінічної фармакології.

Захист відбудеться " 21 "_січня____________ 2004 р. о _13_ год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01 при Інституті фармакології та токсикології АМН України (03057, м. Київ, вул. Е.Потьє,14).

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту фармакології та токсикології АМН України (03057, м. Київ, вул. Е.Потьє,14).

Автореферат розісланий "__18___" _грудня_______ 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

Д.26.550.01

к. б. н. І.В. Данова

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Стресорні ситуації постійно супроводжують життя сучасної людини і можуть бути причиною численних захворювань (М.М. Хананашвили, 1998; Z.L. Houtman et al., 1998; Y. Nakano et al., 1998). Це потребує пошуку фармакологічних засобів, які підвищують резистентність організму до дії стресорів. Найбільш перспективними стреспротективними засобами вважають такі, що при зростанні порогу психофізіологічної стійкості організму зберігають його дієздатність (В.И.Петров и соавт., 1996). До них належать препарати з ноотропною дією, серед яких привертає увагу синтетичний антиоксидант мексидол, котрий поєднує психотропні і метаболічні властивості (Т.А. Воронина, С.Б. Середенин, 1998; К.М. Дюмаев и соавт., 1995). Потребує подальшого дослідження за умов стресу класичний представник групи ноотропів – пірацетам, стреспротективні властивості якого інтенсивно вивчаються (Л.Т. Киричек, Э.В. Карнаух, 1999; В.И. Кресюн, Я.В. Рожковский, 1990; П.П. Мурзенок, Н.А. Чура, 1998; Я.В. Рожковский, 2000).

Інша група засобів, здатних поліпшувати розвиток адаптації, представлена регуляторними пептидами. Нині відомо, що ендогенні регуляторні пептиди, зокрема тироліберин, окситоцин, вазопресин, беруть участь у формуванні відповіді організму на дію стресорних факторів (А.И. Робу, 1989; В.Н. Славнов и соавт., 1992; C.S. Carter, M. Altemus, 1997). Водночас можливість профілактики і корекції стресорних зрушень за допомогою екзогенного введення цих препаратів мало досліджена. Ефективність регуляторних пептидів з нейротрофічними властивостями при стресі майже не вивчена. Існують лише поодинокі роботи, присвячені дії церебролізину при мікрохвильовому стресі (А.Т. Гречко, 1998). Трофінотропні пептиди екстракту неокортексу SNC (А.Н. Макаренко, 1994) за умов стресу раніше не досліджувались.

На сьогодні найбільш вивчені мозкові ефекти ноотропів і регуляторних пептидів. Водночас їхні екстрацеребральні ефекти за умов стресу досліджені недостатньо. Особливо це стосується впливу на лімфоїдні органи, кістковий мозок і клітини крові, які чутливо реагують на стрес (Е.Д. Гольдберг и соавт., 1987-1999; П.Д. Горизонтов и соавт., 1983; Н.В. Лунина и соавт., 1986-1998). Важливість дослідження впливу фармакологічних засобів на стресорні зрушення в цих органах і клітинах визначається тим, що останні можуть бути причиною патологічних змін гемопоезу та імунітету (Е.Д. Гольдберг и соавт., 1987-1999; А.М. Дыгай и соавт., 1989-1992; В.П. Шахов, 1986-1996; I. Rinner et al., 1992; J.F. Sheridan et al., 1998; M. Shimaoka et al., 1998). За певних умов такі зміни зумовлюють розвиток імунодефіцитних станів, аутоімунних або онкологічних захворювань (К.П. Балицкий, Ю.П. Шмалько, 1987; S.M. Consoli, 1992; P. Derevenco, 1997).

До теперішнього часу не розроблені критерії кількісної оцінки стреспротективної дії фармакологічних засобів. Це зумовлює актуальність створення таких методів, в тому числі на основі застосування системного аналізу до ефектів препаратів у лімфоїдних органах, кістковому мозку і крові тварин, підданих стресу.

Таким чином, ноотропні засоби і регуляторні пептиди широко вивчаються

і застосовуються в медицині, однак їх лікувальні і профілактичні ефекти при стресі надзвичайно мало досліджені. На основі існуючих даних не можна зробити висновки стосовно перспективності застосування препаратів цих фармакологічних груп для попередження негативних наслідків стресу, зокрема в кровотворних органах і крові. Тому актуальною проблемою фармакології є пошук стреспротективних засобів із числа ноотропів і регуляторних пептидів, вивчення їхнього впливу на лімфоїдні органи, кістковий мозок і клітини крові при стресі і обгрун-тування кількісних критеріїв оцінки ефективності цих фармакологічних засобів.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана в рамках

НДР Української медичної стоматологічної академії (м. Полтава) "Запальні та незапальні хвороби

органів і систем людини, що формуються під впливом екологічних, стресових, імунних, метаболічних та інфекційних факторів. Стан гемо-гомеостазу, гемодинаміки при застосуванні традиційних та нетрадиційних засобів лікування" (№ держреєстрації 0198U000134). Дисертант був співвиконавцем вказаної теми.

Мета дослідження – на основі експериментальних досліджень встановити профілактичні властивості ноотропів і регуляторних пептидів при стресі та виявити серед них найбільш активні фармакологічні засоби, які запобігають розвитку порушень у кровотворних органах і крові.

Для досягнення поставленої мети були визначені основні завдання дисертаційної роботи:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

Об'єкт дослідження – лімфоїдні органи, кістковий мозок і кров лабораторних тварин за умов стресу.

