Міністерство охорони здоров’я України
Міністерство охорони здоров’я України
Національний медичний університет імені О.О. Богомольця
Ананьєва Майя Миколаївна
УДК 616.5 – 002.525:612017
Взаємозв’язок порушень імунітету і пуринового обміну
при системному червоному вовчаку
(клініко-експериментальне дослідження)
14.03.08. – імунолоґія та алерґолоґія (медичні науки)
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Київ – 2004
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Донецькому державному медичному університеті ім. М.Горького МОЗ України
Науковий керівник
доктор медичних наук, професор Ніколенко Юрій Іванович,
Донецький державний медичний університет ім. М. Горького, завідувач кафедри мікробіології, вірусолоґії і імунолоґії
Офіційні опоненти:
- доктор медичних наук, професор Бордонос Володимир Герасимович, Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця МОЗ України, НДЛЦ, завідувач лабораторії імунології
- кандидат медичних наук, доцент Гнилорибов Андрій Михайлович, Інститут невідкладної та відновної хірургії АМНУ ім. В.К. Гусака, завідувач лабораторії імунології
Провідна установа: Луганський державний медичний університет МОЗ України, кафедра імунології, алергології
Захист відбудеться 06.05. 2004 р. о 13-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.003.02 при Національному медичному університеті ім. О.О. Богомольця (Київ, вул. Шовковична, 39/1. Центральна міська клінічна лікарня, корпус 2)
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця (Київ, вул. Зоологічна, 1. Стоматологічний корпус).
Автореферат розісланий 30.03. 2004 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,
доктор медичних наук, професор С.Г.Свирид
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Вивчення системних аутоімунних захворювань є актуальною проблемою сучасної медицини. Системний червоний вовчак (СЧВ) відноситься до одного з розповсюджених і проґностично несприятливих форм патолоґії (Roberts W.N., 1998) людини.
В Україні частота захворювань людей на СЧВ складає 4-250 хворих на 100000 населення в рік. Більше 70% захворюють у віці 14-40 років, а найбільше хворих ? у віці 14-25 років. Співвідношення чоловіків і жінок, що захворіли на СЧВ, складає від 1:8 до 1:10 (Девина О.В., Комаров В.Т., 1998).
Патоґенетичні механізми розвитку СЧВ до кінця не з’ясовані. З одного боку, розвиток аутоімунних процесів проходить з вираженими порушеннями метаболізму, а з іншого боку, спостерігаються „поломки” в системі імунітету (Насонова В.А., 1979, Суглобов Є.В., Мінухін В.В., 2000). Дезорґанізація сполучної тканини і васкуліти є наслідками імунного запалення, яке запускається взаємодією аутоантитіл і сенсибілізованих лімфоцитів з аутоантиґенами (Santiago J.G., 2001, Rosen A., 1999). У ролі аутоантиґенів виступають, перш за все, ядерні компоненти (ДНК, нуклеопротеїди, гістони та інш.). Тому при СЧВ спостерігаються аутоалерґічні реакції як негайного (імунокомплексні, цитотоксичні), так і уповільненого типів (Волкова В.И., Крайнова А.С., 1980, Демин А.А. та інш., 1974). Підсилений розпад нуклеїнових кислот та їх підвищений синтез у результаті репараційних процесів і аутоімунних реакцій призводять до значного порушення пуринового обміну, нормальне функціонування якого необхідне для діяльності усіх клітин, перш за все, імуноцитів (Порядин Г.В., Макаров А.И. та інш., 1997).
В зв’язку з невиявленими деякими аспектами патоґенезу СЧВ, пов’язаними з порушеннями імунітету і пуринового обміну, а також ускладненнями при використанні базисної терапії є необхідність розробки нових підходів до їх корекції.
Зв’язок роботи з науковими темами. Дисертація є фраґментом державної комплексної теми плану НДР Донецького державного медичного університету ім.. М.Горького “Выявить взаимосвязь нарушений иммунитета и пуринового обмена с особенностями поражения нервной системы у больных СКВ и ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС, разработать методы коррекции выявленных нарушений”, номер держреєстрації 0196 U021509. В комплексній темі дисертант виконувала окремі фраґменти роботи.
Мета роботи. Виявити характер взаємозв’язку порушень імунітету і пуринового обміну у хворих на СЧВ і розробити нові підходи до патоґенетичної терапії цього захворювання, спрямовані на зменшення ускладнень та подовження ремісії.
