НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Захарчук Наталія Анатоліївна

УДК: 635.21: 632.481.46: 581.143.6

ФІТОТОКСИЧНІ МЕТАБОЛІТИ PHYTOPHTHORA INFESTANS І ЇХ ВИКОРИСТАННЯ ПРИ СТВОРЕННІ СТІЙКИХ ФОРМ КАРТОПЛІ

06.01.11 – фітопатологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2003

Дисертацією є рукопис

Дисертаційна робота виконана в Інституті картоплярства УААН

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор,

Зайченко Олександр Максимович, Інститут мікробіології і вірусології ім. К.Д. Заболотного НАН України, керівник лабораторії вторинних метаболітів мікроміцетів

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

Слюсаренко Олександр Миколайович, Одеський національний університет ім. І.І.Мечникова МОН України, професор кафедри ботаніки

кандидат біологічних наук, Ковбасенко Василь Михайлович, Київська дослідна станція овочівництва і баштанництва УААН, завідувач відділу мікології і захисту рослин

Провідна організація: Харківський національний аграрний університет

ім. В.В.Докучаєва, кафедра фітопатології, Міністерство аграрної політики України, м.Харків

Захист відбудеться “27 ” червня 2003 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.02 в Національному аграрному університеті за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв Оборони, 15, навчальний корпус 3, аудиторія 65

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв Оборони, 13, навчальний корпус 4, к. 41

Автореферат розісланий “22” травня 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Менджул В.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Картопля - одна з головних сільськогосподарських культур в Україні. Багаті на поживні речовини органи рослин картоплі є добрим субстратом для збудників багатьох хвороб. Вегетативний спосіб розмноження культури сприяє збереженню та значному накопиченню інфекції, що призводить до виникнення епіфітотій, а отже і значних втрат урожаю.

Підраховано, що картопля ушкоджується 38 видами грибів, серед яких найшкодочиннішим є Phytophthora infestans (Mont) de Bary - збудник фітофторозу. Головна небезпека фітофтори обумовлена її високою пластичністю і внутрішньопопуляційною мінливістю.

Впровадження стійких сортів є основною ланкою у системі заходів захисту картоплі від фітофторозу. Насамперед це пов’язано із завданням охорони навколишнього середовища від забруднення хімічними засобами захисту і підвищенням рентабельності картоплярства.

На сьогодні для виведення нових стійких проти хвороби сортів картоплі поряд з традиційними методами селекції використовують сомаклональну мінливость та клітинну селекцію.

Для успішного застосування цих методів необхідно мати ефективну систему регенерації в культурі in vitro, яка у картоплі часто не відповідає вимогам експерименту. Крім того, майже всі нині існуючі схеми клітинної селекції розраховані на створення стійкості до патогенів, які як правило, пов’язані з патотоксинами.

Тому надзвичайно актуальним є пошук нових оригінальних підходів. Виділення фітотоксичних метаболітів гриба P. infestans, які відіграють ключову роль у патогенезі і можуть бути успішно застосовані в клітинній селекції як селективний фактор, і є одним з таких підходів, і саме йому присвячена дана робота.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась у відповідності з напрямком науково-дослідних робіт Інституту картоплярства УААН в рамках проведення досліджень за темою 01.01 “Створити вихідний матеріал і донори стійкості до основних хвороб картоплі, провести оцінку та виділити кращі форми для використання в практичній селекції” (№ державної реєстрації 01970005459), а також науково-технічною програмою “Біотехнологія культурних рослин” УААН “На основі застосування методу клітинної інженерії в культурі in vitro одержати високопродуктивний вихідний матеріал картоплі для цілей селекції” (№ державної реєстрації 1.1.5.5).

Мета та задачі досліджень. Метою даної роботи було вивчити ефективність сомаклональної мінливості і клітинної селекції з використанням фітотоксичних метаболітів (ФТМ) гриба P. infestans для підвищення стійкості проти фітофторозу рослин картоплі. Для вирішення даної мети були поставлені наступні задачі:

- вивчити морфогенетичну активність різних сортів і типів експлантів картоплі і відібрати для подальшої роботи матеріал з високим морфогенним потенціалом in vitro;

- розробити метод виділення та очищення ФТМ гриба P. іnfestans;

- дослідити фітотоксичну активність виділених метаболітів і можливість використання даних речовин як селективних факторів для клітинної селекції;

- отримати на селективних середовищах клітинні клони та рослини-регенеранти і проаналізувати їх стійкість проти фітофторозу в умовах як in vitro, так і in vivo.

Об’єктом дослідження був гриб P. infestans, його метаболіти та сорти картоплі з різною стійкістю проти фітофторозу.

Предметом дослідження були фітотоксичні властивості метаболітів P. іnfestans, показники росту та розвитку суспензійної та калусної культур різних сортів картоплі.

Методи дослідження. Для виконання поставлених завдань використовували фітопатологічні, фізіологічні, фізико-хімічні, біотехнологічні, селекційні методи досліджень.