Предмет дослідження – ефективність та механізми дії засобів з ноотропною дією і регуляторних пептидів при стресі.

Методи дослідження. В роботі використані фармакологічні, цитологічні, цитохімічні, біохімічні та статистичні методи дослідження.

Наукова новизна одержаних результатів. Поглиблено уявлення про порушення в лімфоїдних органах і крові в стадії тривоги гострого стресу, а саме про посилення апоптозу в тимусі і селезінці, збільшення експресії поверхневих глікопротеїнів лімфоцитів крові та зміни функціонального стану поліморфноядерних лейкоцитів (підвищення показника фагоцитозу, активацію мієлопероксидази та зниження продукції активних метаболітів кисню).

Вперше виявлено захисний вплив антиоксиданту з ноотропними властивостями мексидолу на лімфоїдні органи, кістковий мозок і кров при гострому і хронічному стресі. Показано, що в фармакодинаміці мексидолу певне місце займає попередження посиленого апоптозу в тимусі і селезінці, викликаного стресом. Встановлено, що протективна дія мексидолу стосовно стресорних порушень у кровотворних органах і крові зумовлена зменшенням активності надниркових залоз (за даними морфологічних досліджень) і впливом препарату на процеси перекисного окислення ліпідів і обмін глюкози. Дія мексидолу в системі крові при хронічному стресі синергічна природним адаптаційним процесам і супроводжується стадійними змінами гістологічної структури надниркових залоз і антиоксидантного захисту.

Поглиблено уявлення про фармакодинаміку пірацетаму за умов стресу. Встановлено превентивний вплив препарату щодо посилення апоптозу в лімфоїдних органах. Показано, що протективний ефект пірацетаму при гострому стресі зумовлений зменшенням активності надниркових залоз (за даними морфологічних досліджень), антиоксидантною дією і оптимізацією обміну глюкози в лімфоїдних органах.

Уперше встановлено стреспротективні властивості пітуїтрину і розкрито механізми його дії в лімфоїдних органах і крові – здатність регулювати експресію мембранних рецепторів лімфоцитів і активність антиоксидантних ферментів.

Доведена можливість попередження церебролізином стресорних порушень у лімфоїдних органах і крові та розкрито його механізми дії – зниження рівня перекисного окислення ліпідів у тимусі, активація антиоксидантного захисту і зменшення вмісту лактату в селезінці.

Вперше виявлено протективну дію природного комплексу пептидних факторів неокортексу SNC та доведено, що його вплив на лімфоїдні органи створює передумови для попередження стресорних порушень імунітету і грунтується на опіатергічних механізмах.

Уперше показано, що протективна дія ноотропів і регуляторних пептидів при гострому стресі закономірно супроводжується попередженням стресорного посилення кореляцій та змін розподілу їх дисперсії в системі крові, а при хронічному стресі характеризується стадійними змінами цих характеристик кореляційної мережі.

Вперше обгрунтовано можливість кількісної оцінки ефективності фармакологічних засобів при стресі і встановлено, що серед досліджених ноотропів і регуляторних пептидів мексидол є найбільш ефективним препаратом для попередження стресорних порушень у кровотворних органах і крові.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено спосіб кількісної оцінки стреспротективної дії фармакологічних засобів на етапі доклінічного дослідження і впроваджено його в наукову роботу ЦНДЛ Української медичної стоматологічної академії (акт впровадження від 3.04.2002 р.), ЦНДЛ Харківського державного медичного університету (акт впровадження від 16.01.2002 р.), ЦНДЛ Національного фармацевтичного університету (акт впровадження від 8.02.2002 р.). Обгрунтовано перспективність застосування мексидолу, пірацетаму, пітуїтрину і церебролізину для профілактики зрушень у лімфоїдних органах, кістковому мозку і крові, обумовлених впливом стресорних факторів.

За результатами досліджень одержано 2 деклараційні патенти України на винаходи: "Спосіб визначення ефективності фармакологічних засобів при стресі" (№99073834) і "Спосіб імунокорекції" (№ 99073835). За матеріалами дисертації підготовлено і видано методичні рекомендації: "Доклінічне дослідження стреспротективної дії фармакологічних засобів", а також 2 інформаційні листки: "Применение пирацетама для профилактики повреждений иммунокомпетентных органов и печени стрессорного генеза" та "Экстрацеребральные эффекты церебролизина и возможности их клинического использования".

Результати дисертаційної роботи впроваджені в навчальний процес на кафедрах фармакології Національного медичного університету ім О.О. Богомольця (акт впровадження від 14.01.2002 р.), Дніпропетровської державної медичної акаде-мії (акт впровадження від 21.02.2002 р.), Тернопільської державної медичної акаде-мії ім. І.Я. Горбачевського (акт впровадження від 17.01.2002 р.), Національного фар-мацевтичного університету (акт впровадження від 14.01.2002 р.), Вінницького державного медичного університету ім. М.І. Пирогова (акт впровадження від 7.02.2002 р.), Харківського державного медичного університету (акт впровадження від 14.01.2002 р.), Івано-Франківської державної медичної академії (акт впровад-ження від 16.01.2002 р.), Луганського державного медичного університету (акт впровадження від 12.02.2002 р.), Буковинської державної медичної академії (акт впровадження від 4.02.2002 р.), та на кафедрі патологічної фізіології Української медичної стоматологічної академії (акт впровадження від 8.04.2002 р.).

