Національна академія наук України

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця

___________________________________________________________________

ВІТКО ЮЛІЯ МИХАЙЛІВНА

УДК 577.352:616-006.6

ОБ`ЄМРЕГУЛЬОВАНІ ХЛОРНІ КАНАЛИ В КЛІТИНАХ

КАРЦИНОМИ ПРОСТАТИ: ВПЛИВ КАЛЬЦІЙХЕЛАТУЮЧИХ РЕЧОВИН, рН і ПРОТЕАЗ

03.00.02 – біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук

Шуба Ярослав Михайлович,

провідний науковий співробітник

відділу загальної фізіології нервової системи

Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Офіційні опоненти: академік НАН України, доктор біологічних наук Магура Ігор Сильвестрович, професор кафедри молекулярної фізіології і

біофізики Фізико-технічного навчального Центру НАН

України

доктор біологічних наук, професор Романенко Олександр Вікторович, завідувач кафедри біології Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця, МОЗ України

Провідна установа: Київський Національний університет імені Тараса Шевченка,

біологічний факультет, кафедра біофізики

Захист відбудеться11.03.2003 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця 4.

Автореферат розісланий 10.02.2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук З.О. Сорокіна-Маріна

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. За статистичними даними карцинома простати є другою після раку легенів причиною смертності серед чоловіків від ракових захворювань (Parker et al.,1997). Незважаючи на значимість цієї проблеми, біологічні основи регуляції росту нормальної простати і механізми, відповідальні за її злоякісне переродження, залишаються нез'ясованими. Донедавна проблеми фізіології та патології простати вирішувалися головним чином за допомогою біохімічних, гістологічних та молекулярно-біологічних методів. Водночас є переконливі дані про те, що такі процеси, як проліферація, диференціювання й апоптоз, котрі визначають як нормальний, так і патологічний ріст клітин, супроводжуються істотними змінами їхніх мембранних провідностей (Schlichter et al., 1996, Skryma et al., 1997, Nilius B., 2001, Okada et al., 2001). Дослідження мембранних провідностей у клітинах простати методами електрофізіології перебувають на початковій стадії і ще не з'ясовано типи іонних каналів, які вони експресують та роль цих каналів у злоякісному переродженні клітин.

Багато з фундаментальних механізмів канцерогенезу простати можуть бути ефективно дослідженими при використанні in vitro моделей, якими є клітинні лінії, що походять від різних типів первинних злоякісно перероджених клітин простати людини. Одна з таких ліній - епітеліальні клітини лінії LNCaP (Lymph Node Carcinoma of the Prostate), які в умовах in vitro зберігають практично всі властивості первинних епітеліальних клітин, включаючи андроген-залежність росту, синтез кислих фосфатаз і секреторну активність (Horoszewicz et al., 1983). Показано, що потенціалкеровані калієві канали, котрі експресуються в клітинах LNCaP, задіяні в їхній проліферації (Skryma et al., 1997, 1999). Нещодавно в цих самих клітинах було виявлено аніонний канал, активність якого регулюється змінами об'єму клітини (ОРАК - об'ємрегульований аніонний канал, в англійському варіанті - VRAC – volume-regulated anion channel) (Shuba et al., 2000). Цей канал, переносячи хлорний струм, що активується у відповідь на набрякання клітини (ICl,swell), можливо, бере участь у регуляторному відновленні об'єму (РВО, в англійському варіанті RVD – regulatory volume decrease), проте ні його біофізичні властивості, ні його регуляція ендо- і екзогенними факторами поки що не вивчені. Враховуючи те, що за даними, отриманими в дослідженнях на інших об'єктах, функціонування ОРАК може бути пов'язане з білками, які посилено експресуються при злоякісному переродженні клітин (Valverde et al., 1992, Gottesman and Pastan, 1993, Wu et al., 1996), а також з причини його ймовірної участі в процесах онкогенезу й трансформації (Сhou C.Y.,1995, Nilius B., 1997), надзвичайно актуально з'ясувати функціональні властивості й роль ОРАК у ракових клітинах простати, а також визначити фактори, що беруть участь у модуляції його роботи. Серед таких факторів особливий інтерес викликає кальцій як універсальний внутрішньоклітинний посередник, активно задіяний в процесах проліферації, диференціювання й апоптозу (Berridge, 1995, Berridge et al., 1998), зовнішньоклітинний рН, який у пухлинних тканинах зсувається у кислий бік (Stubbs et al., 1999), а також внутрішньоклітинні протеази, що здатні значно модифікувати функціональні характеристики іонних каналів (Armstrong et al., 1973, Hescheler and Trautwein, 1988, Zagotta et al., 1990).

Мета і задачі дослідження. Метою дослідження було визначити основні фізіологічні та біофізичні властивості об'ємактивованої хлорної провідності в епітеліальних клітинах простати LNCaP, вивчити модулюючу роль низки екзогених факторів на її функції і на підставі цього зробити обгрунтовані висновки щодо структурної організації об'ємрегульованого хлорного каналу. Для досягнення даної мети було поставлено наступні задачі:

1) відтворити експериментальні умови, що дозволяють адекватно реєструвати хлорний струм ICl,swell у клітинах LNCaР;

2) вивчити основні властивості ICl,swell у клітинах LNCaР (чутливість до змін клітинного об'єму, характеристики активації та потенціалзалежної інактивації);

3) з'ясувати роль зовнішньоклітинного кальцію і кальційхелатуючих речовин у функціонуванні ОРАК;

4) дослідити вплив зовнішньоклітинного рН на характеристики ICl,swell;

5) дослідити вплив внутрішньоклітинних протеаз на ICl,swell;

6) на підставі отриманих результатів зробити висновки про наявність структурних детермінант, що зумовлюють рН-залежність, проникність, об'ємчутливість і інактивацію об'ємрегульованого хлорного каналу.

