АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ КАРДІОЛОГІЇ ім. акад. М.Д.СТРАЖЕСКА

ЗВЯГІНА ТЕТЯНА ВІТАЛІЇВНА

УДК 616-018.2+612.127.4 – 07-08-092

ПОРУШЕННЯ МЕТАБОЛІЗМУ ОКСИДУ АЗОТУ ПРИ

СИСТЕМНИХ ЗАХВОРЮВАННЯХ СПОЛУЧНОЇ ТКАНИНИ (ДІАГНОСТИКА, ПАТОГЕНЕЗ, ЛІКУВАННЯ)

14.01.12 – ревматологiя

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Київ - 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Донецькому державному медичному університеті ім. М.Горького МОЗ України, Інституті невідкладної і відновної хірургії АМН України (м. Донецьк).

Науковий консультант: доктор медичних наук

Гринь Владислав Костянтинович

Інститут невідкладної і відновної хірургії АМН України, директор, завідувач відділу

експериментальної хірургії (м.Донецьк)

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Свінціцький Анатолій Станіславович, Національний медичний університет ім. О.О.Богомольця, завідувач кафедри госпітальної терапії №2 (м. Київ)

доктор медичних наук, професор Бабиніна Лідія Яківна, Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України, професор кафедри сімейної медицини (м. Київ)

доктор медичних наук Пішак Ольга Василівна, Буковинська державна медична академія МОЗ України, професор кафедри пропедевтики внутрішніх хвороб (м. Чернівці)

Провідна установа:

Дніпропетровська державна медична академія МОЗ України, кафедра госпітальної терапії №2, м.Дніпропетровськ

Захист відбудеться 28.10.2003 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.616.01 в Інституті кардіології ім. акад. М.Д.Стражеска АМН України (03680, м. Київ, вул. Народного ополчення, 5).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту кардіології ім. акад. М.Д.Стражеска АМН України (03680, м. Київ, вул. Народного ополчення, 5).

Автореферат розісланий 24.09.2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Деяк С.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Проблема запальних ревматичних захворювань розглядається як одна з найбільш актуальних у медико-соціальному плані (Амосова Е.Н., Якименко И.Л., 2000; Зборовский А.Б., Гонтарь И.П., 2001; Коваленко В.М. та співавт., 2001; Корнацький В.М., 2001; Насонова В.А., Халтаев Н.Г., 2001; Степанец О.В. и соавт., 2001; Яременко О.Б., 2001). В Україні існує тенденція до значного підвищення захворюваності на системні хвороби сполучної тканини (Коваленко В.Н., Каминский А.Г., 2000; Свинцицкий А.С., 2002), на які разом з іншою патологією кістково-м’язової системи страждає майже 9% населення країни, причому тільки на ревматоїдний артрит (РА) – 160 тис. осіб, а на системний червоний вовчак (СЧВ) – 7 тис. (Коваленко В.Н. и соавт., 2001; Коваленко В.Н., 2002).

Нині при системних захворюваннях сполучної тканини все більша увага приділяється обміну оксиду азоту (NO) (Паніна Л.В. та співавт., 1999; Ремизова М.И., 2000; Коваленко В.Н. и соавт., 2001). Порушення імунітету у таких хворих змінюють синтез NO (Марков Х.М., 2000; Rivier С., 1998), який сприяє як імунному захисту організму, так і виявляє цитостатичні ефекти, що призводять до збільшення різних проявів аутоімунного характеру (Виноградов Н.А., 1998; Ванин А.Ф., 2000; Викторов И.В., 2000; Петухов В.И., 2000). Крім того, NO є унікальним медіатором міжклітинної взаємодії, бере участь у підтримці гомеостатичних параметрів організму, поліпшенні реологічних властивостей крові та стабілізації проникності судинної стінки (Майданник В.Г., Малкоч А.В., 1998; Ванин А.Ф., 2000; Гоженко А.И. и соавт., 2000). Зараз важко назвати функцію організму, у регуляції якої NO не брав би участі (Каштанов С.И. и соавт., 2000). Вивчення метаболізму NO при системних захворюваннях сполучної тканини дозволить поліпшити розуміння патогенезу СЧВ, системної склеродермії (ССД) і РА, а також прогнозувати перебіг патологічного процесу та надійно контролювати хід терапевтичних заходів. Лікування такої категорії хворих у теперішній час залишається однією з найскладніших проблем клінічної медицини (Шуба Н.М., Коваленко В.М., 2001; Дядык А.И., 2002; Надашкевич О.Н., 2002). Препаратами вибору є глюкокортикоїдні гормони й імунодепресанти цитотоксичної дії (Дзяк Г.В. и соавт., 1999; Иванова М.М. и соавт., 2000; Яременко О.Б., 2001; Шуба Н.М. та співавт., 2002), що пригнічують продукцію NO. Ефективність їх найчастіше залишається незадовільною. Раціональне використання в програмі терапевтичних заходів інгібіторів і стимуляторів синтезу NO може поліпшити результати лікування хворих із системними захворюваннями сполучної тканини.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась у рамках планової НДР Донецького державного медичного університету ім. М.Горького МОЗ України „Вивчення статевого диморфізму клінічного перебігу системних запальних ревматичних захворювань” (№ державної реєстрації 0101U009002) та планової НДР Інституту невідкладної і відновної хірургії АМН України (м.Донецьк) „Дослідження особливостей імунонейроендокринних порушень і їх корекція трансплантацією культур фетальних тканин” (№ державної реєстрації 0102U001365). Автор є співвиконавцем зазначених тем.

Мета і задачі дослідження: Метою роботи стало підвищення ефективності діагностики й лікування системних захворювань сполучної тканини. Відповідно до цього були поставлені такі задачі:

1. Вивчити рівні нітритів (метаболітів NO) у крові й сечі, аргініну (попередника NO) та циклічного гуанозинмонофосфату (цГМФ, вторинного месенджеру NO) у крові, залежної та незалежної від ендотелію вазодилатації при СЧВ стосовно віку хворих, тривалості захворювання, характеру його перебігу й активності, тяжкості вісцеритів та судинних уражень, гемодинаміки, гормонального статусу, біохімічних і фізико-хімічних параметрів біологічних рідин.

