НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ЗОЦЕНКО ЛЮДМИЛА ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 619:616.612.017.33

РОЗПОВСЮДЖЕННЯ СЕРЕД ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ І СВИНЕЙ ШИГОТОКСИНПРОДУКУЮЧИХ ЕШЕРИХІЙ ТА ВИВЧЕННЯ ЇХ БІОЛОГІЧНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ

16.00.03 - ВЕТЕРИНАРНА МІКРОБІОЛОГІЯ ТА ВІРУСОЛОГІЯ

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

КИЇВ – 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті ветеринарної медицини Української академії аграрних наук.

Науковий керівник: доктор ветеринарних наук,

старший науковий співробітник

Волинець Леонід Кузьмич,

Інститут ветеринарної медицини УААН,

завідувач лабораторії ветеринарно-

санітарної експертизи

Офіційні опоненти:

доктор ветеринарних наук, академік Завірюха Анатолій Іванович, Інститут ветеринарної медицини УААН, завідувач лабораторії бактеріології;

кандидат ветеринарних наук, старший науковий співробітник Скрипник Валерій Григорович, Науково-контрольний інститут біотехнології і штамів мікроорганізмів, завідувач відділу біотехнології і контролю бактеріальних препаратів

Провідна установа: Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, лабораторія вивчення хвороб молодняка, м. Харків

Захист дисертації відбудеться “ 18 “ червня 2003 року о 12 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.03 в Національному аграрному університеті за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв оборони, 15, навчальний корпус 3, ауд. 65.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв оборони, 13, навчальний корпус № 4, к.41.

Автореферат розісланий “24 “ квітня 2003 р.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради _________________ Міськевич С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Висока напруженість епідемічної ситуації у світі з ентерогеморагічних ешерихіозів поставила необхідність всебічного й глибокого вивчення розповсюдження та біологічних особливостей збудників цих захворювань–шиготоксипродукуючих ешерихій (STEC).

Дослідження циркуляції шиготоксинпродукуючих ешерихій має важливе епізоотологічне значення. Висока частота екскреції STEC у популяціях тварин розглядається як основний фактор ризику можливого інфікування населення (Pai C.H., Kelly J.K., Meyers G.L., 1998). Беручи до уваги збільшення впливу цих ешерихій на здоров’я людей, Всесвітня організація охорони здоров’я акцентувала увагу на всебічному й детальному вивченні джерел, факторів передачі й характеристик штамів STEC у кожній географічній зоні. Основним фактором передачі збудника є продукти харчування тваринного походження, а сільськогосподарські тварини є носіями цих небезпечних патогенів (Wray C., Mc Laren I., 1995). Дослідження по вивченню поширення шиготоксинпродукуючих ешерихій серед поголів’я сільськогосподарських тварин у багатьох країнах проводяться систематично. Оскільки жуйні ідентифіковані як основне джерело STEC, то саме вони, а також продукти харчування – сире м’ясо й молоко, отримані від цієї групи тварин, вважаються потенційно контамінованими й обстежуються найбільш інтенсивно.

На сьогоднішній день багато питань стосовно шиготоксинпродукуючих ешерихій залишаються нез’ясованими. Особливо це стосується не-О15:Н7 STEC. На даний момент патогенний потенціал STEC остаточно не оцінено, адже захворювання у людей і тварин можуть викликати штами з неповним набором факторів патогенності EHEC. Невідомо наскільки патогенні для людей можуть бути штами ешерихій даної групи, виділені не від ВРХ.

На сучасному етапі досліджень особливо важливе значення має вивчення закономірностей прояву епізоотичного процесу, що дозволить контролювати поширення STEC у популяціях тварин і своєчасно розривати ланцюг передачі цих патогенів від тварин до людей. Фактично відсутня інформація про вплив різних факторів на рівень носійства та екскреції цих бактерій різними віковими групами окремих видів тварин. ВОЗ наголошує на необхідності ретельних досліджень щодо встановлення особливостей циркуляції бактерій даної патогрупи у їх природних господарів. Ці дані необхідні для розробки оперативних методів розриву епізоотологічної ланки при STEC-ешерихіозах людей - попередження контамінування продуктів харчування.

Контроль за циркуляцією цих соціально небезпечних патогенів повинен бути обов’язковим компонентом епізоотологічного нагляду, а їх результат – основою для епідеміологічного прогнозування STEC-інфекцій на контрольованій території й розробки програм забезпечення стабільного епідеміологічного благополуччя та ветеринарно-санітарної безпеки продуктів харчування (Ратинер Ю.А., Бондаренко В.М., Siitonen A., 1998, Brunder W., Schmidt H., Karch H., 1999).

Питання поширеності й лабораторної діагностики STEC є актуальними для нашої країни і мають теоретичне й практичне значення. В Україні відсутня інформація щодо епізоотологічної ситуації із шиготоксинпродукуючих ешерихій, не визначені їх антигенна структура й шляхи циркуляції. Не встановлена їх роль у виникненні захворювань у тварин різних видів і не досліджені клініко-епізоотологічні характеристики ешерихіозів, викликаних STEC. Оскільки збудник локалізується в організмі сільськогосподарських тварин, то своєчасна діагностика є ключовим заходом у попередженні можливого контамінування продуктів харчування й інфікування споживачів. Результати епізоотологічних досліджень господарств України в подальшому стануть науковим підґрунтям для розробки програм попередження інфекційних захворювань людей, викликаних шиготоксинпродукуючими ешерихіями, і забезпечення населення якісними та безпечними продуктами харчування тваринного походження. В Україні не розроблені методи діагностування штамів STEC у різних зразках матеріалів від тварин, у продуктах харчування та об’єктах навколишнього середовища. Відсутні методики, не розроблені схеми виділення й дослідження ешерихій даної патогенної групи, немає ефективних диференційно-діагностичних середовищ.