Задачі дослідження. Для досягнення мети були поставлені задачі :
1. Розробити модель системного аутоімунного захворювання на щурах.
2. Вивчити порушення імунітету і пуринового обміну, а також характер взаємозв’язку між ними у мишей лінії MRL/lpr і щурів з моделлю системного аутоімунного захворювання.
3. Вивчити імунній статус і стан пуринового обміну та визначити характер зв’язку між їхніми показниками у хворих на СЧВ.
4. Обґрунтувати можливість взаємної корекції порушень імунітету і пуринового обміну в експерименті на тваринах з аутоімунним захворюванням.
5. Вивчити ефективність використання інгібіторів ксантиноксидази у комплексній терапії хворих на СЧВ.
Об’єкт дослідження ? імунний статус і пуриновий обмін у хворих на СЧВ і тварин з аутоімунним захворюванням.
Предмет дослідження ? взаємозв’язок порушень імунітету і пуринового обміну у хворих на СЧВ та їх взаємна корекція в експерименті на тваринах та комплексній терапії хворих на СЧВ.
Методи дослідження ? імунолоґічні, алерґолоґічні, радіоімунні методи, які характеризували неспецифічну і специфічну реактивність, також використані біохімічні методи дослідження для оцінки стану пуринового обміну, гістологічні (морфологічні), статистичні ? для оцінки достовірності отриманих результатів.
Наукова новизна отриманих результатів. Автором вперше розроблена модель системного проґресуючого аутоімунного захворювання на білих безпородних щурах.
Ефективність формування у тварин аутоімунного захворювання підтверджувалась морфолоґічними та імунолоґічними дослідженнями.
Вперше на експериментальній моделі мишей лінії MRL/lpr і щурів з системними аутоімунними захворюваннями, подібними до СЧВ у людини, виявлені порушення імунітету і пуринового обміну та показаний щільний зв’язок між ними. У більшості хворих на СЧВ, крім значних порушень імунітету, також виявлені зміни показників пуринового обміну. Вперше встановлено тісний зв’язок між ними.
Вперше обґрунтована і експериментально підтверджена на мишах лінії MRL і моделі системного аутоімунного захворювання на щурах ефективність використання інгібіторів ксантиноксидази (КО) у комплексному лікуванні, що призвело до корекції порушень імунітету і пуринового обміну.
Вперше обґрунтована терапія хворих на СЧВ з ефективним використанням інгібіторів КО, що призводило до корекції порушень імунітету і пуринового обміну, а також покращенню перебігу захворювання. Пріоритетність отриманих результатів підтверджена трьома патентами на винахід: патент на винахід № 29276А від 16.10.2000, бюл. № 5-11 (Спосіб моделювання системного аутоімунного захворювання), № 30460 А від 15.11.2000, бюл. № 6-11 (Спосіб лікування системного аутоімунного захворювання), № 30461 А від 29.12.1999, бюл. № 8 (Спосіб визначення субпопуляцій лімфоцитів).
Практична значимість отриманих результатів. Розроблена та запропонована автором модель системного проґресуючого аутоімунного захворювання (патент на винахід № 29276А від 16.10.2000, бюл. № 5-11), яка дозволяє вивчати динаміку імунолоґічних, метаболічних і морфолоґічних порушень при цих захворюваннях, проводити апробацію ефективності нових засобів їх патоґенетичної терапії.
Виявлений тісний зв’язок імунітету і пуринового обміну у хворих на СЧВ і у тварин з моделлю аутоімунного захворювання дозволив запропонувати використання у комплексній терапії інгібіторів КО та оцінити єфективність корекції порушень як імунітету, так і пуринового обміну (патент на винахід № 30460 А від 15.11.2000, бюл. № 6-11). Отримані результати досліджень втілені в навчальний процес Донецького, Харківського та Луганського медичних універсітетів і роботу ревматолоґічних і терапевтичних відділень міських і обласних лікарень Донецька. Підготовлено та впроваджено інформаційний лист “Способ определения субпопуляций лимфоцитов”.
Особистий внесок здобувача. Автором особисто виконані всі лабораторні обстеження хворих та експериментальні дослідження, систематизовані та узагальнені отримані результати, їх статистична обробка, сформульовані та оформлені всі розділи дисертації. Спільно з науковим керівником сформульовані основні висновки та рекомендації. Проаналізована сучасна вітчизняна та іноземна література з теми дисертаційного дослідження, проведено патентний та інформаційний пошук.
