ЧЕРНІВЕЦЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ЮРІЯ ФЕДЬКОВИЧА

ЗІНЬКОВСЬКА НАТАЛІЯ ГРИГОРІВНА

УДК 352.38(015):567

функціонування антиоксидантних систем у крові риб ПРИ інтоксикації йонами міді, цинку, марганцю і свинцю

03.00.04 – БІОХІМІЯ

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ЧЕРНІВЦІ - 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Тернопільському державному педагогічному університеті ім. Володимира Гнатюка, Міністерство освіти і науки України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Грубінко Василь Васильович,

Тернопільський державний педагогічний

університет ім. Володимира Гнатюка,

завідувач кафедри загальної біології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Мещишен Іван Федорович,

Буковинська державна медична академія,

завідувач кафедри медичної хімії

доктор біологічних наук, професор

Великий Микола Миколайович,

Національний медичний університет

ім. О.О. Богомольця, кафедра біоорганічної,

біологічної та фармацевтичної хімії, професор

Провідна установа: Інститут біології тварин УААН, м. Львів

Захист дисертації відбудеться “26” листопада 2003 р. о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 76.051.05 при Чернівецькому національному університеті імені Юрія Федьковича за адресою: вул. Лесі Українки, 25 (ІІІ корп. ун-ту, ауд. № 81), Чернівці, 58012, Україна

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Чернівецького національного університету імені Юрія Федьковича за адресою: вул. Лесі Українки, 23, Чернівці, 58012, Україна.

Автореферат розісланий “24” жовтня 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Копильчук Г.П.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Важкі метали (ВМ) є забруднювачами водойм зростаючого значення, що зумовлено їх стійкістю в зовнішньому середовищі та високою біологічною активністю (Дж. Мур, С. Рамамурти, 1987). Біологічна і токсична роль йонів більшості ВМ пов’язана головним чином з їх участю в окисно-відновних процесах. Йони металів змінної валентності у вільному вигляді можуть генерувати активні форми кисню (И.Б. Афанасьев, 1979). Цинк, який має постійну валентність, також впливає на окисно-відновний потенціал системи, змінюючи реакційну здатність тіолових груп (S.R. Powell, 2000). З іншого боку, більшість ферментів антиоксидантного захисту є металопротеїнами, до складу яких входять залізо, мідь, цинк і марганець (А.Н. Осипов, 1990). Тому детермінація процесів антиоксидантного захисту при дії ВМ зумовлена як впливом надлишку вільних йонів ВМ на генерацію та дію активних форм кисню, так і забезпеченням антиоксидантних ферментів необхідною формою металу.

Для дослідження дії ВМ нами були обрані ті з них, які належать до найпоширеніших забруднювачів водойм – мідь (ІІ), цинк (ІІ), марганець (ІІ) і свинець (ІІ) (П.Н. Линник, 1999). Три перші з них виконують різноманітні життєво важливі біохімічні функції та використовуються у рибництві (В.И. Воробьев, 1979). Більшість досліджень впливу йонів ВМ на АПС гідробіонтів присвячені короткотривалій дії порівняно високих концентрацій йонів (V. Banerjee, M. Banerjee, 1988, A.M. Hilmy et al., 1988, A.A.R. Radi, B. Matkovics, 1988, N. Kray-Klobucar, S. Spasajerie, 1989). За аклімації до сублетальної концентрації міді, цинку, марганцю і свинцю досліджено активність ферментів антиоксидантного захисту, вміст продуктів ПОЛ в печінці, зябрах та еритроцитах коропа (Ю.В. Леус и др., 1998, Ю.В. Леус, В.В. Грубинко, 1998), посттрансляційні модифікації білків крові (А.С. Смольский, 2001, О.Б. Столяр, 2001). Однак результати вивчення тільки сублетальної дози токсиканту не дають достатніх підстав для визначення специфічних біохімічних механізмів пошкоджуючої дії цих металів. Відомо, що дія токсиканту може мати три дозо-залежні стадії (А.И. Божков, 1997). Тому доцільно провести системне дослідження антиоксидантно-прооксидантного статусу (АПС) риб залежно від концентрації металу у водному середовищі.

Дослідження крові у прісноводних риб є особливо цікавим, бо у них вода і багато неорганічних йонів абсорбуються залозистим апаратом зябер і відразу поступають у загальний кровообіг, не проходячи печінки. Неорганічні йони, які резорбуються в шлунково-кишковому тракті транспортуються до печінки, що може викликати появу в плазмі крові продуктів ураження ними гепатоцитів (В.Д. Романенко, 1978). Тому порівняння АПС плазми крові і еритроцитів може мати діагностичне значення.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась в межах держбюджетних тем кафедр загальної біології та хімії Тернопільського державного педагогічного університету ім. Володимира Гнатюка: “Дослідження метаболічної ролі амінокислот в адаптаційно-компенсаторних процесах в організмі тварин при екологічних стресах” (1999-2000 рр., номер держреєстрації 0199U002522); “Токсикоспецифічні адаптації гідробіонтів та водних екосистем до іонів важких металів та їх регуляція” (2001-2003 рр., номер держреєстрації 0101U000303).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було вивчення активності антиоксидантних систем еритроцитів і плазми крові коропа за дії йонів міді, цинку, марганцю, свинцю та оцінка ступеня дії на гідробіонтів досліджених ВМ.

На підставі літературних даних про дозо-залежні стадії дії йонів ВМ в організмі була висунута гіпотеза про залежність антиоксидантно-прооксидантних властивостей йонів металу від його концентрації у воді.