Зв,язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є частиною державного завдання № 0101U000820 Інституту ветеринарної медицини УААН із тематики “Дослідити поширення й антигенну структуру шиготоксинпродукуючих E.coli, виділених від тварин і з продуктів харчування тваринництва, розробити методи діагностики та заходи профілактики ” на період 2001-2005 року.

Мета й завдання досліджень. Мета роботи - визначити ступінь розповсюдження, антигенну структуру і біологічні властивості шиготоксинпродукуючих E.coli серед сільськогосподарських тварин в господарствах України та розробити способи індикації штамів STEC в клінічних зразках та продуктах харчування.

Для досягнення поставленої мети потрібно було вирішити наступні завдання:

- відпрацювати й провести порівняльне вивчення ефективності різних методів індикації STEC;

- з’ясувати розповсюдження E.coli, які продукують шиготоксини, серед ВРХ, свиней, птиці в господарствах України;

- установити етіологічну роль STEC у розвитку шлунково-кишкових захворювань у різних видів тварин, дослідити продукти харчування тваринного походження на наявність штамів STEC;

- визначити культурально-морфологічні, біохімічні властивості виділених штамів STEC, дослідити їх біологічні властивості й установити наявність факторів патогенності ЕНЕС;

- розробити експрес-методи виділення та ідентифікації ЕНЕС серотипу О157:Н7 та провести його скринінг у досліджуваних матеріалах;

Об’єкт дослідження. Поголів’я великої рогатої худоби, свиней і птиці в різних господарствах України та продукти харчування тваринного походження.

Предмет досліджень. Рівень екскреції шиготоксинпродукуючих ешерихій різними віковими групами тварин; епізоотологічні особливості STEC-інфекції у ВРХ, свиней, птиці; фактори патогенності збудника та його біологічні властивості.

Методи досліджень. Епізоотологічний аналіз, бактеріологічні, серологічні, генетичні, біохімічні й статистичні методи.

Наукова новизна роботи. Уперше в Україні проведені дослідження по визначенню циркуляції STEC серед поголів’я сільськогосподарських тварин господарств різних регіонів країни. Циркуляція STEC виявлена серед ВРХ 60% обстежених тваринницьких ферм. Визначено спектр домінуючих сероварів STEC у ВРХ та свиней. Установлено здатність продукувати шиготоксини в E.coli серогруп О2, О8, О26, О111, О139, О141. За допомогою нових сучасних діагностичних методів отримано об’єктивну інформацію щодо факторів патогенності виділених штамів. Установлено етіологічну роль STEC у розвитку захворювань телят і поросят із симптомом діареї, та визначена їх, антигенна структура. Виявлено пряму корелятивну залежність між наявністю еае-генів в ешерихій та проявом захворювання у телят.

Практичне значення одержаних результатів. Виділені провідні серогрупи STEC, які є етіологічним фактором захворювань травного каналу молодняку сільськогосподарських тварин. Отримані результати дали можливість підібрати штами і включити їх у вакцину для профілактики пастерельозу, сальмонельозу та ешерихіозу свиней “Пасако”, ТУУ 24.4.19024865.677-2002 затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини 18 грудня 2002 року. Розроблені й опубліковані Методичні рекомендації по профілактиці захворювань птиці колібактеріозом, які затверджені науково-технічною радою Головного управління ветеринарної медицини з державною-ветеринарною інспекцією Міністерства сільського господарства й продовольства України 17 грудня 1999 року (протокол №2). Отримано деклараційний патент на винахід “Селективне й диференційне живильне середовище для виділення ентерогеморагічних E.coli - О157:Н7 агар” № 53979А. Отримані наукові дані використовуються в учбовому процесі Білоцерківського державного аграрного університету по курсу мікробіології і ветеринарної санітарії.

Особистий внесок здобувача. Робота виконана здобувачем особисто. Автор самостійно розробила напрямки й схему експерименту, провела основні дослідження з виділення й вивчення культурально-морфологічних, біохімічних та патогенних властивостей виділених штамів. Отримання даних із використанням ПЛР проводились спільно з науковими співробітниками лабораторії генетики Інституту свинарства (м. Полтава) Балацьким В.М. і Костенко К.І та лабораторії бактеріології Інституту ветеринарії (м.Пулави, Польща) Осаком Я. Отримання й концентрування токсинів, дослідження з використанням культури клітин, здійснені спільно із співробітниками відділу проблем інтерферону Інституту мікробіології й вірусології ім. Заболотного НАН України Тимошок Н.І. Аналіз та узагальнення одержаних експериментальних даних проведені автором особисто. Самостійно сформульовані основні положення та висновки дисертації.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідалися на Всеукраїнській науково-практичній конференції молодих вчених “Проблеми патології тварин та шляхи їх вирішення” (м.Київ, жовтень 2000 р.), міжнародній науково-практичній конференції “Біотехнологія у ветеринарній медицині” (м.Київ, 9-11 вересня 2002р.) Основні положення дисертаційної роботи обговорювалися на звітних зборах Вченої ради ІВМ УААН (1999-2001 рр.)

Публікації. Матеріали дисертації опубліковані у 7 статтях, у тому числі 5 - у фахових виданнях.

