НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна

ВЕКЛІЧ ТЕТЯНА ОЛЕКСАНДРІВНА

УДК 577.352

ТРАНСПОРТ Са2+ В МІТОХОНДРІЯХ

ГЛАДЕНЬКОМ`ЯЗОВИХ КЛІТИН

03.00.04 – біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України.

Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор

КОСТЕРІН Сергій Олексійович,

завідувач відділу біохімії м`язів,

заступник директора з наукової роботи

Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

ЛІТОШЕНКО Олександр Якович,

керівник лабораторії молекулярної генетики

Інституту геронтології АМН України;

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

КОЛЧИНСЬКА Людмила Іллівна,

старший науковий співробітник відділу нейрохімії

Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України.

Провідна установа – Київський національний університет

імені Тараса Шевченка, кафедра біохімії.

Захист відбудеться “31“ березня 2003 року о 14 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України за адресою: 01601, Київ - 30, вул. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту біохімії

ім. О.В.Палладіна НАН України (Київ, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат дисертації розісланий “27“ лютого 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук КІРСЕНКО О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Іони Са відіграють важливу роль в регуляції багатьох біохімічних та біофізичних процесів, виступаючи як цитоплазматичний сигнальний посередник, який передає інформацію від плазматичної мембрани до внутрішньоклітинних структур [Berchtold M.W. et al., 2000; Somlyo A.P., Somlyo A.V., 2000; Костюк П.Г., 2001; Pu Y., 2001]. Втім, незважаючи на значну кількість експериментальних робіт, присвячених вивченню внутрішньоклітинних кальцієвих сигналів, механізми підтримання фізіологічно значимої концентрації іонів кальцію в клітині ([Ca2+]i <1 мкМ) все ще з`ясовані недостатньо.

Гладенькі м'язи, разом із скелетовими м'язами та міокардом, відіграють важливу роль у забезпеченні життєдіяльності організму. Серед гла-деньком`язових органів матка займає виключне положення не тільки внаслідок особливої функції, яку вона виконує в організмі при виношуванні плоду та пологах, але й з огляду на реагування на різноманітні фактори середовища, що регулюють скоротливу активність (полові гормони, гормони гіпофіза, медіатори, іони, механічне розтягання та інше) [Wray S. et al., 2001; Kim J. et al., 2002; Curley M. et al., 2002; Kayisli U. et al., 2002]. З метою розробки ефективних методів корекції процесу скорочення – розслаблення міометрія важливим є вивчення мембранних та молекулярних механізмів контролю скоротливої функції матки. Численні порушення цієї функції, які, як правило, є основою різноманітних патологій (слабкість пологової діяльності, спонтанні аборти, передчасні пологи, викидні, атонія, гіпо- і гіпертонус матки тощо), пов`язані значною мірою саме з порушенням внутрішньоклітинного гомеостазу іонів Са, яким, як відомо, належить важлива роль у контролі скорочення – розслаблення гладеньких м'язів [Шуба М.Ф., 2002; Kupittayanant S. et al., 2002; Wray S. et al., 2002]. Регуляція концентрації Са2+ у клітинах міометрія, як і інших гладеньких м'язів, забезпечується функціонуванням мембраннозв`язаних Са2+-транспортуючих систем [Костерин С.А., 1990; Kosterin S.A. et al., 1994; Sanborn B.M., 2000; Burdyga T., Wray S., 2002]. Отже особливого значення набуває ідентифікація, вивчення властивостей та особливостей регуляції транспортної активності цих систем у гладеньком'язових клітинах.

Суттєва роль у забезпеченні кальцієвого гомеостазу у клітинах збудливих тканин, зокрема, м`язів, у тому числі гладеньких, належить Mg2+,ATP-залежним Са2+-транспортуючим системам [Duchen M.R., 1999; Sanborn B.M. et al., 2000; Camello-Almaraz C., 2000]. Серед них все більшу увагу привертає до себе електрофоретична Са2+-акумулююча система мітохондрій [Kosterin S.A. et al., 1994; Bernardi P., 1999; Duchen M.R., 2000; Kostyuk P.G., 2000; Pozzan T. et al., 2000; Rizzuto R. et al., 2000; Magalhaes P.J., 2001].

Ця система задіяна у процесі передачі сигналу із цитоплазми в мітохондріальний матрикс для стимуляції дихання та окислювального фосфорилювання [Kavanagh N.I. et al., 2000; Евтодиенко Ю.В., 2000; Дерябина Ю.И., 2000]. Значна увага цій транспортній системі приділяється в зв`зку з центральною роллю мітохондрій в механізмах, що пов`язані із клітинним апоптозом [Brustovetsky N., Dubinsky J., 2000; Duchen M.R., 2000; Smaili S.S., 2000; Галитовский В.Е. Гогвадзе В.Г., 2001; Beutner G., 2001].

Іони Са акумулюються у мітохондріях за рахунок електрохімічного трансмембранного потенціалу протонів H+, який генерується на внутрішній мембрані дихальним ланцюгом чи АТР-синтазою (протонною чи Н+-АТРазою, F0F1-АТРазою, V комплексом окислювального фосфорилювання) [Литошенко А.Я., 2001; Бойер П.Д., 2001; Blum D.J., 2001]. Розроблені уявлення щодо молекулярно-функціональної організації АТР-синтази як турбіноподібного мотора, що обертається [Литошенко А.Я., 2001].

Втім, дані щодо властивостей системи транспорту Са2+ в мітохондріях гладеньких м'язів вельми обмежені. Мова йде, наприклад, за її катіонну та субстратну специфічність, спорідненість до реагентів (Mg2+, ATP, субстрат окиснення, фосфат, Са2+), чутливість до дії інгібіторів та фізико-хімічних факторів (рН, іонне оточення).

