ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ НАН УКРАЇНИ

З і н к о в и ч І г о р І в а н о в и ч

Індекс УДК 616.127-092.9

МЕХАНІЗМИ СТІЙКОСТІ МІОКАРДУ ДО ЕКЗОГЕННИХ

-СИМПАТОМІМЕТИКІВ

14.03.04 – патологічна фізіологія

А в т о р е ф е р а т

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Київ – 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Донецькому державному медичному університеті

ім. М.Горького

Науковий консультант: доктор медичних наук, професор

Яблучанський Микола Іванович

Харківський національний університет

ім. В.М. Каразіна, завідувач кафедри терапії

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор

Ткачук Світлана Сергіївна

Буковинська державна медична академія,

професор кафедри фізіології людини

доктор медичних наук, професор, Лауреат

державної премії України

Середенко Михайло Михайлович

Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України,

завідувач відділу по вивченню гіпоксичних станів

доктор медичних наук,

Нещерет Олександр Павлович

Інститут ендокринології та обміну речовин

ім. В. П. Комісаренка, АМН України

провідний науковий співробітник

Провідна установа: Одеський медичний університет

Міністерства охорони здоров’я України

кафедра патологічної фізіології, м. Одеса

Захист відбудеться 08.04.2003 р. о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

(01024 Київ, вул. Богомольця, 4)

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України (Київ, вул. Богомольця, 4)

Автореферат розісланий 26.02.2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук _________________________ З.О.Сорокіна-Маріна

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. З проблемою стійкості організму до дії ушкоджувальних факторів різної природи пов'язують такі поняття, як адаптація, виживаність, раптова смерть, раптова серцева смерть, життєво небезпечні порушення серцевого ритму тощо [Судаков К.В.,1996; Маркова Е.А. и др., 1998; Меерсон Ф.З. и др., 1998; Goraya T.Y. et al., 2000]. Нею в остаточному підсумку визначаються резерви здоров'я, здатність протистояти хворобам чи померти [Сиротинин Н.Н., 1981; Яблучанский Н.И., 2000; Tabib A. et al., 2000; Tedesco C. et al., 2000]. Від розуміння цієї проблеми залежить правильність прийняття рішень у питаннях професійної придатності і багатьох інших [Iльiн В.М., 1999; Fuller C.M., 2000].

Із упровадженням у наукові дослідження і лікарську практику технологій оцінювання регуляторних систем стала очевидною їх визначальна роль у стійкості організму до дії екстремальних факторів [Bigger I.T. et al., 1992; Opthof T. et al., 2000], причому, якщо раніше основний упор робився на вегетативну регуляцію [Баевский Р.М. и др., 1984; Жемайтиту Д.И. 1982; Akselrod S. et al., 1981], то останнім часом усе більше уваги приділяють гуморальним складовим [Iльiн В.М., 1999; Яблучанский Н.И. и др., 2000; Kucera J.P. et al., 2000; Massin M.M. et al., 2000].

У сфері фізіології і патофізіології біологічних систем ключова роль регуляторних систем у проблемах життя і смерті знайшла відображення в нервізмі І.П. Павлова, теоріях реактивності, природної резистентності [Сироти-нин Н.Н., 1981; Судаков К.В., 1996], функціональних систем [Анохин П.К., 1978], закономірностей патологічного процесу [Давыдовский И.В., 1987], загальному адаптаційному синдромі [Selye H., 1956] і ін.

Інтерес до проблеми стійкості організму все більше зростає ще й тому, що, завдяки дослідженням останніх років, стало можливим не лише передбачення, але й попередження смертельних наслідків при екстремальних впливах [Kam R.M. et al., 1999; Guideri F. Et al., 1999].

На сьогодні в розглянутій проблемі стійкості до екстремальних факторів найменше вивчена роль саме гуморально-метаболічних систем. З позицій важливості впливів на структурну стабільність найбільшу увагу приділяють системам ліпопероксидації, циклічних нуклеотидів і простаноїдів. Значення їх для здоров'я і фундаментальна роль у сприятливому перебігу й ускладненнях хвороб не потребують окремих доказів [Барабой В.А., 1991; Губський Ю.І. і ін., 2002].

Беручи до уваги, що фатальною для організму “мішенню” екстремальних впливів є, насамперед, серце, оскільки основною причиною смерті в таких випадках є серцева смерть, природно буде у вивченні місцевого (тканинного) рівня гуморальних і метаболічних факторів стійкості зосередитися саме на цьому органі.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є фрагментом конкурсної науково-дослідної роботи Міністерства охорони здоров'я України, виконаної в 1998-2000 рр. (№ держреєстрації 0197V002096 МК 97.02.02). Дослідження проведені на базі Центральної науково-дослідної лабораторії Донецького державного медичного університету ім. М. Горького.

Мета і задачі дослідження.

Мета дослідження - на основі вивчення показників спектрального аналізу варіабельності серцевого ритму, систем ліпопероксидації, циклічних нуклеотидів, простаноїдів та інших біохімічних характеристик тканинного метаболізму тварин, що вижили або загинули в результаті впливу екстремальними дозами ізадрину, а також реакцій цих систем в ізольованому міокарді на модуляцію місцевої про- і антиоксидантної активності, визначити механізми стійкості міокарда до обробки -симпатоміметиками.