Наукова новизна одержаних результатів. Усі експериментальні дані, представлені в роботі, отримано вперше: виявлено двофазність змін амплітуди, а також зміни інактиваційних властивостей і об'ємчутливості ICl,swell у клітинах LNCaР під впливом змін зовнішньоклітинної концентрації протонів; описано ефект внутрішньоклітинних протеаз на ICl,swell і встановлено їхній модифікуючий вплив не тільки на амплітудні та кінетичні характеристики струму, але й на його чутливість до змін клітинного об'єму; показано пряму блокуючу дію кальційхелатуючих речовин на об'ємрегульований хлорний канал. Дістало подальший розвиток уявлення про розміри іонопровідної пори ОРАК. Отримані експериментальні дані дозволили зробити внесок у з'ясування структурної організації об'ємрегульованого хлорного каналу і механізми його інактивації.

Теоретичне і практичне значення одержаних результатів. Отримані результати мають насамперед теоретичне значення, оскільки сприяють більш глибокому розумінню будови, функціонування та фізіологічної ролі об'ємрегульованого хлорного каналу, а також природи його потенціалзалежної інактивації. Практичне значення мають результати щодо прямого впливу кальційхелатуючих речовин на об'ємзалежний хлорний струм, які спонукають до більш ретельного вибору типу і концентрації хелаторів для специфічних експериментальних потреб, із урахуванням прямої дії хелаторів кальцію на іонні струми. Практичне значення мають також дані щодо рН-залежності ICl,swell, які, зважаючи на те, що пухлинний рН є істотно нижчим за рН нормальної тканини, вказують на можливе послаблення процесу РВО в ракових клітинах.

Особистий внесок здобувача. Експерименти з вимірювання РВО і визначення впливу кальцію та кальційхелатуючих речовин на ICl,swell було проведено разом із Преварською Н. та Скримою Р. - співробітниками лабораторії клітинної фізіології Університету Наук і Технологій м. Ліль (Франція). Всі інші електрофізіологічні експерименти й обробка експериментального матеріалу було виконано здобувачем особисто. Культивування клітинної лінії LNCaР проводилося старшим науковим співробітником Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України к.б.н. Н. Х. Погорєлою. Обговорення результатів досліджень, планування експериментів і формулювання висновків проводилося спільно з науковим керівником д.б.н. Я. М. Шубою.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи викладалися та обговорювалися на міжнародному симпозіумі “Intracellular Signalling in Plant and Animal Systems” (Київ, вересень, 2001р.), міжнародній конференції “The first Multilateral Conference of the Physiologists from Central Europe” (Братислава, лютий, 2002 р.), 46-му щорічному зборі Біофізичного товариства США (Сан-Франциско, лютий, 2002 р.), ХVI з`їзді Українського фізіологічного товариства (Вінниця, травень, 2002 р.), ІІІ з`їзді Українського біофізичного товариства (Львів, жовтень, 2002 р.), семінарах Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця (Київ, 2000 - 2002).

Публікації. За результатами роботи опубліковано чотири статті та тези п`яти доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, опису результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел із 200 найменувань. Робота викладена на 140 сторінках та містить 37 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Клітинна культура. Клітини лінії LNCaP (American Type Culture Collection) культивували в середовищі RPMI 1640 з доданням 5 ммоль/л L-глутаміну, 10%-ної ембріональної бичачої сироватки (“Gibco BRL”,США), 50000 од/л пеніциліну та 50 мг/мл стрептоміцину. Клітини вирощували в флаконах (50 мл) при 37°С в інкубаторі зі зволоженою атмосферою, що містила 5% СО2. Для досліджень клітини висаджували в чашки Петрі й використовували протягом 4-6 діб.

Електрофізіологічний експеримент і розчини. Мембранні струми в клітинах LNCaP реєстрували з використанням методики “петч-клемп” в конфігурації “ціла клітина”. Осмотичність ізо- та гіпотонічних розчинів становила 310 та 190 мосмоль/л відповідно. Склад базового зовнішньоклітинного гіпотонічного розчину HypoTEA був таким (ммоль/л): CaCl2 - 2, MgCl2 - 2, Glucose - 10, HEPES - 10, TEACl - 80; в ізотонічному розчині IsoTEA - TEACl - 145; склад гіпотонічного розчину без вмісту двовалентних катіонів (DVC-free HypoTEA): Glucose - 10, HEPES - 10, TEACl - 80, Ca2+-хелатор - 0-40.

Реєструвальну піпетку заповнювали внутрішньоклітинним розчином такого складу (ммоль/л): KOH - 100, KCl - 40, MgCl2 - 1, HEPES - 10, EGTA - 10, Mg-ATФ - 5, рН 7,2. Опір реєструвальних піпеток складав 3-5 МОм. Трипсин (1 мг/мл) та соєвий інгібітор трипсину (10 мг/мл) додавали безпосередньо у внутрішньоклітинний розчин, без істотних змін осмотичності. Вільна концентрація кальцію [Ca2+]free за наявності Ca2+-хелаторів визначалася за допомогою програми WinMax 1.7 (Brooks and Storey, 1992). Заміни зовнішніх розчинів проводили за допомогою багатоствольної мікропіпетки зі спільним витоком, який розташовували біля досліджуваної клітини.