Наукова новизна роботи. При відпрацюванні системи калусогенезу та морфогенезу нових сортів картоплі, яка передбачає отримання гетерогенних мілкоагрегованих суспензійних культур з високою швидкістю росту (8-12 днів) та використання модифікованого нами середовища Мурасіге-Скуга для ініціації морфогенезу (40 мг/л аденіну; 1,0 мг/л зеатину; 0,05 мг/л біотину; 0,4 мг/л індолілоцтової кислоти), досягнуто високу частоту регенерації в культурі in vitro. Вперше розроблена методика виділення і очищення фітотоксичних речовин P. іnfestans, що базується на культивуванні патогена в рідкому середовищі Henninger протягом 18 діб (початок стаціонарної фази) та осадженні метаболітів сірчанокислим амонієм (0,7 насичення) з наступним гель-фракціонуванням на “Sephadex” G-75. Показана фітотоксична активність цих метаболітів щодо хлорели, ізольованих листків і калусної тканини картоплі. Встановлено, що ФТМ P. іnfestans, використані як селективний фактор в концентраціях 0,5-5,0 мг/мл, здатні підвищувати стійкість рослин картоплі проти фітофторозу на 2-4 бали. Доведено, що ознака стійкості, набута на клітинному та тканинному рівнях, експресується на рівні рослин-регенерантів та стабільно успадковується принаймні не менше як до третього вегетативного покоління.

Практичне значення одержаних результатів полягає в оптимізації методики виділення ФТМ P. іnfestans і вивченні їх дії на клітинному та рослинному рівні. Обгрунтовано перспективність використання методів клітинної селекції для створення селекційного матеріалу та сортів картоплі стійких проти фітофторозу в комплексі з іншими цінними ознаками та залучення його в селекційну практику. Запропонований метод рекомендовано для широкого застосування під час проведення фітопатологічних і біотехнологічних досліджень в наукових установах та селекційних центрах.

Особистий внесок здобувача полягає в тому, що ним безпосередньо проведено аналіз літературних даних, здійснено планування, підготовка та проведення лабораторних і польових досліджень, узагальнено експериментальні дані, зроблено висновки, а також апробація наукових розробок і підготовка наукових статей здійснено дисертантом самостійно або у співавторстві з різною участю (35-80%).

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень було викладено на засіданнях Вченої Ради Інституту картоплярства УААН (1997-2000рр.), Міжнародній конференції “Агробиoтехнологии растений и животных” (29-30 мая, 1997, Киев); II International Symposium on Plant Biotechnology (4-8 October 1998, Kyiv); Міжнародній конференції “Наукові основи стабілізації виробництва продукції рослинництва” (Харків, 1999); Міжнародній науково-виробничій конференції “Проблеми виробництва екологічно чистої сільськогосподарської продукції на межі 3-го тисячоліття” (Житомир, 2000).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 наукових праць, з них 3 статті у фахових виданнях.

Структура та обсяг роботи. Дисертація викладена на 133 сторінках машинописного тексту, складається зі вступу, огляду літератури та експериментальної частини, що містить 4 розділи, висновків, списку використаних джерел (215 найменувань, в т.ч. 98 – іноземних). Робота містить 24 таблиці і 18 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

В даному розділі наведені літературні дані щодо біології, поширення та шкодочинності збудника фітофторозу картоплі, дана характеристика метаболітів роду Phytophthora. Проаналізовані дослідження по сомаклональній мінливості та клітинній селекції на стійкість проти основних захворювань картоплі. Обгрунтовано перспективність методів біотехнології для одержання форм картоплі з підвищеною стійкістю до фітопатогенів.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Об’єктами досліджень були 7 сортів картоплі селекції Інституту картоплярства УААН з різною стійкістю проти фітофторозу: сприйнятливі – Зов, Незабудка, Повінь; відносно стійкі – Кобза, Луговська, Обрій, Слов’янка; раси P. infestans R 1-11 xyz (1.2.3.4.5.6.6.+0.7.8.10.11), R 1.2.3.4 та місцева популяція гриба, виділена в 1997 році з селекційних посадок Інституту картоплярства, фітотоксичні метаболіти P. infestans, виділені з культуральних фільтратів патогена.

Культура калусних тканин і суспензійних клітин картоплі. В усіх дослідах використовували рослини in vitro оздоровлені від вірусних і бактеріальних хвороб методом культури меристеми в поєднанні з хіміо- і термотерапією (Остапенко, Кучко, 1977).

Калусну тканину отримували, використовуючи листки та стебла пробіркових рослин вихідних сортів, які культивували в чашках Петрі на середовищах для одержання крихкого та морфогенного калусу.

Суспензійну культуру ініціювали з крихких калусів у середовищі М-С (Murashige, Skoog, 1962) і культивували при постійному струшуванні в колбах при температурі 25±1? С, відносній вологості повітря 80-85%, в темряві.

Після 2-3 пасажів, коли суспензія стабілізується, її використовували в роботі для одержання сомаклонів і в дослідженнях по клітинній селекції.

Живильні середовища. Індукцію калусоутворення для різних сортів картоплі проводили з використанням провідного середовища за прописом М-С з деякими нашими модифікаціями.

Для регенерації рослин з калусних тканин були випробувані 8 варіантів живильних середовищ на основi середовища Shepard (1980) з різним складом гормональних і органічних добавок.

Для культивування: суспензійної культури картоплі використовували 2 варіанти середовища, які різнились за вмістом вітамінів, 2,4-діхлорфеноксиоцтової кислоти (2,4-Д) та глюкози; для калусних тканин – досліджувались різні концентрації цукрози, бензиламінопурину (БАП), індолілоцтової кислоти (ІОК), кінетину, аденіну, 2,4-Д та глюкози; для регенерації - випробувані п’ять варіантів середовищ з різним вмістом аденіну, БАП, зеатину та ІОК.

Для розмноження вихідних сортів картоплі і укорінення рослин-регенерантів нами були використані три варіанти безгормональних середовищ.