Особистий внесок здобувача. Автором особисто проведено патентно-інформаційний пошук, у тому числі з використанням серверів "МЕDLINE" та "РUBMED", розроблено програму досліджень. Самостійно проведено всі експериментальні дослідження. Гістологічне вивчення надниркових залоз, визначення експресії поверхневих глікопротеїнів лейкоцитів та досліди in vitro з вивчення впливу мексидолу на дихальний вибух поліморфноядерних лейкоцитів були виконані за методичною допомогою асистента кафедри гістології к.м.н. Н.Ф. Єреміної, наукових співробітників ЦНДЛ Української медичної стоматоло-гічної академії к.б.н. Н.О. Бобрової і д.б.н. О.І. Цебржинського. Автором особисто проведено статистичну обробку, аналіз і узагальнення результатів дослідження, сформульовано основні положення та висновки дисертації.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідались на міжнародній конференції "Структурные преобразования органов и тканей на этапах онтогенеза в норме и при воздействии антропогенных факторов. Проблемы экологии в медицине" (Астрахань, Росія, 1996), IV Російському національному конгресі "Человек и лекарство" (Москва, Росія, 1997), VII Українському біохімічному з’їзді (Київ, 1997), V та VI Російських національних конгресах "Человек и лекарство" (Москва, Росія, 1998, 1999), V національному з’їзді фармацевтів України (Харків, 1999), ІІ Російському конгресі з патофізіології (Москва, Росія, 2000), ІІ національному з’їзді фармакологів України (Дніпропетровськ, 2001), науковій конференції "Фізіологія і патологія перекисного окислення ліпідів, гемостазу та імуногенезу" (Полтава, 1997).

Публікації. Основні результати дисертації висвітлено в 42 публікаціях. Із них 1-монографія, 23 – статті в виданнях, затверджених ВАК України, 4 - статті в зарубіжних журналах, 9 робіт – у матеріалах і тезах з’їздів і конференцій. 13 робіт самостійні, з них статей – 11. Видано 1 методичні рекомендації, 2 інформаційні листки, одержано 2 деклараційні патенти України на винахід.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 363 сторінках машинопису та включає вступ, огляд літератури, опис матеріалів і методів дослідження, 5 розділів власних досліджень, обговорення одержаних даних, висновки, практичні рекомендації, список використаних джерел, який містить 656 джерел, в тому числі 406 українсько- і російськомовних і 250 англомовних публікацій. Робота ілюстрована 52 таблицями, 26 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Експерименти виконано на 339 білих статевозрілих щурах-самцях, 30 мишах СБА та 39 нелінійних білих мишах. Використано щурів гетерозиготного штаму Вістар масою 240-300 г та нелінійних щурів масою 150-250 г. Тварин утримували в стандартних умовах віварію.

В щурів моделювали гострий іммобілізаційний стрес (П.Д. Горизонтов и соавт., 1983) і емоційно-больовий стрес (ЕБС) (O. Desiderato et al., 1974). Гострий стрес у мишей відтворювали шляхом атравматичного підвішування тварин за шкірну складку шиї (И.В. Дардымов, 1976). Хронічний гіпокінетичний стрес моделювали шляхом 16-годинного обмеження рухів тварин у дерев’яних пеналах протягом 30-и діб (Е.А. Коваленко, Н.Н. Гуровский, 1980).

Взяття матеріалу в щурів проводили через 1,5-2 год, у мишей – через 1 год після завершення дії стресорного фактору. Евтаназію тварин здійснювали під гексеналовим або тіопенталовим наркозом (50 мг/кг маси тіла, внутрішньоочере-винно) шляхом забирання крові з серця до його зупинки. Мишей декапітували під ефірним наркозом.

З метою профілактики стресорних зрушень тваринам вводили мексидол у дозі 100 мг/кг (Національний дослідницький центр біологічно активних речовин, Стара Купавна, Росія); пірацетам у дозах 100 і 300 мг/кг (Фармацевтична фірма "Дарниця", Київ, Україна); тироліберин (ТРГ) у дозі 0,04 мг/кг (Berlin-Chemie AG, Берлін, Германія); окситоцин у дозі 1 ОД/кг (Хіміко-фармацевтичне АО "Октамед", Харків, Україна); пітуїтрин у дозі 1 ОД/кг (НВО "Фермент", Каунас, Литва); церебролізин у дозі 0,1 мл/кг (ЕВЕWE, Унтерах, Австрія), а також екстракт неокортексу SNC у дозі 1 мг/кг маси тіла, люб’язно наданий д.мед.н. О.М. Макаренко (Інститут загальної і судової психіатрії, Київ, Україна). Препарати розводили стерильним 0,9% розчином натрію хлориду ex tempore та вводили тваринам внутрішньоочеревинно або в м’язи за 30 хв до початку дії стресорного фактора. Дози препаратів не перевищували 0,1 ЛД50. Вибір доз і шляхів введення препаратів і субстанцій здійснювали на основі літературних даних щодо їхнього застосування за умов стресу або за іншої неврологічної патології, якщо при стресі препарат раніше не вивчали. Зокрема, мексидол застосовували в дозі 100 мг/кг (К.М. Дюмаев и соавт., 1995), яка виявляла протективну дію стосовно показників перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) при гострому стресі (Т.А. Девяткина, 1990). Дози пірацетаму (100 і 300 мг/кг) відповідали терапевтичним дозам при парентеральному введенні в разі невідкладних станів (А.И. Федин, 1997) і узгоджувались із дозами, що застосовувались дослідниками для корекції стресорних порушень у ЦНС, міокарді і крові (від 50 до 500 мг/кг) (В.М. Виноградов и соавт., 1987; В.И. Кресюн, Я.В. Рожковский, 1990; В.И. Петров и соавт., 1996). Доза ТРГ (40 мг/кг) була обрана на основі даних щодо впливу подібної дози на біоелектричну активність у ЦНС (А.Т. Марьянович, Е.Л. Поляков, 1991). Доза окситоцину (1 ОД/кг) відповідала такій в дослідах з вивчення седативної дії пептиду при стресі (C. S. Carter, M. Altemus, 1997). Доза пітуїтрину (1 ОД/кг) була обрана як співставима з дозою для окситоцину. Церебролізин (0,1 мг/кг) застосовували в терапевтичній дозі, рекомендованій в неврологічній практиці (M. Windisch et al., 1998). Екстракт неокортексу тварин SNC вводили тваринам у дозі 1 мг/кг, яка узгоджується з дозою SNC, ефективною при передозуванні барбітуратів (2 мг/кг) (А.Н. Макаренко, 1994). Одночасно з профілактикою стресу препарати та екстракт неокортексу SNC вводили інтактним тваринам.