2. Оцінити взаємозв'язок показників обміну NO при ССД з урахуванням віку хворих, активності патологічного процесу, тривалості й характеру перебігу захворювання, тяжкості судинних уражень і вісцеритів, показників гормонів у крові, фізико-хімічних та біохімічних параметрів біологічних рідин, залежної та незалежної від ендотелію вазодилатації.

3. Проаналізувати особливості метаболізму NO при РА та їх взаємозалежність з активністю, стадією, тривалістю й характером перебігу захворювання, серологічним варіантом, віком пацієнтів, тяжкістю вісцеритів й суглобового синдрому, параметрами гемодинаміки, гормонального статусу, залежної й незалежної від ендотелію вазодилатації, показниками міжфазної тензіореометрії біологічних рідин.

4. Визначити вплив метаболізму NO у хворих на СЧВ, ССД і РА на популяцію лімфоцитів та інших імунокомпетентних клітин у крові, сенсибілізацію їх до різних тканинних антигенів (зокрема імунокомпетентних органів), рівні імуноглобулінів (Іg), циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) і прозапальних цитокінів.

5. Створити модель аутоімунного захворювання у тварин (щурів) і вивчити на ній зміни метаболітів NO і цГМФ у крові в порівняльному аспекті з показниками аутоімунітету (титрами антитіл до дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК), тканин тимуса й селезінки), характером морфологічних змін структур імунокомпетентних органів (тимуса, селезінки), нирок, серця й аорти.

6. Проаналізувати на моделі аутоімунного захворювання патоморфоз внутрішніх органів під впливом інгібіторів синтезу NO (глюкокортикоїдних гормонів, цитостатиків) і його стимуляторів (інгібіторів ангіотензинперетворювального ферменту (ІАПФ) й селективного -адрено-блокатора небівололу), обґрунтувати доцільність використання цих препаратів у лікуванні хворих на СЧВ, ССД і РА.

7. Застосувати інгібітори ангіотензинперетворювального ферменту і небіволол у комплексній терапії системних захворювань сполучної тканини, оцінити ефективність лікарських засобів, що пригнічують і стимулюють продукцію NO, визначити показання до їх використання в клінічній практиці, а також динаміку метаболітів NO у крові й сечі під впливом такого лікування.

8. Встановити клінічні й лабораторні (біохімічні, імунологічні, радіоімунні, імуноферментні, фізико-хімічні) фактори, що визначають ефективність терапевтичних заходів при СЧВ, ССД і РА, виділити критерії, які дозволяють прогнозувати результати лікування при використанні стимуляторів синтезу NO у пацієнтів із системними захворюваннями сполучної тканини.

Об’єкт дослідження: хворі на системні захворювання сполучної тканини (СЧВ, ССД, РА) і тварини з експериментальною моделлю системного аутоімунного захворювання.

Предмет дослідження: показники метаболізму NO (нітрити в крові та сечі, їх добова екскреція з сечею, кліренс NO та його співвідношення до кліренсу ендогенного креатиніну, аргінін і цГМФ у крові) у хворих на СЧВ, ССД, РА й у щурів з моделлю системного аутоімунного захворювання, ефективність використання інгібіторів і стимуляторів синтезу NO в експерименті на тваринах і при системних захворюваннях сполучної тканини.

Методи дослідження: клінічні (опитування, фізичне дослідження, суглобовий рахунок, індекси Річі й Лансбурі, вимір артеріального тиску), біохімічні (рівні нітритів, білка, креатиніну, сечової кислоти, оксипуринолу, калію, натрію в крові і сечі, аргініну, фібриногену, сечовини в крові, фібронектину в сечі), фізико-хімічні (параметри динамічного поверхневого натягу, в’язкоеластичності, релаксації крові й сечі), імунологічні (кількість у крові LE-клітин, титри ревматоїдного фактора, антитіл до тканин тимуса й селезінки, нативної та денатурованої ДНК, популяція лімфоцитів, кількість різних типів імуноцитів і лімфоцитів, сенсибілізованих до тканин тимуса, селезінки, нирок, наднирникових, підшлункової та щитовидної залоз, рівень ЦІК, Ig А, M і G), радіоімунні (вміст у крові цГМФ, кортизолу, альдостерону, активність реніну плазми), імуноферментні (показники цитокінів у крові – інтерлейкін (IL)-1b, IL-4, IL-6, фактор некрозу пухлин (TNFa), гранулоцитарний колонієстимулювальний фактор (g-CSF), інструментальні (електрокардіографія, ехокардіографія, ультразвукове сканування судин), рентгенологічні (рентгенографія суглобів), морфологічні (дослідження тканин тимуса, селезінки, нирок, серця й аорти в експериментальних тварин), статистичні (комп’ютерний кореляційний, одно- й багатофакторний дисперсійний аналіз).

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в клініці й експерименті доведено роль порушень обміну NO в патогенезі системних захворювань сполучної тканини, залежність змін метаболітів NO, аргініну і цГМФ від віку хворих, тривалості, характеру перебігу, активності та стадії захворювання, гемодинамічних показників, функції нирок, тяжкості ураження суглобів, м’язів, лімфатичних вузлів, шкіри, нервової системи і внутрішніх органів.

Вперше визначено взаємозв’язки параметрів метаболізму NO з морфологічними змінами тимуса, селезінки й інших органів, доведено зв’язок з гормональними й імунними порушеннями (популяцією та функцією імуноцитів, показниками аутоімунітету, рівнем прозапальних цитокінів), пуриновим і електролітним обмінами, фізико-хімічним станом крові та сечі.

Вперше доведено доцільність використання стимуляторів синтезу NO в лікуванні системних захворювань сполучної тканини, встановлено клініко-лабораторні (біохімічні, імунологічні, радіоімунні, імуноферментні, фізико-хімічні) фактори, що визначають ефективність терапевтичних заходів при СЧВ, ССД і РА.