Структура та обсяг дисертації. Об’єм дисертаційної роботи складає 162 сторінок і включає: вступ, огляд літератури, результати експериментальних досліджень (6 розділів), їх аналіз та узагальнення, висновки, список використаних джерел, в т.ч. 243 іноземних, 5 додатків. Робота ілюстрована 19 таблицями, 12 діаграмами, 2 фотографіями.

МАТЕРІАЛИ Й МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Робота виконана у 1999-2001 році в лабораторії ветеринарно-санітарної експертизи Інституту ветеринарної медицини УААН, лабораторії генетики Інституту свинарства (м. Полтава), лабораторії бактеріології Інституту ветеринарії (м.Пулави, Польща), відділу проблем інтерферону Інституту мікробіології й вірусології ім. Заболотного НАН України, тваринницьких господарствах різної форми власності Київської, Вінницької, Чернігівської, Кіровоградської та Миколаївської областей.

Для проведення наукових досліджень були використані референтні та епізоотичні штами E.coli .

Серогрупову належність виділених культур E.coli встановлювали в реакції аглютинації з типоспецифічними аглютинуючими О-сироватками для ідентифікації ентеропатогенних типів кишкової палички (Армавірської біофабрики). Наявність фімбріальних адгезинів К99, F41, Att25, 987P, K88ac, K88ab, K88ad визначали в РА з набором сироваток ешерихіозних антиадгезивних аглютинуючих (ІЕКВМ).

Шиготоксинпродукування виділеними штамами визначали в культурі клітин Vero. Культуру клітин Vero отримували в Біо-Тест-Лабораторії у вигляді суспензії на ростовому поживному середовищі. Для визначення здатності продукувати шигоподібні токсини використовували культуру клітин вирощену у пробірках. Для вирощування культури використовували стандартні та підготовлені в умовах лабораторіїї розчини. Досліджувані культури вирощували при 37о С на протязі 5 год у пробірках з 5 мл МПБ рН 7,5. У пробірки вносили 2,5 мкг мітоміцину С (20 мкл розчину) й інкубували ще 15 год. Культури центрифугували (6000хg/ 15 хв), супернатант фільтрували через 0,22 мкм мембранний фільтр і досліджували в культурі клітин.

Для визначення наявності stx- та еае-генів застосовували полімеразну ланцюгову реакцію. Використовували праймери MK1/MK2 (stx), LP30/ LP31 (Stx-1) і LP43/ LP 44 (Stx-2), SK1/SK2 (еае), синтезовані “DNA-Gdansk”, Польща.

Оцінку експресії EHEC-гемолізину проводили за методом А. Lehmacher et al. (1994).

Здатність продукувати термолабільний ентеротоксин виділеними штамами E.coli визначали в Бікен-тесті. Визначення термостабільного ентеротоксину проводили на мишенятах-сисунах за методом Романенкової із співавторами (1986) .

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Розповсюдження STEC серед здорової ВРХ

З метою вивчення поширення шиготоксинпродукуючих E.coli було досліджено 440 голів ВРХ з 15 господарств 6-ти областей України, із них 245 – дорослі (корови, нетелі) і 195 - молодняк (1 тиждень - відгодівля). Усі тварини були клінічно здоровими, а господарства благополучні щодо колібактеріозу. Культури шиготоксинпродукуючих ешерихій були виділені з фекалій 41 тварини (9,3%) з 15 обстежених господарств (60 %). Інтенсивність виділення STEC-позитивних тварин варіювала від 2,9 до 30,6%.

Частота виявлення збудника у фекаліях тварин різних вікових груп у всіх господарствах була неоднаковою. У наших дослідженнях інтенсивність виділення STEC-позитивних тварин серед молодняку була у 1,8 раз вищою порівняно з дорослим поголів’ям. При дослідженні фекалій від 195 телят виявлено 24 тварини, які виділяли шиготоксинпродукуючі ешерихії, що становить 12, 3% від загальної кількості обстеженого молодняку. В той же час культури STEC були виділені з фекалій 17 з 245 обстежених голів дорослих тварин - 6,94%. У більшості господарств токсигенні ешерихії виділялись одночасно і від дорослих, і від молодняку. У ряді господарств рівень екскреції STEC молодняком значно перевищував рівень екскреції дорослим поголів’ям (рис.1).

Рис.1 Інтенсивність екскреції STEC ВРХ

Визначення питомої ваги шиготоксинпродукуючих ешерихій в етіологічній структурі шлунково-кишкових хвороб телят

Одним з головних завдань даної роботи було визначення патогенетичної ролі E.coli, які володіють здатністю продукувати шиготоксини у виникненні й розвитку шлунково-кишкових захворювань телят і визначення ступеню їх поширення. З цією метою були проведені бактеріологічні дослідження фекалій 78 хворих телят з симптомом діареї і патологічного матеріалу від 34 телят з 16 господарств України, неблагополучних щодо масових шлунково-кишкових захворювань. В результаті бактеріологічних досліджень шиготоксинпродукуючі ешерихії були виділені зі шлунково-кишкового каналу 22 хворих телят і 7 зразків патологічного матеріалу, відібраного від тварин з симптомом діареї. Наявність STEC-інфекціїї встановлено в 5 (29,4%) із 17 обстежених неблагополучних щодо масових шлунково-кишкових захворювань телят господарствах. В середньому рівень виділення E.coli, які належать до даної патогенної групи, від телят становив 12,9%.