При аналізі ефектів мексидолу використано засоби, аналогічні за хімічною будовою його структурним компонентам: емоксипін (2-етил-6-метил-3-оксипіридин у вигляді хлорводневої солі) в дозі 100 мг/кг (Талліннський хіміко-фармацевтичний завод, Таллінн, Естонія) і натрію сукцинат у дозі 50 мг/кг (ВАТ "Фармак", Київ, Україна). З метою вивчення механізмів дії SNC тваринам вводили блокатор опіаторецепторів налоксон у дозі 0,1 мг/кг ("Здоровье народа", Харків, Україна).

Визначали цитологічні показники тимусу, селезінки, кісткового мозку і крові. Загальну кількість каріоцитів (цитоз) у лімфоїдних органах досліджували за методом П.Д. Горизонтова і співавт. (1983). Відбитки тимусу і селезінки, а також мазки кісткового мозку фіксували метанолом і фарбували за Паппенгеймом (М.А. Базарнова и соавт., 1988). При ідентифікації лімфоїдних елементів керувались їхніми розмірами і морфологічними особливостями. Досліджуючи апоптоз, із тимусу і селезінки щурів виділяли ДНК і визначали міжнуклеосомну фрагментацію в ній електрофоретичним методом (С. Херрингтон, Дж. Макги, 1999). Загальну кількість лейкоцитів і еритроцитів у крові вивчали шляхом підрахунку клітин у камері Горяєва. Лейкоцитарну формулу підраховували в мазках крові, пофарбованих за Паппенгеймом (М.А. Базарнова и соавт., 1988).

Досліджували процеси, котрі характеризують киснезалежні реакції поліморфноядерних лейкоцитів (ПМЯЛ): тест з нітросинім тетразолієм (НСТ-тест) за Б.С. Нагоєвим (1983), активність мієлопероксидази (МПО) за Р.П. Нарцисовим (1964); кисненезалежні реакції: лізосомально-катіонний тест (ЛКТ) за В.Є. Піга-ревським і співавт. (1983) і стан клітинних мембран: життєздатність (Ю.М. Лопухин, Э.М. Коган, 1975) і поверхневі глікопротеїни (А.Д. Луцик и соавт., 1989). Експресію поверхневих глікопротеїнів визначали також на лімфоцитах крові. Цитохімічні реакції оцінювали напівкількісно (G. Astaldi, L. Verga, 1957) і обчислювали середній цитохімічний коефіцієнт за L.S. Kaplow (1957). Одночасно досліджували фагоцитарну активність ПМЯЛ (В.И. Стручков и соавт., 1978; К.А. Лебедев, И.Д. Понякина, 1990).

З метою з’ясування механізмів дії мексидолу проводили досліди in vitro (n=94) з використанням ПМЯЛ крові здорових донорів. Виконання дослідів in vitro включало передінкубацію донорської крові з розчином НСТ і мексидолом при 370 С протягом 5 хв та інкубацію зі стимуляторами дихального вибуху. Концентрацію мексидолу розраховували згідно з подвоєною вищою разовою дозою препарату, припускаючи, що він одномоментно надходить до крові і рівномірно розподіляється в ній.

Оскільки цитологічні зрушення в лімфоїдних органах можуть вести до змін імунітету, досліджували кількість антитілоутворюючих клітин у селезінці (Г. Фримель, 1987) і титр антиеритроцитарних антитіл у сироватці крові (Е.А. Кост, 1975).

У тимусі, селезінці і крові визначали основні показники ПОЛ і антиоксидантного захисту: вміст продуктів, що реагують із 2-тіобарбітуровою кислотою (ТБКАП) (В.Б. Гаврилов и соавт., 1987), активність супероксиддисмутази (СОД) (О.С. Брусов и соавт., 1976) і каталази (М.А. Королюк и соавт., 1988). У лімфоїдних органах також визначали вміст молочної (Ю.В. Хмелевский, 1985) та піровиноградної кислот (Н.К. Кучеренко и соавт., 1988).