Для досягнення поставленої мети були сформульовані такі основні задачі:

1. на основі використання технології спектрального аналізу варіабельності серцевого ритму вивчити взаємовідношення компонентів нейрогуморальної регуляції в стійкості кроликів до навантаження екстремальними дозами ізадрину;

2. установити зв'язок між початковим станом і змінами системи ліпопероксидації з виживаністю кроликів при парентеральному введенні ізадрину;

3. визначити роль початкового стану і змін системи простаноїдів у виживаності кроликів після введення ізадрину;

4. виявити значущість початкового стану і наступних змін системи циклічних нуклеотидів у виживаності кроликів після введення ізадрину;

5. оцінити внесок структурних змін міокарда у виживаність кроликів після введення ізадрину;

6. визначити роль місцевої (тканинної) ланки гуморально-метаболічних систем у виживаності кроликів після введення ізадрину;

7. установити роль про- і антиоксидантних втручань у гуморально-метаболічний гомеостаз ізольованого міокарда в його реакціях на вплив ізадрином;

8. вивчити ефективність антиоксидантних заходів на рівні ізольованого міокарда при впливі ізадрином.

Об'єкт дослідження – експериментальні кролики, препарати ізольованого міокарда, модельні системи, що імітують in vitro біологічні середовища.

Предмет дослідження - гуморально-метаболічні системи і механізми стійкості міокарда до дії екстремальних доз -симпатоміметика ізадрину.

Методи дослідження – моделювання екстремальних впливів (навантаження ізадрином, експериментальний гострий інфаркт міокарда) на тваринах та ізольованому міокарді, спектральний аналіз варіабельності серцевого ритму для оцінки нейрогуморальної регуляції, біохімічні, біофізичні, радіоімунні та імуноферментні методи оцінки інтенсивності ліпопероксидації, вмісту циклічних нуклеотидів, простаноїдів, метаболітів крові і тканини міокарда для аналізу стану гуморально-метаболічних систем, статистичні методи обробки результатів наукових досліджень.

Наукова новизна одержаних результатів

Уперше:

- виявлені нові відомості про гуморально-метаболічні реакції міокарда на навантаження критичними дозами екзогенного -симпатоміметика ізадрину, що вносить нові положення в теоретичні уявлення про механізми його стійкості до екстремальних впливів;

- визначене значення початкового стану гуморально-метаболічних показників організму і міокарда для сприятливих і несприятливих для життя наслідків у відповідь на вплив ізадрином, що може бути використане в розробці нових способів прогнозування стійкості до дії екстремальних факторів. Розроблені способи захищені авторським свідоцтвом СРСР (N 1745209) і патентом України (N 18934) на винаходи;

- установлені системно-локальний характер гуморально-метаболічного забезпечення стійкості міокарда до дії -симпатоміметика і першорядне значення в ній систем ліпопероксидації, циклічних нуклеотидів і простаноїдів;

- визначені закономірності еволюції гуморально-метаболічних систем у відновлювальному періоді після впливів ізадрином у тварин, що вижили;

- доведено, що провідним механізмом загибелі при впливі екстремальними дозами ізадрину є регуляторні, насамперед, гуморально-метаболічні порушення, але не його пряма пошкоджувальна дія на міокард.

Практична значущість одержаних результатів. Робота належить до фундаментальних досліджень.

Одержані результати поглиблюють існуючі уявлення про гуморально-метаболічні механізми стійкості міокарда до впливу екстремальних доз
-симпатоміметика ізадрину. Конкретизується роль систем ліпопероксидації, циклічних нуклеотидів і простаноїдів. Знання цих механізмів створює передумови для розробки і використання нових підходів до діагностики, прогнозування і профілактики екстремальних станів у медицині.

Розроблено стандартизовані моделі вивчення стійкості тварин до навантаження ізадрином і способи її прогнозування до дії екстремальних факторів, які рекомендуються для використання в експериментальних дослідженнях.

Результати можуть бути використані у навчальному процесі при викладанні нормальної і патологічної фізіології, біохімії, нервових і внутрішніх хвороб, медицини катастроф, у роботі лабораторій науково-дослідних інститутів відповідних наукових напрямків, при написанні підручників і монографій із зазначених галузей теоретичної медицини.

Результати досліджень упроваджені в навчальний процес теоретичних і клінічних кафедр Донецького державного медичного університету ім.М.Горького, Харківського медичного університету, Запорізького медичного університету, Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна, Луганського медичного університету, а також у роботу науково-дослідних лабораторій інституту невідкладної і відновної хірургії АМН України.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно сформульовані напрямки досліджень, їх цілі і завдання, запропоновані і відпрацьовані експериментальні моделі. Ним особисто виконані операційні втручання на кроликах, збір, вивчення й аналіз матеріалів дослідження, статистична обробка отриманих результатів, сформульовані висновки роботи. Автор був відповідальним виконавцем науково-дослідної роботи МОЗ України, виконаної за темою дисертації.