Обробка одержаних результатів. Аналіз даних виконувався з використанням аналітичних програмних продуктів (pCLAMP 6.0, Axon Instruments; Origin 5.0 (Microcal Software). Експериментальні точки подані на графіках як усереднені значення ± стандартна похибка середнього. Статистична вірогідність результатів визначалась за крітерієм t Стьюдента (Р<0,05 вважалось статистично вірогідним).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Характеристика об'ємчутливої хлорної провідності в клітинах лінії LNCaP. Зміна нормального зовнішньоклітинного розчину на розчин із зниженою на 40% тонічністю викликала розвиток додаткового струму, потенціал реверсії якого становив -20±2,4 мВ, що за значенням досить близько до розрахункового рівноважного потенціалу для іонів хлору - -17,5 мВ (рис. 1, рис. 5, В). Таким чином, цей струм було ідентифіковано як "ICl,swell" (Shuba et al., 2000). Для того, щоб відокремити досліджуваний об'ємактивований хлорний струм від ТЕА-чутливого калієвого струму (Skryma et al., 1997, 1999), ми використовували ТЕА як основний катіон для зовнішньоклітинних розчинів.

Рис. 1. Об'ємактивований хлорний струм ICl,swell в клітинах LNCaP.

ICl,swell починав розвиватися після затримки (латентний період) 68±12 с і набував максимальної щільності в 63±7 пА/пФ при +120 мВ протягом наступних 298±55 с в той час, коли повернення в ізотонічний розчин призводило до досить швидкого і фактично повного зменшення ICl,swell протягом 103±28 с. Повернення в розчин IsoTEA супроводжувалося також миттєвим підвищенням струму у вихідному напрямку, що підтверджує його хлорну природу, адже концентрація хлору в IsoTEA була вища порівнянно з HypoTEA (рис. 5, А, Б). У відповідь на ступінчасту деполяризацію до потенціалів вищих за +60 мВ спостерігалася інактивація цього струму, рівень якої збільшувався з підвищенням деполяризації (рис. 1). При потенціалі +120 мВ зменшення струму внаслідок інактивації можна було описати як суму експоненційно спадаючої та стаціонарної складових зі сталою часу експоненти (фin), яка коливалася в різних серіях експериментів від 67±5 мс до 102±5 мс, і амплітудою (Aexp), яка більш, ніж в 5 разів перевищувала амплітуду постійного струму (Asus) (рис. 6). Апроксимація рівнянням Больцмана дозволила визначити такі показники стаціонарної інактивації контрольного струму як потенціал половинної інактивації, фактор нахилу і мінімальний рівень інактивації. Враховуючи варіабельність у значеннях показників потенціалзалежної інактивації, ми виконували контрольні виміри для кожної серії експериментів.

При вимірюванні відносних змін об`єму клітин через різні проміжки часу після їхнього утримання в стандартному HypoTEA і в HypoTEA з додаванням блокатора хлорних каналів NPPB (100 мкмоль/л) було встановлено, що в стандартному HypoTEA швидке збільшення клітинного об`єму (до 24%) змінювалося на його повільне (протягом 15 хв) зменшення, завдяки розвитку РВО, до практично повного відновлення. В HypoTEA з доданням NPPB відновлення клітинного об`єму відбувалося значно повільніше (лише на 3% від максимального значення за 15 хв). Ці результати свідчать про те, що NPPB блокує і РВО-процес, що, в свою чергу, свідчить на користь безпосередньої участі ICl,swell у РВО.

Вплив Са2+ і кальційхелатуючих речовин на об'ємзалежний хлорний струм. Наявність у HypoTEA як підвищеної концентрації Са2+ (10 ммоль/л), так і повна його відсутність не викликали ніяких змін ні в часових показниках активації ICl,swell у відповідь на зміну тонічності, ні в амплітуді та кінетиці струму, ні в характеристиках його випрямлення.

Для забеспечення достатнього зниження концентрації Са2+ і перевірки можливої модулюючої ролі субмікромолярних концентрацій Са2+ на ICl,swell ми використовували хелатор кальцію EDTA. Заміна стандартного HypoTEA на гіпотонічний розчин без вмісту двовалентних катіонів (DVC-free/HypoTEA) з доданням 10 ммоль/л EDTA призводила до миттєвого зменшення амплітуди ICl,swell (рис. 2, А). Струм, що залишався після цього зменшення, мав подібний до контрольного потенціал реверсіі, що визначає його хлорну природу. Модифікація полягала в потенціалзалежному блокуванні ICl,swell, ступінь якого поступово підвищувався від 20% при -100 мВ до 50-60% при +50 мВ без суттєвого збільшення цього рівня за більш високої деполяризації. Кінетика ICl,swell залишалася без змін.