З метою підтвердження протективного характеру дії ноотропів і регуляторних пептидів досліджували класичні загальносоматичні ознаки стрес-синдрому, які відображають стан гіпоталамо-гіпофізарно-надниркової системи: відносну масу тимусу і надниркових залоз, виразкоутворення в шлунку (В.М. Виноградов, В.А. Полонский, 1983), описували гістологічну будову надниркових залоз, використовуючи забарвлення гематоксилін-еозином (О.В. Волкова, Ю.К. Елецкий, 1971), і визначали ширину їхнього коркового і мозкового шарів (Г.Г. Автандилов, 1990).

Одержані результати піддавали статистичній обробці методом варіаційної статистики. Вірогідність різниці оцінювали за критерієм t Ст’юдента та непараметричним критерієм “точний метод Фішера” (ТМФ). Кореляційний аналіз 34 морфофункціональних показників лімфоїдних органів, кісткового мозку і крові здійснювали за методом кореляційних плеяд (Ю.В. Редькин, Т.Ф. Соколова, 1988). Оцінку ефективності фармакологічної профілактики стресорних порушень проводили з використанням дискримінантного аналізу (С.Н. Лапач и соавт., 2000), а також за допомогою розробленого способу визначення ефективності фармакологічних засобів при стресі (О.М. Важнича, Т.О. Дев’яткіна, 2000). Цей спосіб полягає в тому, що до всіх засобів застосовують єдину схему дослідження з наступним абстрагуванням від цифрового матеріалу, вираженням його в балах з урахуванням направленості зрушень і знаходженням алгебраїчної суми балів. Перевага превентивних ефектів виражається сумою зі знаком “+” і свідчить про наявність стреспротективної дії. Обчислення виконано на мікрокалькуляторі "Электроника "МК-52" за стандартними програмами (А.Е. Шелест, 1988) та на персональному комп’ютері ІВМ РС Pentium III-1000 за програмами С.Н. Лапача і співавт. (2000).

Результати досліджень та їх обговорення

Стресорні порушення в лімфоїдних органах, кістковому мозку і крові.

Під впливом гострого стресу в стадію тривоги стрес-синдрому спостерігається вірогідне зменшення цитозу тимусу на 49% і зростання в ньому вмісту великих тимоцитів і бластів, зменшення цитозу селезінки на 24% і зростання серед її клітин частки лімфоцитів розмірами 4-8 мкм (Т-клітини); істотно збільшується цитоз кісткового мозку на 62%; відмічається лімфопенія, еозинопенія і нейтрофільний лейкоцитоз. Такі результати узгоджуються з даними літератури (П.Д. Горизонтов и соавт., 1983; Е.Д. Гольдберг и соавт., 1997) і вказують на закономірний характер клітинних реакцій у системі крові за умов стресу. Гострий стрес супроводжується посиленням міжнуклеосомної фрагментації ДНК у тимусі і селезінці, що вказує на роль активації апоптозу в клітинному спустошенні цих органів. Під впливом стресорного фактору експресія поверхневих глікопротеїнів лімфоцитів зростає на 33% (р<0,05), що свідчить про порушення функціональної активності цих клітин. Вірогідно підвищується активність МПО на 32% і показник фагоцитозу ПМЯЛ на 25%. На момент спостережень НСТ-тест знижується в 2 рази порівняно з таким у інтактних тварин (р<0,02). Серед зазначених зрушень стану гранулоцитів найбільш постійно реєструється активація МПО. Це доповнює відомі дані щодо реакції на стрес лізосомального апарату ПМЯЛ (Н.В. Луніна і співавт., 1998).

У тимусі тварин, підданих ЕБС, вміст ТБКАП вірогідно зростає на 62%, тоді як за умов гострого іммобілізаційного стресу він не змінюється, вочевидь, завдяки підвищенню активності СОД на 152 % (р<0,05). За цих моделей стресу в селезінці розвиток надлишкової пероксидації стримується активацією антиоксидантного захисту. Водночас при відтворенні нервовом’язового напруження в мишей вміст ТБКАП у селезінці вірогідно зростає на 70 % (р<0,05). Стан ПОЛ і антиоксидан-тного захисту свідчить, що через 1,5 год після завершення стресорного впливу в тимусі і селезінці може мати місце як посилення, так і гальмування ПОЛ. Стрес викликає також зміни концентрації продуктів гліколізу в лімфоїдних органах, які супроводжуються накопиченням лактату в селезінці (p<0,05).

Описані процеси відбуваються на фоні морфологічних ознак підвищеної активності надниркових залоз, зокрема вірогідного збільшення товщини їх коркового і мозкового шару.

Зрушення, викликані гострим стресом, супроводжуються зростанням загальної кількості міцних вірогідних кореляцій у системі крові. Відбувається перерозподіл дисперсії зв’язків на користь кореляцій між клітинними показниками і параметрами ПОЛ, а також збільшення числа взаємозв’язків за участю морфофункціональних показників селезінки.

При моделюванні хронічного гіпокінетичного стресу виявлено стадійність клітинних реакцій у лімфоїдних органах, кістковому мозку і крові. На 15-у добу цитоз тимусу зменшується на 91% (р<0,05), а кількість великих тимоцитів у ньому – на 45% (р<0,05) порівняно з початковими даними. В кістковому мозку вірогідно зростає вміст мієлобластів, промієлоцитів і мієлоцитів у 1,5 рази, що свідчить про посилення гранулоцитопоезу. На 30-у добу цитоз тимусу відновлюється, але кількість малих тимоцитів лишається нижчою за початковий рівень показників (р<0,001). У селезінці вірогідно зростає вміст еритроїдних клітин, що вказує на посилення екстрамедулярного гемопоезу. Активність СОД селезінки підвищується на 15-у (р<0,05) і повертається до норми на 30-у добу гіпокінезії.