Тому завданням досліджень визначено:

1. Вивчити дію йонів міді, цинку, марганцю, свинцю та їх суміші на стан ферментів антиоксидантного захисту еритроцитів і плазми крові коропа залежно від концентрації йонів у воді, а для міді, і часу їх дії.

2. Визначити вміст продуктів окисної деградації гемоглобіну і ліпідів крові за дії на організм йонів ВМ в різних концентраціях.

3. Виявити ступінь прооксидантної дії йонів ВМ на кров in vitro.

4. Виявити оціночні показники АПС організму риб за дії йонів ВМ.

Об’єкт дослідження – стан крові коропа за дії на організм йонів ВМ.

Предмет дослідження – антиоксидантно-прооксидантний стан еритроцитів і плазми крові.

Методи дослідження – стан антиоксидантних систем характеризували за активністю супероксиддисмутази плазми крові та еритроцитів, каталази крові та плазми крові, церулоплазміну плазми крові, вмістом GSH в еритроцитах. Визначали вміст продуктів ПОЛ – малонового альдегіду і дієнових кон’югатів в плазмі крові, вміст гемоглобіну, метгемоглобіну та глікозильованого гемоглобіну в крові.

Одержані дані опрацьовані методами варіаційної статистики з використанням t-критерію Стьюдента.

Наукова новизна одержаних результатів. Показано подібність впливу йонів міді, цинку, марганцю і свинцю на АПС крові коропа за ступенем збалансованості АПС еритроцитів і плазми крові залежно від дози металу. Для дії кожного з досліджуваних металів спостерігалось три дозо-залежні стадії, які адекватно були відображені за допомогою інтегрального показника – коефіцієнту антиоксидантного стану (КАС) системи. При дії токсичних доз металів виявлено індивідуальні особливості їх впливу на стан металоферментів антиоксидантного захисту еритроцитів і плазми крові коропа. Вперше показано діагностичне значення визначення вмісту церулоплазміну та активності каталази в плазмі крові при дії на риб ВМ. Показано участь низькомолекулярних тіолів в захисті крові від прямої дії йонів ВМ.

Практичне значення одержаних результатів. Запропоновано об’єктивний і доступний набір методик для аналізу і прогнозу токсичної дії йонів ВМ, який полягає у визначенні інтегрального показника КАС еритроцитів та плазми крові. На основі одержаних результатів розроблено рекомендації для оцінки ступеня небезпечності забруднення водойм за збалансованістю АПС крові риб. Пропонується використовувати показник стабільності гемоглобіну як доступний і інформативний тест при визначенні ступеню токсичності йонів ВМ.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є особистою науковою працею автора. Постановка методик дослідження, одержання експериментальних даних, їх аналіз та оформлення здійснювались автором самостійно. Формулювання завдань та інтерпретацію результатів здійснено з допомогою наукового керівника: доктора біологічних наук, професора В.В.Грубінка.

В роботах, які опубліковані за темою дисертації і виконані у співавторстві, дисертант самостійно виконала експеримент, здійснила інтерпретацію результатів із впливу йонів міді, цинку, марганцю і свинцю на стан крові коропа. Співавтори досліджували інші тканини організму.

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи доповідалися на І Всеукраїнській науковій конференції „Екологічний стрес і адаптація в біологічних системах”, Тернопіль, 1998; Міжнародній конференції з фізіології і біохімії тварин, присвяченій 100-річчю від дня народження професора С.З.Гжицького, Львів, 2000; ІІІ з’їзді Гідроекологічного товариства України, Тернопіль, 2001; симпозіумі “Metals and Cells Symposium”, Canterbury 2001, Міжнародній науково-практичній конференції “Біологічні основи підвищення продуктивності тварин”, присвяченій 40-річчю створення Інституту біології тварин УААН, Львів, 2002; VIIІ Українському біохімічному з’їзді, Чернівці, 2002.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 11 робіт, з них 8 – статті в наукових фахових виданнях, 3 – матеріали і тези доповідей на з’їздах, симпозіумах і конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 136 сторінках машинописного тексту, складається зі вступу, огляду літератури, опису методів і об’єкту досліджень, 5 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, практичних рекомендацій та списку використаної літератури. Робота містить 16 рисунків, 38 таблиць. Бібліографічний список складає 233 джерела, з них 118 іноземними мовами.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури висвітлено механізми утворення та знешкодження активних форм кисню у організмі тварин за дії йонів важких металів; особливості реакції антиоксидантної системи організму тварин на дію міді, цинку, марганцю і свинцю.

Матеріали і методи досліджень. Дослідження проводились на дворічках коропа лускатого (Cyprinus carpio L.) масою 200 – 250 г. В кожну експериментальну групу було включено 5-6 особин. Дослідних риб адаптували до умов басейна протягом не менше 3 діб. Експериментальні умови створювали в басейнах об’ємом 200 л з кількістю риб з розрахунку 1 особина на 40 л води. Вміст кисню у воді підтримували на рівні 7,0 – 8,0 мг/л, диоксиду вуглецю – 2,2 – 2,8 мг/л, рН - 7,6 – 8,0. Воду відстоювали і змінювали кожні дві доби. Температура води коливалась від 10° до 18°С залежно від сезону. В експерименті риб не годували.

В кожному лабораторному досліді одна група була контрольною, іншій (іншим) у воду додавали солі ВМ. Вміст у воді Cu2+ (CuSO4 ·5 Н2О) складав 0,01; 0,1; 0,2; 0,5 і 1,0 мг/л, Zn2+ (ZnSO4) - 0,1, 2,0 або 5,0 мг/л, Mn2+ (MnCl2) – 0,13; 2,6 або 6,0 мг/л, Pb2+ (Pb(NO3)2) - 0,01; 0,2 або 0,5 мг/л. При дослідженні дії суміші йонів вміст компонентів складав Zn2+ - 0,1 мг/л, Cu2+ – 0,01 мг/л, Mn2+ – 0,13 мг/л, Pb2+ - 0,01 мг/л.