Щоб відповісти на питання, чи пов'язана модифікація ICl,swell з якимось специфічним впливом EDTA або з його здатністю знижувати концентрацію двовалентних катіонів, ми провели подібні експерименти з двома іншими хелаторами Са2+ - BAPTA і HEDTA. Відсоток блокування струму був найбільшим у BAPTA (67%), меншим у EDTA (49%) і найменшим у HEDTA (35%). Розрахунки показали, що [Са2+]free у розчинах, які містили 10 ммоль/л відповідних хелаторів, становила 1,2х10-11 моль/л для BAPTA, 2,5х10-12 моль/л для EDTA і 2,5х10-10 моль/л для HEDTA, що є значно нижчим від фізіологічного рівня. Ці дані підтверджують те, що зміни в [Ca2+]out не відіграють ролі в блокуванні ICl,swell. Більше того, аплікація розчину DVC-free/HypoTEA, в якому [Ca2+]free була забуферена на постійному рівні 2х10-7 моль/л, але з використанням 10 ммоль/л хелаторів, призводила до різного рівня блокування ICl,swell (BAPTA - 65%, EDTA - 26%, HEDTA - 7%), що виключає залучення Ca2+ до блокування струму.

Рис. 2. EDTA блокує ICl,swell у LNCaP клітинах. А - записи струмів у розчині IsoTEA, контрольного, EDTA-блокованого та ICl,swell після відмивання EDTA (лінія співпадає з контролем). Б - доза-залежність блокуючої дії хелаторів Са2+. В - різниця в блокуванні ICl,swell 10 мМ EDTA при рН6 и рН8 (n=6).

Це блокування не корелювало також із концентрацією вільного хелатора, що свідчить про високу специфічність серед них. Таким чином, можна припустити, що прямий специфічний вплив хелаторів кальцію на об'ємрегульований хлорний канал викликає блокування ICl,swell. На рис. 2, Б зображено криву доза-ефект для блокуючої дії хелаторів кальцію на ICl,swell. Результати апроксимування експериментальних даних ізотермами Ленгмюра показали, що BAPTA - найбільш ефективний блокатор ICl,swell, концентрація половинного блокування якої становила IC50=70 мкмоль/л, а рівень максимального блокування Аmax=67%. Ефективність блокування для EDTA становила IC50=1,7 ммоль/л і Аmax=49%, для HEDTA - IC50=23 ммоль/л і Аmax=40%.

З огляду на те, що ОРАК є аніонним каналом, цілком вірогідно, що EDTA-індуковане блокування ICl,swell при підвищенні деполяризації можна пояснити існуванням стопорного механізму, в якому негативно заряджена EDTA підходить до зовнішнього устя каналу завдяки збільшенню рушійної сили, де вона може взаємодіяти з позитивно зарядженою ділянкою, що відповідає за аніонну селективність, і закриває таким чином провідну пору для проходу хлору. Якщо ця гіпотеза є вірною, то EDTA-індуковане блокування ICl,swell повинно бути рН-залежним, збільшуючись за лужних значень рН завдяки підвищенню змісту EDTA форм із негативним зарядом, і навпаки. Дійсно, підвищення рН розчину HypoTEA до рН8,2 само по собі викликало підвищення амплітуди ICl,swell майже вдвічі, однак подальша аплікація DVC-free/HypoTEA із доданням 10 ммоль/л EDTA при такому же рН викликала блокування струму на 87,4±7% (при +100 мВ), яке було значно більшим за блокування при нормальному рН7,2 - 49,7±6,3% і при рН6 - 30,7±4% (рис. 2, В) .

Крім лінії LNCaP, подібні експерименти на лінії щурячої базофільної лейкемії (RBL-2H3) і кератиноцитах HACaT показали, що ні К+-струм в LNCaP, ні Kv1.3-опосередкований К+-струм в RBL-2H3 клітинах не були чутливі до зовнішньоклітинної BAPTA. Однак 0,5 ммоль/л BAPTA блокувало ICl,swell в RBL-2H3 клітинах на 49,7±5,3% (n=6) і ICl,swell в HACaT клітинах на 35,7±6,4% (n=4). Ці експерименти дають вагому підставу припустити, що чутливість до хелаторів кальцію є загальною рисою всіх ОРАК, незалежно від типу клітин.

Вплив зовнішньоклітинного рН на об'ємактивований хлорний струм в епітеліальних клітинах карциноми простати. При переведенні клітини із IsoTEA в гіпотонічний розчин зі зміненими значеннями рН активація струму відбувалася з часовими показниками, які суттєво відрізнялися від контрольних. Так, при зниженні рН до 5-ти латентний період вірогідно скорочувався приблизно вдвічі (від 68±12 с до 30±4 с), а час розвитку – приблизно в 5 разів (від 298±55 с до 62±8 с) порівняно з контролем. Одночасно максимальна щільність ICl,swell зменшувалася майже на 40% (від 63±7 пА/пФ до 38±4,5 пА/пФ). Залуження HypoTEA до рН9 призводило до протилежних змін - час розвитку струму та його максимальна щільність збільшувалися приблизно на 50% (відповідно до 490±40 с та 97±19,3 пА/пФ), тоді як латентний період залишався практично незмінним порівняно з контролем (рис. 4, А).

Для того, щоб визначити, наскільки швидко відбуваються рН-індуковані зміни, в наступній серії експериментів ми попередньо розвивали ICl,swell при контрольному рН, а вже потім прикладали гіпотонічні розчини з тестовими значеннями рН. Як видно з часової залежності змін струму, як закислення, так і залуження зовнішнього гіпотонічного розчину призводили до двофазових змін ICl,swell (рис. 3).

Рис. 3. Часова залежність розвитку ICl,swell у відповідь на зміни зовнішньоклітинного рН (тут і далі: при підтримуючому потенціалі - нижній графік, при потенціалі +20 мВ - верхній графік) .