В ряді робіт були наведені переконливі докази того, що деякі метаболіти, зокрема поліамін спермін, у концентраціях, що відповідають такій у цитоплазмі, проявляють істотний активуючий вплив на Са2+-транспортуючу систему мітохондрій різних тканин [Дерябина Ю.И., 2000]. Вважають, що зміни концентрації сперміну в клітині можуть призводити до помітного підвищення здатності мітохондрій накопичувати і утримувати іони Са [Евтодиенко Ю.В., 2000]. При вагітності збільшується вміст поліамінів в тканинах матки жінок [Бердинских Н.К., Залеток С.П., 1987]. Проте сучасні уявлення щодо закономірностей впливу сперміну на енергозалежний трансмембранний обмін Са2+ у мітохондріях гладеньком'язових клітин матки вельми обмежені.

Привабливою експериментальною моделлю для вивчення енерго-залежного транспорту Са2+ у внутрішньоклітинних депо гладеньких м`язів є суспензія міоцитів, попередньо оброблених розчином неіонного детергенту дигітоніну з метою підвищення неспецифічної проникності плазматичної мембрани [Horowitz A., 1996; Sutko I.L., 1996; Fiskum G. et al., 2000; Yang Z., 2000]. Як виявилось, використання дигітоніну у невеликих концентраціях (~0,1 мг/мл) не призводить до руйнування ендоплазматичного ретикулуму та мітохондрій і забезпечує доступ компонентів середовища інкубації (реагенти, інгібітори, іонофори, іони тощо) до внутрішньоклітинних Са2+-транспортуючих систем [Kargacin M.E., 1995; Шлыков С.Г. и др., 1997; Дерябина Ю.И., 2000]. При цьому акумуляцію Са2+ у мітохондріях у дослідах, виконаних із використанням ізотопної техніки (45Са2+), можна тестувати як таку, що не є чутливою до дії тапсигаргіну чи циклопіазонієвої кислоти, а накопичення Са2+ у ретикулумі - як таке, що гальмується цими інгібіторами [Бабіч Л.Г., 1999; Camello-Almaraz C. et al., 2000; Borisova L.A., 2002; Kupittayanant S. et al., 2002].

Отже, актуальною є надійна біохімічна ідентифікація системи Mg2+,ATP-залежного транспорту Са2+ у мітохондріях клітин міометрія, вивчення її властивостей та чутливості до дії сперміну.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертація відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу біохімії м`язів Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України (проблема “Біохімія тварин та людини”): тема 2.10.5 № 0194И013509 “Вивчення біохімічних механізмів регуляції концентрації Са2+ у гладеньком`язових клітинах та ролі систем енергозалежного транспорту цього катіона у контролі скорочення - розслаблення гладеньких м`язів” (І кв. 1994 – IV кв. 1998 р.); тема 2.10.5, № 0199И000270 “Вивчення біохімічних механізмів електро- та фарма-комеханічного спряження у гладеньких м`язах та ролі систем енергозалежного транспорту Са2+ у забезпеченні цього процесу” (І кв. 1999 – IV кв. 2003 р.).

Мета та задачі дослідження. Мета роботи: у дослідах, виконаних на обробленій розчином дигітоніну суспензії гладеньком`язових клітин матки щурів, вивчити з використанням ізотопного методу (45Са2+) властивості системи Mg2+,ATP-залежного транспорту іонів Са у мітохондріях міометрія.

Для досягнення зазначеної мети було сформульовано такі основні задачі:

1. У дослідженнях, проведених із використанням селективних інгібіторів мембранозв`язаних енергозалежних Са2+-транспортуючих систем (рутенієвий червоний, азид натрію, тапсигаргін, циклопіазонієва кислота) та Са2+-іонофора А-23187, тестувати Mg2+,ATP-залежну акумуляцію Са2+ у мітохондріях.

2. Вивчити властивості Са2+-акумулюючої системи мітохондрій: катіонну та субстратну специфічність, концентраційні залежності впливу реагентів на транспорт Са2+, чутливість до дії інгібіторів та фізико-хімічних факторів – рН, одновалентних іонів.

3. Дослідити вплив сперміну на енергозалежне накопичення іонів Са у мітохондріях.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше у дослідах, виконаних на суспензії міоцитів, оброблених розчином дигітоніну (0,1 мг/мл), проведено систематичне дослідження властивостей Са2+-акумулюючої системи мітохондрій гладенького м'язу матки.

Доведено, що нечутлива до дії тапсигаргіну і циклопіазонієвої кислоти акумуляція Са2+ у міоцитах, оброблених розчином дигітоніну, повністю гальмується рутенієвим червоним та азидом натрія і відбувається у мітохондріях. Значення початкової швидкості транспортного процесу становить 1260+130 пмоль Са2+/106 клітин за 1 хв. Транспортна система мітохондрій є специфічною стосовно АТР та іонів Mg.

Двовалентні катіони неспецифічно пригнічують Mg2+,ATP-залежний транспорт Са2+ у мітохондріях відповідно до послідовності: Cu2+ > Ni2+ > Co2+.

Досліджені та кінетично охарактеризовані залежності швидкості акумуляції Са2+ у мітохондріях від концентрацій Mg2+, ATP (у присутності сукцинату), сукцинату (у присутності АТР), неорганічного фосфату та Са2+.

Вивчена чутливість Са2+-акумулюючої системи мітохондрій до апро-бованих інгібіторів Mg2+,ATP-залежних мембранозв`язаних кальцієвих помп. Пригнічувальний ефект цих речовин на накопичення Са2+ у мітохондріях відповідає послідовності: рутенієвий червоний > еозин Y ~ n-хлормеркурібен-зоат >> о-ванадат ~ азид натрію.

Трансмембранний обмін Са2+ у мітохондріях є чутливим до зміни рН середовища інкубації, але не залежить від концентрації іонів Na в ньому.