Найменша досліджувана концентрація металів перевищує їх середній вміст у прісних водоймах не більше, ніж в межах одного порядку (П.Н. Линник, 1999). Вищі, створювані нами, концентрації не викликали летальних наслідків протягом 14 діб інкубації і лише доза 1,0 мг/л міді викликала загибель риб після 2 діб інкубації. Вміст металу у воді створювали внесенням солей кваліфікації “хч” (“Реахим”) і контролювали за допомогою атомно-абсорбційної спектрофотометрії на спектрофотометрі С-115.

Витримували риб у токсичному середовищі за дії міді протягом 2, 7 і 14 діб, свинцю – 7 і 14 діб, цинку, марганцю та суміші йонів – 14 діб. Період 14 діб вважається найбільш оптимальним для аклімації гідробіонтів до дії екстремального фактора (В.Д. Романенко и др., 1991).

Для аналізу використовували кров, взяту з серця. Всі процедури по виділенню і обробці зразків проводились на холоді. Всі реактиви, крім окремо зазначених, були фірми “Реахим” кваліфікації “хч”.

При вивченні дії йонів металів на кров in vitro гепаринізовану кров об’ємом 0,1 мл змішували з 0,85% NaCl. До проб додавали розчин йонів металу (у вигляді хлориду) і (або) цистеїн (цистеїн-НСl, Reanal). Загальний об’єм проби становив 3 мл. Після цього проби інкубували протягом 1 год. при 25 С в термостаті при помішуванні. Кінцева концентрація металу в пробі становила від 0,01 мМ до 330 мМ.

Активність супероксиддисмутази (СОД) [КФ 1.15.1.1] визначали за інтенсивністю відновлення нітротетразолію синього (Е.Е. Дубинина, 1989, С. Чевари и др., 1991). Активність каталази [КФ 1.11.1.6] визначали за методом М.А. Королюка і ін. (1988). Вміст церулоплазміну [КФ 1.16.3.1] в плазмі крові вимірювали за здатністю окиснювати р-фенілендіамін (В.Г. Колб, В.С. Камышников, 1982), концентрацію відновленого глутатіону (GSH) - за допомогою реактиву Еллмана (J. Sedlak, R.H. Lindsay, 1968). Вміст дієнових кон’югатів визначали за особливостями спектру поглинання (И.Д. Стальная, 1977), а малонового альдегіду (МА) - в реакції з 2-тіобарбітуровою кислотою (И.Д. Стальная, Т.Г. Гаришвили, 1977). Залежно від умов інкубації визначали вміст МА в плазмі крові, його утворення за спонтанної інкубації крові та за активації ферментного або неферментного ПОЛ (Б.Н. Галкин и др., 1988), а також індекс антиоксидантної активності (В.Б. Мартынюк, 1991). Інкубаційна суміш для визначення неферментного ПОЛ містила 80 мМ аскорбінової кислоти, 0,2 мМ АDP, 0,012 мМ FeSO4, а ферментного ПОЛ – замість аскорбінової кислоти - 0,5 мМ NADPH.

Визначали також вміст загального гемоглобіну (Hb) та метгемоглобіну (MetHb) ціанметгемоглобіновим методом (М.С. Кушаковский, 1968), глікозильованого гемоглобіну – колориметричним методом (В.А. Галенок и др., 1989). В експерименті in vitro визначали стабільність гемоглобіну за часом преципітації в 17% розчині ізопропанолу в 0,1 М трис-НС1 буфері, рН 7,4 при 37°С (R.W. Carell, R.A. Kay, 1972).

За результатами досліджень обчислювали коефіцієнт антиоксидантного стану (КАС) крові як відношення сум показників стану антиоксидантного (А) і прооксидантного (П) статусу: КАС = ? А/? П (О.Б. Столяр и др., 2000). Кожний показник визначали за формулою: 1 ± (Мд – Мк)/Мк, де 1 – характеристика показника в нормі, Мд і Мк – середньоарифметичні значення показників відповідно дослідної і контрольної серій. До “А” відносили такі показники як активність СОД еритроцитів і каталази крові, вміст GSH в крові і церулоплазміну в плазмі крові; до “П” – вміст продуктів пероксидації ліпідів та окисних модифікацій білків. Останній показник був одержаний в паралельно проведеному експерименті (О.Б. Столяр, 2001) і люб’язно поданий автором. Вміст білків в плазмі крові визначали методом O.H. Lowry et al. (1951).

Вміст металів (цинку, міді, марганцю, свинцю) у крові визначали після спалювання зразків у перегнаній нітратній кислоті в співвідношенні 1:5 (маса:об’єм) на атомно-адсорбційному спектрофотометрі С-115, свинцю на спектрофотометрі S-600 і виражали в мкг на г вологої маси тканини. Результати обробляли статистично з використанням t-критерію Стьюдента (Г.Ф. Лакин, 1990) та коефіцієнту кореляції (К. Дерффель, 1994).

Результати досліджень і їх обговорення

Дія йонів міді на АПС крові коропа. Дослідження дії йонів міді на АПС крові після 2 і 7 діб інтоксикації коропа показало, що збільшення вмісту MetHb спостерігається лише при дії найвищої дози йонів міді, 0,1 мг/л протягом 7 діб, а вміст GSH в еритроцитах майже не зазнає змін. В плазмі крові відзначене помітне зростанні вмісту тіолів і МА. Активність СОД зменшується як в еритроцитах, так і в плазмі крові. Активність каталази в плазмі крові зростає.