При закисленні струм спочатку короткочасно (транзиєнтно) потенціювався, а потім поступово зменшувався до нового стаціонарного значення, нижчого за те, яке він мав до переходу в більш кисле середовище. Перехід до лужних значень рН супроводжувався протилежними відхиленнями струму – короткочасне пригнічення змінювалося довготривалою потенціацією. Сталість потенціалу реверсії всіх ВАХ свідчить про те, що, як у ході короткочасних так і довготривалих змін амплітуди, рН не призводить до активації додаткових струмів та/або до змін селективності самих ОРАК. рН-викликані довготривалі зміни ICl,swell не були потенціалзалежними, тоді як рівень транзиєнтної потенціації струму у відповідь на закислення середовища був помітно вищим при позитивних потенціалах.

На рис. 4, Б приведені усереднені рН-залежності транзиєнтних та стаціонарних змін амплітуди ICl,swell при +120 мВ. У результаті апроксимації експериментальних точек кривими титрування ми одержали такі показники для транзиєнтних змін ICl,swell: Amax=1,46, Amin=0,91, pK=6, n= -8, а для стаціонарних -

Amax=1,52, Amin=0, pK=5,9, n=3,7 (Amax та Amin - максимальні та мінімальні відносні зміни, pK - уявна константа титрування, n - коефіцієнт Хілла).

Рис. 4. Вплив зовнішньоклітинного рН на об'ємзалежність, амплітуду та інактивацію ICl,swell. А - латентний період (1), час розвитку (2) (зліва) і щільність ICl,swell при +120 мВ (справа) в контролі та при зміні рН. Б - криві титрування стаціонарних і транзиєнтних змін амплітуди. В - значення стаціонарної інактивації, суцільні лінії апроксимують експериментальні точки за рівнянням Больцмана.

рН впливав також на і на кінетику інактивації ICl,swell при позитивних мембранних потенціалах (рис. 4, В). Проаналізувавши рН-залежність характеристик інактивації ICl,swell, можна побачити, що їхні зміни зі зміною рН не є монотонними. Так, стала часу інактивації виявилась мінімальною при рН6 (фin=58,47±2,4мс), підвищуючись при зміні рН як в лужний (до фin=102,3±5 мс при рН 7,2 та 142,3±1,7 мс при рН 8), так і в кислий (до фin=193,3±11,6 мс при рН 5) боки від цього значення. Водночас відношення амплітуди експоненційно спадаючої складової до амплітуди стаціонарної було найбільшим при контрольному значенні рН7,2, зменшуючись по обидва боки від нього. Апроксимація кривих стаціонарної інактивації ICl,swell рівнянням Больцмана вказує на те, що потенціал половинної інактивації (V1/2) зі збільшенням рН зсувається в позитивну ділянку, становлячи +54, +45,8, +83,2 та +117,7 мВ для значень рН, рівних 5, 6, 7,2 та 8. При цьому фактор крутизни (k) для тих самих значень рН становив -26, -27, -31,2 та –44,6 мВ, а мінімальний рівень інактивації (І8) – 0,63, 0,18, 0,24 та 0,33 відповідно (рис. 4, В).

Вплив внутришньоклітинного введення трипсину на характеристики ICl,swell. За наявності внутрішньоклітинного трипсину в клітинах LNCaP у відповідь на прикладання гіпотонічного розчину активувався струм, потенціал реверсії якого був подібним до контрольного, але зі значно зміненими показниками розвитку, інактивації та максимальної амплітуди. Наявність трипсину призводила до значного прискорення реакцій ICl,swell на зміни зовнішньоклітинної осмотичності.

Рис. 5. Вплив внутрішньоклітинного введення трипсину на об'ємзалежність і амплітуду ICl,swell. А - розвиток ICl,swell при змінах зовнішньоклітинної тонічності в контролі і за наявності трипсину. Б - латентний період (1), час розвитку (2), час зменшення (3) струму та вольт-амперні характеристики (С) в контролі і в клітинах предіалізованих трипсином. Латентний період, час розвитку струму та час його зменшення скорочувалися більш ніж утричі порівнянно з контролем (латентний період - від 68±12 с до 23,33±3,3 с, час розвитку - від 298,33±55,04 с до 93,33±38,4 с, час зменшення - від 103,33±28,48 с до 40±15,27 с (рис. 5, Б)). Внутрішньоклітинне введення трипсину спричинювало також значне уповільнення інактивації ICl,swell при високих позитивних потенціалах (рис. 6) та більш ніж дворазове збільшення його максимальної щільності (від 62,6±6,9 пА/пФ при + 120 мВ в контролі до 138,25±10,3 пА/пФ при аплікації трипсину ). На рис. 6 порівнюються пронормовані записи струмів ICl,swell при +120 мВ, отримані від контрольних та трипсиндіалізованих клітин.

Рис. 6. Трипсин-індукована модифікація інактивації ICl,swell. Пронормовані струми при потенціалі +120 мВ (зліва) та усередненні значення стаціонарної інактивації, апроксимованні за рівнянням Больцмана (справа).

Аналіз фази експоненційного спаду цих струмів свідчить про те, що сповільнення інактивації під дією трипсину відбувається завдяки значному збільшенню сталої часу експоненційно спадаючої складової (від 67±5 мс до 170±29 мс), зменшенню її амплітуди та одночасному збільшенню амплітуди стаціонарної складової настільки, що внесок обох компонент в загальний ICl,swell ставав приблизно однаковим.