Практичне значення одержаних результатів. Виділено параметри метаболізму NO, що відбивають ступінь активності й тяжкість перебігу системних захворювань сполучної тканини, прогностичні критерії щодо результатів лікувальних заходів. Продемонстровано можливість і доцільність застосування у комплексному лікуванні хворих з системними захворюваннями сполучної тканини стимуляторів синтезу NO. Доведено їх високу ефективність у хворих на СЧВ, ССД, РА та визначено показання до такої терапії. Сформульовано позитивні і негативні прогностичні критерії щодо результатів лікування. Вперше проаналізовано стан обміну NO при різному клініко-лабораторному перебігу системних захворювань сполучної тканини, доведено зв’язок метаболізму NO з іншими метаболічними порушеннями, змінами гормонального й імунного статусів, проведено порівняльний аналіз з фізико-хімічними та морфологічними дослідженнями.

Впровадження в клінічну практику результатів дослідження дозволило поліпшити якість діагностики, прогнозувати перебіг патологічного процесу та контролювати хід терапевтичних заходів у хворих на СЧВ, ССД і РА, а також підвищити ефективність лікування цієї категорії хворих.

Результати дисертаційної роботи впроваджено в лікувальну практику терапевтичного відділення Інституту невідкладної і відновної хірургії АМН України (м. Донецьк), ревматологічного відділення Донецького обласного клінічного територіального медичного об’єднання, терапевтичних відділень Донецьких міських клінічних лікарень № 18 і №20, нефрологічного відділення Донецької клінічної міської лікарні № 1, терапевтичного відділення Дніпропетровської обласної клінічної лікарні ім. І.І. Мечнікова, терапевтичного відділення Полтавської міської клінічної лікарні №4, ревматологічного відділення Запорізької міської лікарні №10, кардіологічного відділення Харківської міської клінічної лікарні №25, ревматологічного відділення Чернівецької міської лікарні №3, терапевтичного відділення Луганської обласної клінічної лікарні, а також у навчальний процес кафедр шпитальної терапії, пропедевтики внутрішніх хвороб Донецького державного медичного університету ім. М Горького, кафедри госпітальної терапії та профпатології Дніпропетровської державної медичної академії, кафедри шпитальної терапії Луганського державного медичного університету, кафедри догляду за хворими і вищої медичної освіти Буковинської державної медичної академії, кафедри терапії Харківської медичної академії післядипломної освіти, про що свідчать акти впровадження.

Особистий внесок здобувача. Внесок здобувача в отримані результати досліджень є основним і складається в доборі, обстеженні й лікуванні хворих на СЧВ, ССД і РА, моделюванні системного аутоімунного захворювання у тварин, вивченні параметрів метаболізму NO в клініці й експерименті. Автором особисто здійснена розробка основних теоретичних і практичних положень роботи, проведений аналіз літературних джерел. Здобувач оволоділа методами клінічних та патофізіологічних досліджень, самостійно провела набір і обробку фактичного матеріалу, написала всі розділи дисертації, сформулювала основні положення концепції про порушення метаболізму оксиду азоту при системних захворюваннях сполучної тканини та механізми лікувальної ефективності стимуляторів синтезу оксиду азоту. Зробила висновки й запропонувала практичні рекомендації, підготувала до друку результати власних досліджень. Запозичень ідей та розробок співавторів публікацій не було. Матеріали кандидатської дисертації у написанні докторської дисертації не використовувалися.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації оприлюднені й обговорені на VI Конгресі кардіологів України (Київ, 2000), Російському національному конгресі кардіологів “Кардиология, основанная на доказательствах” (Москва, Росія, 2000), III Національному конгресі ревматологів України (Дніпропетровськ, 2001), Щорічній конференції товариства фахівців з серцевої недостатності “От артериальной гипертонии к сердечной недостаточности” (Москва, Росія, 2001), Українській науково-практичній конференції “Профілактика і лікування артеріальної гіпертензії в Україні в рамках реалізації національної програми” (Київ, 2002), Науково-практичній конференції “Актуальні проблеми мікроциркуляції та гемостазу при патології внутрішніх органів” (Чернівці, 2002), Об’єднаному пленумі правлінь українських наукових товариств кардіологів, ревматологів та кардіохірургів з міжнародною участю “Серцева недостатність – сучасний стан проблеми” (Київ, 2002), Російському національному конгресі кардіологів (м. Санкт-Петербург, 2002), II Всеросійському з’їзді з трансплантології та розробки штучних органів (м. Москва, 2002), науково-практичних конференціях ІНВХ АМН України (м. Донецьк, 1999-2002). Дисертаційну роботу розглянуто і рекомендовано до захисту на спільному засіданні співробітників кафедр шпитальної терапії, внутрішніх хвороб №1 з курсом ендокринології і внутрішніх хвороб №2, пропедевтики внутрішніх хвороб, мікробіології, вірусології й імунології, фармакології з курсом клінічної фармакотерапії Донецького державного медичного університету ім. М.Горького, відділів експериментальної хірургії та лабораторної діагностики, абдомінальної хірургії і політравми Інституту невідкладної і відновної хірургії АМН України у 2002 р. та на розширеному засіданні апробаційної ради Інституту кардіології ім. акад. М.Д.Стражеска АМН України у 2003 р.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 43 наукові праці, в тому числі – одна монографія, 31 стаття (з них одноосібних – 13) у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України.