Вивчення дії йонів міді протягом 14 діб дозволило виявити істотну відмінність між дією порівняно малої дози (0,01 мг/л) та порівняно великих доз (0,2 і 0,5 мг/л). Доза 0,01 мг/л міді викликає значне збільшення активності ферментів антиоксидантного захисту в крові, особливо каталази, а дози 0,2 і 0,5 мг/л – зменшення активності СОД еритроцитів та вмісту в них GSH (табл. 1). Великі дози йонів міді також викликають збільшення загального вмісту Hb і MetHb в крові та зменшення вмісту глікозильованих похідних (табл. 2), зростання активності каталази та вмісту церулоплазміну в плазмі крові (табл. 3). Значне зростання вмісту продуктів ПОЛ в крові коропа спостерігається при дії всіх досліджуваних концентрацій міді (табл. 3). ПОЛ особливо активується в присутності Fe2+ незалежно від природи відновника.

Таблиця 1

Показники системи антиоксидантного захисту крові коропа при дії на організм йонів важких металів протягом 14 діб, M±m, n=5

Вміст йонів металів у воді,

мг/л | Активність СОД

еритроцитів,

у.о./г гемоглобіну | Активність каталази крові,

мг Н2О2/мл крові за хв | Вміст GSH, мкмоль/мл крові

Мідь

Контроль | 4,441,05 | 5,08±0,50 | 0,610,03

0,01 | 7,050,99* | 23,90±1,00* | 0,720,06

Контроль | 4,95±0,99 | 4,50±0,61 | 0,73±0,06

0,2 | 3,90±0,17* | 6,88±1,02* | 0,65±0,02

0,5 | 3,54±0,27* | Х | 0,47±0,03*

Цинк

Контроль | 5,58±0,30 | 4,96±0,76 | 0,67±0,12

0,1 | 4,79±0,44 | 12,2±2,9* | 2,96±0,31*

Контроль | 5,57±0,16 | 4,50±0,61 | 0,74±0,05

2,0 | 2,88±0,48* | 6,25±0,99 | 0,76±0,08

Контроль | 5,57±0,16 | 5,20±0,10 | 0,74±0,05

5,0 | 3,91±0,16* | 5,70±0,10 | 0,88±0,06*

Марганець

Контроль | 4,650,25 | 5,0±0,8 | 0,67±0,12

0,12 | 4,200,51 | 12,2±1,3* | 2,01±0,19*

Контроль | 4,68±0,24 | 6,4±2,2 | 0,81±0,07

2,4 | 2,70±0,11* | 27,1±2,9* | 0,80±0,12

Контроль | 4,05±0,45 | Х | 0,81±0,07

6,0 | 6,99±1,38* | Х | 0,57±0,09*

Свинець

Контроль | 4,65±0,25 | 4,96±0,76 | 0,67±0,12

0,01 | 4,48±0,09 | 8,80±0,08* | 1,33±0,10*

Контроль | 4,68±0,24 | 5,58±0,30 | 0,64±0,08

0,2 | 3,75±0,32 | 6,60±0,30* | 0,49±0,05*

Контроль | Х | 4,71±0,96 | 0,64±0,08

6,0 | Х | 6,12±0,69 | 0,83±0,19

Суміш металів

Контроль | 4,670,11 | 4,280,35 | 0,540,08

Дослід | 3,670,03* | 6,730,81* | 0,630,07

Примітка. - в цій таблиці і далі * - відмінність порівняно з контролем вірогідна, р< 0,05, X – показник не визначався

Таблиця 2

Вміст дериватів гемоглобіну в еритроцитах коропа при дії йонів важких металів протягом 14 діб, M±m, n=5