Протягом усього терміну хронічного гіпокінетичного стресу кількість міцних вірогідних кореляцій між морфофункціональними показниками кровотворних органів і крові нижча за початковий рівень, але на 30-у добу вона підвищується в 1,4 рази порівняно з такою на 15-у добу спостережень. Це свідчить про стадійність змін мережі попарних лінійних кореляцій в системі крові протягом хронічного стресу.

Рис. 1. Попередження мексидолом фрагментації ДНК у тимусі (А) і селезінці (Б) тварин при гострому стресі (електрофореграма, фото). Доріжки електрофореграми: 1-3 – інтактні тварини; 4-6 – стрес + 0,9% розчин натрію хлориду; 7-9 – стрес + мексидол.

Ефективність засобів з ноотропною дією за умов стресу. Для профілактики стресорних порушень було застосовано мексидол, який має антиоксидантну та нейротропну дію. При одноразовому внутрішньоочере-винному введенні перед гострим стресом у дозі 100 мг/кг він вірогідно збільшує цитоз тимусу на 40%, попереджує зміни клітинного складу та активацію апоптозу в тимусі і селезінці (рис. 1). Мексидол запобігає розвитку нейтрофільо-зу (р<0,001) і еозинопенії (p<0,05), зменшує активність мієлопероксидази ПМЯЛ на 15% (р<0,05).

Мексидол при гострому стресі попереджує активацію ПОЛ у лімфоїдних органах, зокрема знижує вміст ТБКАП у селезінці в 2 рази порівняно з контролем (р<0,05). Передумовою превентивного впливу препарату на клітинні реакції в тимусі і селезінці можна вважати його здатність регулювати обмін глюкози в цих органах. Причому в тимусі він підвищує вміст пірувату (р<0,01), а в селезінці знижує вміст лактату (р<0,01) (рис. 2).

Здатність мексидолу гальмувати стимульовану продукцію активних метаболітів кисню в ПМЯЛ і знижувати експресію поверхневих глікопротеїнів цих клітин у дослідах in vitro вказує, що одним з механізмів дії препарату на лейкоцити є стабілізація їх клітинних мембран.

Рис. 2. Вплив мексидолу і пірацетаму на вміст піровиноградної (А) і молочної (Б) кислот у тимусі і селезінці при гострому стресі. 1 – стрес + 0,9% розчин натрію хлориду; 2 – стрес + мексидол; 3 – стрес + пірацетам; 100% - показники інтактних тварин; p<0,05 у порівнянні: * - з інтактними тваринами; ** - зі стресом.

Оскільки відомо, що мексидол гідролізується з утворенням 3-оксипіридинів і сукцинату (А.К. Сариев и соавт., 2001), в дослідах з препаратами, які є аналогами структурних компонентів мексидолу, показано, що емоксипін вірогідно знижує вміст інтермедіатів ПОЛ у селезінці, але не впливає на клітинні порушення, викликані гострим стресом у лімфоїдних органах і крові (рис. 3). Водночас натрію сукцинат вірогідно попереджує нейтрофільоз і еозинопенію, підвищує вміст лімфоцитів у крові. Він знижує вміст ТБКАП у селезінці і крові. Це свідчить, що дія мексидолу в лімфоїдних органах і крові за умов стресу значною мірою зумовлена сукцинатом, котрий входить до складу препарату.

Рис. 3. Порівняння профілактичної активності мексидолу, емоксипіну і натрію сукцинату при гострому стресі. А, Б, В – абсолютна кількість у крові нейтрофілів, лімфоцитів та еозинофілів відповідно; Г-ТБКАП, селезінка; Д-ТБКАП, кров. Групи тварин: 1 – стрес + 0,9% розчин натрію хлориду; 2 – стрес + мексидол; 3 – стрес +емоксипін; 4 – стрес + натрію сукцинат. 100% - показники інтактних тварин. р<0,05 у порівнянні: * - з інтактними тваринами; ** - зі стресом.

За даними дискримінантного аналізу всієї сукупності морфофункціо-нальних показників лімфоїдних органів, кісткового мозку і крові тварин, яким перед стресом вводили мексидол, дискримінантна функція 1,0 Е+16 перевищує константу –8,8Е+15. Це вказує на належність зазначеної сукупності до умовної норми. Ефективність мексидолу при гострому стресі за сумою балів дорівнює +6 (табл. 1). Такі результати свідчать про наявність стреспротективної дії і узгоджуються з попередженням розвитку загальносоматичних ознак стресу.

Таблиця 1

Протективний ефект засобів з ноотропною дією за умов гострого стресу

Показники | Мексидол | Пірацетам

Тимус: цитоз

клітинний склад

ТБК-активні продукти

активність СОД | +1

+1 |

+1

+1

0

+1

Селезінка: цитоз

клітинний склад

ТБК-активні продукти

активність СОД | 0

+1

+1

0 | 0

0

-1

-1

Кров: кількість лейкоцитів

лейкограма

ТБК-активні продукти

активність СОД | 0

+1

0

0 | 0

+1

-1

0

Поліморфноядерні лейкоцити:

активність МПО

ЛКТ

життєздатність

фагоцитоз |

+1

0

0

0 |

+1

-1

0

0

Протективний ефект (сума балів) | +6 | +1

Примітки:1. +1 – вірогідне попередження стресорних зрушень; 2. -1 – по-дальше поглиблення зрушень; 3. 0 – відсутність зрушень у порівнянні зі стресом.