Частина біохімічних і біофізичних досліджень виконана на базі відділу клінічної хімії (зав., к.б.н., ст. науков. співробітник О.Д. Якубенко) ЦНДЛ Донецького медичного університету, за що автор висловлює щиру подяку.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи повідомлені на ІУ Всесоюзному з'їзді патофізіологів “Порушення механізмів регуляції та їхня корекція”, Кишинів, 1989; обласній конференції “Науково- технічні проблеми сучасної терапії”, Харків, 1989; III Всесоюзній конференції “Біоантиоксидант”, Москва, 1989; науково-практичній конференції “Нові додатки морфометрії і математичного моделювання в медико-біологічних дослідженнях”, Харків, 1990; науково-практичній конференції “Структурно-функціональні одиниці та їхні компоненти в органах вісцеральних систем у нормі і патології”, Харків, 1991; школі-конференції молодих учених “Актуальні питання загальної патології і патофізіології”, Новосибірськ, 1991; IY Всесоюзному симпозіумі “Стрес, адаптація і дисфункції”, Кишинів, 1991; науково-практичній конференції “Роль ейкозаноїдів у патогенезі і терапії серцево-судинних захворювань”, Харків, 1991; обласній науковій конференції морфологів, Донецьк, 1993; XYth Meeting of the International Society for Heart Research, Missouri, 1993; XIY з'їзді Українського фізіологічного товариства ім. І.П. Павлова, Київ, 1994; науковій конференції анатомів, гістологів, ембріологів і топографоанатомів України, присвяченій 100-річчю з дня народження професора А.П. Любомудрова “Актуальні проблеми функціональної анатомії судинної системи”, Львів, 1995; Першому російському конгресі з патофізіології “Патофізіологія органів і систем. Типові патологічні процеси (експериментальні і клінічні аспекти)”, Москва,1996; Другому російському конгресі з патофізіології “Патофізіологія органів і систем. Типові патологічні процеси”, Москва, 2000; науково-практичній електронній конференції, присвяченій 70-річчю Донецького медичного університету ім.М.Горького "Медицина на порозі третього тисячоліття”, Донецьк, 2000; IYМіжнародному слов'янському конгресі з електростимуляції і клінічної електрофізіології, Санкт-Петербург, 2000; засіданні сектора вісцеральних систем Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України та товариства патофізіологів від 25.04.2002; спільному засіданні кафедр патофізіології, біохімії і Центральної науково-дослідної лабораторії Донецького державного медичного університету ім. М. Горького, Донецьк, 2002; Українському Пленумі товариства патофізіологів, 2002; YIII Українському біохімічному з’їзді, Чернівці, 2002.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 51 наукова праця, з них - 3 винаходи, 1 монографія, 20 - у спеціалізованих наукових виданнях, інші - в журналах, збірниках, матеріалах і тезах конференцій.

Структура й обсяг дисертації. Робота складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, 9 розділів власних досліджень, аналізу одержаних результатів, висновків, практичних рекомендацій і покажчика літератури, що містить 353 джерел. Дисертація викладена на 316 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 36 таблицями і 75 малюнками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Моделювання екстремального впливу виконано на 45 кроликах-самцях породи Шиншила з масою тіла від 2 до 3,2 кг однократним підшкірним уведенням -симпатоміметика ізадрину дозою 6 мг/кг на масу тіла. У перші 30 хвилин експерименту загинуло 17 (1-а група – нестійкі до навантаження ізадрином). Інші 28 кроликів (2-а група – стійкі до навантаження ізадрином) були виведені з експерименту через добу шляхом гострого кровопускання під гексеналовим наркозом.

Роль місцевих (тканинних) факторів у стійкості міокарда до навантаження ізадрином вивчали на препаратах ізольованого міокарда 121 рандомбредного щура-самця з масою тіла від 190 до 250 гр. Усього поставлено 11 серій дослідів (табл. 1).

Для підтвердження зв'язків між рівнем сироваткового міоглобіну (МГ) і інтенсивністю ліпопероксидації на 24 кроликах та 16 собаках моделювали гострий інфаркт міокарда способом перев'язки відгалужень передньої міжшлуночкової артерії в середній третині. Додатково в модельних експериментах in vitro вивчали антиоксидантний потенціал препаратів очищеного міоглобіну в концентраціях від 50 до 500 нг/мол на швидкість переокислення ліпідів у сироватці крові 18 інтактних щурів і в суспензії жовтка курячих яєць. Як систему, що генерує вільні радикали, використовували розчини двовалентного заліза [Клебанов Г.И. и др., 1988].

Також у модельних дослідах, на сироватці крові 40 інтактних щурів, з'ясовували можливі механізми впливу фосфотидилхолінових ліпосом на рівні ендогенних простаноїдів.

Таблиця 1

Характеристика серій експериментів із препаратами ізольованого міокарда

№ серії | Умови експерименту | Кіль-кість

1. | Перфузія фізіологічним розчином | 17

2. | Перфузія розчином ізадрину (10 мкмоль/л) | 24

3. | Перфузія ізадрином (10 мкмоль/л) і пропранололом (3 мкмоль/л) | 12

4. | Перфузія розчином тренталу (0,05 г/л) | 9

5. | Перфузія ізадрином (10 мкмоль/л) і тренталом (0,05 г/л) | 9

6. | Перфузія розчином FeS04 (25 ммоль/л) | 12

7. | Перфузія ізадрином (10 мкмоль/л) і FeSO4 (25 ммоль/л) | 6

8. | Перфузія розчином супероксиддисмутази – СОД (50 мг/л) | 7

9 | Перфузія ізадрином (10 мкмоль/л) і СОД (50 мг/л) | 9

10 | Перфузія суспензією лецитинових ліпосом | 9

11. | Перфузія ізадрином (10мкмоль/л) і суспензіею ліпосом | 7

Дослідження варіабельності серцевого ритму (ВСР) проводили за допомогою комп'ютерного електрокардіографа “Cardiolab-2000” на п'ятихвилинних послідовностях RR-інтервалів ЕКГ відповідно до діючих вимог [Malik M. et al., 1996; Яблучанский Н.И. и др., 2000].

Для оцінки системи ліпопероксидації використовували методи спектрофотометрії і хемілюмінесценції (ХЛ). У плазмі крові, перфузатах, міокарді й інкубаційних середовищах визначали вміст дієнових кон’югат (ДК), малонового діальдегіду (МДА), -токоферолу (ТФ), активність супероксиддисмутази (СОД), каталази, загальну антиоксидантну активність (АОА) [Горячковский А.М., 1998; Королюк М.А. и др., 1988; Csonka C. et al., 2000; Waterfal A. H. et al., 1997;]. Показники про- і антиоксидантної активності також розраховували за даними ХЛ [Павленко І. О. і ін., 1996].