Оцінка рослин-регенерантів в культурі in vitro та in vivo. Оцінку стійкості рослин in vitro до збудника фітофторозу картоплі проводили лабораторним методом шляхом обприскування суспензією зооспор за методикою Коваль (1987).

В умовах in vivo протягом вегетаційного періоду проводили морфологічні та фенологічні спостереження, обліки ураження хворобами, визначення кількісних і якісних показників (Методичні рекомендації по проведенню досліджень з картоплею, 1983).

Усі варіанти дослідів проводили не менше, ніж в 3-х кратній повторності та обробляли за допомогою статистичного методу дисперсійного аналізу за Доспєховим (1979).

Методи виділення фітотоксичних метаболітів P. infestans, дослідження їх біологічної активності та вивчення впливу отриманих сполук на суспензійну і калусну культури картоплі будуть наведені при викладенні наступних розділів.

РОЗШИРЕННЯ ГЕНЕТИЧНОЇ ВАРІАБЕЛЬНОСТІ МЕТОДОМ СОМАКЛОНАЛЬНОЇ МІНЛИВОСТІ

Дана частина досліджень була спрямована на відпрацювання оптимальних умов отримання та культивування суспензійних і калусних культур, досягнення морфогенетичних процесів та одержання рослин-регенерантів.

Слід зазначити, що інтенсивність росту калуса, консистенція утворюваної тканини та регенераційні процеси залежали від генотипових особливостей сорту картоплі, носили сезонний характер, але головним чином вони залежали від наявності в середовищі регуляторів росту. Для регенерації рослин з калусних тканин були випробувані 8 варіантів середовищ, скомпонованих на мінеральній основі за прописом Шепарда, що різнились за вмістом органічних та гормональних компонентів.

Характер регенераційних процесів складався по-різному.

Стеблові апекси з’являлись лише на середовищах, які містили зеатин.

Пік утворення регенерантів для всіх сортів припадав на 5-10 пасажі калуса, після якого кількість утворених рослин зменшувалась, калус втрачав свою життєздатність. Проте, регенераційна активність калусної тканини з стеблового експланту сортів Незабудка, Обрій та Слов’янка зберігалась і після 20 пасажу.

Вплив тривалості пасування калуса на морфогенетичні процеси у різних сортів виявлявся неоднозначно. Рослини-регенеранти, одержані з перших п’яти пасажів калуса, як правило, фенотипово були ідентичні вихідному сорту. Серед ліній регенерантів, які отримали з тривало пасованого калуса, значно зростає число форм зі зміненою морфологією: карлики, розеточні, з ослабленим верхівковим домінуванням та іншими відхиленнями, які значно знижують їх практичну цінність.

Найбільш активний морфогенез ми спостерігали в березні-квітні, листопаді-грудні. Пік утворення рослин-регенерантів для всіх сортів, незалежно від взятого експланту і гормонального складу середовища, припадав на грудень місяць.

Крихкий калус, що слугував вихідним матеріалом для одержання суспензії клітин, отримували шляхом культивування калусної тканини на середовищі зі зниженою до 0,2 мг/л концентрацією кінетину. Суспензійна культура проявляла значну варіабельність по кольору, структурі, щільності та швидкості росту.

Найбільша швидкість росту була відмічена у клітин сортів Зов, Незабудка, Повінь. Щільність суспензії 104- 105 клітин/мл досягалась у цих випадках через 6-8 днів після пасажу. Тривалість суспензійного пасажу для сортів Слов’янка і Луговська була дещо довшою і складала 10 та 12 днів, відповідно. При подальшому субкультивуванні строки пересадки суспензії практично вирівнювались незалежно від вихідного сорту та характеристики калуса і становили 10-12 днів.

Для регенерації було використано 5 варіантів середовищ, на яких складався різний характер регенераційних процесів.

Так на середовищі, яке було перенасичене широким набором регуляторів росту різного характеру дії, активно наростала калусна тканина, проте морфогенні процеси були відсутні.

Рясний органогенез для всіх використаних сортів (за винятком с. Повінь) спостерігали на модифікованому нами середовищі з вмістом 40 мг/л аденіну; 0,05 мг/л біотину; 1мг/л зеатину і 0,4мг/л ІОК. Калуси сортів Незабудка, Луговська і Слов’янка утворювали 60-80 апексів у одній колбі. Проте лише 50% з них перетворювались у пагони. Для сорту Повінь, навіть на оптимальному середовищі, регенерація була низькою і складала лише близько 5% від загальної кількості висаджених калусів.

Утворені пагони переносили на середовища для укорінення і вирощування рослин-регенерантів.

В результаті проведених досліджень були модифіковані живильні середовища, відпрацьовані оптимальні умови для масового отримання крихкого та щільного калусів, суспензійної культури та регенерації рослин картоплі, що забезпечило планомірне виконання подальших досліджень.

ВИДІЛЕННЯ ФІТОТОКСИЧНИХ МЕТАБОЛІТІВ PHYTOPHTHORA INFESTANS ТА ВИВЧЕННЯ ЇХ АКТИВНОСТІ

Для виділення фітотоксичних метаболітів нами був використаний класичний підхід, що базується на фракціонуванні культуральних фільтратів та дослідженні активності одержаних фракцій за допомогою ряду тест-систем. Цей підхід включав також попереднє відпрацювання умов культивування патогена, орієнтованих на високий вихід і активність метаболітів.

Кращий ріст був відмічений на середовищі Henninger, яке ми використовували в подальшому для культивування P. іnfestans.