Обсяг і структура дисертації. Дисертацію викладено українською мовою на 347 сторінках друкованого тексту. Робота складається зі вступу, 8 розділів (в тому числі огляду літератури, матеріалів і методів, 6 розділів власних досліджень), аналізу та узагальнення отриманих результатів, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних джерел літератури, що містить 387 найменувань (130 кирилицею і 257 латиницею). Робота ілюстрована 99 таблицями і 39 рисунками (наведені 10 мікрофотографій), що займають 29 повних сторінок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Загальна характеристика хворих та методи дослідження. Під спостереженням перебували 211 хворих із системними захворюваннями сполучної тканини віком від 16 до 62 років, серед яких 33,6% осіб страждали на СЧВ, 24,2% – на ССД, 42,2% – на РА. Пацієнти із ССД були старші за віком, ніж із СЧВ (p=0,004), але молодші, аніж з РА (p=0,031). Середня тривалість захворювання у хворих на СЧВ становила 8,2±0,9 років, на ССД – 10,4±0,9 років, на РА – 10,2±0,8 років (відмінності недостовірні). У 4,2% пацієнтів з СЧВ констатовано гострий перебіг патологічного процесу, у 39,4% – підгострий, у 56,4% – хронічний. У 59,6% випадків РА встановлено серопозитивний варіант захворювання. I стадія РА була у 9,0% спостережень, II – у 40,4%, III – у 36,0%, IV – у 14,6%. Високий ступінь активності СЧВ відзначено у 42,3% хворих, ССД – у 31,4%, РА – у 23,6%. Якщо хворі на СЧВ і ССД різної статі практично не відрізнялися між собою за віком, то вік чоловіків з РА склав 50,0±1,1 років, а жінок – 42,5±1,0 років (p<0,001). Ступінь активності патологічного процесу в групі РА був вищим у жінок (p=0,010), при цьому чоловіки й жінки не відрізнялися за стадією захворювання.

У 85,9% хворих на СЧВ виявлено гломерулонефрит, у 83,1% – артрит або артралгії, у 73,2% – ураження шкіри, у 70,4% – міокарда, у 64,8% – ендокарда і формування клапанних пороків серця, у 63,4% – лихоманку, у 50,7% – лімфаденопатію, у 47,7% – алопецію, у 45,1% – міозит або міалгії, у 38,0% – гепатит, у 36,6% – зміни центральної нервової системи, у 19,7% – периферичної нервової системи, у 35,2% – плеврит, у 33,8% – пневмоніт, у 32,4% – перикардит, у 14,1% – спленомегалію. У 4,9% з хворих з вовчаковим гломерулонефритом встановлено нефротичний синдром, у 16,4% – хронічну ниркову недостатність I ступеня. У 77,5% хворих на СЧВ у периферичній крові виявлено LE-клітини, у 87,3% – антитіла до нативної ДНК. У 84,3% хворих на ССД відзначено синдром Рейно, у 82,4% – ураження суглобів, у 74,5% – шкіри, у 62,8% – міокарда, у 56,9% – легень, у 52,9% – стравоходу і/або шлунка, у 45,1% – ендокарда і/або клапанів серця, у 43,1% – м'язів, у 33,3% – нирок, у 31,4% – печінки, у 21,6% – центральної нервової системи, у 17,7% – периферичної нервової системи, у 5,9% – перикарда, у 19,6% – алопецію, у 15,7% – лихоманку. У 35,3% хворих на ССД із нефропатією віявлено зниження функції нирок І ступеня. У 51,7% хворих на РА відзначено наявність позасуглобових ознак захворювання: лихоманку анемію, лімфаденопатію, полінейропатію, периферичні ревматоїдні вузли, ураження серця, легень, плеври, нирок, очей, шкірний васкуліт, дигітальний артеріїт, сітчасте ліведо, синдром Шегрена, тиреоїдит. Серце уражалося в 50,6% хворих, нирки – у 22,5%, легені і плевра – у 15,7%.

Моделювання системного аутоімунного захворювання проводили на щурах лінії Вістар за методикою В.Ю. Ніколенка (2000). Для моделювання системного аутоімунного захворювання щурам Вістар під ефірним інгаляційним наркозом у корінь хвоста неодноразово вводили повний ад’ювант Фрейнда та розчин селезінкової ДНК великої рогатої худоби з чергуванням метилурацилу й азатіоприну. Використовували 81 тварину (30 самців і 51 самку), розподілену на 5 груп: 1-у (контрольну) склали 17 інтактних тварин, 2-у, 3-ю, 4-у і 5-у (експериментальні) – по 16. Тварин 2-ї групи залишили без лікування, а щурам 3-ї, 4-ї і 5-ї груп щодня внутрішньом’язово протягом місяця вводили циклофосфамід (Циклофосфан-КМП, ВАТ Київмедпрепарат, Україна) 5 мг/кг і дексаметазон (Дексаметазон, ДЗ ДНЦЛЗ, Україна) 1 мг/кг, які мають імунодепресивну та протизапальну дію і які широко використовуються в клініці для лікування аутоімунних захворювань. Крім того, щури 4-ї групи паралельно отримували еналаприл (Еналаприл, ФК Здоров’я, Україна) 5 мг/кг, а 5-ї групи – небіволол (Небілет, Berlin-Chemie (Menarini Group), Німеччина) 1 мг/кг. На фоні внутрішньочеревного нембуталового наркозу тварин виводили з експерименту (через два місяці від його початку).

У крові й сечі хворих на системні захворювання сполучної тканини, а також у сироватці експериментальних тварин з використанням реактиву Гріса визначали стабільний кінцевий продукт метаболізму NO – нітрит за методикою L.C.Green et al. (1982) у модифікації П.П.Голікова (2000). Абсорбцію розчину вимірювали спектрофотометричним методом при довжині хвилі 546 нм, а як стандарт використовували нітрит натрію. Підраховували рівень нітритів у крові (NОк) і сечі (NОс), добову екскрецію їх із сечею (NОс24), кліренс нітритів (CNO), співвідношення CNO до кліренсу ендогенного креатиніну (CNO/CCr). На автоматичному амінокислотному аналізаторі “ААА339М-Microtechna” (Чехія) вивчали вміст у плазмі попередника NO аргініну. Концентрацію цГМФ у крові (вторинного месенджеру NO) визначали радіоімунним методом (лічильник “Гамма-800”, Україна, набори “Amercham”, Великобританія).