Поліамін спермін активує Mg2+,ATP-залежне накопичення Са2+ в мітохондріях (значення уявної константи активації Ка становило 0,43+0,04 мМ).

Одержані результати розширюють сучасні уявлення щодо біохімічних механізмів контролю кальцієвого обміну в гладеньком'язових клітинах, властивостей Са2+-транспортуючої системи у мітохондріях цих м'язів.

Практичне значення одержаних результатів. Продемонстровано, що суспензія міоцитів, попередньо оброблених розчином дигітоніну, є перспективною експериментальною моделлю для дослідження властивостей Са2+-транспортуючої системи мітохондрій міометрія, вивчення впливу внутрішньоклітинних метаболітів на неї (на прикладі сперміну).

Результати, що були одержані, мають значення для розробки методів спрямованої корекції активності Са2+-транспортуючої системи мітохондрій міоцитів матки.

Особистий внесок здобувача. Дисертантка особисто одержувала суспензію гладеньком'язових клітин матки щурів, проводила досліди по вивченню акумуляції іонів Са в мітохондріях клітин міометрія із використанням ізотопної методики (45Са2+) (деякі з таких експериментів було виконано разом із к.б.н. Шинловою О.П.), а також безпосередньо проводила кінетичний та статистичний аналіз фактичних результатів.

Дисертанткою самостійно здійснено аналіз та узагальнення відповідних літературних даних. Головна ідея та задачі досліджень були сформульовані науковим керівником – доктором біологічних наук, професором Костеріним С.О. Аналіз експериментальних результатів, їх узагальнення, інтерпретацію та формування основних положень і висновків роботи проведено спільно із науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що викладено в дисертації, були апробовані на таких наукових конференціях: конкурс молодих вчених Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України у 2001 р. (ІІ місце); конференція “Биология – наука 21го века“, Пущино, Росія, 2001 р.; конференція, що була присвячена відкриттю Українського молекулярно-біологічного товариства, 2001 р., Київ, Україна; міжнародна конференція з інформотерапії: теоретичні аспекти і практичне застосування, 2001 р., Київ, Україна; 6-та Пущинська школа-конференція молодих вчених, 2002 р., Пущино, Росія; ІІ Львівсько-Люблінська конференція з експериментальної та клінічної біохімії, 2002 р., Люблін, Польща; VII Український біохімічний з`їзд, 1997 р., Київ, Україна. Результати експериментів доповідались на наукових семінарах відділу біохімії м'язів, загальноінститутському семінарі та засіданнях Вченої Ради Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України.

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 4 статті у фахових наукових журналах та 6 тез доповідей у матеріалах міжнародних та українських наукових конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 167 сторінках машинописного тексту і складається з таких розділів: “Вступ”, “Огляд літератури”, “Методи досліджень”, “Результати досліджень та їх обговорення”, “Заключний розділ”, “Висновки” та “Список використаних джерел”, який містить 260 посилань. Робота ілюстрована – 37 рисунками та 4 таблицями.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Огляд літератури складається з одного розділу. Він присвячений загальним уявленням щодо транспорту Са2+ у мітохондріях, автоколивань концентрації іонів Са у матриксі мітохондрій і цитозолі клітин, функціональній ролі системи транспорту Са2+ в цих субклітинних структурах, а також деяким особливостям транспорту іонів Са в мітохондріях гладеньких м'язів.

MEТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Суспензію гладеньком`язових клітин матки невагітних щурів, естрогенізованих за 16 годин до забору тканини [Rao P. et al., 1986] (внутрішньом`язово вводили 50 мкл 0,1% розчину естрадіолу), одержували із використанням колагенази і соєвого інгібітору трипсину за допомогою методу [Mollard Р. et al., 1986] з деякими модифікаціями.

Функціональну активність електрофоретичної Mg2+,АТР-залежної Са2+-транспортуючої системи мітохондрій (МХ) тестували в експериментах, що були виконані на суспензії міоцитів матки, оброблених розчином дигітоніну. Концентрація дигітоніну у стандартному середовищі інкубації (склад наведено у розділі “Результати досліджень та їх обговорення”) становила 0,1 мг/мл. Доведено, що додавання дигітоніну у цій концентрації беспосередньо в середовище інкубації надійно забезпечує підвищення неспецифічної проникності плазматичної мембрани клітин міометрія і, відповідно, доступність ефекторів (реагенти, інгібітори тощо) до енергозалежних Са2+-транспортуючих систем, локалізованих у внутрішньоклітинних структурах, та не впливає на структурно-функціональні властивості цих структур [Fiscum G. et al., 1985; Шлыков C.Г. и др., 1997]. Енергозалежну акумуляцію Са2+ в ендо-плазматичному ретикулумі гальмували тапсигаргіном (100 нМ). Для пригнічення енергозалежного накопичення Са2+ у МХ використовували рутенієвий червоний (10 мкМ) або азид натрію (10 мМ).

Транспорт Са2+ у МХ клітин міометрія щурів, за умов обробки останніх розчином дигітоніну, вивчали за допомогою ізотопної методики з вико-ристанням 45Са2+ (див. розділ “Результати досліджень та їх обговорення”). Як правило, акумуляцію Са2+ ініціювали внесенням аліквоти (50 мкл) суспензії міоцитів (кінцева кількість клітин в пробі - 200-500 тисяч) в стандартне або модифіковане по своєму складу середовище інкубації (об`єм – 0,5 мл). Кількість Са2+, акумульованого МХ міоцитів в енергозалежному процесі (пмоль/106 клітин), розраховували по різниці між загальним накопиченням цього катіону із стандартного (чи модифікованого по концентраціям реагентів) середовища інкубації та його адсорбцією на поверхні субклітинних структур у випадку використання інкубаційних середовищ, що не містять АТР (або MgCl2). При вивченні пасивного транспорту Са2+ в МХ клітини матки попередньо навантажували 45Са2+ в стандартному середовищі інкубації із наступним гальмуванням подальшої акумуляції Са2+ в МХ рутенієвим червоним (10 мкМ). В усіх дослідах транспортні процеси зупиняли шляхом швидкого фільтрування інкубаційної суміші через мембранні фільтри ("Хіміфіл", Естонія або "Millipor", США) (діаметр пор 0,45 мкм). Радіо-активність фільтрів вимірювали за допомогою сцинтиляційного лічильника.