Ліпідний обмін оцінювали з використанням комерційних наборів Біо-Ла-Тест (Чеська республіка) за рівнями загальних ліпідів (ЗЛ), фосфоліпідів (ФЛ) і неестерифікованих жирних кислот (НЕЖК). Про ушкодження клітинних і субклітинних мембран судили за виходом у кров і перфузат ферментів лактатдегідрогенази (ЛДГ), креатинкінази (КК), кислої фосфатази (КФ), катепсину Д (КД), рівнем низько- і средньомолекулярних пептидів чи молекул середньої маси (МСМ) [Горячковский А.Ф., 1998].

Вміст у біологічних рідинах і в тканині міокарда циклічних нуклеотидів (цАМФ і цГМФ), простаноїдів (стабільного метаболіту простацикліну 6-кето-простагландину-F1 - ПЦ, тромбоксану А2 - ТХ, простагландину F2 - ПгF2 і простагландину Е2 - ПгЕ2) і міоглобіну визначали радіоімунним методом з використанням комерційних наборів відповідно до інструкцій фірм-виготовлювачів. Математичну обробку результатів радіометрування проб проводили на ПЄОМ із використанням пакета прикладних програм "РІА" (ПО "Медапаратура", Україна).

Електронномікроскопічні дослідження виконані за стандартними методами на мікроскопі “TESLA-BS-613”.

Статистичну обробку отриманих результатів проводили на ПЄОМ IBM PC/AT за допомогою ліцензійного пакета прикладних програм Statistica 5.5.

Результати дослідження та їх обговорення. Насамперед на рівні цілісного організму у кроликів, що вижили і загинули, були проаналізовані особливості нейрогуморальних реакцій на підшкірне введення ізадрину. Показано, що за даними аналізу часових показників ритмограм, ранній період адаптації у тварин з різною стійкістю до навантаження -симпатоміметиком перебігає неоднаково.

Для загиблих кроликів характерне зростання варіабельності ритму, парасимпатичних впливів, менша участь надорганних (центральних) механізмів регуляції (рис. 1).

Початкові значення спектральних характеристик ВСР у тварин, що вижили і загинули, мало відрізняються (табл. 2). Нейрогуморальні реакції на вплив ізадрином у всіх тварин якісно однакові і характеризуються підвищенням загальної потужності регуляції за рахунок утворюючих її доменів.

Характер і ступінь змін потужностей у доменах, що відповідають симпатичній і парасимпатичній ланкам вегетативної регуляції, у тварин порівнюваних груп виявляються різними. Через 10 хвилин від початку експерименту для загиблих характерне зростання потужності низькочастотного домена регуляції (рис. 2).

Рис. 1. Динаміка вегетативного показника ритму (ВПР) та індексу напруги (ІН) у кроликів порівнюваних груп у перші 10 хвилин після навантаження ізадрином.

Реакція на введення ізадрину з боку високочастотного домена у цих тварин, навпаки, характеризується зниженням його потужності (рис. 3). У частині випадків вона “вироджується”, створюючи помилкове враження про нормалізацію симпато-вагального балансу. Вся регуляція у цих тварин ніби концентрується в гуморальній ланці – дуже низькочастотному домені. Результати біохімічних і біофізичних досліджень показали, що стійкість кроликів до ізадрину визначається переважно початковим балансовим станом системи ліпопероксидації.

Шанси на життя і ризик смерті, насамперед, пов'язані з рівнями ДК і -токоферолу, власними характеристиками спонтанної й індукованої ХЛ. Початково високе ПОЛ і низький АОП знижують стійкість до екстремальних впливів і можуть розглядатися як фактори ризику загибелі тварин (табл. 3).

Таблиця 2

Вихідні значення показників ВСР кроликів (M ± m)

Показники | Загиблі (n=11) | Що вижили (n=7)

ТР, мс2 | 389 ± 173 | 492 ± 165

VLF, мс2 | 203 ± 43(1) | 113 ± 34

LF, мс2 | 72 ± 28 | 105 ± 34

HF, мс2 | 138 ± 80 | 135 ± 85

LF/HF, безразм. | 1,7 | 1,2

Примітка. (1)- р < 0,05 у показниках порівнюваних груп тварин

Рис. 2. Динаміка потужності низькочастотного домена (LF, мс2) після навантаження ізадрином кроликів порівнюваних груп.

Доведено, що на стан балансу ПОЛ-ОАП істотно впливають сироватковий міоглобін, низько- і середньомолекулярні продукти деградації тканин, кислі гідролази, причому, якщо стимульована експериментальним впливом активація ферментів позитивно корелює з інтенсивністю переокислення ліпідів, то вплив сироваткового МГ і МСМ можна оцінити як антирадикальний.

Рис. 3. Динаміка потужності високочастотного домена (HF, мс2) після навантаження ізадрином кроликів порівнюваних груп.

Таблиця 3

Розрахункові показники ліпопероксидації кроликів (M + m)

Показники * | Що вижили (n=28) | Загиблі (n=17)

-токоферол/ДК | 2,64 + 0,33 | 1,65 + 0,36

Латентний період/-токоферол | 0,38 + 0,10 | 1,22 + 0,30

Латентний період ДК | 1,03 + 0,27 | 2,90 + 0,77

Примітка. *- розходження достовірні для всіх показників, р<0,05

У проведених модельних дослідах на суспензії фосфоліпідів і на сироватці крові інтактних щурів доведені антиокисні властивості сироваткового міоглобіну (рис. 4). Ці дані були пізніше підтверджені в класичних біохімічних дослідженнях (Тимочко М.Ф. и др., 1992).