Вміст йонів

металів у воді,

мг/л | Гемоглобін, г/100 мл крові | Метгемоглобін,

% від загального | Глікозильований гемоглобін,

% від загального

Мідь

Контроль | 7,671,58 | 1,30,3 | 5,86±0,55

0,01 | 8,670,08 | 1,40,2 | 6,36±0,59

Контроль | 8,0±0,4 | 1,7±0,1 | 5,33±0,33

0,2 | 10,7±0,7* | 2,2±0,4 | 4,22±0,33*

0,5 | 11,7±0,6* | 4,7±0,7* | Х

Цинк

Контроль | 7,01±0,51 | 1,88±0,42 | 5,99±0,20

0,1 | 4,14±0,29* | 0,38±0,08* | 6,25±0,27

Контроль | 7,82±0,61 | 1,68±0,20 | 5,65±0,38

2,0 | 9,76±0,19* | 1,16±0,14 | 7,36±0,29*

Контроль | 7,82±0,61 | 1,68±0,20 | 5,75±0,75

5,0 | 7,79±0,93 | 2,40±0,42 | 4,58±0,51

Марганець

Контроль | 7,01±0,51 | 1,88±0,42 | 5,99±0,20

0,12 | 3,74±0,41* | 0,68±0,08* | 5,41±0,36

Контроль | 7,50±0,53 | 1,92±0,28 | 6,38±0,22

2,4 | 8,68±0,24* | 2,02±0,48 | 5,03±0,20*

Контроль | 7,800,43 | 1,60,7 | Х

6,0 | 8,400,45 | 0,60,2* | Х

Свинець

Контроль | 7,32±0,28 | 1,57±0,19 | 5,99±0,20

0,01 | 6,31±0,68 | 0,42±0,10* | 5,43±0,28

Контроль | 7,50±0,53 | 1,92±0,28 | 6,38±0,22

0,2 | 8,48±1,66 | 0,86±0,06* | 5,61±0,10*

Контроль | 6,52±0,42 | 1,90±0,14 | 5,75±0,75

0,5 | 5,68±0,58 | 1,11±0,30* | 4,76±0,73

Суміш металів

Контроль | 6,710,98 | 1,940,19 | 5,710,11

Дослід | 6,470,16 | 2,140,41 | 6,310,84

Вміст міді в крові при дії 0,2 мг/л міді не зазнавав змін: при дії 0,2 мг/л міді – 1,490,11 мг/мл крові проти 1,590,01 в нормі. Одержані результати вказують на те, що прооксидантною дією, ймовірно, володіють активні форми кисню, які генеруються у підвищеній кількості, а не безпосередні зміни вмісту міді в крові. У всіх умовах дослідження еритроцити краще захищені від дії йонів міді, ніж плазма. Ознакою токсичності йонів міді є зменшення активності СОД еритроцитів та плазми крові, збільшення активності каталази та вмісту церулоплазміну в плазмі крові.

Таблиця 3

Показники системи антиоксидантного захисту плазми крові коропа при дії на організм йонів важких металів, M±m, n = 5

Вміст йонів металів у воді, мг/л | Активність СОД, у.о./мкг білку | Активність каталази,

мг Н2О2/мл плазми | Вміст церулоплазміну, мг/г білку плазми

Мідь

Контроль | 3,60±0,06 | 1,030,03 | 1,580,08

0,01 | 5,65±0,07* | 0,580,09* | 1,580,17

Контроль | 3,42±0,15 | 0,90±0,12 | 1,5±0,1

0,2 | 7,56±2,28* | 2,79±0,26* | 13,8±4,2*

0,5 | 5,49±0,57* | 3,53±0,31* | 24,6±2,1*

Цинк

Контроль | 3,80±0,45 | 0,98±0,11 | 1,44±0,08

0,1 | 0,73±0,19* | 1,21±0,12 | 3,42±0,10*

Контроль | 3,87±0,11 | 1,160,09 | 1,770,29

2,0 | 3,49±0,13 | 1,140,25 | 5,680,37*

5,0 | 2,44±0,12* | 0,400,13* | 5,781,01*

Марганець

Контроль | 3,80±0,46 | 0,98±0,11 | 1,44±0,08

0,12 | 1,91±0,41* | 1,26±0,10 | 2,16±0,12*

Контроль | 3,66±0,09 | 0,95±0,12 | 1,56±0,05

2,4 | 3,62±0,25 | 0,31±0,04* | 1,55±0,12

Контроль | 3,43±0,27 | 0,95±0,12 | Х

6,0 | 3,87±0,94 | 0,20±0,02* | Х

Свинець

Контроль | 2,94±0,30 | 0,98±0,11 | 1,44±0,08

0,01 | 2,55±0,27 | 1,11±0,15 | 1,86±0,18*

Контроль | 3,66±0,09 | 1,15±0,09 | 1,56±0,05

0,2 | 3,32±0,64 | 1,30±0,20 | 1,14±0,12*

Суміш металів

Контроль | 3,300,64 | 0,830,19 | 1,430,18

Дослід | 1,850,30* | 1,270,10* | 1,760,14

Дія йонів цинку на АПС крові коропа. Показано, що при дії найменшої досліджуваної дози йонів цинку, 0,1 мг/л, складові системи антиоксидантного захисту крові коропа (табл. 1) активуються. В цих умовах значно зростає активність каталази крові, різко збільшується вміст GSH, а активність СОД не зазнає вірогідних змін. Також відбувається зменшення вмісту MetHb (табл. 2). Таку відповідь, ймовірно, можна кваліфікувати як адаптивну. При дії вищих концентрацій йонів цинку активність СОД еритроцитів зменшується порівняно з контролем, активність каталази залишається в межах норми, а вміст GSH відповідає нормі при дії 2,0 мг/л і дещо зростає при дії 5,0 мг/л цинку. При дії 2,0 мг/л цинку зростає вміст Hb, а також його глікозильованої форми та рівень церулоплазміну в плазмі крові. Однак, жодна з досліджуваних доз йонів цинку не викликала збільшення вмісту в крові MetHb.

Таблиця 4

Вміст білків в плазмі крові коропа при дії на організм йонів важких металів протягом 14 діб, M±m, n = 5

Вміст металу у воді, мг/л | Вміст білків | Вміст металу у воді, мг/л | Вміст білків

Мідь | Марганець

Контроль | 41,03,2 | Контроль | 39,0±1,3

0,01 | 24,50,9* | 0,12 | 44,6±4,9

Контроль | 36,0±2,4 | Контроль | 38,0±2,7

0,2 | 21,0±2,0* | 2,4 | 50,5±5,2*

0,5 | 17,5±2,5* | Контроль | 40,9±2,8

Свинець | 6,0 | 37,5±3,3

Контроль | 39,0±1,3 | Цинк

0,01 | 39,2±3,7 | Контроль | 39,0±1,3

Контроль | 38,0±2,7 | 0,1 | 47,0±2,1*

0,2 | 52,8±4,6* | Контроль | 39,0±1,1

Контроль | 33,0±4,6 | 2,0 | 46,4±4,5

0,5 | 22,5±3,0* | 5,0 | 42,8±2,1

Активність каталази в плазмі крові (табл. 3) змінюється лише при дії 5,0 мг/л цинку, причому відзначене її зменшення, що свідчить про відсутність деструктивних змін у мембранах клітин, в першу чергу еритроцитів і гепатопацитів, які б супроводжувались виходом в плазму цього, невластивого для неї ферменту (Н.Г. Арцимович, 1991). Вміст МА зростає лише при дії 5,0 мг/л цинку, особливо за індукції йонами Fe3+ і аскорбіновою кислотою. Одержані дані свідчать про те, що при дії йонів цинку АПС плазми крові зазнає значно більших змін, ніж еритроцитів.