Необхідний діапазон концентрацій іонізованого Са задавали із використанням ЕГТА–вмісного середовища інкубації, до складу якого входили АТР, MgCl2, CaCl2, сукцинат та фосфат [Костерин С.А., 1990].

Експериментальні дані були оброблені із застосуванням загальноприйнятих методів кінетичного аналізу та варіаційної статистики із використанням персонального комп`ютера типу IBM PC/AT за спеціально складеними програмами [Варфоломеев С.Д., 1999]. Графіки побудовано за допомогою програми Excel. Уявні квазірівноважні константи, що характеризують спорідненість Са2+-транспортуючої системи до реагентів (Кm по АТР та сукцинату, КMg2+ по Mg2+, КCa2+ по Са2+) та ефекторів (І0,5 – для інгібіторів та іонів металів, Ка – по сперміну) розраховували, виходячи із лінеаризованих рівнянь Хілла, Ейзенталя-Корніш-Боуден, Едді-Хофсті. Зна-чення коефіцієнтів кореляції r лінеаризованих графіків становили 0,96 - 0,99.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

1. Тестування Mg2+,ATP-залежної акумуляції Са2+ у мітохондріях клітин міометрія, оброблених розчином дигітоніну, було проведене з використанням селективних інгібіторів мембранозв`язаних енергозалежних Са2+-транспортуючих систем (рутенієвий червоний, азид натрію, тапсигаргін, циклопіазонієва кислота) та Са2+-іонофора А-23187.

Отже, на першому етапі дослідження ми вивчили загальні закономірності енергозалежного транспорту Са2+ в суспензії клітин міометрія, що були оброблені розчином дигітоніну (рис. 1).

Гладеньком`язові клітини матки мали здатність акумулювати 1660+56 пмоль Са2+/106 міоцитів за 5 хв (n=8) при 37оС із стандартного середовища інку-бації, що містило дигітонін (0,1 мг/мл) і мало наступний склад (мМ): HEPES (pH=7,4) - 25, 125 - KCl, NaCl - 25, ATP - 3, сукцинат Na - 3, MgCl2 - 3, Pi (в вигляді К-фосфатного буферу) - 2, (40CaCl2+ 45CaCl2) - 0,01 (контроль) (рис. 1, стовпчик 1). У відсутності іонів Mg транспорт Са2+ взагалі не спостерігався.

В присутності в середовищі інкубації 50 нМ тапсигаргіну – селективного інгібітора Са2+-помпи ендо(сарко)плазматичного ретикулуму [Wictome M. et al., 1992; Hoth M. et al., 1997; Camello-Almaraz C. et al., 2000; Рубцов А.М., 2001], міоцити накопичували 1480+43 пмоль Са2+/106 міоцитів за 5 хв (n=8) (рис. 1, стовпчик 2), тобто на 10% менше, ніж у першому випадку (рис. 1, стовпчик 1).

Для накопичення Са2+ за вказаних експериментальних умов вкрай необхідна наявність у середовищі інкубації АТР, але не субстрату окиснення (сукцинату), бо у відсутності АТР у цьому середовищі (за наявності сукцинату) (рис. 1, стовпчик 4) накопичення Са2+ складало лише 105+15 пмоль Са2+/106 міоцитів за 5 хв, і, таким чином, зменшувалось на 94-95% відносно контролю (рис. 1, стовпчик 1). У відсутності ж сукцинату у середовищі інкубації (але за наявності АТР) транспорт Са2+ гальмується лише на 45% (рис. 1, стовпчик 3) відносно контролю (рис. 1, стовпчик 1). Цікаво відзначити, що стимулююча дія сукцинату на накопичення Са2+ спостерігалась лише за наявності АТР у середовищі інкубації: у відсутності нуклеозидтрифосфату, але у присутності сукцинату накопичення Са2+ було дуже низьким (рис. 1, стовпчик 4). В останьому випадку рівень акумуляції Са2+ практично відповідав такому, що

Рис. 1. Mg2+,АТР-залежна акумуляція Са2+ в клітинах міометрія в умовах моди-фікації складу середовища інкубації, що містило дигі-тонін (0,1 мг/мл) (n=8).

1 – контроль: стандартне середовище інкубації (ССІ) (не містило тапсигаргін); 2 – ССІ, що містило тапсигаргін (50 нМ); 3 – ССІ, що не містило сукцинат; 4 – ССІ, що не містило АТР; 5 – ССІ, що не містило АТР і сукцинат; 6 – ССІ, що містило рутенієвий червоний (10 мкМ); 7 – ССІ, що містило азид натрію (10 мМ).

спостерігався за умов одночасної відсутності АТР та сукцинату у середовищі інкубації (рис. 1, стовпчик 5).

Інгібітори енергозалежного транспорту Са2+ в МХ – рутенієвий червоний (10 мкМ) і азид натрію (10 мМ) - пригнічували включення Са2+ в гладень-ком`язові клітини до рівня 309+19 і 472+21 пмоль Са2+/106 міоцитів за 5 хв, тоб-то на 80-82% і 70-72% (рис. 1, стовпчики 6 і 7 відповідно) відносно контролю (рис. 1, стовпчик 1). Пригнічувальний вплив рутенієвого червоного на нечутли-ву до дії тапсигаргіну (100 нМ) енергозалежну акумуляцію Са2+ в гладенько-м`язових клітинах матки був значно ефективнішим, ніж азиду натрію: значення уявної константи інгібування І0,5 становило 0,6+0,2 мкМ та 0,9+0,1 мМ відповідно (n=8) (рис. 2). Тому у подальших експериментах для пригнічення акумуляції Са2+ в МХ, як правило, використовували саме рутенієвий червоний.