Визначення рівня цитокінів у крові виконували за допомогою імуноферментного методу (ридер “PR2100 Sanofi diagnostic pasteur”, Франція) з використанням комерційних наборів реагентів “ProCon” (Росія). Вивчали показники IL-1, IL-4 і IL-6, TNF, G-CSF. Радіоімунним методом (набори “Immunotech”, Чехія) визначали вміст у крові гормонів – кортизолу, альдостерону, активність реніну плазми при t=+4C (АРП4) і t=+37C (АРП37). Дослідження складу популяцій і субпопуляцій мононуклеарів проводили методом непрямої імунофлюоресценції (Пинчук В.Г. и соавт., 1990). Було використано панелі комерційних моноклональних антитіл CD3, CD4, CD8, CD16, CD22, CD25, CD38 і CD95 виробництва Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Е.Кавецького НАН України. За допомогою світлової мікроскопії оцінювали кількість таких лімфоцитів: бобоподібних (БЛ), веретеноподібних (ВЛ), молодих (МЛ), рідеровських (РЛ), аберантних (АЛ), великих гранульованих (ГЛ). Для оцінки ступеня сенсибілізації організму до власних тканинних антигенів (нирки, надниркових, підшлункової та щитовідної залоз, селезінки й тимуса) використовували цитотоксичний тест (Слюсарь Л.И. и соавт., 1991). Тільки в сироватці крові досліджено концентрації імуноглобулінів (Ig) G, A, M, циркулюючих імунних комплексів (ЦІК), фібриногену, сечовини й оксипуринолу, у крові та сечі – креатиніну, сечової кислоти, калію та натрію, тільки в сечі – фібронектину (аналізатори “Cone-Progress Plus” і “Cone-Specific”, Фінляндія). Дослідження динамічного поверхневого натягу (ПН) крові та сечі проведено з використанням комп'ютерного адсорбційного тензіометра (“МРТ2-Lauda”, Німеччина). Результати ПН подавалися у вигляді тензіограм – кривих залежності його від часу (t), на яких комп'ютер визначав точки, що відповідають t=0,01 сек (ПН1), t=1 сек (ПН2) і t=100 сек (ПН3), а також кут нахилу кривих тензіограм (КН) (Казаков В.Н. и соавт., 1997, 2000; Kazakov V.N. et al., 2000) . Фазовий кут між амплітудними значеннями деформації (ФК), рівноважний ПН при t (ПН4), модуль в’язкоеластичності (ВЕ) та час релаксації (ЧР) біологічних рідин (їх реологічні властивості) визначали за допомогою комп’ютерного тензіореометра “ADSA-Toronto” (Канада).

Усім хворим проводили електрокардіографію (апарат “Fukuda Denshi Cardimax-FX326”, Японія, “Aspen-Acuson”, США), трансторакальну або черезстравохідну ехокардіографію (апарати “Hеwlеtt Packard”, США і “SSA-270A-Toshiba”, Японія). Дослідження судин (сонних артерій і черевної аорти) виконували за допомогою ультразвукового сканера “Sonoline Elegra Siemens” (Німеччина). Функцію ендотелію артерій і гладеньком’язових клітин оцінювали шляхом неінвазивного виміру діаметра плечової артерії у відповідь на незалежні від ендотелію (нітрогліцерин) і залежні (реактивна гіперемія) стимули (Созыкин А.В. и соавт., 2000).

Як контрольні вивчено параметри метаболізму NO у 43 практично здорових людей віком від 23 до 46 років, серед яких було 12 чоловіків і 31 жінка. Імунологічні, імуноферментні та фізико-хімічні показники визначено у 31 особи (6 чоловіків і 25 жінок віком від 15 до 69 років).

У крові експериментальних тварин, крім метаболітів NO і цГМФ, досліджували титри антитіл до нативної (нДНК) і денатурованої ДНК (дДНК), а також до водно-сольових екстрактів тимуса й селезінки (імунокомпетентних органів). Для визначення титрів антитіл застосовували реакцію пасивної гемаглютинації з використанням селезінкової ДНК великої рогатої худоби. За допомогою світлової мікроскопії у щурів проводили морфологічне дослідження тканин серця, аорти, нирок, тимуса й селезінки. Морфологічні препарати забарвлювали гематоксиліном і еозином за ван Гізоном, альціановим синім, ставили PAS-реакцію.

Статистичну обробку отриманих результатів проведено на персональному комп'ютері за допомогою одно- й багатофакторного дисперсійного аналізу (пакети ліцензійних програм “Microsoft Excel”, “Stadia.6.1/prof” і “Statistica”). Оцінювали середні значення, їх похибки, коефіцієнти кореляції, критерії Стьюдента, Фішера, Вілкоксона, Рао, Крускала-Уолліса, Хі-квадрат і достовірність статистичних показників (р).

Результати досліджень та їх обговорення. При СЧВ (табл. 1) відзначено збільшення на 5,5% NОк (p=0,004), на 45,6% CNO (p=0,013) і на 83,9% CNO/CCr (p=0,014), але зменшення в 2,1 раза NOс24 (p=0,001). NOк і NOс між собою не корелювали.

Таблиця 1

Показники метаболізму NO у хворих на системні

захворювання сполучної тканини і здорових людей(M±m)

Показники | Групи обстежених

здорові

n=43 | хворі

СЧВ

n=71 | ССД

n=51 | РА

n=89

NOк, мкмоль/л

NOс, мкмоль/л

NOс24, мкмоль/доб

СNO, мл/хв

CNO/CCr, %

Аргінін, мг/л

цАМФ, пмоль/мл |

5,06±0,06

5,14±0,05

9,49±0,11

2,04±0,03

1,93±0,03

6,52±0,14

11,1±0,19 | 5,34±0,07*

6,48±0,68

4,45±1,37**

2,97±0,36*

3,55±0,65*

5,03±0,15**

7,61±0,19** | 5,30±0,07*

5,13±0,09

1,62±0,05**

1,68±0,07**

2,15±0,11

4,82±0,17**

6,63±0,23** | 5,40±0,06**

5,40±0,08*

1,97±0,02**

1,78±0,02**

2,24±0,08**

6,17±0,10*

8,30±0,22**

Примітка: * – p<0,05, ** – p<0,001 — відмінності між аналогічними показниками у хворих і здорових людей статистично достовірні.