З метою визначення терміну максимального утворення фітотоксичних метаболітів P. іnfestans в різних умовах культивування, культуральні фільтрати тестували на токсичність за допомогою ізольованих листків картоплі. Дані візуальної оцінки наведені в таблиці 1, з якої видно, що здатність до утворення ФТМ з’являється вже на 3-4 добу культивування гриба. В подальшому спостерігається її наростання, і максимум утворення відзначається на 12-18 добу, тобто в стаціонарну фазу росту культури. Оскільки ФТМ визначаються після 3-денного культивування, можна припустити, що патоген утворює їх після проникнення в рослину.

Таким чином, базуючись на цих даних, ФТМ P. іnfestans можуть бути класифікованні як вторинні метаболіти, які продукуються при ураженні рослин картоплі.

Таблиця 1 - Динаміка утворення фітотоксичних метаболітів Phytophthora infestans

Термін культивування, діб | Інтенсивність некротичної реакції, візуально

1 | _

2 | _

3 | +

6 | ++

9 | +++

12 | ++++

15 | ++++

18 | ++++

Наступний етап досліджень передбачав культивування гриба з метою фракціонування метаболітів. Для досліджень використовували нативний культуральний фільтрат, який одержували шляхом пропускання культуральної рідини через мембранні фільтри марки “Synpor” (Чехія) з розміром пор 0,4 мкм. Такий підхід запобігав попаданню в препарати клітинних елементів патогена. Поряд з цим, використовували ліофілізований культуральний фільтрат. В подальшому такий культуральний фільтрат використовували і для одержання препаратів різної хімічної природи і зокрема: полісахаридної, білкової, ліпідної та препарату метаболітів низької молекулярної маси.

Всі одержані препарати тестували на фітотоксичну активність за допомогою Chlorella vulgaris 62 (Зольникова,1979) та ізольованих листків картоплі.

Як було встановлено, лише білкова фракція виявляла незначну фітотоксичну активність, в той час як інші досліджувані фракції такої активності не виявляли навіть в широкому діапазоні концентрацій.

Оскільки найбільша активність була характерною для білкової фракції, подальша стратегія досліджень була зорієнтована саме на цей препарат з подальшим його фракціонуванням.

З огляду на це, “сумарний білок”, одержаний шляхом висолювання сірчанокислим амонієм (повне насичення), піддавали подальшому фракціонуванню з використанням 0,3; 0,5; 0,7 та 0,9 – насичення (NH4)2SO4.

Одержані відповідним висолюванням фракції діалізували проти дистильованої води протягом 36 годин при температурі 4-6? С з застосуванням магнітної мішалки. Дистильовану воду замінювали через кожні 6 годин. Повноту діалізу контролювали кондуктометрично.

Одержані після діалізу осади центрифугували при 4000хg і ліофілізували.

Тестування одержаних білкових фракцій на можливу присутність вуглеводних компонентів за допомогою фенолсірчаної кислоти виявило розвиток кольорової реакції, особливо у препарату, одержаного при 0,7–насичення (NH4)2SO4, що свідчило про наявність в ньому вуглеводних фрагментів.

Поряд з цим, розвиток кольорової реакції з барвником “Кумассі” підтверджував наявність в одержаному препараті і білкових фрагментів.

На основі одержаних даних з великою ймовірністю можна передбачати глікопротеїдну природу одержаних препаратів. Саме тому нами була започаткована робота щодо виділення препаратів глікопротеїдної природи.

Узагальнена схема виділення та очистки ФТМ P. іnfestans приведена на рис. 1.

Рис. 1. Узагальнена схема виділення та очистки ФТМ Phytophthora іnfestans

Для виділення глікополімеру використовували культуральний фільтрат гриба P. infestans та метод гель-фільтрації на “Sephadex” G-75 (“Pharmacia”, Швеція) з застосуванням колонки розміром 14х650 мм. Елюцію глікополімеру здійснювали за допомогою фосфатного буфера (рH 7,0) з концентрацією 50 ммоль. Швидкість витікання з колонки – 0,3 мл/хв.

Перед нанесенням на колонку культуральний фільтрат концентрували приблизно в 5-6 разів за допомогою поліетиленгліколю з молекулярною масою 5000-7000 (“Loba Feinchemie”, Австрія). Кінцевий об’єм фільтрату був 360 мл. Фракції збирали об’ємом 5 мл і кожну з них аналізували на вміст білка ( з барвником “Кумассі”) та вуглеводів (фенолсірчаний метод).

Як видно з профілю елюції глікополімеру (Рис. 2), фракції з №22 по №33 включно містили як білок, так і вуглеводи в концентраціях 12,6 і 12,7 мкг/ на фракцію, відповідно. Стабільність даних щодо вмісту білків і вуглеводів в різних фракціях може свідчити про чистоту одержаного глікополімеру.

Рис. 2. Профіль елюції глікопротеїду Phytophthora infestans

Всі ці фракції об’єднували і ліофілізували. Одержаний таким чином препарат використовували як селективний фактор.

Селекція на стійкість щодо P. infestans передбачала відпрацювання селективних концентрацій ФТМ, у межах яких проявлялась життєздатність клітин, що характеризуються різною стійкістю до даного фактору. ФТМ P. infestans застосовували в різні фази росту клітинної популяції і стадії ембріогенезу залежно від сорту картоплі.

Встановлення сублетальних доз ФТМ базувалось на порівняльних дослідженнях дії різних концентрацій на ріст суспензійної культури. Так встановлено, що для стійкого сорту Луговська оптимальна концентрація ФТМ становила 5,0 мг/мл. Для сортів Кобза, Обрій, Слов’янка, що характеризуються середньою стійкістю – 3,0 мг/мл, а для сприйнятливих сортів Зов, Незабудка, Повінь – 0,5-1,0 мг/мл.