Із наведених вище даних випливає, що в клітинах міометрія нами ідентифікована система нечутливої до дії тапсигаргіну Mg2+,АТР-залежної акумуляції Са2+, яка пригнічується рутенієвим червоним і азидом натрію (рис. 1 та 2) та, відповідно, локалізована саме у МХ. Що ж стосується чутливої до інгібіторної дії тапсигаргіну (різниця між стовпчиками 1 та 2 на рис. 1) та резистентної до впливу рутенієвого червоного та азиду натрію (стовпчики 6 та 7 відповідно на рис. 1) складової акумуляції Са2+ у міоцитах, то вона, згідно із літературними даними [Borisova L.A., 2002], відзеркалює функціонування Mg2+,АТР-залежної кальцієвої помпи ендоплазматичного ретикулуму.

В подальших експериментах ми дослідили кінетику акумуляції Са2+ в МХ міоцитів, оброблених розчином дигітоніну. Нечутливу до дії тапсигаргіну

Рис. 2. Кінетичний аналіз за методом Хілла концентраційних залежностей впливу рутенієвого червоного та азиду натрію на нечутливу до дії тапсигаргіну (100 нМ) Mg2+,АТР - залежну аку-муляцію іонів Ca в клітинах міометрія.

Тут А0 і А - акумуляція Са2+ у відсутності і присутності інгібіторів відповідно, І - інгібітор.

(100 нМ) Mg2+,АТР-залежну акумуляцію іонів Са у гладеньком`язових клітинах визначали по різниці між загальною акумуляцією Са2+ (рис. 3, графік 1) і нако-пиченням катіона за відсутності АТР (рис. 3, графік 2) у стандартному середовищі інкубації. Накопичення Са2+ зростало в часі протягом 1-5 хв, на 3-5-ій хвилинах спостерігався стаціонарний рівень акумуляції катіону (в середньому 1460+54 пмоль Са2+/106 міоцитів) (n=7) (рис. 3, графік 3). Подальше збільшення часу інкубації приводило до незначного зменшення кількості іонів Са, які акумулювались в МХ. Початкова швидкість акумуляції Са2+ (V0) складала 1260+130 пмоль Са2+/106 міоцитів за 1 хв (n=7).

Рис. 3. Кінетика нечутливої до дії тапсигаргіну (100 нМ) Mg2+,ATP-залежної акумуляції Са2+ в клітинах міометрія (n=5).

1 – загальна акумуляція Са2+;

2 – накопичення Са2+ при відсутності АТР; 3 – Mg2+,ATP-залежна акумуляція Са2+, що визначена по різниці між графіками 1 і 2.

Стаціонарний рівень акумуляції Са2+ у МХ зумовлений суперпозицією двох процесів: активного накопичення його у матриксі та пасивного вивільнення іонів Са із нього. За фізіолігічних умов пасивна проникність внутрішньої мембрани МХ для іонів Са дуже низька [Костерин С.А., 1990]. В дослідах, проведених на клітинах міометрія, що були оброблені розчином дигітоніну, ми вивчили пасивне вивільнення Са2+ із МХ (рис. 4).

Рис. 4. Звільнення Са2+ із клітин міометрія, оброблених розчином дигітоніну, що індукується ЕГТА і кальцієвим іонофором

А-23187 (див. текст).

МХ попередньо навантажували Са2+ в ході енергозалежної акумуляції цього катіону (час інкубіції – 5 хв) із стандартного середовища інкубації, після чого транспортний процес зупиняли шляхом додавання в середовище аліквоти розчину рутенієвого червоного (кінцева концентрація – 10 мкМ) (рис. 4, графік 1, точка на осі ординат) з наступним розведенням (на 5 хв) клітинної суспензії в два рази ізотонічним розчином, який містив 0,01 мМ рутенієвий червоний, але не містив АТР і сукцинат Na. Як видно (рис. 4, графік 1, інтервал часу 0-5 хв), за 5 хв, які пройшли після зупинки транспортного процесу рутенієвим червоним, із клітин міометрія пасивно звільняється не більше 10% від кількості попередньо акумульованого Са2+. Це вказує на той факт, що на рівні викорис-тання такої експериментальної моделі, як суспензія міоцитів, оброблених роз-чином дигітоніну, для МХ міометрія властива надійна (відносно Са2+) бар`єрна функція внутрішньої мембрани. Внесення в середовище інкубації ЕГТА (кінце-ва концентрація – 1 мМ) на 5-й хв, яка пройшла після зупинки процесу акумуляції Са2+ рутенієвим червоним, призводило до збільшення швидкості виходу іонів Са, попередньо накопичених у МХ. Втім, при цьому встановлю-валась нова рівновага для іонів Са у системі “мітохондрії – середовище розве-дення”, яка характеризувалась відносною стабільністю його вмісту на рівні 6-10 хв інкубації (рис. 4, графік 1, момент внесення аліквоти розчину ЕГТА вказаний стрілкою, інтервал часу 5 – 10 хв). Кальцієвий ж іонофор А-23187 (кінцева концентрація – 1 мкМ), внесений в стандартне середовище інкубації разом з ЕГТА (кінцева концентрація – 1 мМ) через 5 хв після зупинки процесу енергозалежного включення Са2+ в пермеабілізовані міоцити рутенієвим червоним, індукував практично повне оборотне швидке звільнення попередньо акумульованого катіону в середовище інкубації (рис. 4, графік 2, час добавки аліквоти розчину А-23187 і ЕГТА вказаний стрілкою, інтервал часу 5 – 10 хв).