Якщо рівень NOс24 зменшувався як у чоловіків (p<0,001), так і в жінок (p=0,008), то CNO в першій групі знижувався (p<0,001), а в другій – підвищувався (p=0,008). Виявлено вплив віку на CNO/CCr (p=0,014), тривалості захворювання – на NOс (p=0,016), CNO (p=0,003) і CNO/CCr (p=0,002), перебігу СЧВ – на NOс24 (p=0,010), активності патологічного процесу - на NOс (p=0,002). На показники NOк впливали наявність лихоманки (p=0,039), міозиту або міалгій (p=0,006), лімфаденопатії (p=0,006), перикардиту (p=0,001), пневмоніту (p=0,006), плевриту (p=0,003), спленомегалії (p=0,049) та ураження периферичної нервової системи (p=0,016). NOс мав залежність від ураження шкіри (p=0,036), лімфатичних вузлів (p=0,007), плеври (p=0,018), центральної і периферичної нервової системи (відповідно p=0,028 і p=0,034), а також нирок (p=0,003). Показники NOс24 пов’язані з розвитком алопеції (p=0,013), ендокардиту і змін клапанів серця (p=0,001), плевриту (p=0,035). На рівень CNO впливали лімфаденопатія (p=0,034), ендокардит і клапанні пороки серця (p=0,041), церебральний васкуліт (p=0,027), а на CNO/CCr – ураження лімфатичних вузлів (p=0,001), плеври (p=0,035) і центральної нервової системи (p=0,003). На показники CNO і CNO/CCr впливала наявність у периферичній крові LE-клітин (відповідно p=0,018 і p=0,004) і антитіл до нДНК (p=0,048 і p=0,002).

При СЧВ спостерігається зменшення параметрів аргініну і цГМФ (табл. 1) відповідно на 29,6% (p<0,001) і 45,9% (p<0,001). Не виявлено впливу на показники аргініну і цГМФ віку пацієнтів, тривалості захворювання, характеру перебігу СЧВ і ступеня активності патологічного процесу. Рівень аргініну і цГМФ різноспрямовано корелював з тяжкістю ураження міокарда (відповідно p=0,007 і p=0,021), перикарда (p<0,001 і p=0,005), ендокарда (p=0,001 і p=0,002). Встановлено позитивний зв’язок аргінінемії з вираженістю пневмоніту (p=0,007) і спленомегалії (p=0,003). Виявлено вплив на NOк і негативні кореляційні зв’язки з ним дифузних змін міокарда (p<0,001 і p=0,006), відносної недостатності тристулкового клапана (p=0,021 і p=0,027), гіпертрофії та дилатації правого шлуночка (відповідно p=0,012 і p=0,032, p=0,039 і p=0,032). Аргінін і цГМФ мали різноспрямовані кореляційні зв’язки з легеневою гіпертензією (p=0,007 і p=0,010).

Відзначено пряму залежність рівня амінокислоти від ступеня порушення скорочувальної здатності міокарда (p=0,006). Рівень аргініну і цГМФ (відповідно прямо і обернено) корелював з ураженням клапанів серця, а також перикарда. Показники середнього артеріального тиску прямо корелювали з параметрами NOк (p=0,018), NOс (p<0,001), NOс24 (p<0,001), CNO (p<0,001), CNO/CCr (p<0,001) і аргініну (p=0,016), а обернено – із цГМФ (p<0,001). З коефіцієнтом корисної дії зовнішньої роботи лівого шлуночка позитивно корелював рівень цГМФ (p=0,003), а обернено – NOс24 (p<0,001), CNO (p=0,002) і CNO/CCr (p=0,001). Виявлено залежність артеріального тиску від рівня альдостерону в крові (p<0,001) і АРП37 (p=0,042). Вміст альдостерону негативно корелював з NOс (p=0,024), NOс24 (p=0,017), CNO (p=0,015) і CNO/CCr (p=0,013), а АРП37 – позитивно (відповідно p=0,045, p=0,042, p=0,038, p=0,039).

При СЧВ виявлено збільшення на 1,3% ПН2 (p=0,001) і на 24,0% КН (p<0,001) при зменшенні на 24,6% ВЕ (p=0,035) і на 41,0% ЧР (p<0,001). Встановлено прямий кореляційний зв’язок NОк із ПН2 (p=0,037), ФК (p<0,001) і ВЕ (p=0,014), а обернений – із ПН4 (p<0,001) і ЧР (p=0,001). Виявлено пряму залежність NОк із сечовиною (p=0,041) і сечовою кислотою (p=0,001), калієм (p=0,005) і натрієм (p=0,023).

При СЧВ відзначено обернений кореляційний зв’язок між аргініном і цГМФ у крові (p=0,015). Рівень амінокислоти негативно корелював з показниками NOк (p<0,001), циклічний нуклеотид обернено – з концентрацією в крові сечової кислоти (p=0,007), аргінін мав взаємозв’язки з ПН3 (p=0,015), ПН4 (p=0,009), ФК (p<0,001) і ЧР (p=0,005). Концентрації метаболітів NO у сечі прямо співвідносилися з показниками фібронектинурії. Це стосувалося NOс (p=0,003) і NOс24 (p=0,004), а також похідних кліренсових тестів – CNO (p=0,001) і CNO/CCr (p=0,001). CNO мав також кореляції з рівнями загальної протеїнурії (p=0,049) і урикозурії (p=0,045). Поверхнева активність сечі при t=100 сек прямо корелювала з NOс (p=0,004), NOс24 (p=0,001), CNO (p<0,001) і CNO/CCr (p<0,001). З NОс, CNO і CNO/CCr позитивно співвідносилися і показники ПН сечі при t=0,01 сек (відповідно p=0,031, p=0,022, p=0,028).