Циркуляція STEC у свинарських господарствах

На протязі виконання даної роботи у лабораторії ВСЕ ІВМ досліджувався матеріал з 17 товарних свинарських господарств, де реєструвались захворювання поросят віком 0,1-2 місяці з ознаками діареї. Було досліджено 94 зразки патологічного матеріалу і виділено 29 культур ешерихій. Також, вероцитотоксичні властивості вивчали у 19 штамів ешерихій, отриманих із ряду районних державних лабораторій ветеринарної медицини, які виділили при дослідженні патолого-анатомічного матеріалу від свиней. 14 штамів виділено при обстеженні благополучних щодо ешерихіозу господарств від здорових поросят і свиноматок. STEC були ізольовані з патологічного матеріалу від 35 захворілих гастроентеритом на протязі 1 тижня після відлучки поросят 6 господарств.

Структура факторів патогенності STEC, виділених від дорослої ВРХ

Від 13 дорослих корів були виділені ізоляти E.coli, які продукували один тип токсину і мали однакові біологічні властивості, що вказує на носійство одного штаму STEC. Але в ряді випадків одна тварина екскретувала ешерихії з різними токсигенними властивостями - від 4-х дорослих корів одночасно були виділені ізоляти кількох токсигенних типів.

Аналізуючи частоту виділення ешерихій (рис.2), продукуючих різні типи шиготоксинів, слід відмітити, що частота виділення Stx2–позитивних тварин в 1,4 рази більша, ніж Stx1. Із 17 STEC-позитивних тварин культури лише Stx1-продукуючих ешерихій були виділені тільки від 1 тварини і ще двоє корів експресували Stx1-продукуючі ешерихії у комбінації з E.coli - продуцентами Stx2 чи Stx1/2. У тварин решти господарств домінували STEC, які продукували Stx2 і Stx1/2 (Р<0,05). 7 голів ВРХ екскретували stx2 E.coli і 5 – stx1/2. Загальна частка виділення Stx2 і Stx1/2- продукуючих E.coli складає 70%, тоді як Stx1- Stx1/2 – 35%.

При серологічному вивченні О-групової належності виділених штамів E.coli установлено, що більшість культур не типувалося О-колі аглютинуючими сироватками. Із 367 ізолятів виділених від дорослої ВРХ, було встановлено серогрупу у 38. Ідентифіковані штами належали до чотирьох серогруп – О111, О8, О26 і О2. В ряді господарств від групи STEC-позитивних тварин виділяли ешерихії, які належали до певної серогрупи (типувалися) і які не типувалися в РА зі стандартними сироватками . Три тварини були носіями 2 штамів STEC.

Результати ПЛР із праймерами SK1/ SK2 показали наявність у семи культур STEC (35%), виділених від ВРХ 3-х господарств, еаеА-генів. Із 16 виділених від дорослої ВРХ шиготоксинпродукуючих культур ешерихій, ентерогемолізин продукувало 2 (12,5%) ізоляти .

1 - Stx1, 2 - Stx2, 3 - Stx1/2, 4 - Stx1+ Stx2, 5 - Stx1+ Stx1/2, 6 - Stx1/2+ Stx2

Рис. 2 Структура носійства різних типів STEC

дорослими ВРХ

Властивості штамів STEC, виділених від клінічно здорових телят

Штами шиготоксинпродукуючих ешерихій виділені з фекалій від 24 телят 8 господарств. Виділені культури належали до кількох серогруп, але на відміну від дорослих тварин, більшість E.coli від молодняку типувалися О-колі аглютинуючими сироватками. Зокрема, у E.coli від 14 телят (71,4%) було визначено групову належність соматичного антигену (табл.1)

Таблиця 1

Характеристика штамів STEC, виділених із фекалій молодняку

№ | Господарство | Виділено STEC-позитивних | Кількість позитивних ізолятів в культурі | О серогрупа | Тип токсинопродукування

1 | КСП “Україна” | 1 | 5 | Онт | stx2 еае

2 | КСП “Прогрес” | 5 | 4,5 | Онт | stx-2

3 | ЗАТ “Гайсинське” | 2 | 7,5 | О111 | stx-2 еае

Продовження таблиці 1

4 | ПП Войтенко Л.І. | 2 | 8 | О2 | stx-1/2

5 | ЗАТ “Агросвіт” | 3 | 5,3 | Онт | stx-2

6 | СВК “Зоря Поділля” | 1 | 9 | Онт | stx-1

7 | СВК “Правда” | 7

1 | 7,6 | О26

Онт | stx-1еае

stx-2

8 | ВАТ “Колос” | 2 |

6 | О8 |

stx-1/2 еае

Всього | 24

Основна частка типованих ізолятів припадає на одне господарство (СВК “Правда”), де при дослідженні фекалій від 16 телят 7-210-денного віку у 8 (50%) виділено E.coli О26. При порівнянні серогрупової належності ізолятів ешерихій, виділених від окремих тварин різних вікових груп обстежених господарств, серед молодняку відмічено менш різноманітний серологічний пейзаж О-груп. Так, ешерихії кількох серогруп і кількох токсигенних типів виявлені лише в одному господарстві - СВК “Правда”. Від 7 тварин було виділено О26 stx-1, а від 1 – О26 stx-1 і Онт stx-2. В той же час у дорослих тварин циркуляція ешерихій двох серогруп і кількох патотипів відмічена в 4-господарствах. У всіх господарствах де було встановлено О-серогрупу ешерихій, циркулюючих серед молодняку, ешерихії таких самих серогруп виділені й у дорослих корів. Можливо, що серогрупи ешерихій ВРХ різних вікових груп співпадають і в решти господарствах, але при відсутності повного набору діагностичних О-колі сироваток і обмеженої кількості досліджень, ми не можемо стверджувати про ідентичність циркуляціїї STEC певних серогруп у межах однієї ферми чи стада ВРХ.