Порівняння дії йонів цинку і міді на АПС крові коропа указує на їх подібність за рядом ознак: зменшення активності СОД, збільшення вмісту церулоплазміну і тіолів (табл. 4). Всі ці показники пов’язані з процесами транспорту металів до металопротеїнів, які для цих металів мають подібний механізм (B.L. Vallee, 1988, G. Musci et al., 1996, M.R. Ciriolo et al., 2001). Вміст власне цинку, як і міді, в умовах експерименту в крові відповідає нормі. Однак при дії йонів міді діапазон відхилень цих показників від норми значно більший, ніж при дії йонів цинку. Аналогічні спостереження були зроблені і при вивченні короткотривалої дії йонів цих двох металів на коропа (A.A.R. Radi, B. Matkovics, 1988). Разом з тим, йони цих металів суттєво відрізняються за впливом на активність каталази плазми і на GSH еритроцитів, що, очевидно, зумовлено винятковою окиснювальною здатністю міді і її відсутністю у цинку.

Таблиця 5

Вміст продуктів пероксидації ліпідів в плазмі крові коропа при дії на організм йонів важких металів, M±m, n = 5

Вміст йонів металу

у воді, мг/л | Дієнові кон’югати,

мкмоль/мл крові | Малоновий альдегід,

мкмоль/мл крові

Мідь

Контроль | 20,79±3,78 | 1,440,09

0,01 | 43,054,34* | 2,41±0,36*

Контроль | 17,5±4,7 | 1,74±0,15

0,2 | 18,2±1,6 | 3,84±0,40*

0,5 | Х | 4,19±0,68*

Цинк

Контроль | 21,4±1,8 | 1,130,15

0,1 | 39,0±4,9* | 1,070,24

Контроль | 17,5±4,7 | 1,17±0,12

2,0 | 29,1±4,4* | 0,87±0,13

Контроль | Х | 1,01±0,11

5,0 | Х | 11,3±0,5*

Марганець

Контроль | 21,4±1,8 | 1,06±0,26

0,12 | 21,0±1,9 | 2,05±0,37*

Контроль | 23,1±2,1 | 1,18±0,21

2,4 | 19,7±3,4 | 2,06±0,25*

Контроль | Х | 1,31±0,14

6,0 | Х | 0,89±0,06*

Свинець

Контроль | 21,4±1,8 | 1,06±0,26

0,01 | 17,5±2,5 | 0,83±0,08*

Контроль | 23,07±2,10 | 1,25±0,12

0,2 | 19,78±1,00 | 0,77±0,21*

Контроль | Х | 1,01±0,11

0,5 | Х | 2,67±0,11*

Суміш металів

Контроль | Х | 1,050,18

Дослід | Х | 0,580,11*

Дія марганцю на АПС крові коропа. Вивчення впливу йонів марганцю становить інтерес у зв’язку з його здатністю легко змінювати ступінь окиснення (Ю.А. Ершов, Т.В. Плетенева, 1989). Результати дослідження показали, що зростання активності каталази та вмісту GSH в крові спостерігається вже при дії 0,12 мг/л металу. При дії вищих доз спостерігаються зміни активності СОД, каталази і GSH, причому, залежно від дози металу, їх характер протилежний (табл. 1). Вміст GSH вважається одним із найбільш чутливих показників токсичності сполук марганцю (J.J. Liccione, M.D. Maines, 1988). Як видно з одержаних даних, лише при дії найвищої досліджуваної дози металу спостерігається його зменшення. Однак, і в цьому випадку Hb є захищеним від окиснення (табл. 2). Вміст глікозильованого Hb зменшується порівняно з контролем лише при дії 2,4 мг/л марганцю.

Стан ферментів у плазмі найбільш помітно змінюється при дії 0,12 мг/л марганцю, причому активність СОД зменшується, а вміст церулоплазміну зростає (див. табл. 3). Активність каталази плазми в цих умовах відповідає нормі, а при дії 2,4 і 6,0 мг/л марганцю зменшується. Досить істотно змінюється вміст МА, причому дія 0,12 і 2,4 мг/л марганцю викликає його збільшення, а 6,0 мг/л – зменшення порівняно з нормою. Як і за дії цинку, особливо виражена активація неферментного ПОЛ. Визначення вмісту самого марганцю в крові показало, що при дії 2,4 мг/л він зростає вдвічі (з 0,100,01 до 0,200,02 мкг/мл крові, p < 0,05), тоді як при дії 6,0 мг/л марганцю він не змінюється (0,050,01 мкг/мл в нормі і 0,040,01 мкг/мл – в досліді).

Стан білків, які містять залізо (каталаза, Hb), або беруть участь в його обміні (церулоплазмін) виявився найбільш чутливим серед показників крові до дії йонів марганцю. Доза 2,4 мг/л відрізняється від інших досліджених доз тим, що при ній збільшується утворення кінцевих продукті ПОЛ і зростає вміст марганцю в крові.