Зміни стінок сонних артерій виявлено в 40,9% хворих на СЧВ, а черевного відділу аорти – у 38,0%. Встановлено прямий кореляційний зв’язок ушкоджень з рівнем середнього артеріального тиску (p<0,001 і p=0,001). Відзначено залежність змін сонних артерій і черевної аорти від концентрації в крові нітритів (відповідно p<0,001). Якщо в здорових людей залежна від ендотелію вазодилатація становила 7,0±0,2%, а незалежна – 15,7±0,2%, то при СЧВ перша зменшувалася на 62,8% (p<0,001), а друга – на 10,6% (p<0,001). Обидва види вазодилатації мали прямий кореляційний зв’язок з NОк (p<0,001 і p=0,048) і цГМФ (p<0,001 і p=0,008), а обернений – з аргініном (p=0,002 і p=0,036). Ушкодження сонних артерій і аорти прямо корелювало (p<0,001) з аргінінемією, а обернено – з концентрацією нітритів, цГМФ, показниками залежної і незалежної вазодилатації. Залежна від ендотелію вазодилатація негативно співвідносилася з пропасним і шкірним синдромами (p=0,021 і p=0,036), алопецією (p=0,021), перикардитом (p<0,001), ендокардитом (p=0,013), пневмонітом (p=0,028) і плевритом (p=0,029), а незалежна – з перикардитом (p=0,009) і спленомегалією (p=0,037).

При ССД спостерігалося (табл. 1) збільшення на 4,7% NOк (p=0,011), зменшення на 21,4% CNO (p<0,001) і в 5,9 раза NOс24 (p<0,001). При цьому відзначено прямий кореляційний зв’язок параметрів NOк і NOс (p=0,023). Зниження CNO було властиве лише жінкам (p<0,001). У них виявилися більш низькими показники NOс24 (p<0,001) і CNO (p=0,048). Стать хворих впливала на CNO (p=0,012), а тривалість ССД – на NOк (p=0,019). Від віку пацієнтів достовірно залежали параметри метаболітів NO у сечі: NOс (p=0,018), NOс24 (p=0,016) і CNO (p=0,013). З віком хворих збільшувалися NOк (p=0,014) і NOс (p=0,027). На параметри NOк впливали синдром Рейно (p=0,012), ураження перикарда (p=0,006), легень (p=0,005) і нирок (p=0,017), на NOс – зміни міокарда (p=0,003), стравохода (p=0,046), на NOс24 – синдром Рейно (p=0,023) і ураження периферичної нервової системи (p<0,001), на CNO – пропасний синдром (p=0,012), синдром Рейно (p=0,018), розвиток алопеції (p=0,001), ураження перикарда (p=0,005), ендокарда чи клапанів серця (p<0,001) і нирок (p=0,033), на CNO/CCr – синдром Рейно (p=0,003), зміни ендокарда (p=0,027), печінки (p=0,005) і центральної нервової системи (p=0,045). Вміст нітритів у крові позитивно співвідносився з рівнем середнього артеріального тиску (p=0,001), а рівень загального периферичного судинного опору – обернено з параметрами добової екскреції метаболітів NO з сечею (p=0,001).

Порівняно з показниками здорових людей у хворих на ССД виявлено на 35,3% зменшення в крові рівня аргініну (p<0,001) і на 67,4% – цГМФ (p<0,001). Відзначено обернену кореляцію параметрів аргініну в крові з тяжкістю ураження периферичної нервової системи. Ступінь гіпертрофії лівого шлуночка обернено корелював з аргінінемією (p=0,030), а синдром ранньої реполяризації шлуночків і блокада лівої ніжки пучка Гіса – з рівнем цГМФ (p=0,048 і p=0,031). Ураження перикарда впливало на вміст нітритів у крові (p=0,003), що обернено корелював зі ступенем недостатності аортального клапана (p=0,049). Амінокислота обернено співвідносилася із середнім артеріальним тиском (p=0,004), а циклічний нуклеотид – прямо (p=0,045). При ССД рівень середнього артеріального тиску обернено корелював з АРП4 (p=0,001). Показники кортизолу мали прямий кореляційний зв’язок з параметрами добової екскреції з сечею нітритів (p=0,044), АРП4 – з NOс24 (p=0,016) і аргініном (p=0,022), а АРП37 – обернений з NOк (p=0,021). Відзначено високу пряму залежність NОк з показниками креатинін- і сечовинемії (p=0,017 і p=0,011).

При ССД був наявний високий негативний кореляційний зв’язок показників у крові аргініну і цГМФ (p<0,001), які різноспрямовано корелювали з NOк (p<0,001 і p=0,002) і CNO (p=0,005 і p=0,043). Аргінін і цГМФ були взаємозалежні з ВЕ крові (p=0,046 і p=0,002), а показники циклічного нуклеотиду ще прямо корелювали з ПН в зоні малих (p=0,048) і середніх часів (p=0,024) існування поверхні. CNO і CNO/CCr обернено корелювали з креатинінурією (p=0,031 і p=0,001). CNO мав також негативний зв’язок з параметрами калій- і натрійурії (p=0,004 і p<0,001), а прямий – з рівнем урикозурії (p=0,017). NOс позитивно корелював з ПН2 сечі (p=0,042) і ВЕ (p=0,024), NOс24 – з ПН1 (p=0,022), а CNO/CCr – з ПН4 (p = 0,017) і ВЕ (p=0,023). При цьому відзначено вплив NOс на КН і ФК тензіореограм.

Стінки сонних артерій виявилися зміненими у 49,0% пацієнтів, а черевної аорти – у 39,2%. При ССД відзначено достовірний вплив рівня нітритів у крові на стан аорти (p=0,012), зменшення на 52,2% залежної від ендотелію вазодилатації (p<0,001) і на 16,3% – незалежної (p<0,001). Залежна вазодилатація прямо корелювала з показниками NOк і NOс (p<0,001 і p=0,008), а незалежна – з добовою екскрецією із сечею нітритів (p=0,030). Незалежна вазодилатація обернено співвідносилася з віком обстежених пацієнтів (p=0,008) і тривалістю захворювання (p=0,003). Зміни стінок сонних артерій і черевної аорти негативно співвідносились з NOс24 (відповідно p<0,001), CNO (p=0,001 і p=0,005), аргініном (p=0,027 і p=0,026) і показниками незалежної від ендотелію вазодилатації (p<0,001 і p=0,001). Тяжкість ураження черевного відділу аорти позитивно корелювала з CNO/CCr (p<0,001), залежна від ендотелію вазодилатація – з вираженістю легеневої патології (p=0,030), а незалежна – з ураженням перикарда (p=0,021) і периферичної нервової системи (p=0,007).