Апробація роботи. Основні положення дисертаційної роботи повідомлені та обговорені на 4 з’їзді імунолоґів СНД (Москва, вересень 2001 р.), конференції по імунолоґії (Луганськ, жовтень 2001 р.), на 63, 64 і 65 Всеукраїнських науково-практичних конференціях молодих вчених і студентів (Донецьк, квітень 2001 - 2003 р.р.), на засіданнях Донецьких обласних товариств імунолоґів та мікробіолоґів 1998 - 2002 р.р.
Публікації. Результати дисертаційного дослідження повністю опубліковані у 18 наукових роботах, в т.ч. в 6 статтях у виданнях, рекомендованих ВАК України, а також в 3 патентах України на винаходи, в інших виданнях та матеріалах наукових конференцій, з’їздів, конгресів.
Обсяг і структура дисертації. Робота написана на 145 сторінках принтерного тексту (основний текст ? на 116 сторінках), складається із вступу, огляду літератури, 4-х розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків. Список літератури включає 245 джерел вітчизняних та іноземних авторів, дисертація ілюстрована 43 таблицями та 3 рисунками.
Результати дослідження
Матеріали і методи дослідження. Комплексно обстежені 70 хворих на СЧВ, серед яких було 60 жінок і 10 чоловіків. Причому 40 із них обстежені в динаміці до і після лікування. Контролем служили 30 умовно здорових людей.
Склад популяції і субпопуляції визначали як в тестах розеткоутворення, так і по експресії антиґенних рецепторів за допомогою непрямої РІФ з моноклональними антитілами до СD3, СD4, СD8, СD22. Вивчалася активність Т-лімфоцитів в РБТЛ на ФГА і КонА, визначали концентрацію імуноґлобулінів, ЦІК, титри аутоантитіл в РПГА і ГУТ в РГМЛ, активність комплементу, концентрацію лізоциму, фаґоцитарну активність нейтрофілів. Визначали показники пуринового обміну по вмісту ДНК, сечової кислоти (СК), активності ксантиноксидази, амінокислот ? попередників пурину, цАМФ і цҐМФ, а також продуктів перекисного окислювання ліпідів (ППОЛ).
В дослідах використано 150 мишей лінії MRL/lpr різного віку. При цьому 60 мишей ? після проведеного лікування.
Для розроблення моделі використано 140 щурів, серед яких 70 тварин було лінії Вістар. На 70 безпородних щурах відпрацьовано створення моделі системного проґресуючого аутоімунного захворювання. На 70 тваринах обґрунтована терапія цього захворювання. Тварини із експерименту виводились під ефірним наркозом декапітацією. Всі тварини обстежені комплексно імунолоґічними, біохімічними і морфолоґічними методами.
Отримані результати оброблені методами варіаційної статистики, а також кореляційного аналізу за допомогою програми Statistic Windows на персональному комп’ютері.
Порушення імунітету і пуринового обміну у хворих на СЧВ. У хворих на СЧВ виявлені значні порушення імунітету. У крові хворих знижено вміст Т- і В-лімфоцитів та їх субпопуляцій, визначенних як в РУК, так і в РІФ з моноклональними антитілами, і ці зміни носять однотипний характер ? в бік зменшення (табл. 1), що свідчить про зниження супресорної ланки Т-системи. Про зниження її функції свідчить зменшення РБТЛ на КонА, а про зменшення загальної функції Т-лімфоцитів ? достовірне зменшення РБТЛ на ФГА.
Зниження абсолютної кількості В-лімфоцитів значно менше, ніж Т-лімфоцитів, а їх функція підвищена, що проявляється в підвищенні концентрації Ig G, Ig M і ЦІК.
У хворих на СЧВ виявлені також значні аутоімунні реакції гуморального типу (в РПГА), клітинного (у РГМЛ) _на н-ДНК і гомолоґічні тканинні антиґени (табл. 2). При цьому слід відзначити значні аутоімунні реакції гуморального і клітинного типів проти центрального (тимуса) і периферійного (селезінки) орґанів імунної системи. Це свідчить про самостійно підтримуваний аутоімунний процес у хворих на СЧВ.