При аналізі токсигенних властивостей E.coli, виділених від телят, встановлено, що більшість із них були носіями stx-2 генів і, відповідно, продуцентами Stx2 токсину. Із 24 STEC-позитивних телят, 11 (45,8%) були носіями stx-2 E.coli, 4 (16,7%) - stx-1/2, 8 (33,3%) - stx-1, 1 (4,2) - stx-1 і stx-2. Частота виділення stx-1 E.coli від молодняку значно більша, ніж від дорослих тварин (рис.3).

Від 13 (52,2%) телят з 4-х (50% досліджених) господарств були виділені культури STEC, які були позитивні в ПЛР з еае-генними послідовностями (див.табл.1). Наявність еае-гену у STEC, виділених від телят, є вірогідно частіша (Р<0,01), ніж у культур ешерихій даної патогрупи, виділених від дорослих. Ентерогемолізин продукували лише культури E.coli О26, виділені від 8 телят СВК “Правда”.

1 -stx1, 2 – stx2, 3 – stx 1/2, 4 – stx Ѕ + stx1 , 5 – stx Ѕ + stx2, 6 – stx1 + stx2

Рис.3 Порівняльна характеристика екскреції різних типів STEC великою рогатою худобою

Властивості STEC, виділених від хворих телят з симптомом діареї

При визначенні серогрупи виділених штамів шиготоксинпродукуючих E.coli встановлено, що вони належали до серогруп О111 (5 культур), О26 (11), О8 (5), О5 (7), Онт (1), ОR (1). У двох господарствах від хворих телят виділені E.coli серогрупи О26 і у двох господарствах в телят встановлена наявність STEC кількох серогруп. При аналізі типу шиготоксинопродукуванння було встановлено, що в групі шиготоксинпродукуючих ешерихій, виділених від хворих телят домінують продуценти Stx1 (рис. 4).

Продукування ентерогемолізину і наявність ehxA-генів були властиві лише штамам серогрупи E.coli О26, виділеним в обох господарствах.

Властивості STEC, виділених від свиней

При бактеріологічному дослідженні проб, отриманих від хворих і загиблих поросят з ознаками діареї було виділено 48 штамів E.coli. Вони належали до серогруп: О149 – 13 штамів (27,1%), О139 – 10 (20,8%), О141 – 7 (14,6%), О101 – 4 (8,3%), 14 (29,2%) не типувалися в РА. Веротоксин продукували 6 штамів, які ізолювали від хворих на діарею поросят 2-місячного віку в 6 свинарських господарствах (див. табл. 2). Слід відмітити, що загалом синтез ентеротоксинів було встановлено у 42 (87,5%) ізолятів. Найбільше виділених культур продукували термолабільний ентеротоксин – 18 штамів (42,9% від загальної кількості всіх токсигенних штамів). Здатність до продукування цього ентеротоксину була більше

1-Stx1 2-Stx1/2 3 – Stx2

Рис. 4 Структура типів STEC виділених від хворих телят із симптомом діареї

виражена у E.coli серогрупи О149 – 77% виділених штамів цього серотипу продукували термолабільний токсин окремо або в комбінації з термостабільним.. 10 штамів (23,8%) продукували лише термостабільний, а 8 штамів (19%) – термолабільний і термостабільний токсини ( табл.2)

Таблиця 2

Токсигенність штамів E.coli виділених від свиней

Серогрупа | Кількість виділених штамів, які продукували токсини (%) | Усього токсигенних штамів (%)

ТЛ | ТС | Stx2v+ТЛ | ТС+ТЛ | Stx

О149 | 9 (69,2) | 3 (23,1) | 1 (7,7) | 13 (30,9)

О139 | 2 (20) | 2 (20) | 3 (30) | 2 (20) | 1 (10) | 10 (23,8)

О141 | 2 (28,6) | 2 (28,6) | 1 (14,3) | 1 (14,3) | 1 (14,3) | 7 (14,3)

О101 | 2 (50) | - | 2 (50) | 4 (9,5)

Онт | 3 (37,5) | 3 (37,5) | 2 (25) | 8 (19,1)

Всього | 18 (42,9) | 10 (23,8) | 4 (9,5) | 8 (19) | 2 (4,8) | 42 (100)

Із 42 штамів ешерихій у яких встановлено здатність до продукування ентеротоксинів, 6 продукували шиготоксин, що складає 14,3% від загальної кількості токсигенних штамів. З них 4 (66,7%) одночасно продукували Stx2v і ТЛ і 2 (33,3) – лише Stx2v.

Скринінг штамів серогрупи О157

При бактеріологічному дослідженні 758 зразків фекалій, вмісту кишечника та внутрішніх органів загиблих тварин, отриманих від тварин із різних регіонів України, а також продуктів харчування, відібраних із ринків м.Києва виділяли різноманітну мікрофлору. E.coli виділили з 96% проб. У зв’язку з тим, що серогрупа О157 представлена не тільки сорбіт-негативним шиготоксинпродукуючим серотипом O157:H7, а й іншими серотипами, які також можуть належати до класу STEC, в РА із сироваткою на ліпополісахаридний антиген О157 типували всі виділені культури.