Внесення ж аліквоти розчину ЕГТА (кінцева концентрація – 1 мМ) в стандартне середовище інкубації в умовах початкової присутності в ньому рутенієвого червоного (10 мкМ) (рис. 4, графік 3, інтервал часу 5 – 10 хв) практично не впливало на вміст Са2+ в клітинах міометрія, що були оброблені розчином дигітоніну (рис. 4, графік 3).

Наведені дані, що були отримані у дослідах на суспензії міоцитів матки, оброблених розчином дигітоніну (0,1 мг/мл) (рис. 1 - 4), свідчать про наступне: нечутливе до дії тапсигаргіну оборотне накопичення Са2+ у міоцитах матки, оброблених розчином дигітоніну, яке пригнічується рутенієвим червоним (І0,5 = 0,6+0,2 мкМ) та азидом натрію (І0,5 = 0,9+0,3 мМ) – то є прояв функціонування саме системи Mg2+,ATP-залежного транспорту Са2+ у МХ. У той же час дигітонін як такий у концентрації 0,1 мг/мл практично не впливає на бар`єрну (відносно іонів Са) функцію внутрішньої мембрани МХ.

2. Вивчення властивостей Са2+-акумулюючої системи мітохондрій міоцитів матки.

На другому етапі дослідження ми, використовуючи модель суспензії міо-цитів, оброблених розчином дигітоніну, дослідили деякі властивості нечутливо-го до дії тапсигаргіну Mg2+,ATP-залежного транспорту Са2+ в МХ міометрія.

2.1. Катіонна специфічність. Ми знайшли, що катіонна специфічність стосовно забезпечення акумуляції іонів Са у МХ за умов заміни іонів Mg на інші двовалентні катіони задовільняє слідуючій послідовності: Mg2+ >> Co2+, Ni2+, Cu2+. Таким чином, для здійснення акумуляції Са2+ у МХ міоцитів матки іони Mg практично не можуть бути замінені на іони Co, Ni чи Cu.

2.2. Вплив іонів двовалентних металів (Ме2+). Cu2+, Ni2+ та Co2+, що були внесені до Mg2+,ATP-вмісного стандартного середовища інкубації, з різним ступенем ефективності пригнічували енергозалежну акумуляцію іонів Са в МХ клітин міометрія. При цьому іони Сu найбільш ефективно гальмували акумуляцію Са2+, повний ефект пригнічення спостерігався при концентрації іонів Сu, рівній 10-4 М. Уявна константа інгібування І0,5 для Сu2+ складала 4,2+0,2 мкМ (n=7). В малих концентраціях (10-6 - 10-5 М) Co2+ і Ni2+ практично не впливають на енергозалежний транспорт Ca2+ в МХ. Проте, починаючи з концентрації Me2+ 10-4 М, інгібуючий ефект зростає, досягаючи максимуму при величині концентрації іонів Co і Ni, що становить 10-2-10-3 M. У випадку дії іонів Ni величина уявної константи інгібування І0,5 складала 51+7 мкМ (n=7). Гальмівний ефект іонів Со був значно слабшим, значення уявної константи інгібування І0,5 складало 290+30 мкМ (n=7). Безперечно, в основі пригнічувального ефекту Ме2+ на акумуляцію Са2+ у МХ є комплексні події – конкуренція між Ме2+ та Ca2+ за Ca2+-уніпортер, розведення радіоактивної мітки у матриксі як наслідок можливої акумуляції Ме2+ у МХ, прямий ефект Ме2+ на проникність внутрішньої мембрани МХ для іонів Са тощо (див., зокрема, [Дубицький Л.О., Вовканич Л.С., 1996, 2000]).

Отже, згідно із значеннями І0,5, катіони двовалентних металів Ме2+ неспецифічно гальмують Mg2+,ATP-залежний транспорт Са2+ у МХ клітин міометрія відповідно послідовності: Сu2+ > Ni2+ > Со2+.

2.3. Специфічність до нуклеозидтрифосфатів. Нами було показано, що МХ міоцитів матки здатні акумулювати Са2+ в енергозалежному процесі із середовища, яке містить АТР і сукцинат, і практично не здатні накопичувати іони Са у присутності сукцинату, але при відсутності АТР (рис. 1, стовпчик 4). Ці результати відповідають даним, одержаними іншими дослідниками [Bernardi P., 1999]. Втім, при заміні АТР на інші нуклеозидтрифосфати (GTP, СТР, UTP) Mg2+-залежне накопичення катіону в МХ клітин міометрія було дуже низьке: лише в присутності GTP накопичення складало 10% від контрольної величини; при використані СТР і UТР акумуляція іонів Са не перевищувала 1% від контрольного рівня (час інкубації – 10 хв.). Отже, субстратна специфічність системи енергозалежного накопичення Са2+ у МХ гладеньком`язових клітин відповідає послідовності АТР >> GTP > CTP > UTP. Таким чином, для системи транспорту Са2+ у МХ міоцитів матки характерна висока субстратна специфічність відносно АТР.

2.4. Вплив різних концентрацій Mg2+. Ми знайшли, що іони Mg абсолютно необхідні для забезпечення чутливої до дії азиду натрію та рутенієвого червоного і резистентної до дії тапсигаргіну АТР-залежної акумуляції Са2+ у клітинах міометрія. Активність Mg2+,АТР-залежної Са2+-акумулюючої системи МХ зростає по мірі збільшення концентрації іонів Mg від 10-3 до 10-2 М за умов фіксованих концентрацій АТР (3 мМ) та сукцинату натрія (3мМ) в інкубаційному середовищі. Значення оптимальної для акумуляції Са2+ концентрації Mg2+ складає 10 мМ. Значення величини уявної константи активації по Mg2+ (KMg2+) складає 4,27+0,04 мМ (n=5). Отже, ця величина є фізіологічно значимою, бо відповідає концентрації Mg2+ у міоцитах [Lamb G.D., 2002; Chakraborti S. et al., 2002]. При подальшому зростанні концентрації Mg2+ до 410-2 М цей катіон істотно гальмує акумуляцію Са2+ (на 65% від макси-мального значення, що спостерігається при концентрації Mg2+ 10 мМ). Гальмівний ефект пов`язаний, мабуть, з тим, що за умов використання Mg2+ у концентрації >10 мМ останній може блокувати накопичення Са2+ у МХ шляхом зв`язування безпосередньо біля транспортного центру або опосередковано – через так званий “заряд-екрануючий ефект” [Рубцов А.М., 2001].