Таблиця 1
Порушення імунітету у хворих на СЧВ
Імунолоґічні
показники | Ґрупи обстежених
хворі на СЧВ | здорові
CD3 (Г/л) | 0,45 ± 0,05 | 1,18 ±0,08
CD4 (Г/л) | 0,19 ± 0,03 | 0,62± 0,04
CD8 (Г/л) | 0,08± 0,02 | 0,31 ± 0,03
CD4/CD8 | 2,4 ± 0,02 | 2,0 ± 0,04
РБТЛ на ФГА % | 48,8 ± 5,42* | 71,4 ± 2,02
РБТЛ на КонА% | 25,1 ± 1,26* | 38,5 ± 3,12
Спонтанна РБТЛ % | 9,1 ± 2,29* | 1,1 ± 0,62
CD22 (Г/л) | 0,49 ± 0,03 | 0,58 ± 0,05
IgG (г/л) | 15,1 ± 0,62* | 9,4 ± 0,55
IgA (г/л) | 1,7 ± 0,21 | 1,7 ± 0,14
IgM (г/л) | 1,4 ± 0,11* | 0,9 ± 0,04
ЦІК (г/л) | 1,6 ± 0,08* | 0,5 ± 0,05
* ? різниця між ґрупами статистично достовірна
Таблиця 2
Показники аутоімунітету у хворих на СЧВ
Діаґностикуми
та антиґени | Антитіла (-ln М ± m) | РГМЛ (%)
хворі на СЧВ | здорові | хворі на СЧВ | зорові
н-ДНК | 4,32 ± 0,25* | 0,9 ±0,07 | 50,2 ± 4,18* | 101,0 ± 2,23
Тимус | 4,4 ± 0,41* | 1,0 ± 0,10 | 43,3 ± 3,03* | 99,1 ± 2,21
Нирка | 3,9 ± 0,22* | 0,8 ± 0,05 | 64,10 ± 3,98* | 102,2 ± 3,8
Печінка | 3,8 ± 0,31* | 1,1 ± 0,12 | 68,2 ± 3,52* | 95,1 ± 5,4
Селезінка | 4,2 ± 0,25* | 1,5 ± 0,11 | 57,4 ± 4,07* | 103,4 ± 4,3
У хворих на СЧВ виявлені значні порушення пуринового обміну, показники якого тісно пов’язані між собою та з порушеними показниками імунітету (табл. 3). В крові у хворих виявлено підвищення вмісту ДНК, СК, активності КО. Порушено співвідношення цАМФ/цҐМФ у бік переважання цҐМФ, що відображає системний характер імунного запалення у хворих на СЧВ.
Підвищення активності КО супроводжується паралельним підвищенням вмісту ППОЛ (вихідний рівень ? 3,4 ± 0,29 до 9,4 ± 0,71 при р < 0,01).
Таблиця 3
Показники пуринового обміну у хворих на СЧВ і здорових
Показники | Ґрупи обстежених
хворі на СЧВ | здорові
СК крові (ммоль/л) | 0,48 ± 0,06* | 0,25 ± 0,02
КО крові (мкмоль/л) | 9,6 ± 0,46* | 1,7 ± 0,22
ДНК крові (мкг/мл) | 153,0 ± 14,1* | 117 ± 3,37
цАМФ(пкмоль/мл) | 31,2 ± 2,09* | 35,9 ± 2,12
цҐМФ(пкмоль/мл) | 39,4 ± 2,96* | 11,0 ± 1,06
цАМФ/цҐМФ | 1,3 ± 0,05* | 3,3 ± 0,15
Це є допоміжним фактором патоґенетичних уражень імунної системи, що сприяє підтримці аутоімунних реакцій і збереженню активного системного імунного запалення.
Порушення імунітету та пуринового обміну у тварин з моделлю аутоімунного захворювання. Для вивчення порушень імунітету і пуринового обміну використано 90 мишей лінії MRL/lpr різного віку по 30 тварин у ґрупі. Перша – 2-3-місячного віку – без ознак захворювання (контроль), друга ґрупа – 3-4-місячного віку, третя – 5-6-місячного віку.
У лінії MRL/lpr мишей з віком розвиваються виражені аутоімунні реакції гуморального і клітинного типів (табл. 4).
Таблиця 4
Показники аутоімунітету у лінії MRL/lpr мишей різного віку
Діаґности-куми та ауто- антиґени | Титри аутоантитіл (ln М±m)
у мишей | ПРМ на аутоантиґени
у мишей
контроль | 3-4 міс. | 5-6 міс. | контроль | 3-4 міс. | 5-6 міс.