Дія свинцю на АПС крові коропа. Аналіз результатів визначення параметрів антиоксидантного захисту крові при дії йонів свинцю (табл. 1) показує, що найбільш чутливим з них є активність каталази крові. Її активність значно зростає, особливо при дії 0,01 мг/л свинцю. Активність СОД не зазнає змін порівняно з нормою в умовах експерименту. Вміст GSH в еритроцитах залежить від концентрації свинцю в середовищі. При дії 0,01 мг/л металу він збільшується порівняно з нормою, тоді як при дії більших доз його вміст зменшується або залишається в межах норми.

Одержані результати свідчать про те, що при дії свинцю в еритроцитах формується особливий стан, який дозволяє підтримувати Hb у відновленому стані. Відомо, що метаболізм гему проявляє високу чутливість до збільшення вмісту йонів свинцю в середовищі (Ю.А. Ершов, Т.В. Плетенева, 1989). В нашому експерименті дія свинцю в еритроцитах найбільш помітно відображається на стані гемових білків – Hb і каталази, причому сприяє їх функціонуванню. Всі досліджувані дози викликають зменшення вмісту MetHb (табл. 2). Утворення глікозильованих похідних Hb має тенденцію до зменшення також при дії всіх досліджуваних доз, але найкраще вона виражена при дії 0,2 мг/л свинцю, що узгоджується з раніше отриманими даними (О.С. Смольський, 2001).

Відомо, що ознакою токсичності свинцю є зменшення вмісту небілкових тіолів в тканинах гідробіонтів (P. Thomas, M.J. Juedes, 1992, B. Pawlik-Skowroska, 2000). Ми спостерігали такі прояви при дії 0,2 мг/л свинцю. Активність СОД і каталази плазми крові при дії 0,01 і 0,2 мг/л свинцю не зазнає змін (див. табл. 3). Вірогідні зміни вмісту відзначені для церулоплазміну, але вони становлять лише біля 25 % від величини цього показника в нормі, тоді як дія інших факторів, наприклад, йонів міді, викликає значно більші відхилення вмісту церулоплазміну. Результати дослідження дії йонів свинцю на ПОЛ в крові коропа показують (табл. 5), що дози 0,01 і 0,2 мг/л металу викликають зменшення вмісту МА в крові. Лише концентрація 0,5 мг/л приводить до збільшення цього показника.

При концентрації свинцю у воді 0,2 і 0, 5 мг/л визначався його вміст у крові. Він вірогідно збільшується при дії обох доз і становить при дії 0,2 мг/л свинцю 0,750,26 мкг/мл крові проти 0,240,07 мкг/мл в нормі, а при дії 0,5 мг/л свинцю – 2,820,21 мкг/мл проти 1,560,09 мкг/мл. Однак, як ми спостерігали, зміни в утворенні МА, як і зміни його вмісту, мають місце тільки при дії 0,5 мг/л йонів свинцю.

Стан крові коропа при комбінованому ураженні йонами важких металів та при дії in vitro. Оскільки в природних водоймах спостерігається поліметалічне забруднення (П.Н. Линник, 1999), становило інтерес дослідження дії суміші йонів ВМ на коропа і порівняти її з дією окремих компонентів. Концентрація кожного з виду йонів металів в суміші відповідала найменшій з досліджуваних нами концентрацій цього виду йонів при окремій їх дії.

Вивчення стану крові коропа показало, що вміст дериватів Hb, а також GSH у піддослідних тварин відповідає нормі. Однак активність ферментів антиоксидантного захисту зазнає значних змін порівняно з контролем. Для активності СОД еритроцитів і плазми крові характерне зменшення, а для активності каталази крові і плазми крові – збільшення показників порівняно з контрольними. Зміна активності каталази крові є найзначнішою із змін показників стану еритроцитів коропа при дії на нього суміші ВМ. Вміст церулоплазміну залишається при дії суміші в межах норми.

Отже, найбільш послідовним проявом дії суміші йонів на АПС крові є зменшення активності СОД у еритроцитах і плазмі крові. Такі зміни можуть бути пов’язані із перерозподілом вмісту міді і цинку в організмі, оскільки Cu/Zn-вмісна СОД міститься як в еритроцитах, так і в плазмі крові. Постачання міді для СОД більш істотно залежить від наявності її тіонеїнзв’язаної форми, ніж для церулоплазміну (M.R. Ciriolo et al., 2001, L.A. Meyer, 2001). Істотною ознакою дії суміші металів на печінку коропа було зменшення вмісту мідьтіонеїнів при постійному вмісті цинк-зв’язаної форми (O.B. Stolyar, 2002), що узгоджується з нашими спостереженнями.

Hb в гемолізатах ще значно чутливіший до дії міді, і викликає зростання рівню MetHb навіть при співвідношенні кількостей міді і гемоглобіну в пробі 1 : 10000, тоді як при дії міді на цільну кров цей показник близький до норми навіть при співвідношенні 1 : 50. Мідь (І) значно менше впливає на Hb, ніж мідь (П). Присутність цистеїну не впливає на дію міді (ІІ), але посилює окиснювальну дію міді (І) на Hb крові при найменшій концентрації металу і зменшує її при високих концентраціях. Отже йони міді, залежно від умов дії, можуть приводити до прооксидантної дії тіолів, що узгоджується з літературними даними (R.S. Smith et al., 1999).

Дія йонів свинцю на кров приводить до збільшення утворення MetHb, лише при високих концентраціях, які є нереальними для організму. Ця дія послаблюється додаванням цистеїну. При дії суміші йонів міді і свинцю окисна дія міді на Hb втрачається. Цинк проявляє дію, подібну до міді (І), причому цистеїн в цьому випадку виявився ефективним антиоксидантном. Марганець не впливає на вміст дериватів Hb, а додавання в суміш цистеїну також не викликає його помітних змін.