Мексидол здатний попереджати стресорні порушення в кровотворних органах і крові, залежні як від гіпоталамо-гіпофізарно-надниркової системи (зміни цитозу і клітинного складу тимусу, посилення апоптозу тимоцитів, еозинопенію), так і від симпатоадреналової системи (зміни клітинного складу селезінки, нейтрофільоз). Він також зменшує морфологічні ознаки активації надниркових залоз, зокрема ширину їх коркового і мозкового шару на 12% (р<0,05). Це свідчить, що основним механізмом протективної дії препарату є гальмування активності центральних стрес-реалізуючих систем. Вочевидь, його ініціальною ланкою є модифікація ГАМК-бенздіазепінового рецепторного комплексу в ЦНС і пов’язана з нею анксіолітична дія (Т.А. Воронина, С.Б. Середенин, 1998; К.М. Дюмаев и соавт., 1995). Вона веде до обмеження активності провідних стрес-реалізуючих систем і, відповідно, до зменшення зрушень у лімфоїдних органах і крові. Ще одним механізмом захисного впливу мексидолу є антиоксидантна дія в селезінці і оптимізація обміну глюкози в тимусі і селезінці з перевагою серед кінцевих продуктів гліколізу пірувату, який є основним субстратом циклу Кребса і антиоксидантом (К.Brand. 1997).

Інакше діє мексидол (100 мг/кг) при щоденному внутрішньоочеревинному введенні протягом хронічного гіпокінетичного стресу. На 15-у добу гіпокінезії препарат викликає вірогідне зниження кількості малих і середніх тимоцитів у тимусі, збільшує число нейтрофілів у крові в 2,6 рази (p<0,001) (рис.4), сприяє зростанню вмісту мієлобластів, промієлоцитів і мієлоцитів у кістковому мозку в 1,3 рази (рTМФ<0,025), підвищує активність СОД у селезінці (р<0,05).

Рис. 4. Вплив мексидолу на цитоз тимусу (1), селезінки (2) і кісткового мозку (3) та абсолютну кількість нейтрофілів у крові (4) при хронічній гіпокінезії (відхилення від показників при гіпокінезії без введення мексидолу, %). * р<0,05 у порівнянні з гіпокінезією.

За даними гістологічного дослідження такий вплив препарату супроводжується збереженням морфологічних ознак підвищеної активності коркового і мозкового шару надниркових залоз.

На 30-у добу експерименту мексидол збільшує цитоз тимусу в 2,3 рази (рТМФ <0,025) (рис. 4) за рахунок великих і малих тимоцитів, попереджує активацію екстрамедулярного гемопоезу в селезінці і запобігає пригніченню активності СОД у ній (р<0,05). Зазначені процеси відбуваються на фоні зменшення морфологічних ознак активності надниркових залоз порівняно з патологічним фоном - у корковому шарі спостерігається більше світлих клітин, зменшується стаз крові. Цитоз селезінки і кісткового мозку протягом хронічного гіпокінетичного стресу істотно не змінюється (рис.4).

Мексидол при хронічній гіпокінезії, поряд із впливом на окремі морфофунк-ціональні показники кровотворних органів і крові, змінює всю сукупність міцних вірогідних кореляцій між ними. Він збільшує кількість значущих зв’язків на 15-у добу і зменшує її на 30-у добу експерименту. За даними дискримінантного аналізу, загальний стан тимусу, селезінки, кісткового мозку і крові на 15-у добу належить до класу “стрес” (константа 1,12 Е+17, функція 1,01Е+17), а на 30-у добу – до умовної норми (константа 3,1Е+16, функція 3,5Е+16).

Таким чином, ефекти мексидолу залежать від терміну гіпокінезії. В усі строки хронічного стресу вони синергічні природним адаптаційним процесам. Відмінності в фармакодинаміці мексидолу при гострому і хронічному стресі, вочевидь, зумовлені переходом від швидкої неспецифічної (анксіолітичної) дії препарату до специфічної ноотропної активності при його багаторазовому застосуванні.

Відомий ноотроп пірацетам (100 і 300 мг/кг) при внутрішноочеревинному введенні за 30 хв до гострого стресу попереджує порушення цитозу і клітинного складу тимусу. При цьому він збільшує загальну кількість каріоцитів у вилочковій залозі на 68% і зменшує вміст великих тимоцитів на 34% (р<0,05). Препарат запобігає посиленню апоптозу в тимусі і селезінці. Профілактичне введення пірацетаму попереджує стресорні зміни в лейкоцитарній формулі крові (р<0,01) і активацію мієлопероксидази ПМЯЛ (р<0,01).

Вплив пірацетаму на клітинні реакції відбувається на фоні підтримання на рівні норми активності СОД тимусу (p<0,05), зниження вмісту ТБКАП у селезінці на 33% (р<0,05) і активації СОД у цьому органі на 57% (р<0,05) порівняно зі стресом без фармакопрофілактики. Пірацетам сприяє зрушенню співвідношення лактат/піруват у лімфоїдних органах вбік останього подібно до мексидолу (рис.2).