Апроксимація рівнянням Больцмана кривої стаціонарної інактивації модифікованого трипсином ICl,swell (рис. 6, справа), показала, що така модифікація також призводить до позитивного зсуву потенціалу половинної інактивації майже на 10 мВ (від V1/2=++59,76±2,9 мВ до V1/2=+69,3±7,3 мВ), зменшення потенціалчутливості на 12% (від k=-26,13±1,8 мВ до k=- 29,2±3,8 мВ) і до збільшення мінімального рівня інактивації майже в 3 рази порівняно з контролем (від I8=0,20±0,03 до I8=0,53±0,4).

Додання до внутрішньоклітинного розчину разом з 1мг/мл трипсину 10 мг/мл інгібітора трипсину усувало протеолітичні модифікації ICl,swell таким чином, що всі його характеристики не відрізнялися від контрольних, що вказує на те, що ці ефекти дійсно пов`язані з протеолітичною активністю ферменту.

Взаємодія ефектів рН і трипсину. Для того, щоб перевірити адитивність ефектів рН і трипсину, ми прикладали розчини HypoTEA із різними тестовими значеннями рН (від рН4 до рН9) до предіалізованих трипсином клітин LNCaP, в яких попередньо розвивали ICl,swell внаслідок аплікації HypoTEA з нормальним рН7,2. HypoTEA із тестовими значеннями рН прикладалися після повного розвитку ефектів трипсину та гіпотонічності. Перехід як до лужних, так і до кислих значень рН супроводжувався змінами всіх характеристик ICl,swell, подібно до таких у контрольних клітинах (без трипсину).

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

В роботі було досліджено об'ємрегульовані аніонні канали у клітинах карциноми простати.

З огляду на те, що фармакологічні блокатори ОРАК зазвичай блокують і РВО (Bond et al., 1998), вважається, що об'ємрегульовані хлорні канали беруть участь у РВО (Eggermont et al., 2001, Nilius et al., 1997, Okada, 1997). Однак далеко не зрозуміло, чи є РВО єдиною, або навіть основною фізіологічною функцією ОРАК. У наших експериментах показано, що при блокуванні ICl,swell в клітинах LNCaP відновлення об'єму клітин не відбувалося, що свідчить про визначальну роль ОРАК у регуляторному відновленні об'єму цих клітин. Проте робити висновки про додаткові фізіологічні функції ОРАК у клітинах простати, окрім регуляції клітинного об'єму, поки передчасно. Пригнічення ICl,swell при кислих значеннях рН, які характерні для пухлин, може свідчити про послаблення процесу РВО ракових клітин. Проте можлива участь ОРАК в інших клітинних процесах поки не дозволяє однозначно визначити, як рН-залежність ICl,swell позначиться на розвитку пухлини.

У наших експериментах на клітинах карциноми простати ми не зареєстрували впливу змін концентрації [Са2+]out на характеристики ICl,swell. Ці дані узгоджуються з результатами на інших об'єктах (Verdon et al., 1995, Wu et al., 1996). Однак при зосередженні на можливій модуляції ICl,swell субмікромолярними концентраціями зовнішньоклітинного Са2+, ми несподівано винайшли, що кальційхелатуючі речовини, такі як BAPTA, EDTA та HEDTA, самі по собі можуть спричинювати потенціалзалежне блокування ICl,swell.

Вплив хелаторів Са2+ на клітинні процеси, як правило, вважається опосередкованим тільки через зміну концентрації полівалентних катіонів. Однак існують докази, що BAPTA та EGTA можуть прямо впливати на Ca2+-активовані К+ канали (Urbano and Buno, 1998) і Ca2+ канали (Bodding and Penner, 1999) хромаффіних клітин, а також блокувати К+ струми в гранулярних нейронах мозочка (Watkins and Mathie, 1996). Ці дані свідчать про те, що деякі канали можуть мати специфічні сайти взаємодії з Ca2+ хелаторами.

Наші досліди показали, що різні хелатори викликають різне блокування ОРАК. Серед трьох протестованих хелаторів ВАРТА виявилась найбільш ефективним блокатором. Блокування ICl,swell було більш вираженим при позитивних потенціалах, коли струм мав вихідний напрямок, асоційований із вхідним потоком негативно зарядженого хлору.

Результати про рН-залежність EDTA-індукованого блокування ICl,swell свідчать про те, що ефективність блокування пов'язана з негативним зарядом трьох вільних форм хелатора в розчині. Це може означати, що механізм блокування полягає в наступному. Негативно заряджена молекула хелатора при мембранних потенціалах, що підвищують рушійну силу для її руху у вхідному напрямку, може входити до зовнішнього устя ОРАК, але, через просторове обмеження і/чи сильне зв'язування, не може пройти через канал, закриваючи тим самим прохід для іонів Cl-. Сталість потенціалу реверсії як без так і за наявності хелаторів свідчить проти їхнього проходження через канал. У цьому випадку підвищення негативного заряду молекули хелатора може, з одного боку, робити цю молекулу більш конкурентноспроможною відносно до хлору за вхід в устя каналу і, з іншого боку, може підсилювати її взаємодію з позитивно зарядженим сайтом (сайтами) ОРАК, що лежать в основі його аніонної вибірковості (McCarty, 2000). Відповідно до такого механізму блокування, EDTA блокує ICl,swell сильніше при більш лужних значеннях рН, коли збільшується частка вільних форм EDTA з більш високим негативним зарядом.