Із 758 культур типоспецифічними сироватками, які входять до набору, типувалося 362 культури (47,8 %). Було виділено два штами Е.coli О157. При вивченні поширення шиготоксинпродукуючих ешерихій в одному з господарств Вінницької області було відібрано групу дорослої ВРХ. З фекалій однієї тварини виділили E.coli O157:HР. Отримані дані показали, що кількість E.coli O157:HР в пробі була дуже низькою і становила в середньому 65 КУО в 1 гр фекалій. При обстеженні всіх тварин ферми культури Е.coli О157 виділили ще від 3-х дорослих тварин. Серед телят і ВРХ на відгодівлі даних Е.coli не було виділено, хоча більш характерною є їх циркуляція серед тварин молодшого віку. Усі виділені в даному господарстві культури серотипу О157 були ідентичні. Вони не мали джгутиків, були сорбіт-негативні і не токсичні для культури клітин. Дослідження цих штамів в ПЛР із праймерами LP30/LP31 показали наявність у них генів, які відповідають за продукування шиготоксину-2 та прояв А/Е пошкодження. Виділені культури продукували ентерогемолізин на агарі з відмитими овечими еритроцитами. Аналізуючи частку виділення культур ешерихій даної серогрупи від ВРХ різних господарств і регіонів України, слід відмітити, що ці ешерихії представлені незначною кількістю ізолятів. У наших дослідженнях, із 552 культур E.coli, виділених від ВРХ різних вікових груп і з різним клінічним статусом, E.coli O157:HР становили 0,54%.

Другий штам E.coli серогрупи О157 виділили від хворих на діарею поросят господарства ,,Авангард” Чернігівської області. Він типувався в реакції аглютинації до титру 1:3200, мав фімбрії К88ас, ?-гемолізин.

Культури цього штаму мали джгутики, але він не належав до серогрупи Н7, оскільки всі культури ферментували сорбіт на протязі 24 год при 37°С і колонії цього штаму на О57 агарі були червоного кольору. Цей штам виділили від 11 з 14 (78,6%) хворих поросят, 3 з 54 (5,6%) здорових і 2 (1,3%) свиноматок, а також мезентеріальних лімфатичних вузлів 1 загиблого поросяти з онаками враження шлунково-кишкового каналу. Проведені скринінгові дослідження штамів ешерихій, виділених у свиногосподарствах України на протязі періоду виконання даної роботи, показали, що E.coli серогрупи О157 становлять 2% від загальної кількості мікроорганізмів даного виду. Виділені E.coli не продукували шиготоксин - культуральні супернатанти і бактеріальні лізати даного штаму не були цитотоксичні для лінії Vero. Негативні результати отримані також при проведенні гібридизації з відповідними нуклеотидними праймерами. Але даний штам був здатний продукувати термолабільний ентеротоксин.

Проведені дослідження показали, що дані штами належать до двох різних патогруп ешерихій. Штам О157:НР, виділений від ВРХ, належить до групи STEC, оскільки має stx-гени, а штам О157:К88ас належить до групи ЕТЕС, оскільки йому властива експресія фімбріальних адгезинів і синтез термолабільного ентеротоксину.

Таким чином, виходячи з результатів досліджень по виділенню культур ешерихій на протязі 1999-2001 року, можна константувати, що E.coli серогрупи О157 складають 2% загальної кількості епізоотичних ізолятів мікроорганізмів даного виду.

ВИСНОВКИ

1. Проведеними дослідженнями вперше в Україні вивчено розповсюдження шиготоксинпродукуючих ешерихій у тваринницьких господарствах, оцінено антигенну структуру та визначено спектр домінуючих сероварів STEC у різних видів сільськогосподарських тварин. У виділених штамів вивчені фактори патогенності та встановлені ознаки належності до групи ентерогеморагічних ешерихій – збудників геморагічного коліту, гемолітичного уремічного синдрому й тромбоцитопенічного акроангіотромбозу.

2. Шиготоксинпродукуючі E.coli широко розповсюджені в господарствах різних адміністративних регіонів України – циркуляція STEC виявлена серед ВРХ 60% обстежених тваринницьких ферм. Носіями ешерихій даної патогенної групи є 9,3% ВРХ, кількість STEC-позитивних телят вища порівняно з дорослим поголів’ям у 1,8 рази.

3. E.coli., що мають здатність продукувати шиготоксини, можуть відігравати патогенетичну роль у виникненні й розвитку шлунково-кишкових захворювань телят і поросят. STEC виділені від 12.9% хворих на діарею телят та 9,68% поросят.

4. Носійство ешерихій, які мали властивість продукувати Stx2 встановлено у 41 % від загальної кількості дослідженої ВРХ, у 6% - Stx1, у 29% - Stx1/2. 24% тварин характеризувалися одночасною екскрецією штамів STEC із різними токсигенними властивостями: у 6% обстеженого поголів’я ВРХ циркулювали E.coli, продуценти Stx1 та Stx2 токсинів, у 6% - Stx1 та Stx1/2, у 12% - Stx2 та Stx1/2.

5. Наявність еае-гену, відповідального за синтез інтиміну – фактору колонізації макроорганізму, встановлено у 18,8% виділених від дорослої ВРХ і 52,2% від здорових телят штамів STEC. Цей ген був присутній у 100% штамів STEC, виділених від хворих тварин (р< 0,05). 12,5% штамів STEC, виділених від дорослих ВРХ і 29% штамів, виділених із фекалій здорового молодняку, володіють ентерогемолітичними властивостями. У штамів STEC не виявлено продукування термолабільного й термостабільного ентеротоксинів й експресії фімбріальних адгезинів.

6. Для ВРХ характерною є одночасна екскреція STEC із різною антигенною структурою й типом токсинопродукування. При дослідженні проб фекалій, отриманих від корів і телят, STEC з різними соматичними антигенам були виділені від 4 тварин (9,7%). Більшість досліджуваних культур STEC не типувалося аглютинуючими О-колі сироватками. Було ідентифіковано серогрупу E.coli з проб фекалій 8 корів (47%) і 14 телят (54,2%) у 4-х господарствах. Ідентифіковані штами належали до чотирьох серогруп – О111, О8, О26 і О2.