Ефекти пірацетаму супроводжуються усуненням морфологічних ознак активності надниркових залоз, зокрема зменшенням ширини їх коркової і мозкової речовини на 16% і 14% відповідно (p<0,05).

Пірацетам запобігає стресорному збільшенню кількості міцних вірогідних кореляцій серед морфофункціональних показників системи крові і попереджує порушення розподілу дисперсії значущих зв’язків. За даними дискримінантного аналізу, коли дискримінантна функція 1,9Е+18 перевищує константу 8,1Е+17, загальний стан лімфоїдних органів, кісткового мозку і крові при застосуванні пірацетаму наближується до умовної норми. Згідно з розробленим способом ефективність пірацетаму при стресі дорівнює +1 бал (табл.1). Це означає, що дія пірацетаму при введенні перед гострим стресом є протективною. Такий висновок узгоджується з гальмівним впливом препарату на розвиток загальносоматичних ознак стресу.

Попередження пірацетамом клітинних реакцій, залежних від гіпоталамо-гіпофізарно-надниркової системи (зменшення цитозу тимусу, активація апоптозу в тимусі, лімфопенія), та процесів, залежних від симпатоадреналової системи (нейтрофільоз), разом із структурними змінами в надниркових залозах свідчить, що механізм дії пірацетаму при стресі зумовлений гальмуванням активності центральних стрес-реалізуючих систем. Антиоксидантна дія препарату і зміни під його впливом вмісту продуктів гліколізу в тимусі і селезінці вказують на наявність у пірацетаму периферичних механізмів стреспротективної дії в кровотворних органах.

При порівнянні ефектів мексидолу і пірацетаму встановлено, що вони мають спільні риси фармакодинаміки при гострому стресі: попереджають зміни цитозу тимусу і вмісту в ньому великих тимоцитів і бластів, запобігають активації апоптозу в лімфоїдних органах, попереджають стресорні зрушення лейкоцитарної формули крові і активацію МПО лейкоцитів. Спільність існує також стосовно дії ноотропних препаратів на структуру надниркових залоз, антиоксидантних ефектів і змін концентрації лактату і пірувату в лімфоїдних органах. Вочевидь, виявлені особливості є закономірними для протективної дії ноотропів різної хімічної структури при гострому стресі.

Ефективність регуляторних пептидів за умов стресу. Відомо, що окситоцин і вазопресин в організмі регулюють стрес-реакцію, перебуваючи в динамічній взаємодії між собою (C.S. Carter, M. Altemus, 1997). Поєднана дія окситоцину і вазопресину була досліджена при застосуванні препарату пітуїтрину (1 ОД/кг), який містить зазначені пептиди. За умов гострого стресу він вірогідно збільшує цитоз тимусу на 71% і сприяє збереженню вмісту великих тимоцитів і бластів у тимусі на рівні показників інтактних тварин (р<0,05). Препарат зменшує міжнуклеосомну фрагментацію ДНК з селезінки щурів, що свідчить про попередження стрес-індукованого апоптозу в цьому органі. Для розуміння механізмів дії пітуїтрину важливо, що він підтримує на рівні норми стан поверхневих глікопротеїнів лімфоцитів крові, зменшуючи їх експресію в 1,3 рази (рис. 5). Препарат також попереджує активацію СОД у тимусі і селезінці (р<0,001). Вплив пітуїтрину на лімфоїдні органи і клітини крові за умов гострого стресу не супроводжується зменшенням морфологічних ознак підвищеної активності коркової і мозкової речовини надниркових залоз.

Пітуїтрин запобігає стресорному збільшенню кількості міцних вірогідних кореляцій серед морфофункціональних показників лімфоїдних органів, кісткового мозку і крові. Він сприяє збереженню на рівні норми розподілу дисперсії зв’язків (табл.2). За даними дискримінантного аналізу, коли дискримі-нантна константа становить 8,3Е+16, а функція дорівнює 2,1Е+17, сукупність показників лімфоїдних органів, кісткового мозку і крові тварин, які перед стресом одержували пітуїтрин, наближується до умовної норми. За сумою балів, ефективність пітуїтрину дорівнює +4. Це свідчить про наявність стреспротективної дії і узгоджується зі здатністю препарату зменшувати класичні загальносоматичні ознаки стресу – інволюцію тимусу і пошкодження слизової оболонки шлунка.

Рис. 5. Середній цитохімічний коефіцієнт поверхневих глікопротеїнів лімфоцитів крові при введенні пітуїтрину перед гострим стресом. 1 – стрес + 0,9% розчин натрію хлориду; 2 – стрес + пітуїтрин. 100% – показники інтактних тварин. р <0,05 у порівнянні: * – з інтактними щурами, ** – зі стресом.

Слід вважати, що в основі протективних ефектів пітуїтрину стосовно порушень у лімфоїдних органах і крові знаходиться дія на стан мембранних структур лімфоцитів і активність антиоксидантних ферментів у тимусі і селезінці. Вочевидь, вона обмежує вплив глюкокортикоїдів і катехоламінів на клітинні процеси в системі крові щурів, підданих стресу.

Поряд із природним пептидним комплексом пітуїтрином досліджено ефекти окремих регуляторних пептидів – окситоцину і тироліберину, які беруть участь у формуванні відповіді на стрес (А.И. Робу, 1989; Я.Х. Туракулов и соавт., 1993; I.D. Neunann et al., 2000; D.А. Robinson, 2002). Показано, що ці пептиди модифікують окремі клітинні реакції і процеси