Вплив метаболітів на реакції вільнорадикального окислення значно підсилюється при екстремальних станах. Виявлений у ранній період (у перші години) після навантаження ізадрином чи в умовах гострого інфаркту міокарда позитивний кореляційний зв'язок між рівнями МГ (до +0,7) і МСМ (до +0,4), з одного боку, і різними показниками АОА, з іншого, дозволяє розглядати ці метаболіти не лише як маркери ушкодження, але й як компоненти регуляції ліпопероксидації, а, отже, і стійкості організму до симпатоміметиків.

Рис. 4. Вплив міоглобіну на загальну антиоксидантну активність плазми крові інтактних щурів.

Навантаження ізадрином у тварин, що вижили, має своїм наслідком взаємозалежні за інтенсивністю й еволюцією зміни у взаємовідношеннях між компонентами системи ліпопероксидації – ПОЛ та АОП. Баланс між цими компонентами багато в чому визначає стратегію відновлювального періоду. Зростання, що спостерігається у перші години інтенсивності переокиснення ліпідів, закономірно сполучається з достовірним підвищенням потужності антирадикального захисту. Останнє, поряд з іншими факторами, може забезпечуватися і виходом у кров МГ, МСМ і показаним у роботі посиленням у відповідь на навантаження ізадрином активності антиоксидантних ферментів: каталази і СОД.

Привертає увагу виявлене фазове зрушення в ізадрин-індукованих змінах антирадикального потенціалу. Максимальні відхилення його інтегральних показників (загальна антиоксидантна активність і тривалість латентного періоду ХЛ) відзначені вже через 0,5 години. Статистично ж значущі відмінності від початкових значень в активності каталази і СОД наявні лише починаючи з 3 години (табл. 4).

Таблиця 4

Динаміка показників антирадикального захисту в крові кроликів, що вижили після навантаження ізадрином, M m (n = 28)

Показник | Час від початку експерименту, година

До | 0,5 | 1 | 3 | 5 | 24

АОА, % | 62,4 2,6 | 72,7 4,1(1) | 69,8 2,1(1) | 68,9 2,0(1) | 65,6 3,8 | 66,2 2,9

Каталаза, мкат/л | 14,4 1,1 | 16,4 2,1 | 16,0 1,1 | 18,2 1,4(1) | 21,1 2,9(1) | 18,1 1,2(1)

СОД,
Е/мг білка | 0,04 0,01 | 0,05 0,01 | 0,06 0,01 | 0,08 0,01(1) | 0,09 0,02(1,2) | 0,07 0,01(1)

-токоферол, мкмоль/л | 2,57 0,25 | 3,19 0,11(1) | 2,45 0,28(2) | 2,05 0,22(2) | 1,80 0,19(1,2) | 1,98 0,14(1,2)

Примітка: 1. (1) - розходження з вихідними значеннями, p < 0,05;

2. (2) - розходження зі значеннями через 0,5 години від початку експерименту, p < 0,05.

Удалося довести, що зростання антирадикального потенціалу в різні терміни екстремального стану забезпечується різними механізмами. У перші години після навантаження ізадрином – переважно за рахунок неферментативних компонентів, у тому числі і за рахунок виходу МГ і МСМ. Пізніше, починаючи з 3 години експерименту - переважно за рахунок активізації специфічних ферментних систем антирадикального захисту (рис. 5).

Вагомість внеску ферментів в АОП кроликів через 3 години після навантаження ізадрином підтверджується зростанням середнього модуля кореляції між даними параметрами. Значення цього статистичного показника через 5 годин від початку експерименту статистично достовірно перевищувало їхні початкові значення (0,60 + 0,09 порівняно з 0,19 + 0,03) і редукція наставала лише з відновлювальними змінами.

Таким чином, у стані спокою характерна “відносна свобода” у поведінці параметрів системи ліпопероксидації, тоді як екстремальні впливи вимагають їхніх погоджених за часом та інтенсивністю змін, включаючи і встановлені в цьому дослідженні форми фазових зрушень. Синхронізація цих механізмів – необхідна умова ефективності відновлювальних процесів. Основи її закладені в характерних фізіологічних нормах, і всякі відхилення від них спричиняють зниження стійкості до екстремальних впливів, найбільш грізне і тяжке з яких – загибель тварин.

Рис. 5. Коефіцієнти кореляції між активністю каталази, СОД, рівнями ТФ, МСМ, МГ і тривалістю латентного періоду ХЛ сироватки крові кроликів через 1 і 5 годин після введення ізадрину.

Вивчення вмісту простаноїдів у крові і міокарді кроликів до і після навантаження ізадрином показало їхню важливу роль у стійкості до екстремальних впливів. Кролики з різною стійкістю до навантаження екзогенним симпатоміметиком відрізнялися початковими значеннями у плазмі крові простагландинів F2 (відповідно, у тих, що вижили – (503 + 78) пг/мл, у загиблих – (244 + 59) пг/мл) і Е2, (відповідно: (1091 + 189) пг/мл і (619 + 141) пг/мол) а також величиною балансу концентрацій тромбоксану і простацикліну: (13,9 + 3,9 і 4,8 + 1,4, відповідно в тих що, вижили і загинули).

Екстремальний вплив ізадрином має у своїх реакціях статистично значуще збільшення рівня практично усіх вивчених простаноїдів (табл. 5) і показників балансу між ними (рис. 6).