н-ДНК | 0,26 ± 0,018 | 2,0 ± 0,36* | 2,6 ± 0,16* | 99,3 ± 1,36 | 44,2 ± 3,13* | 28,4 ± 2,23*
Тимус | 0,74 ± 0,081 | 1,5 ± 1,11* | 2,6 ± 0,34* | 96,5 ± 2,21 | 50,6 ± 4,25* | 31,3 ± 1,86*
Нирка | 0,59 ± 0,091 | 1,6 ± 0,14* | 2,4 ± 0,35* | 98,4 ± 2,25 | 56,3 ± 3,21* | 25,2 ± 1,19*
Селезінка | 1,2 ±
0,08 | 2,6 ± 0,65* | 2,7 ± 0,46* | 97,4 ± 3,15 | 61,4 ± 2,36* | 46,1 ± 2,31*
У мишей також, як і у людей, крім н-ДНК, виявляються аутоімунні реакції гуморального і клітинного типів до орґанних антиґенів, в тому числі антиґенів імунних орґанів – тимуса і селезінки. У мишей лінії MRL/lpr виявлено з віком підвищення концентрації ЦІК (0,34 ± 0,06 в контролі, 0,71 ± 0,12 і 0,94 ± 0,14 г/л в дослідних ґрупах при р < 0,02). Вивчення пуринового обміну виявило у тварин лінії MRL/lpr значні порушення (табл. 5), особливо у мишей старшого віку.
Таблиця 5
Показники пуринового обміну у лінії MRL/lpr мишей різного віку
Показники | Контроль | 3-4 міс. | 5-6 міс.
ДНК(мкг/мл) | 52,0 ± 5,81 | 93,5 ± 8,32* | 139,0 ± 10,61*
СК (мкмоль/л) | 215,0 ± 15,11 | 202,0 ± 22,9 | 808,0 ± 52,7*
цАМФ (пкмоль/мл) | 20,1 ± 1,34 | 30,3 ± 2,84* | 40,5 ± 4,25*
цҐМФ(пкмоль/мл) | 10,2 ± 1,26 | 25,2 ± 2,36* | 42,5 ± 3,54*
КО (мкмоль/л) | 2,5 ± 0,32 | 4,2 ± 0,58 | 9,6 ± 1,25*
ППОЛ(од/мл) | 3,8 ± 0,28 | 5,6 ± 0,44 | 3,6 ± 0,92*
Кореляційний аналіз виявив високий рівень взаємозв’язку між ЦІК і антитілами до н-ДНК (r=0,8 ± 0,07 при р < 0,01), між титрами антитіл до н-ДНК та ПРМ (r=-0,69 ± 0,06 при р < 0,01). Відмічається високий рівень кореляції між антитілами до н-ДНК і вмістом ДНК і СК у крові тварин другої дослідної ґрупи (r=0,58 ± 0,07 та r=0,76 ± 0,09 при р < 0,01). Високий ступінь взаємозв’язку виявлений між ПРМ до н-ДНК і вмістом цҐМФ (r=0,81 ± 0,08 при р < 0,01), а також між активністю КО і вмістом ППОЛ і СК (r=0,73 ± 0,08 і r=0,86 ± 0,08 при р < 0,01).
Для створення системного проґресуючого аутоімунного захворювання на щурах використали 70 білих безпородних щурів. Захворювання розвивалось при трикратному введені ПАФ з ДНК і чергуванні введення азатіоприну і метилурацилу. У тварин з відтвореною моделлю розвиваються аутоімунні реакції гуморального і клітинного типів (табл. 6). При цьому антитіла і ПРМ виявляються до н-ДНК, антиґенів нирок, а також антиґенів центрального (тимуса) і периферійного (селезінки) орґанів імунної системи, що свідчить про розвиток системного аутоімунного захворювання і можливість його самопідтримки.
Таблиця 6
Показники аутоімунізації у щурів з моделлю аутоімунного захворювання
Антиґени і діаґностикуми | Титри антитіл (-ln M±m) | ПРМ до антиґенів (%)
інтактні | з моделлю | інтактні | з моделлю
н-ДНК | 0,8 ± 0,05 | 3,6 ± 0,13* | 98,2 ± 1,22 | 36,5 ± 2,85*
Тимус | 0,96 ± 0,07 | 2,8 ± 0,15* | 96,1 ± 2,15 | 42,4 ± 3,12*
Нирка | 0,81 ± 0,05 | 3,4 ± 0,22* | 99,3 ± 2,21 | 38,6 ± 3,45*
Селезінка | 1,12 ± 0,20 | 3,6 ± 0,28* | 97,2 ± 2,46 | 52,1 ± 3,13*
У піддослідних тварин виявлені також значні порушення пуринового обміну (табл. 7), які тісно пов’язані між собою і з показниками імунітету.