Блокування ОРАК Са2+-хелатуючими речовинами надає важливу інформацію про розміри пори каналу. Існуючі уявлення про розміри пори ОРАК засновані на тих даних, що найбільш великим аніоном, здатним переносити струм через ОРАК, є глюконат з діаметром ~0,54 нм, тоді як молекула АТФ із діаметром ~1 нм вже є ефективним зовнішньоклітинним блокатором каналу (Okada, 1997). Ці відомості накладають обмеження на розмір зовнішнього устя ОРАК приблизно в 1 нм, і встановлюють діапазон у 0,54-1 нм для діаметра його іонпровідної пори. Наші дані про блокування ICl,swell Са2+-хелатуючими речовинами дозволяють понизити верхню межу діаметра пори ОРАК до ~0,8 нм, що відповідають розрахунковому діаметру молекули EDTA.

Наші результати показали, що блокування ICl,swell хелаторами Ca2+ не є специфічним для LNCaР клітин, а являє собою явище загального характеру, що не залежить від типу клітин. Таким чином, для задоволення специфічних експериментальних потреб необхідно здійснювати ретельний добір типу і концентрації Ca2+ -хелаторів.

Відомо, що вплив зовнішньоклітинного рН на функції мембранних іонних каналів та відповідних їм струмів зводиться до двох основних ефектів – зсуву потенціалзалежних характеристик струму та зміни його амплітуди і кінетики (Hille, 2000).

У наших експериментах уперше показана комплексність дії зовнішньоклітинного рН на ICl,swell в епітеліальних клітинах карциноми простати. Виявилося, що рН впливає не тільки на амплітудні та кінетичні характеристики струму, але і на його чутливість до змін клітинного об`єму. Зокрема, наші результати свідчать, що сенсор об`єму каналу, очевидно, має в своєму складі молекулярну групу, повернуту в зовнішній простір, протонування якої прискорює реакцію каналу на набрякання клітини.

Ефекти рН на амплітудні та кінетичні характеристики ICl,swell виявилися складними. З наших результатів можна зробити висновок, що амплітуда ICl,swell контролюється принаймні двома рН-залежними групами. Швидкі зміни амплітуди струму можна пов'язати з протонуванням групи, яка, судячи з того, що ці зміни залежать від величини мембранного потенціалу, найімовірніше знаходиться всередині пори каналу. Протонування цієї групи з рК=6 відповідає за швидке короткочасне і порівняно незначне (максимум на 60%) посилення струму при зниженні рН, яке повільно змінюється довготривалим пригніченням. Останнє відбувається внаслідок протонування іншої, вже поверхневої, групи з близьким рК=5,9, яке призводить до майже повного, потенціалнезалежного блокування струму при рН, нижчих за 4. Які з цих змін пов`язані зі впливом рН на провідність каналу, а які зі впливом на ймовірність його знаходження у відкритому стані поки що судити важко. За аналогією з ендотеліальними клітинами, в яких було показано, що провідність VRAC потенціалнезалежним чином конролюється зовнішньою аніонною групою з рК=4,6 (Sabirov et al., 2000), можна припустити, що в клітинах LNCaP саме повільний ефект рН на амплітуду ICl,swell зумовлений впливом на провідність каналу, а швидкий – на ймовірність його знаходження у відкритому стані.

рН-залежність виявлених нами змін інактиваційних характеристик ICl,swell є такою, що інактивація струму проявляється найбільше в діапазоні рН6-рН7,2, в той час, як по обидва боки від цих значень спостерігається як зростання постійної часу інактивації, так і зменшення внеску інактиваційної складової в загальний струм. Така поведінка можлива, якщо припустити, що процес інактивації знаходиться під контролем двох молекулярних груп, які взаємодіють між собою (наприклад “ворота” та рецепторна ділянка). Причому, як повне протонування цих груп при низьких рН, так і повне депротонування при високих рН завдяки збільшенню одноіменного заряду не сприяють їх взаємодії, призводячи до сповільнення інактивації.

Про посилення інактивації ICl,swell у вузькому діапазоні рН6-рН7,2 свідчать також криві стаціонарної інактивації. До речі, показаний нами зсув потенціалу половинної інактивації ICl,swell в ділянку більш негативних значень зі зменшенням рН є нетиповим для більшості каналів, для яких подібний зсув відбувається в позитивну ділянку за рахунок нейтралізації іонами Н+ фіксованих негативних поверхневих зарядів мембрани. Цей факт може свідчити про те, що щільність таких зарядів в околиці ОРАК є неістотною, а вказаний зсув відбувається внаслідок впливу іонів Н+ на сам воротний механізм каналу.

Експерименти стосовно впливу трипсину на характеристики ICl,swell показали, що внутрішньоклітинна активність трипсину призводить до: 1) прискорення реакцій ICl,swell на зміни зовнішньоклітинноі осмотичності; 2) усуванню його інактивації; 3) збільшенню амплітуди. Протеолітична модифікація струмів раніше була описана для потенціалкерованих натрієвих (Armstrong et al., 1973), калієвих Mayorga-Wark et al., 1993, Zagotta et al., 1990) та кальцієвих каналів (Hescheler et al., 1988). Основною рисою такої модифікації було значне уповільнення інактивації струмів, яке часто супроводжувалося потенціацією амплітуди. Загалом ці дані свідчать про те, що модифікація інактивації протеолітичними ферментами може розглядатися як доказ існування специфічної внутрішньоклітинної детермінанти, яка відповідає за цей процес. Експерименти з структурно-функціонального аналізу принципових б1- субодиниць натрієвих, калієвих та кальцієвих каналів, експресованих у штучних системах, дозволили ідентифікувати структурні домени цих каналів, задіяні в інактивації (Catterall et al., 1996, Hoshi et al., 1990).