Як і в системі ліпопероксидації, у тварин, що вижили, після досягнення максимальних значень у перші години від початку досліду концентрації простаноїдів і балансові співвідношення між ними далі стабілізуються й у своїй більшості виходять на початковий рівень до результату першої доби.

Ґрунтуючись на порівняльному аналізі кінетики простаноїдів крові тварин, що вижили і загинули, слід вважати, що однією з імовірних причин граничного зниження їхньої стійкості до дії екстремальних факторів є виражений зсув балансу простаноїдів у бік переваги синтезу тромбоксану. Середнє значення показника ТХ/ПЦ у загиблих після навантаження ізадрином кроликів у момент смерті перевищувало початковий рівень у 3,8 рази (р < 0,05).

Таблиця 5

Динаміка рівня простаноїдів плазми крові кроликів, що вижили, (М m)

Показник | Час від початку експерименту, година

До | 0,5 | 1 | 3 | 5 | 24

ПЦ, пг/мл | 174 14 | 261 29(1) | 285 33(1) | 249 22(1) | 255 32(1) | 231 29

ТХ, пг/мл | 2768

499 | 4706 522(1) | 4215 517(1) | 3899 275(1) | 3338

944 | 2624 461(2)

ПгF2, пг/мл | 503 78 | 599 65 | 688 131 | 312 51(1,2) | 267 62(1,2) | 299 56(1)

ПгЕ2, пг/мл | 1091

189 | 1425

131 | 1697 206(1) | 1705 243(1) | 1520 102(1) | 968 1445

Примітка: 1. (1) - розходження з початковими значеннями, p < 0,05;

У початкових умовах (тварини у стані спокою) рівні простаноїдів слабко пов’язані з показниками інтенсивності вільнорадикального окислення і потужності антирадикального потенціалу. Після введення ізадрину значно збільшується ступінь синхронізації станів систем простаноїдів і ліпопероксидації (табл. 6).

Рис. 6. Динаміка співвідношень рівнів ПгЕ2 до ПгF2 і ТХ до ПЦ у плазмі крові кроликів, що вижили, після навантаження ізадрином;

Примітка. - відмінності порівняно з контролем, р < 0,05.

Максимальні значення середнього модуля кореляції (СМК) визначаються для вільнорадикальних процесів через 1 годину, а і для показників антирадикального потенціалу – через 5 годин після введення ізадрину.

Таблиця 6

Зміни СМК рівнів простаноїдів і параметрів ПОЛ-АОП (М ( m)

Показники | Час від початку експерименту, година

До введення | 1 | 5 | 24

Інтенсивність ПОЛ,N= 12 | 0,11 0,03 | 0,56 0,18(1) | 0,47 0,09(1) | 0,20 0,05

Потужність АОП, N= 24 | 0,22 0,05 | 0,36 + 0,11 | 0,71 0,14(1) | 0,61 0,10(1)

Примітка: 1. N - кількість усереднених коефіцієнтів кореляції;

2. (1) - розходження з вихідними даними, p < 0,05.

Виявлений взаємозв'язок параметрів ПОЛ та АОП з концентраціями простаноїдів свідчить про наявність в останніх не лише механізмів прямого впливу на міокард, опосередкованого специфічними рецепторами й іншими клітинними компонентами, що є досить відомим фактом (Гусева Н.Г., 2001; Маркова О.О., 1998; Смолянінов К.Б. і ін., 2002; Crofford L. J., 2001). Виразність міокардіальних ефектів простаноїдів, а, можливо, і характер цих ефектів багато в чому можуть модулюватися станом системи ліпопероксидації.

Зв'язок між рівнями простаноїдів і виживаністю тварин виявляється не лише на системному, але й місцевому (тканинному) рівнях, причому доведено, що, порівняно з даними, одержаними при дослідженні сироватки крові, стійкість кроликів до ізадрину статистично тісніше позв'язана з активацією простаноїдів міокарда (табл. 7).

Незважаючи на однотипний для порівнюваних груп тварин характер реакцій у міокарді з боку ПЦ і ТХ, вдалося показати, що важливою умовою підвищеної резистентності до гіперкатехоламінемії є перевага простациклін-синтетазної над тромбоксансинтетазною функцією міокарда (рис. 7). Аналогічні особливості відзначені і для показника балансу рівнів ПгЕ2 і ПгF2 (рис. 8) .

Таблиця 7

Вміст простаноїдів у міокарді кроликів (М m)

Показник | Групи тварин

інтактні | загиблі | що вижили

(n = 9) | (n = 12) | 1 година (n=9) | 24 години (n=17)

ПЦ, пг/мл | 66,8 9,1 | 104 8,1(1) | 121 10,9(1) | 74,5 2,2

ТХ, пг/мл | 13,6 4,9 | 43,9 13,3(1) | 33,8 8,8(1) | 13,6 2,9

ПгF2, пг/мл | 73,3 8,2 | 27,1 5,1(1) | 84,7 7,3 | 34,7 5,0(1)

ПгЕ2, пг/мл | 90,6 7,3 | 65,8 6,9(1) | 135 21,0(1) | 71,8 10,1

Примітка. (1) - розходження порівняно з інтактним міокардом, p < 0,05.

Вміст простаноїдів у міокарді тісно синхронізований зі станом системи ліпопероксидації. Як і для крові, значення середнього модуля кореляції зростає в умовах екстремального впливу. Особливо суттєво, статистично значуще – для міокарда кроликів, стійких до навантаження ізадрином (табл. 8).