7. У свиней E.coli, здатні продукувати шиготоксини становлять 14,3% від загальної кількості токсигенних штамів. Штами STEC, виділені від свиней, здатні одночасно продукувати ентеротоксини й шиготоксини: 66,7% культур одночасно продукують Stx2v і ТЛ і 33,3% продукують тільки Stx2v. Установлено належність ізолятів STEC від свиней до серогруп О139 і О141. У даних штамів не виявлено експресії адгезивних антигенів, сироватки до яких входять до складу діагностичного набору.

8. Уперше в Україні проведено скринінг і виділено штами E.coli серогрупи О157. Ці ешерихії складають 2% загальної кількості епізоотичних ізолятів мікроорганізмів даного виду в господарствах України, у тому числі, вони становлять 0,54% від загальної кількості культур E.coli, виділених від ВРХ різних вікових груп і з різним клінічним статусом і 1,46% від загальної кількості культур E.coli, виділених від свиней.

9. Додавання до 1л МПА 5 г жовчі ВРХ, 12 г сорбіту, 0,001 г кристал-віолету, 0,03 г нейтрального червоного, 1 г цитрату заліза, 5 г тіосульфату натрію забезпечує високу селективність та диференціацію росту ентерогеморагічних ешерихій серотипу О157:Н7. Значні інгібуючі властивості у відношенні мікробів-асоціантів забезпечують ефективність даного живильного середовища при дослідженні зразків із фекалій, патологічного матеріалу, об’єктів навколишнього середовища, продуктів харчування.

ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

На підставі проведених досліджень для практичного застосування пропонуються:

- вакцина для профілактики пастерельозу, сальмонельозу й ешерихіозу свиней “Пасако”

- методичні рекомендації з діагностики та профілактики колібактеріозу птиці”

- селективне й диференційне живильне середовище для виділення штамів ентерогеморагічних Е. Сoli О157:Н7 агар

СПИСОК ОСНОВНИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Зоценко Л.В. Токсигенні ізоляти Escherichia coli, виділені від хворих на діарею поросят // Науковий вісник Національного аграрного університету. – Вип.28. – Київ, 2000. – С. 218-219.

2. Зоценко Л.В. Аналіз цитотоксичності в культурі клітин і полімеразна ланцюгова реакція як методи дослідження шиготоксинпродукуючих E.coli // Вісник Білоцерків. держ. аграрного ун-ту. – Вип. 18. – Біла Церква, 2001. – С. 52-56.

3. Зоценко Л.В. Вплив умов культивування на рівень продукування веротоксинів E.coli // Міжвідомчий тематичний науковий збірник “Ветеринарна медицина”. – Вип. 79, том.1. – Харків, 2001. – С. 146-148.

4. Волинець Л.К., Мазур Т.В., Тарасюк Т.І., Зоценко Л.В., Яненко В.М., Яненко У.М., Москалюк В.І., Прокоп’юк О.Г. Ефективність щеплення свиней вакциною “Пасако” // Науковий вісник НАУ. – Вип.36. – Київ, 2001. – С. 111-114.

Дисертантці належать всі експериментальні дослідження, пов’язані з ешерихіозними компонентами у складі вакцини

5. Зоценко Л.В., Волинець Л.К. Моніторинг штамів E.coli серогрупи О157 // Ветеринарна біотехнологія. – Бюлетень № 2. – Київ, 2002. – С. 83-87.

Дисертантка провела всі бактеріологічні дослідження, систематизувала та узагальнила результати досліджень

6. Волынец Л.К., Зоценко Л.В. Продуцирование веротоксинов ешерихиями, выделенными при колибактериозе телят // Актуальные проблемы патологии сельскохозяйственных животных: Материалы международной научно-практической конференции 5-6 октября 2000, БелНии экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского. – С. 249-251

Дисертантці належить основна частина бактеріологічних досліджень, систематизація та оформлення одержаних результатів.

7. Tarasiuk T., Zotsenko L., Volynets L. The use of superhigh frequency field in the control of toxicoinfections. Symposium Ukraine – Osterreich. Landwirtschaft: Wissenchaft unds Praxis. Tschernivci, 14-16 September 2000.- P.136

Дисертантка провела вивчення властивостей E.coli та узагальнила результати досліджень.

Зоценко Л.В. Розповсюдження шиготоксинпродукуючих ешерихій серед ВРХ і свиней та вивчення їх біологічних властивостей. – Рукопис

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.03 – ветеринарна мікробіологія та вірусологія. – Національний аграрний університет, Київ, 2003

Дисертаційна робота присвячена вивченню розповюдження шиготоксинпродукуючих ешерихій серед тварин господарств України. У результаті проведених досліджень вперше в Україні визначено ступінь поширення шиготоксинпродукуючих ешерихій серед ВРХ, свиней, птиці, оцінено їх антигенну структуру та спектр домінуючих сероварів. У виділених штамів вивчені фактори патогенності та встановлені ознаки належності до групи ентерогеморагічних ешерихій – збудників геморагічного коліту, гемолітичного уремічного синдрому й тромбоцитопенічного акроангіотромбозу. Установлено етіологічну роль STEC у розвитку захворювань телят і поросят, які супроводжуються діареєю, та визначена їх антигенна структура. Використані сучасні діагностичні методи дали змогу отримати об’єктивну інформацію щодо факторів патогенності виділених штамів. Проведено скринінг штаму О157:Н7.

Ключові слова: ешерихії, шиготоксинпродукування, E.coli O157:H7, stx, STEC.