2.5. Вплив різних концентрацій АТР. Приймаючи до уваги високий рівень субстратної специфічності системи акумуляції іонів Са у МХ клітин міометрія щодо АТР, ми дослідили концентраційну залежність впливу цього нуклеозидтрифосфату на транспортний процес.

Графік залежності накопичення Са2+ в МХ клітин міометрія від концентрації АТР в інкубаційному середовищі, яке містить 3 мМ сукцинату і 3 мМ MgCl2, має куполоподібний вигляд. Підвищення концентрації АТР в сере-довищі інкубації в діапазоні від 0,1 до 3 мМ призводило до активації транспорту Са2+, при подальшому зростанні концентрації АТР до 10 мМ спостерігається пригнічення процесу акумуляції Са2+. Значення оптимальної для акумуляції Са2+ концентрації АТР складає 1-3 мМ. Величина уявної константи Міхаеліса (Кm) по нуклеозидтрифосфату дорівнює 0,10+0,01 мМ (n=6) (рис. 5) і є фізіологічно значимою [Gommans I.M. et al., 2002; Lamb G.D., 2002].

В цілому важлива роль АТР у забезпеченні Mg2+,АТР-залежної акумуляції іонів Са у МХ міометрія (рис. 1, стовпчики 2, 4 та 5; рис. 3; рис. 5) відзеркалює дію АТР-синтази як оборотного спряжуючого пристрою: цей турбіноподібний мотор може використовувати енергію гідролізу АТР для генерації H+, забезпечуючи транспорт протонів через мембрану проти градієнту їхньої концентрації [Литошенко А.Я., 2001].

Рис. 5. Концентраційна залежність впливу АТР на Mg2+-залежну акумуляцію іонів Ca в мітохондріях клітин міометрія (n=6).

2.6. Вплив різних концентрацій сукцинату. При відсутності сукцинату в середовищі інкубації накопичення іонів Са у МХ складає – 58 - 60% від конт-рольного значення. Підвищення концентрації сукцинату в цьому середовищі в діапазоні від 1 до 10 мМ стимулювало Mg2+,АТР-залежну акумуляцію Са2+ у МХ клітин міометрія. Максимальне накопичення Са2+ в присутності 3 мМ АТР і 3 мМ MgCl2 спостерігається при концентрації сукцинату натрія > 3 мМ. Значення уявної константи Міхаеліса Кm по цьому субстрату складає 0,30+0,05 мМ (n=6). Отже, за присутності нуклеозидтрифосфату Са2+-акумулююча система МХ гладенького м`язу матки має, судячи по значенню Кm для сукцинату, фізіологічно значиму чутливість до субстрату окиснення [Bernardi P., 1999; Duchen M.R., 2000].

2.7. Вплив різних концентрацій неорганічного фосфату. Фосфат калію, внесений у середовище інкубації, яке містило АТР (3мМ) і Mg2+ (3 мМ), потенціює нечутливе до дії тапсигаргіну Mg2+,АТР-залежне включення іонів Ca в клітини міометрія. Накопичення іонів Са в МХ зростало із збільшенням концентрації Са2+-преципітуючого аніона в інтервалі від 0,1 до 10 мМ. При відсутності фосфату калію в середовищі інкубації суспензії міоцитів, що були оброблені розчином дигітоніну, акумуляція Са2+ у МХ складає 83-85% від контрольного значення (тобто за умов присутності у середовищі інкубації 2 мМ фосфату).

2.8. Вплив різних концентрацій Са2+. Важливою “паспортною” характеристикою кальцієвого уніпортера МХ є його спорідненість до субстрату переносу, що тестується по величині уявної константи активації по іонізованому Са (КСа2+).

Ми знайшли, що підвищення концентрації вільного кальцію в середовищі

Рис. 6. Концентраційна залежність впливу іонізованого кальцію на Mg2+,АТР-залежну акумуляцію іонів Са в мітохондріях клітин міометрія (n=5).

інкубації в діапазоні 10-7 - 10-5 М призводило до активації енергозалежного транспорту даного катіону у МХ (щодо розрахунку концентрації вільного каль-

цію в системі, що містить CaCl2, MgCl2, ATP і ЕГТА, див. розділ “Методи дослідження”). Залежність рівня накопичення субстрату переносу від концентрації Са2+ має тенденцію до насичення. Значення концентрації катіону, при якій спостерігається максимальне накопичення Са2+, становить 510-6 М, величина КСа2+ по Са2+ становить 1,0+0,1 мкМ (n=5) (рис. 6).

Ці дані підтверджують результати, що були одержані раніше у випадку використання таких експериментальних моделей, як фракції ізольованих субклітинних мембранних структур: у випадку міометрія спорідненість Са2+-транспортуючої системи МХ до іонів Са значно менша, ніж спорідненість Mg2+,АТР-залежної кальцієвої помпи плазматичної мембрани (КСа2+ = 0,3 - 0,6 мкМ) [Kosterin S.A. et al., 1994; Бабіч Л.Г., 1999; Слінченко Н.М., 2000].