(ЦН) значною мірою визначає стійкість кроликів до впливу критичними дозами ізадрину. Загиблих тварин відрізняють не тільки інші початкові рівні цАМФ і цГМФ (при характерному для тих, що вижили, балансі даних нуклеотидів), але й менша, порівняно з тими, що вижили, внутрішньогрупова варіабельність обох показників і більш тісні кореляційні зв'язки між вмістом у крові ЦН і показниками ПОЛ (табл. 9)

Таблиця 8

Значення СМК між рівнями простаноїдів міокарда і станом ліпопероксидації крові кроликів (М m)

Показники | Групи тварин

інтактні | Загиблі | що вижили, 1 год

Інтенсивність ПОЛ, N = 12 | 0,23 0,10 | 0,42 0,11 | 0,51 0,08(1)

Потужність АОП, N= 24 | 0,46 0,12 | 0,66 0,90 | 0,79 0,11(1)

Примітка: 1. N - кількість усереднених коефіцієнтів кореляції;

2. (1) - розходження з інтактним міокардом (p < 0,05).

Реакція системи ЦН на введення симпатоміметика полягає в ранній активації ферментів синтезу і цАМФ і цГМФ. Рівні у крові даних аналізів

Таблиця 9

Початковий рівень циклічних нуклеотидів у плазмі крові кроликів і СМК із показниками ліпопероксидації (М m)

Показники | Що вижили (n=28) | загиблі (n=17)

цАМФ, пмоль/л | 23,2 3,81 | 39,9 6,03 (1)

цГМФ, пмоль/л | 4,8 0,99 | 7,91 1,32

цАМФ/цГМФ | 3,85 0,73 | 5,04 0,78

СМК із показниками ПОЛ, N = 12 | 0,24 0,03 | 0,41 0,06 (1)

СМК із показниками АОП, N= 24 | 0,19 0,03 | 0,25 0,02

Примітка. (1) - розходження у порівнюваних групах, р < 0,05.

зростали протягом перших 3 годин після початку впливу, досягаючи значень (42,80 + 4,16) пмоль/л і (7,11 + 0,45) пмоль/л для цАМФ і цГМФ відповідно. Надалі обидва показники мали чітку тенденцію до зниження, причому, якщо концентрація цГМФ вже через 5 годин після навантаження ізадрином не відрізнялася від початкових значень, то нормалізація рівня цАМФ зареєстро-вана лише через добу від початку впливу. Навантаження ізадрином призводило не тільки до зміни абсолютних значень концентрацій ЦН. Вже з першої години після впливу було наявним виражене зростання величини їхнього балансу. Найбільші відхилення цього показника від початкового рівня зареєстровані через 5 годин від початку експерименту. Статистична достовірність відмін-ностей від початкових значень зберігалася і через добу після впливу (рис. 9).

Особливістю реакції системи ЦН загиблих кроликів на навантаження ізадрином є відносно менша (майже у 2 рази) активація аденілатциклази при практично рівному ступені зміни активності гуанілатциклази.

Ізадрин-індукована стимуляція аденілат- і гуанілатциклази супроводжувалася зростанням тісноти кореляційного зв'язку між змінами рівнів циклічних нуклеотидів і параметрів, що відображають інтенсивність вільнорадикального окислення і потужність антиокислювального потенціалу. Найбільші значення показник СМК мав для продуктів ПОЛ у перші 5 годин експерименту.

Рис. 9. Динаміка балансу у плазмі крові рівнів цАМФ і цГМФ протягом доби після введення кроликам ізадрину.

Вміст циклічних нуклеотидів у міокарді тварин обох експериментальних груп був статистично достовірно вищим від рівня, характерного для інтактних (табл. 10). При цьому, на відміну від показників крові, особливістю тих тварин, що вижили, була відносно велика, порівняно із загиблими, активація гуанілатциклази.

На відміну від крові, реакція системи ЦН міокарда призводила до істотного зниження балансу їхніх концентрацій: 4,83 1,39 у тих, що вижили, і 5,28 1,24 у загиблих, порівняно з 7,27 1,86 для інтактного міокарда.

Зіставлення електронно-мікроскопічних характеристик міокарда тих тварин, що вижили, загиблих та інтактних кроликів дає підстави вважати, що основні механізми стійкості тварин до екстремальних факторів значною мірою перебувають саме на рівні гуморальної регуляції. Загибель тварин, які не витримали екстремальних доз ізадрину, відбувається за рахунок індивідуальної реакції тварин на ту ж саму дозу ушкоджувального фактора ізадрину, за рахунок початкового стану перелічених вище регуляторних систем і, насамперед, гуморальної системи, що реалізується на місцевому, внутрішньоклітинному рівні, але не є прямим наслідком ушкоджувальної дії ізадрину на міокард.

Таблиця 10

Вміст циклічних нуклеотидів у міокарді кроликів (M m)

Показник | Групи тварин

інтактні | Загиблі | що вижили

(n = 9) | (n = 12) | 1 год (n=9) | 24 год (n = 15)

ЦАМФ, пмоль/л | 3,73 0,41 | 8,32 1,74(1) | 9,29 2,11(1) | 4,84 0,93

ЦГМФ, пмоль/л | 0,72 0,11 | 1,75 0,38(1) | 2,34 0,46(1) | 1,42 0,31(1)

Примітка. (1) - розходження порівняно з інтактним міокардом, p < 0,05.

Результати, одержані на цілісному організмі, доводять принципову значущість біохімічних механізмів для виживаності тварин після екстремальних втручань. Те, що ці захисні механізми реалізуються головним чином на біохімічному, але не структурному рівні, підтверджується й електронно-мікроскопічними дослідженнями. Роль початкового стану і характеру реакцій з боку гуморальних систем при зворотних ультраструктурних змінах міокарда дає підстави для таких тверджень.