Використавши одержані дані про стабільність Hb при інкубації в розчинах металів, можна побудувати ряд чутливості Hb до дії металів: Mn2+ <Zn2+<Pb2<Cu2+.

Вивчення впливу йонів ВМ на утворення МА в крові в умовах in vitro показало, що їх дія істотно відрізняється залежно від природи та концентрації металу (рис. 1). Мідь (П) найбільше активує ПОЛ, тоді як мідь (І) здійснює таку дію лише у великих дозах. Йони свинцю збільшують утворення МА лише при дії порівняно високих концентрацій і значно менше, ніж йони міді. Поєднання йонів свинцю і міді, як і у випадку з Hb, приводить до нормалізації утворення МА. Навіть концентрації йонів міді, які викликають при окремій дії збільшення утворення МА в п’ять разів порівняно з контролем, в поєднанні з свинцем не викликають такого ефекту. Лише при вмісті свинцю 40 мкмоль/мл крові додавання невеликої кількості міді приводить до зростання утворення МА. Отже, поєднання різних видів йонів металів, істотно впливає на їх здатність здійснювати окисну деструкцію у клітині.

В присутності цистеїну в контрольних пробах рівень ПОЛ підвищується, проте в умовах додавання йонів металів цистеїн істотно нормалізує цей показник і навіть зменшує його порівняно з нормою. Порівняння дії різних концентрацій ВМ та цистеїну на утворення МА показує, що між їх концентрацією та утворенням МА немає прямої залежності. Більш того, різні кількісні поєднання тих самих факторів можуть викликати протилежний ефект, що, як і у випадку дії міді (І) на гемоглобін, демонструє зміну властивостей тіолів від антиоксидантних до прооксидантних, залежно від складу середовища.

Порівняння дії йонів ВМ на утворення МА в крові в умовах in vitro і in vivo показує, що загальна тенденція дії металу за відсутністю цистеїну в обох випадках збігається. Це зростання прооксидантної дії металів в ряді Mn2+ <Pb2+<Zn2+,Cu2+. При цьому прооксидантна здатність міді (ІІ) значно вища, ніж інших металів та міді (І). Аналогічні результати за дії міді і марганцю на ПОЛ були одержані і для тканини кори наднирників (Н.А. Дорошкевич и др. 1988).

Досліджуючи дію ВМ на компоненти крові коропа, в якій функціонують важливі металоферменти антиоксидантного захисту, ми ставили завдання проаналізувати, в якій мірі зміни стану АПС можуть бути проявами специфічної дії металів чи неспецифічною відповіддю на дію екстремального фактору. Останнім часом відомо багато спроб застосувати окремі показники стану гідробіонтів для біоіндикації (Н.В. Довженко и др., 2002, С.Л. Зарубин и др. 2002). Однак, як свідчать літературні (Ю.В. Леус, 1998, С.С. Руденко, 2000, О.Б. Столяр и др., 2001) та одержані нами дані, власне інтегральний показник ступеню і напряму зміщення рівноваги АПС - КАС адекватно відображає стан захисних систем організму.

Одержані дані свідчать про те, що для дії порівняно низької концентрації кожного з досліджуваних видів йонів ВМ характерна адаптивна відповідь, яка проявляється в суперкомпенсації антиоксидантних можливостей еритроцитів і плазми крові коропа. При її дії зростає інтенсивність антиоксидантних факторів в крові, в першу чергу, активності каталази і вмісту GSH, зменшення або нормальний рівень MetHb і МА, тобто суперкомпенсаторні зміни. Особливо чітко адаптивна відповідь при дії найменшої дози металу проявляється для йонів міді і цинку. На прикладі міді ми спостерігали, що така відповідь формується лише після достатнього для аклімації тварин часу (14 діб) і при концентрації не вище 0,01 мг/л.

Дія проміжної концентрації йонів металів була специфічною для кожного з металів, причому зміни, що визначались при її дії в ряді випадків були подібні до змін, що викликає менша доза, а в інших випадках – до дії вищої дози. Очевидно, ця доза йонів металу є критичною у можливостях системи до адаптації. При дії цієї дози відзначено високий рівень розбалансованості антипероксидантної системи, що може значно підвищувати чутливість системи до інших абіотичних факторів.

Найбільша досліджувана нами доза, користуючись термінологією Руденко С. С. (2000), використана при оцінці токсичності йонів алюмінію, відповідає верхній межі толерантності. КАС при дії цієї дози має подібну величину для трьох металів – цинку, міді і свинцю. Така уніфікація відповіді, очевидно, є результатом втрати толерантності організму. При її дії особливо виражено збільшення вмісту МА та MetHb в крові.

Експозиція риб в присутності порівняно високих доз йонів металів дозволяє чітко спостерігати специфічну відповідь, зумовлену природою металу. Для міді і цинку істотною ознакою розвитку токсичних процесів є збільшення вмісту в плазмі церулоплазміну – білку “гострої фази” (Н.Г. Арцимович и др., 1991). Найбільш чутливим до виснаження компонентом антиоксидантного захисту була СОД еритроцитів і плазми крові. У переважній кількості дослідних серій, лише за виключенням дії найменшої дози міді (ІІ) і найбільшої марганцю (ІІ), активність СОД еритроцитів зменшувалась або відповідала контролю. В аналогічних умовах було відзначено, що дія йонів ВМ приводить і до виснаження СОД в печінці коропа (Ю.В. Леус, 1998, О.Б. Столяр и др. 2000-2002). Очевидно, що залежність функції СОД еритроцитів від постачання металом проявляється в обмеженій його можливості брати