Визначення молекулярних детермінант, які відповідають за протеолітичну модифікацію ICl,swell, описану в нашому дослідженні, ускладнюється тим фактом, що молекулярна природа ОРАК зовсім невідома. Стосовно хлортранспортуючих каналів взагалі, то трипсин-індукована модифікація була продемонстрована для ендогених CFTR (Welsh et al., 1992) і ClC-2 каналів (Grunder et al., 1992, Jordt and Jentsch, 1997).

Показана нами комплексна дія внутрішньоклітинного трипсину на ICl,swell свідчить про те, що детермінанти ОРАК, відповідні за об`ємзалежність, потенціалзалежну інактивацію та провідність, розташовані з внутрішньго боку мембрани та є легко доступними для протеолітичного розщеплення . Проте ми не можемо визначити, яка з цих характеристик ICl,swell першою зазнає модифікації, як це було зроблено для кальцієвих струмів у кардіоміоцитах (Hescheler and Trautwein, 1988), адже активація ICl,swell під впливом гіпотонічності відбувається за час, який порівнянний з часом, необхідним для збільшення концентрації трипсину в клітині. Таке визначення допомогло б судити про відносну доступність окремих детермінант із внутрішньоклітинного боку та зробити обгрунтовані висновки стосовно їх локалізації.

Загалом, майже повне усунення потенціалзалежної інактивації ICl,swell трипсином свідчить про те, що подібно до натрієвих і калієвих каналів, ОРАК може функціонувати відповідно до “ball-and-chain” або “hinged-lid” механізмів та мати у своїй структурі відповідні детермінанти. При цьому, зважаючи на можливу схожість структури ОРАК та членів СlС-родини хлорних каналів можна припустити, що N-терміналь ОРАК відіграє роль “ball-and-chain” воріт з рецепторною ділянкою для “ball”, розташованою на одній з внутрішньоклітинних петель, які з'єднують трансмембранні домени, як це передбачалось для ClC-2 каналу (Jordt and Jentsch, 1997). Схоже, що збільшення щільності ICl,swell у відповідь на дію трипсину, є вторинним до усунення інактиваційних воріт, що призводить до збільшення ймовірності перебування каналів у відкритому стані.

Судження про природу детермінант, відщеплення яких трипсином спричинює збільшення чутливості ICl,swell до змін клітинного об'єму, є досить умовними, адже механізми об'ємочутливості ОРАК досі невідомі. Можна припустити, що чутливість ICl,swell до змін об'єму клітини є наслідком відщеплення всього інактиваційного домену, який за нормальних умов може виконувати аутоінгібуючу функцію, як це було показано для ClC-2 каналу (Grunder et al., 1992, Jordt and Jentsch, 1997).

Ефекти трипсину та лужних значень рН виявилися подібними відносно усунення потенціалзалежної інактивації і збільшення амплітуди струму. Наші експерименти відносно зв'язку ефектів рН та трипсину дозволяють зробити висновок про те, що зовнішньоклітинні протони і внутришньоклітинно прикладений трипсин впливають на різні структурні детермінанти ОРАК і ці 2 ефекти не залежать один від одного. Про це свідчить той факт, що ефект рН на LNCaР клітинах, перфузованих трипсином, практично не відрізнявся від такого без наявності трипсину, а накладався на нього. Аналіз цих результатів дає підставу дійти до висновку про те, що трипсин впливає на інактивацію ОРАК N-типу за допомогою відщіплення внутрішньоклітинного інактиваційного домену. Після розвитку ефекту трипсину й усунення інактивації N-типу в клітинах LNCaР ще більш сильне уповільнення інактивації спостерігалося при зміні концентрації протонів як у кислий, так і в лужний боки, із прискоренням її у вузькому діапазоні рН6-рН7,2. За аналогією з калієвими каналами, що мають поряд із внутрішніми воротами і ворота з зовнішнього боку пори, що зумовлюють С-тип інактивації (Lopez-Barneo et al., 1993, Ogielska et al., 1995), можна припустити, що уповільнення інактивації при зміні зовнішньоклітинної концентрації протонів свідчить про наявність С-типу інактивації в ОРАК, яка здійснюється шляхом протонування взаємодіючих між собою двох молекулярних груп із зовнішнього боку каналу і/або супутніх конформаційних змін каналу.

ВИСНОВКИ

1. На клітинній лінії карциноми простати людини за допомогою методу "петч-клемп" у конфігурації "ціла клітина" досліджені основні характеристики (показники розвитку, зменшення та потенціалзалежної інактивації) трансмембранного хлорного струму ICl,swell, що активується у відповідь на осмотично зумовлене збільшення об'єму клітини, а також їхня модуляція зовнішньоклітинним кальцієм, кальційхелатуючими речовинами, протонами та внутрішньоклітинно прикладеним трипсином. Показано, що активація ICl,swell є одним