Присутність сублетальних концентрацій ФТМ в селективних середовищах викликала різке зниження життєздатності клітинних колоній, тому в подальших дослідженнях використовували ступеневе зростання концентрацій ФТМ.

На контрольному середовищі (без токсину) маса калуса в середньому складала: 148 мг для сорту Зов, 153 мг для сорту Незабудка, 171 мг для сорту Повінь, 156 мг для сорту Кобза, 168 мг для сорту Луговська, 150 мг для сорту Обрій і 164 мг для сорту Слов’янка. Найменша концентрація ФТМ – 0,1 мг/мл фактично не впливала на приріст і життєздатність калусної тканини як щодо стійких ( Кобза, Луговська, Обрій, Слов’янка) так і сприйнятливих (Зов, Незабудка, Повінь) сортів, порівняно з контролем.

Суттєву різницю у зменшенні приросту калуса спостерігали при концентраціях 0,5-5,0 мг/мл. В цілому ріст калусної тканини відносно стійких сортів пригнічувався значно менше, ніж сприйнятливих. Так, при концентрації 0,5 мг/мл приріст маси калуса сорту Луговська зменшився на 12% щодо контролю, а нестійкого сорту Повінь на - 49%.

Серед випробуваних концентрацій не виявлено таких, які б повністю пригнічували ріст калусної тканини, хоча для клітин дані концентрації були сублетальними. Можливо, це пояснюється різним рівнем організації клітин і тканин, тому концентрації ФТМ для калусних тканин напевне повинні бути дещо вищими.

На середовищі з концентрацією 5,0 мг/мл приріст калусної тканини стійкого сорту Луговська складав 48% від контролю, а для сорту Повінь лише 23%. Дана тенденція спостерігалась і при використанні відносно стійких (Обрій, Кобза, Слов’янка) і сприйнятливих сортів (Зов, Незабудка) (Рис.3).

На окремих калусних тканинах всіх задіяних сортів на середовищах з високим вмістом ФТМ спостерігали формування зелених ділянок більш стійкої тканини, а також морфогенних зон.

Суттєва різниця в прирості калусної маси стійких і нестійких проти фітофторозу сортів на селективних середовищах з однаковим вмістом ФТМ дала змогу продовжувати роботу в цьому напрямку.

КЛІТИННА СЕЛЕКЦІЯ КАРТОПЛІ НА СТІЙКІСТЬ ПРОТИ ФІТОФТОРОЗУ

Вивчали вплив робочих концентрацій ФТМ P. infestans на процеси морфогенезу і органогенезу різних вихідних експлантів та генотипів рослин картоплі.

В кінці першого селективного відбору (4–6 тижнів) частка калусів здатних до росту, складала від 0,9 до 9,7% в залежності від задіяного сорту та концентрації ФТМ P. infestans. Деякі з них

Рис. 3. Дія різних концентрацій ФТМ Phytphthora infestans на ріст калусної тканини сортів картоплі

1 – контроль, 2 – 5 мг/мл, 3 – 3 мг/мл, 4 – 1 мг/ мл, 5 – 0,5 мг/мл, 6 – 0,1 мг/мл

продовжували ріст і при підвищенні концентрації селективного фактору в другому і третьому селективних циклах.

Після двох-трьох пасажів калуса в умовах токсичного середовища резистентні експланти пересаджували на звичайне середовище (без ФТМ) і культивували протягом 4-6 тижнів для збереження їх регенераційної здатності, оскільки в разі сильного пресингу токсичних метаболітів калусна тканина повністю втрачала морфогенетичну здатнісь, в зв’язку з чим був використаний переривчастий метод відбору.

Для оцінки стабільності стійкості відібрані калуси повторно культивували на середовищі з ФТМ (IV селективний цикл). При цьому вони поділялись на дві групи:

у першої життєздатність була обумовлена адаптацією – ця група калусних ліній загинула, у другої – можливо, визначалась генетичними змінами, ці лінії активно продовжували ріст.

Після четвертого селективного циклу виділили по 4 стійких клітинних ліній у сортів Зов і Незабудка, 6 у сорту Повінь, 13 у сорту Кобза, 14 у сорту Обрій, 43 у сорту Луговська та 25 у сорту Слов’янка.

Таким чином, на тканинному рівні одержали сомаклональні лінії, які несуть у своєму генотипі стійкість щодо ФТМ P. infestans. Проте слід зазначити, що не всі отримані лінії були здатні до регенерації. В ході тривалого селективного відбору деякі з них втратили морфогенетичну компетентність. Серед резистентних калусних ліній сорту Луговська до регенерації були здатні лише 36, сорту Слов’янка – 12, сортів Кобза та Обрій – 8 і 9 відповідно, сорту Незабудка – 2, сортів Зов і Повінь по 1 лінії.

Результати досліджень регенерації рослин, проведеної в селективних умовах, показали, що підвищення концентрації токсичних метаболітів в середовищі знижувало кількість одержаних регенерантів. Так, для сорту Луговська на контрольному середовищі (без ФТМ) одержали 118 регенерантів, на середовищі, яке містило 0,1 мг/мл ФТМ –102, 0,5 мг/мл – 89, 1,0 мг/мл – 67, 3,0 мг/мл – 49 і на середовищі з найвищою концентрацією 5,0 мг/мл всього 42 рослини.

Така закономірність зберігалась для всіх задіяних сортів (Табл. 2).