Зоценко Л.В. Распространение шиготоксинпродуцирующих эшерихий среди КРС и свиней, а также изучение их биологических свойств. – Рукопись

Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук по специальности 16.00.03 – ветеринарная микробиология и вирусология. – Национальный аграрный университет, Киев, 2003

Диссертационная работа посвящена изучению распространения шиготоксинпродуцирующих эшерихий среди сельскохозяйственных животных. В результате проведенных исследований впервые в Украине определена степень носительства шиготоксинпродуцирующих эшерихий крупным рогатым скотом, свиньями, птицами, оценена их антигенная структура и спектр доминирующих сероваров.

Циркуляция STEC виявлена среди 9,3% КРС из 60% исследованных хозяйств, количество STEC-положительых телят превысило количество STEC-положительных взрослых в 1,8 раза. При исследовании фекалий от 195 телят выявлено 24 животных – носителей STEC, что составило 12,3% от общего количества исследованного молодняка. Из 245 иследованных проб фекалий от взрослых голов, культуры STEC выделены из 17 образцов (6,94%).

При изучении биологических свойств выделенных штамов использованы высокочуствительные и высокоспецифические методы исследований (полимеразная цепная реакция, культура клеток), благодаря чему была получена объективная информация о биологических свойствах выделенных штамов STEC.

Результаты проведенных исследований по исседованию типа шиготоксинпродуцировани показали, что 41% культур STEC, виделенных от взрослого крупного рогатого скота продуцировали Stx2. Із 17 STEC-положительных животных культуры только Stx1-продуцирующих эшерихий были выделены только от 1 животного и еще двое коров экскретировали Stx1-продуцирующие ешерихии в комбинации с E.coli - продуцентами Stx2 или Stx1/2. У остальных животных доминировали STEC, которые продуцировали Stx2 і Stx1/2 (Р<0,05). 7 голов КРС екскретировали stx-2 E.coli і 5 - stx-1/2. При анализе токсигенних свойств E.coli, виделенных от телят, установлено, что большинство из них были также носителями stx-2 гена і, соответственно, продуцентами Stx2 токсина. Из 24 STEC-положительных телят, 11 (45,8%) были носителями stx-2 E.coli, 4 (16,7%) - stx-1/2, 8 (33,3%) - stx-1, 1 (4,2) - stx-1 і stx-2.

У выделенных штамов изучены факторы патогенности и установлены признаки энтерогеморагических эшерихий – возбудителей геморргаческого колита, гемолитического уремического синдрома и тромбоцитопенического акроангиотромбоза. Изучение наличия еае-гена, отвечающего за синтез интимина – фактора колонизации макроорганизма, показало его присутствие у 18,8% выделенных от взрослых КРС і 52,2% выделенных от здоровых телят штаммов STEC. Наши результаты показали, что наличие еае-гена у STEC, выделенных от телят, было вероятно выше (Р<0,05), чем у культур ешерихий данной патогруппы, виділенных от взрослых. Этот ген имели все штаммы STEC, выделенные от больных телят.

12,5% штаммов STEC, выделенных от взрослых КРС и 29% штаммов, выделенных с фекалий здорового молодняка обладали ентерогемолитическими свойствами.

При изучении О-серогруппы выделенных штаммов E.coli установлено, что большинство культур не типировалося О-коли аглютинирующими сыроватками. Идентифицированные штаммы принадлежали к четырем серогруппам – О111, О8, О26 і О2. В ряде хозяйств от группы STEC-положительных животных виделено ешерихии, принадлежали к определенной серогруппе и которые не типировались в реакции аглютинации с стандартными сыроватками. Трое животных были носителями 2 штаммов STEC с разной антигенной структурой и типом токсинопродуцирования.

При определении серогруппы выделенных шиготоксинпродуцирующих штаммов E.coli от телят установлено их принадлежность к серогруппам О111, О26, О8, О5, ОR, ОНТ, причем основну долю культур STEC составили E.coli серогруппы О26. При исследовании проб фекалий телят, STEC с разными соматическими антигенами были выделены от одного животного. При анализе типа токсинопродуцирования было установлено, что в группе шиготоксинпродуцирующих эшерихий, виділених від хворих телят домінують продуценти Stx1

Проведений аналіз одержаних у дисертаційній роботі даних дає підставу зробити заключення про те, що в господарствах України циркулюють штами шиготоксинпродукуючих ешерихій, які володіють факторами патогенності ентерогеморагічних E.coli.

Установлено этиологическую роль STEC в развитии заболеваний поросят, сопровождающихся диареей. У свиней E.coli, способные продуцировать шиготоксини составили 14,3% от общего количества токсигенных штаммов. Із 42 штаммов E.coli, у которых установлено способность к продуцированию энтеротоксинов, 6 продуцировали шиготоксин, что составило 14,3% от общего количества токсигенних штаммовв. Из них 4 (66,7%) одновременно продуцировали шиготоксин и термолабильный энтеротоксин и 2 (33,3%) – только шиготоксин. Шиготоксинпродуцирующие штаммы эшерихий принадлежали к серогруппам О139 и О141.

Впервые в Украине проведено скрининг и выделено штаммы E.coli, принадлежащие к серогруппе О157. Эти ешерихии составили 2% общего количества эпизоотических изолятов микроорганизмов данного вида, выделенных в хозяйствах Украины, в том числе, они составили 0,54% культур E.coli, выделенных от КРС и 1,46% E.coli, выделенных от свиней.

Ключевые слова: эшерихии, шиготоксинпродуцирование, E.coli O157:H7, stx, STEC.

Zotsenko L.V. Distribution shigotoxinproducing E.coli among cattle and pigs and