2.9. Вплив деяких інгібіторів кальцієвих помп. Як відомо, у біохімічних дослідженнях, що присвячені вивченню мембранних механізмів контролю внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу, активно використовуються різноманітні інгібітори енергозалежних Са2+-помп та Са2+-обмінників [Gatto C., 1995]. Так, наприклад, використання речовин, дія яких приводить до гальмування акумуляції Са2+ в МХ (азид натрію NaN3, рутенієвий червоний, 2,4-динітрофенол, олігоміцин), ендоплазматичному ретикулумі (тапсигаргін, циклопіазонієва кислота), а також активного транспорту Са2+ через плазматичну мембрану (еозин Y), дозволяє “виключити” ту чи іншу мембранозв`язану енергозалежну Са2+-транспортуючу систему [Inesi G., 1994]; це відкриває перспективи для оцінки її парціального внеску в контроль внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу і скоротливої відповіді м`яза.

Раніше було продемонстровано, що рутенієвий червоний та азид натрію NaN3 ефективно інгібують Mg2+,ATP-залежний транспорт іонів Са в МХ клітин міометрія (І0,5 = 0,6+0,2 мкМ і І0,5 = 0,9+0,3 мМ відповідно) (див. рис. 1, 2). Ми дослідили концентраційний вплив деяких інших інгібіторів активного трансмембранного переносу Са2+, що мають різну хімічну природу (тапсигаргін, циклопіазонієва кислота, о-ванадат натрія, n-хлормеркурібензоат, еозин Y), на Са2+-транспортуючу систему МХ клітин міометрія (рис. 7).

Високоефективні інгібітори Mg2+,ATP-залежної кальцієвої помпи ендо(сарко)плазматичного ретикулуму тапсигаргін та циклопіазонієва кислота (ЦПК), що були використані у концентрації 10-9 – 10-7 та 10-9 – 10-5 М відповідно, практично не впливали на акумуляцію Са2+ в МХ міометрія (рис. 7, графіки 1 та 2 відповідно).

Рис. 7. Концентраційні залежності впливу інгібіторів на Mg2+,АТР-залежну акумуляцію Са2+ в мітохондріях клітин міометрія (n=7).

За 100% прийнято значення Mg2+,АТР-за-лежної транспортної активності, яка вимі-рювалась за відсутності інгібіторів в середовищі інкубації. Час інкубації – 10 хв. ЦПК – циклопіазонієва кислота, n-ХМБ - n-хлормеркурі-бензоат, І – інгібітор.

0 25 50 75 100

[Тапсигаргін], нМ

В діапазоні концентрацій 10-6-10-4 М ортованадат Na пригнічує Mg2+,ATP-залежний транспорт Са2+ в МХ гладеньком`язових клітин матки лише на 10% в порівнянні з контрольним рівнем, подальше збільшення концентрації ортованадату до 10-3 М призводить до інгібування кальцієвого уніпортера МХ клітин міометрія на 70% в порівнянні з контрольною величиною. Величина уявної константи інгібування І0,5 дорівнює 0,6+0,2 мМ (n=6) (рис. 7, графік 3).

При підвищенні концентрації n-хлормеркурібензоату (n-ХМБ) до 10-6 М енергозалежний транспорт Са2+ в МХ міоцитів матки інгібується незначно – не більше, ніж на 20% від контрольної величини, проте при збільшенні концентрації n-хлормеркурібензоату до 10-5 – 10-4 М акумуляція іонів кальцію в МХ гальмується майже повністю – на 90-95% відносно контрольного значення. При цьому величина І0,5 складає 3,1+0,3 мкМ (n=6) (рис. 7, графік 4).

При концентрації еозину Y 10-4 М також повністю інгібується Mg2+,ATP-залежний транспорт Са2+ в МХ. Значення уявної константи інгібування І0,5 при цьому складає 2,1+0,4 мкМ (n=6) (рис. 7, графік 5).

Таким чином, у відповідності до значень І0,5, гальмівний ефект інгібіторів енергозалежних Са2+-транспортуючих систем на Mg2+,ATP-залежну Са2+-транспортуючу систему МХ клітин міометрія задовільняє послідовності (рис. 2, 7): рутенієвий червоний > еозин Y ~ n-хлормеркурібензоат >> о-ванадат ~ азид натрію.

2.10. Вплив рН та іонів Na. Закислення середовища інкубації (рН=8,0-6,0) призводить як до пригнічення нечутливого до дії тапсигаргіну та чутливого до дії рутенієвого червоного енергозалежного накопичення Са2+ у клітинах міометрія, оброблених розчином дигітоніну, так і до стимуляції пасивного звільнення катіону із міоцитів після зупинки попередньої акумуляції Са2+ в них рутенієвим червоним.

У той же час було знайдено, що ізотонічна заміна K+ на Na+ у середовищі абсолютно не впливає на вказані транспортні процеси.

Ці дані підтверджують результати, що були одержані при використанні іншої експериментальної моделі – фракції ізольованих МХ міометрія [Костерин С.А., 1990], стосовно наявності у цих субклітинних структурах системи Н+-Са2+ обміну, але відсутності в них системи Na+-Ca2+-обміну. Можлива функціональна роль системи Н+-Са2+ обміну у забезпеченні вивільнення іонів Са із МХ міометрія за умов in vivo підлягає ретельному подальшому вивченню.

3. Дослідження впливу сперміну на енергозалежне накопичення іонів Са у мітохондріях гладеньком'язових клітин матки.

Полікатіону сперміну належить важлива роль в регулюванні різних біохімічних процесів, які протікають в живій клітині [Bernardi P., 1999; Дерябина Ю.И., Звягильская Р.А., 2000]. У 1988 р. Kroner H. висловив припущення, що спермін є алостеричним регулятором Са2+-уніпортера МХ збудливих тканин. Дія сперміну імовірно обумовлена його зв`язуванням з самим переносником [Вотякова Т.В., 1992]. Зміни концентрації сперміну в клітині можуть істотно підвищити здатність МХ накопичувати і утримувати