Серед одержаних рослин-регенерантів лише 7-20% ліній (в залежності від сорту) мали нормальний фізіологічний розвиток.

Всі регенеранти, які добре росли в пробірковій культурі, були розмножені живцюванням і оцінені на стійкість до P. infestans в умовах in vitro.

В своїх дослідженнях ми використовували ізоляти раси 1.2.3.4.5.6.6.+0.7.8.10.11xyz, яка характеризується високою агресивністю і містить 11 генів вірулентності та місцеву популяцію збудника. Перед інфікуванням суспензію витримували 2-3 години в холодильнику (температура 3-5? С) для стимулювання виходу зооспор.

Таблиця 2 - Вихід рослин-регенерантів із суспензійної культури картоплі на селективному середовищі з різною концентрацією ФТМ

Варіант досліду | Отримано рослин-регенерантів у сортів, шт

Зов | Неза-будка | Повінь | Кобза | Луго-вська | Обрій | Сло-в’янка

МС (контроль) | 49 | 98 | 21 | 48 | 118 | 68 | 75

МС + ФТМ мг/мл

0,1 | 31 | 72 | 18 | 32 | 102 | 45 | 67

0,5 | 12 | 21 | 11 | 28 | 89 | 32 | 46

1,0 | 6 | 8 | 3 | 23 | 67 | 23 | 25

3,0 | 3 | 2 | 1 | 14 | 49 | 18 | 19

5,0 | 1 | 0 | 0 | 7 | 42 | 10 | 12

Методом штучного зараження в умовах in vitro була проведена оцінка 760 ліній сомаклонів, одержаних методом сомаклональної мінливості та 105 ліній, отриманих методом клітинної селекції. Слід зазначити, що серед рослин кожного з досліджуваних сортів, одержаних на контрольному (без ФТМ) і на селективних середовищах, спостерігали утворення ліній як із підвищеною стійкістю, так і більш сприйнятливих. Можливо, це пояснюється сомаклональною варіабельністю клітин під дією умов культивування in vitro. Характер розподілу частоти утворення різних за стійкістю ліній в межах кожного з вивчених генотипів указує на те, що більш стійкі на рівні регенерантів лінії зустрічаються частіше у рослин, одержаних з більш стійких генотипів. Так, серед регенерантів сорту Луговська 42% складали рослини, які мали вищий бал стійкості, в порівнянні з контролем, сорту Слов’янка – 27%. Тоді як лінії з підвищеною стійкістю у сорту Незабудка не перевищували 12% від загальної кількості одержаних рослин. В середньому з усієї кількості досліджуваного матеріалу, одержаного методом сомаклональної мінливості, 21,6% ліній мали стійкість вище контролю.

Внесення фітотоксичних метаболітів гриба P. infestans у селективні середовища призводило не лише до підвищення стійкості у рослин-регенерантів на 1-4 бали, але й до збільшення загальної кількості стійких ліній порівняно з контролем. Так, 33,9% отриманих ліній мали вищий бал стійкості, ніж вихідний сорт.

На рівень стійкості рослин-регенерантів впливали також кількість і тривалість пасажів калусної тканини. У сомаклонів сортів Незабудка, Обрій і Слов’янка, одержаних після 15 пасажу, спостерігали повне ураження рослин фітофторозом в культурі in vitro (бал стійкості 1-2). У рослин-регенерантів, отриманих з 5 по 11 пасаж калусу, бал стійкості щодо P. infestans становив 5-8. Можна припустити, що саме в цьому діапазоні виявляються більш стійкі форми.

Лінії регенерантів сортів Зов, Незабудка, Повінь, Кобза, Луговська, Обрій і Слов’янка, які характеризувались підвищеною стійкістю в культурі in vitro, в подальшому оцінювали на стійкість щодо P. infestans у польових умовах в 1999-2001 роках лабораторно-польовим методом за методикою Коваль.

Облік проводили тричі за період вегетації. Після узагальнення даних кожної з оцінок визначали середній індекс ураження фітофторою за період вегетації і за ряд років.

Оцінюючи результати тестування щодо P. infestans, можна зробити висновок, що стійкість досягнуту в культурі in vitro, не завжди можна проконтролювати в польових умовах. Не зважаючи на те, що стійкість у сортів Незабудка і Повінь становила 3 бали, а в 18% регенерантів 4-5 балів, у полі вони в першу чергу уражувались вірусними хворобами і були вибракувані.

У рослин-регенерантів сортів Зов, Кобза, Луговська, Обрій і Слов’янка індекс ураження фітофторою становив від 3,3 до 20 (5-9 балів).

В результаті досліджень нам вдалось виділити лінії, які протягом трьох років випробувань характеризувались нижчим індексом ураження порівняно з вихідними сортами (Рис.4).

Рис. 4. Стійкість біотехнологічних ліній картоплі до Phytophthora infestans в умовах in vivo

1 – контроль; 2-8 – лінії

ж – Зов; ¦ - Кобза; ¦ - Луговська; ^ - Обрій; x - Слов’янка.

Таким чином, при використанні сомаклональної мінливості і селективних середовищ з ФТМ гриба P. infestans були відібрані лінії картоплі, які характеризувались підвищеною стійкістю проти фітофторозу, порівняно з вихідними сортами. Встановлено, що ознака стійкості дібрана на клітинному та тканинному рівнях, експресується на рівні рослин.

Одержаний бульбовий матеріал оцінювали за комплексом господарськи цінних ознак з урахуванням фенологічних спостережень, морфологічного опису рослин, стійкості щодо грибних і бактеріальних хвороб.