У хворих на РА встановлено (табл. 1) збільшення на 6,7% NOк (p<0,001), на 5,1% – NOс (p=0,005) і на 16,1% – CNO/CCr (p=0,001) при зменшенні на 14,6% CNO (p<0,001) і в 4,8 раза – NOс24 (p<0,001). Вік пацієнтів впливав на NOк (p=0,024) і прямо корелював з CNO (p=0,036). Тривалість захворювання впливала на NOс24 (p=0,011) і CNO (p=0,005), а обернено корелювала з NOс (p=0,031) і CNO (p=0,035), активність патологічного процесу впливала на NOк (p=0,005) і NOс (p=0,019) і прямо корелювала з цими ж параметрами метаболізму NO (p=0,013 і p=0,020), стадія РА – на NOк (p=0,001), NOс (p<0,001), NOс24 (p=0,001) і CNO (p=0,001), а позитивно корелювала з NOк (p=0,003) і NOс (p=0,001). На параметри нітритів у крові та сечі впливав серологічний варіант хвороби (p=0,020 і p=0,019). З NOс, NOс24, CNO, CNO/CCr прямо корелювали титри ревматоїдного фактора в крові (відповідно p=0,012, p<0,001, p<0,001, p=0,042). З поширеністю артриту був пов’язаний рівень NOк (p=0,007), а з індексами Річі й Лансбурі – NOс24 (p=0,011 і p=0,013). Добова екскреція нітритів із сечею залежала від суглобового рахунку (p=0,015). Наявність легеневої патології у хворих на РА впливала на NОс (p=0,022), причому встановлено обернений зв’язок (p=0,043). Кардіальна патологія діяла на добову екскрецію з сечею метаболітів NO (p=0,012) Середній артеріальний тиск прямо корелював з CNO (p=0,046), а загальний периферичний судинний опір – обернено з NОс (p=0,003).

При РА виявлено зменшення в крові на 5,7% концентрації аргініну (p=0,041) і на 33,7% - цГМФ (p<0,001). Відзначено більш низькі параметри цГМФ у чоловічій групі (p=0,009). На показники циклічного нуклеотиду впливали вік хворих (p=0,014), тривалість захворювання (p=0,009), ступінь активності патологічного процесу (p<0,001) і серологічний варіант хвороби (p<0,001). цГМФ негативно корелював із суглобовим рахунком (p=0,049), індексами Річі (p=0,042) й Лансбурі (p<0,001), а також показниками середнього артеріального тиску (p<0,001). Значення альдостеронемії прямо корелювали з параметрами добової екскреції з сечею нітритів (p=0,026) і співвідношенням кліренсів NO і креатиніну (p<0,001), а обернено – з рівнем цГМФ (p<0,001). З NOс були негативно пов’язані показники кортизолу (p=0,010) і АРП4 (p=0,035), а з цГМФ – АРП4 (p=0,016). Остання, як і АРП37, обернено співвідносилася з NOк (p=0,003 і p=0,001). Якщо амінокислота не взаємодіяла з іншими показниками метаболізму NO, то циклічний нуклеотид негативно корелював з NOс24 (p=0,036) і CNO (p=0,026).

Рівень метаболітів NO у крові хворих на СЧВ впливав (табл. 2) на популяцію лімфоцитів, рецептори імуноцитів, рівень Ig і цитокінів. При цьому аргінін і цГМФ на зазначені сумарні показники імунітету не впливали. NOк обернено корелював із БЛ (p=0,019), МЛ (p=0,006), ГЛ (p=0,026) і g-CSF (p=0,018), а прямо – з CD95 (p=0,005), лімфоцитами, сенсибілізованими до тканин селезінки (p=0,003), IgА (p=0,016), IL1b (p=0,017), IL4 (p=0,005), TNFa (p=0,001). NOс мав негативний зв’язок з CD22 (p=0,027), CD38 (p=0,012), IL6 (p=0,036), а прямий – з кількістю лімфоцитів, сенсибілізованих до тканин нирки (p=0,028). Вміст аргініну в крові негативно корелював з відповіддю лімфоцитів на антигени з щитовидної залози й селезінки (p=0,011 і p=0,003), з концентрацією IgМ (p=0,012), показниками в крові IL4 (p=0,020) і TNFa (p=0,049). Відзначено пряму кореляцію цГМФ із РЛ (p=0,022), АЛ (p=0,011) і ЦІК (p=0,004).

Таблиця 2

Достовірність впливу (р) порушень метаболізму NO

на імунологічні характеристики у хворих на системні захворювання сполучної тканини

Хвороби | Імунні показники | Показники метаболізму NO

NОк | Аргінін | цГМФ

СЧВ | Тип лімфоцитів

Рецептори імуноцитів

Імуноглобуліни

Інтерлейкіни | <0,001

<0,001

0,003

<0,001 | 0,306

0,318

0,849

0,143 | 0,655

0,929

0,541

0,840

ССД | Тип лімфоцитів

Рецептори імуноцитів

Імуноглобуліни

Інтерлейкіни | 0,001

<0,001

<0,001

0,519 | 0,336

0,169

0,163

0,474 | 0,583

0,223

0,116

0,420

РА | Тип лімфоцитів

Рецептори імуноцитів

Імуноглобуліни

Інтерлейкіни | <0,001

<0,001

<0,001

<0,001 | 0,155

0,753

0,740

0,817 | <0,001

0,003

0,237

0,274

Рівень нітритів у крові впливав на популяцію лімфоцитів