Виділення внеску системних і локальних (тканинних) гуморальних компонентів у стійкість тварин до ізадринового втручання виконано в 11 серіях дослідів на ізольованому міокарді. Беручи до уваги, що в токсичних ефектах високих доз катехоламінів мішенню є система внутрішньоклітинного кальцію, було вирішено звернутися до моделі тотально ішемізованого міокарда (Меерсон Ф.З. и др., 1992; Бабіч Л.Г. 1999). Умови такого експерименту дозволили мінімізувати впливи на кінцеві результати активації системи кальцієвих насосів.

Насамперед, у серіях з використанням блокатора кальцієвих каналів (пропранолол) та інгібітора фосфодіестерази цАМФ (трентал) удалося довести: ефекти ізадрину, що реєструвалися, реалізуються через кардіоміоцитарні рецептор-опосередковані впливи ізадрину на вторинний месенджер -адреноре-цепторів - цАМФ. Саме ізадрин запускає каскад “місцевих” реакцій, пов'язаних з активацією ПОЛ, зростанням потужності АОП, зміною синтезу простаноїдів та іншими важливими біохімічними процесами. Додавання в перфузійний розчин пропранололу практично запобігало ізадрин-індукованим змінам цАМФ і розвитку всіх подальших біохімічних процесів у міокарді.

На фоні пропранололу скорочувався ізадрин-індукований вихід з міокарда продуктів ПОЛ, фосфоліпідів, МСМ, обмежувалося нагромадження в міокарді простаноїдів, при цьому запобігалося виснаженню -токоферолу і зберігалася активність СОД. Ізадрин на фоні пропранололу не призводить до значущого збільшення активності лізосомальних ферментів у відтікаючому від міокарда перфузаті, менше впливає на інтенсивність ліполізу, не змінює співвідношення рівнів вивчених простагландинів.

Незважаючи на те, що виявлені ефекти ізадрину в ізольованому міокарді частково чи повністю пригнічуються додаванням у перфузат блокатора
-адренорецепторів, присутній у міокарді інгібітор фосфодіестерази цАМФ завжди підсилював ізадрин-індукований вихід з нього ДК, ФЛ, НЄЖК. У результаті достовірно знижувалася активність вивчених ферментів, відзначалося більш виражене виснаження компонентів антирадикального захисту. Трентал поза ізадрином практично не впливав на біохімічні процеси в ізольованому серці.

Одержані нами в дослідах на цілісному організмі і на препаратах ізольованого міокарда докази ролі ліпопероксидації у стійкості організму і міокарда до екстремальних впливів екзогенним симпатоміметиком вимагали уточнення її ролі в чутливості міокарда до ізадрину.

Перфузія ізольованого міокарда розчином двовалентного заліза закономірно призводить до дво - чотирикратного посилення ПОЛ з виснаженням компонентів антирадикального захисту. Примітним був виявлений факт, що при активованому переокисленні ліпідів практично не виявлялися зареєстровані раніше ефекти ізадрину, причому це стосувалося не лише метаболітів, прямо пов'язаних з ліпопероксидацією.

На фоні обробки міокарда солями двовалентного заліза статистично достовірно змінювався ізадрин-індукований вихід у перфузат вивчених простаноїдів.

З іншого боку, у дослідах, коли інтенсивність ПОЛ штучно інгібували додаванням у перфузат СОД, також відзначали не лише обмеження ліпопероксидації (у 3,6 – 5,3 рази, порівняно з серією 2) і запобігання ізадрин- обумовленому виснаженню компонентів антирадикального захисту, але й обмеження виходу в перфузат вивчених ферментів, низько- і средньомолекулярних пептидів, ліпідних компонентів міокарда. Усі ці показники не відрізнялися від серії дослідів з перфузією міокарда фізіологічним розчином. Наявність у перфузаті СОД запобігало посиленню під впливом ізадрину виходу з міокарда продуктів метаболізму арахідонової кислоти.

Усе це підтверджує залежність ефектів ізадрину на міокард від стану системи ліпопероксидації на її місцевому (тканинному) рівні.

Меті уточнення ролі системи ліпопероксидації в механізмах стійкості міокарда до екзогенних симпатоміметиків були присвячені і досліди з обробкою ізольованого міокарда ізадрином на фоні перфузії лецитинових ліпосом, яким багатьма авторами приписуються антиоксидантні властивості (Тимченко О.Г. та ін., 1995; Bechoua S. et al., 1999). Результати показали, що перфузія лише лецитиновими ліпосомами не виявляє ні про-, ні антиоксидантної активності. Додавання ж у перфузійний розчин ізадрину, однак, кардинально змінює ситуацію. У підсумку комбінована перфузія ізольованого міокарда ліпосомами й ізадрином частково чи повністю пригнічує ізадрин-індуковані ефекти, пов'язані з порушеннями в біохімічних реакціях, які сприяють ушкодженню міокарда. Украй цікавим і несподіваним у контексті комбінованої перфузії ізольованого міокарда ліпосомами та ізадрином є виявлене при цьому явище активації посилення виходу в перфузат вивчених простаноїдів.

Виявлена здатність ліпосом впливати на спектр простагландинів, що відтікають із міокарда при його обробці ізадрином, була перевірена у 4 додаткових серіях модельних дослідів. Використана сироватка крові 40 інтактних щурів. Перша серія - інтактна сироватка (контроль); друга - суміш "сироватка - ліпосоми" в об'ємному співвідношенні 10:1; третя - до 1 мл інтактної сироватки додавали 0,1 мл системи, що ініціює вільнорадикальні реакції (25 ммоль/л розчин сірчанокислого заліза); четверта - до 1 мл суміші "сировотка-ліпосоми"