Аналіз частоти виникнення в популяціях сомаклональних ліній, які перевищують за продуктивністю вихідну форму показав, що у більшості сомаклонів таких сортів як Кобза, Луговська, Обрій, Слов’янка такі лінії зустрічались значно частіше, ніж у Зову та Незабудки. Оцінка по господарськи цінних ознаках сомаклональних ліній різних сортів представлена в таблиці 3.

Після всебічного вивчення (морфологія, урожайність, стійкість проти хвороб, біохімічні показники) сомаклональну лінію стеблового походження К-18 (01.45.003) сорту Обрій передано для подальшого вивчення до розсадника основного випробування лабораторії селекції. Дана лінія перевищує вихідну форму (сорт Обрій) за господарськими показниками та стійкістю проти фітофторозу. Інші сомаклони проходять випробування на різних етапах селекційного процесу.

Статистичні показники рослин-регенерантів, одержаних методом клітинної селекції, виявили середню мінливість за урожайністю (коефіцієнт варіації 13,5–14,95) та незначну – за біохімічними показниками (коефіцієнт варіації 2,24-9,42). Використання ФТМ супроводжувалось високою мінливістю за стійкістю проти фітофторозу (коефіцієнт варіації 25-42,9), а це дало нам змогу серед одержаних регенерантів добирати форми з високими показниками стійкості до патогена.

Отже, в результаті проведених досліджень встановлено, що для збереження регенераційної здатності калусної тканини доцільно використовувати переривчастий метод відбору.

Тест-оцінка сомаклонів в культурі in vitro та in vivo на стійкість проти фітофторозу довела, що ознака стійкості, дібрана на клітинному та тканинному рівнях, експресується на рівні рослин.

Внесення ФТМ P. infestans в селективні середовища призводило до утворення рослин-регенерантів з підвищеною стійкістю проти фітофторозу та до збільшення загальної кількості стійких ліній (33,9%) порівняно до контролю (21,6%).

В результаті проведеної роботи в популяції сомаклонів нами відібрані лінії сортів Кобза, Луговська, Обрій, Слов’янка з високими показниками стійкості листя і бульб проти фітофторозу і комплексом господарськи цінних показників, які включені в подальшу роботу.

Таблиця 3 - Оцінка сомаклонів за основними господарськи цінними показниками (середня за 1999 – 2001 рр.)

Походження |

Урожай-ність, г/кущ | Вміст | Стійкість проти

кро-хма-лю, % | сухої речо-вини, % | сирого протеї-ну, мг% | фітофторозу |

макрос–поріозу, бал

листя, індекс уражен-ня | бульби, бал

Кобза

Стандарт | 572 | 18,0 | 24,5 | 3,0 | 29,0 | 3 | 7

К–29 Кб/ст | 527 | 17,8 | 24,2 | 3,2 | 8,3 | 9 | 5

НІР05 | 29 г/кущ

Луговська

Стандарт | 510 | 16,4 | 22,7 | 2,6 | 19,0 | 7 | 8

К–172 Луг/ст | 509 | 16,1 | 22,9 | 3,1 | 8,0 | 7 | 8

К–176 Луг/ст | 583 | 17,0 | 22,0 | 2,9 | 6,6 | 3 | 8

НІР05 | 26 г/кущ

Обрій

Стандарт | 557 | 16,7 | 23,0 | 3,1 | 26,7 | 3 | 7

К–11Об/ст | 810 | 17,6 | 23,1 | 3,1 | 16,7 | 5 | 7

К–18 Об/ст | 625 | 18,5 | 25,1 | 3,0 | 5,5 | 7 | 7

К–2 Об/л | 527 | 17,6 | 24,0 | 2,8 | 15,8 | 5 | 7

НІР05 | 32 г/кущ

Слов’янка

Стандарт | 500 | 12,6 | 18,1 | 2,2 | 20,0 | 3 | 6,6

К–30 Сл/ст | 478 | 12,6 | 18,5 | 2,4 | 6,7 | 3 | 7,3

К–21 Сл/ст | 550 | 11,7 | 17,5 | 2,0 | 13,3 | 5 | 7,3

К–24Сл/cт | 344 | 11,7 | 17,5 | 2,0 | 3,3 | 5 | 6,6

К–23 Сл/ст | 521 | 13,1 | 19,0 | 2,5 | 8,6 | 1 | 7,3

К–28 Сл/ст | 588 | 13,5 | 19,5 | 2,2 | 12,7 | 5 | 7,0

К– 19 Сл/ст | 490 | 12,4 | 18,25 | 2,3 | 11,4 | 3 | 7,3

НІР05 | 25 г/кущ

ВИСНОВКИ

1. Встановлено, що фітотоксичні метаболіти Phytophthora infestans можуть бути використані як селективний фактор при одержанні форм картоплі з підвищеною стійкістю до патогена. Такий підхід є ефективним і перспективним для практичного застосування.

2. Використання методу сомаклональної мінливості поряд із застосуванням фітотоксичних метаболітів Phytophthora infestans у 1,5-2 рази підвищує ефективність методів in vitro, особливо на ранніх пасажах (від 5 до 10), коли морфогенний потенціал культури досить високий (90% добору), а вірогідність втрати основних сортових ознак є незначною (до 5%).

3. При вивченні морфогенетичної здатності суспензійної та калусної культур досліджених сортів картоплі встановлено, що сорти Незабудка, Обрій, Слов’янка мають високий морфогенетичний потенціал in vitro (вихід з одного калусного експланту становить 30-40 рослин), не втрачають регенераційної здатності при тривалому культивуванні ( після 26 пасажу) і є зручними для використання в експериментах по клітинній інженерії.

4. Морфогенетичні процеси в калусах картоплі залежать не лише від типу експланта і складу морфогенного середовища, але і від гормонального складу середовища, на якому вони були отримані, тобто від гормонального статусу самих калусних клітин. Високоефективним для прояву морфогенезу є модифіковане нами середовище Мурасіге-Скуга з наступним вмістом гормонів: 40 мг/л аденіну; 1,0 мг/л зеатину; 0,05 мг/л біотину; 0,4 мг/л індолілоцтової кислоти.

5. Вперше відпрацьована схема виділення фітотоксичних метаболітів Phytophthora infestans, яка базується на фракціонуванні культуральних фільтратів та виявленні активних метаболітів. Одержані полісахаридна, білкова, ліпідна фракції та фракція низькомолекулярних метаболітів. Встановлено, що фракція, одержана шляхом висолювання сірчанокислим амонієм (0,7 насичення), проявляла найбільшу фітотоксичну активність. Гель-фільтрація даної фракції на “Sephadex” G-75 дозволила одержати метаболіт, який може бути ідентифікований як глікопротеїд (на основі стабільності складу вуглеводного і білкового компонентів).

6. Показано, що сумарна білкова фракція, як і глікопротеїд, виділений з неї, пригнічують ріст Chlorella vulgaris 62 і викликають некрози на ізольованих листках картоплі, ідентичні прояву реакції при штучному зараженні патогеном. Відпрацьовані концентрації фітотоксичних метаболітів Phytophthora infestans як селективного фактору в культурі in vitro, в межах яких проявляється різна життєздатність клітин у сортів, що різняться за стійкістю проти фітофторозу: для відносно стійких сортів вони становили 3,0-5,0 мг/мл, для сприйнятливих – 0,5-1,0 мг/мл

7. Показано, що сублетальні концентрації фітотоксичних метаболітів призводять до 100% втрати життєздатності калусних культур, в зв’язку з чим було розроблено ступеневе введення даного препарату в живильне середовище для кожного з задіяних сортів (від 0,1 мг/мл на стадії суспензійної культури до 5,0 мг/мл на стадії морфогенезу). Встановлено, що під дією сильного пресингу селективного фактору калусна тканина повністю втрачає морфогенетичну здатність, з огляду на що доцільно використовувати переривчастий метод добору стійких форм на стадії регенерації рослин.

8. З використанням методів in vitro отримані клітинні і калусні лінії та рослини-регенеранти з підвищенною на 2-4 бали стійкістю до патогену. Доведена висока ефективність раннього скринінгу в культурі in vitro. Лабораторна оцінка регенерантів, одержаних на фоні застосування фітотоксичних метаболітів Phytophthora infestans виявила форми картоплі з підвищеною стійкістю до патогена у 33,9% рослин. Доведено, що ознака стійкості, набута на клітинному та тканинному рівнях, експресується на рівні рослин-регенерантів та стабільно успадковується принаймні не менше як до третього вегетативного покоління.

9. Використовуючи метод сомаклональної мінливості та клітинної селекції з фітотоксичними метаболітами Phytophthora іnfestans в якості селективного фактору виділили лінії К-19, К-21, К-23, К-24, К-28, К-30 сорту Слов’янка, К-172, К-176 сорту Луговська, К-2, К-11 сорту Обрій, К-29 сорту Кобза, які характеризуються підвищенною стійкістю проти фітофторозу в поєднанні з господарськи цінними ознаками і проходять випробування на різних етапах селекційного процесу. Лінія К-18 стеблового походження сорту Обрій рекомендована для вивчення в розсаднику основного випробування лабораторії селекції.

РЕКОМЕНДАЦІЇ ЩОДО ПРАКТИЧНОГО ВИКОРИСТАННЯ

1.Фітотоксичні метаболіти гриба Phytophthora infestans, екстраговані за розробленою нами методикою рекомендується використовувати як селективні агенти в культурі in vitro при підвищенні стійкості картоплі проти фітофторозу.

2. Відпрацьовані та оптимізовані нами живильні середовища з вмістом 40 мг/л аденіну, 1,0 мг/л зеатину, 0,05 мг/л біотину, 0,4 мг/л індолілоцтової кислоти є високоефективними для регенерації в культурі картоплі і рекомендуються для використання в науково-дослідних установах для біотехнологічних досліджень.

3. Створений селекційний матеріал К-19, К-21, К-23, К-24, К-28, К-30 сорту Слов’янка, К-172, К-176 сорту Луговська, К-2, К-11 сорту Обрій, К-29 сорту Кобза рекомендується використовувати в селекційних програмах.

4. Виділена лінія К-18 с. Обрій пропонується для вивчення в розсаднику основного випробування лабораторії селекції Інституту картоплярства УААН.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Захарчук Н.А., Олійник Т.М., Зайченко О.М., Рубежняк І.Г., Кучко А.А. Елісіторні властивості метаболітів Phytophthora infestans (Mont) De Bary // Захист рослин.- 1998.- № 6.- С.20. (Особистий внесок здобувача 70%. Проведення експериментальних досліджень).

2. Захарчук Н.А., Олійник Т.М. Використання культури клітин в селекції картоплі //Наук. вісник Нац. аграрн. ун-ту.- 2001.- Вип. 34.- С. 58-61. (Особистий внесок здобувача 80%. Експериментальні дослідження та їх аналіз).

3. Захарчук