Таблиця 7
Показники пуринового обміну у щурів з моделлю аутоімунного захворювання
Ґрупи тварин | Показники пуринового обміну
СК
(мкмоль/л) | КО
(мкмоль/л) | цАМФ (пкмоль/мл) | цҐМФ
(пкмоль/мл)
Інтактні | 98,8 ± 9,79 | 2,1 ± 0,28 | 16,1 ± 1,77 | 9,1 ± 1,02
З моделлю | 145,2 ± 6,34* | 10,2 ± 1,12* | 36,1 ± 3,81* | 46,5 ± 4,52*
Підтвердженням формування системного аутоімунного захворювання у тварин є морфолоґічні дослідження, які доводять ураження внутрішніх орґанів, а також центральних і периферійних орґанів імунної системи, пов’язаних з імунним запаленням.
Обґрунтування корекції імунітету і пуринового обміну в експерименті на тваринах і хворих на СЧВ. Для відпрацювання способів лікування використано 90 мишей ліній MRL/lpr 5-6 місячного віку, які розподілені на 3 ґрупи по 30 в кожній: перша ґрупа – контрольна, друга – з базисним лікуванням (кортикостероїди і метотрексат або циклофосфан) і третя – з поєднанням базисної терапії з інгібіторами КО, при цьому дози цитостатитків знижували у два рази. Усі дози препаратів були у межах терапевтичних.
Аналіз показників імунітету в динаміці показує (табл. 8), що найбільш ефективним в комплексному лікуванні мишей лінії MR/lpr є додавання алопуринолу. Більш ефективно це поєднання ліків впливає і на показники пуринового обміну (табл. 9). В тому числі, в другій піддослідній ґрупі нормалізується вміст ДНК, СК, активність КО і зменшується ПОЛ.
Таблиця 8
Показники імунітету у лінії MRL/lpr мишей в процесі лікування
Діаґностикуми та антиґени | Ґрупи тварин
без лікування | перша піддослідна | друга піддослідна
Антитіла до: (-ln Мm)
н-ДНК | 2,6 ± 0,16 | 2,1 ± 0,17* | 1,6 ± 0,14*
Тимус | 2,6 ± 0,34 | 1,8 ± 0,19 | 1,5 ± 0,15*
Нирка | 2,4 ± 0,35 | 2,0 ± 0,22 | 1,6 ± 0,20*
Селезінка | 2,7 ± 0,46 | 2,2 ± 0,16 | 1,7 ± 0,17*
ПРМ до:
н-ДНК | 28,4 ± 2,23 | 52,1 ± 2,15* | 83,4 ± 2,13*
Тимусу | 31,3 ± 1,86 | 60,3 ± 3,4* | 86,3 ± 3,12*
Нирки | 25,2 ± 1,19 | 56,4 ± 2,44* | 74,5 ± 2,34*
Селезінки | 46,1 ± 2,31 | 60,5 ± 2,32* | 88,4 ± 3,0*
ЦІК (г/л) | 0,94 ± 0,14 | 0,61 ± 0,05 | 0,32 ± 0,04*
Таблиця 9
Показники пуринового обміну у лінії MRL/lpr мишей в процесі лікування
Показники | Ґрупи тварин
без лікування | перша піддослідна | друга піддослідна
ДНК (мкг/мл) | 139,0 ± 10,61 | 122,0 ± 8,24 | 80,4 ± 3,62*
СК (мкмоль/л) | 808,0 ± 52,7 | 610,1 ± 25,15* | 256,1 ± 8,13*
цАМФ (пкмоль/мл) | 40,5 ± 4,25 | 30,4 ± 2,24 | 23,4 ± 1,64*
цҐМФ (пкмоль/мл) | 42,5 ± 3,54 | 31,2 ± 3,06* | 15,8 ± 0,85*
КО(мкмоль/л) | 9,6 ± 1,25 | 8,1 ± 0,94 | 3,6 ± 0,34*
ППОЛ (од/мл) | 13,6 ± 0,92 | 12,2 ± 0,86 | 6,3 ± 0,95*
Для вивчення впливу лікування на показники імунітету і пуринового обміну використано 70 щурів лінії Вістар, із них було 10 інтактних, 10 ? з моделлю системного аутоімунного захворювання без лікуваня (контроль), і ґрупи з різними методами лікуваня. Перша піддослідна отримувала по 15 мг/кг азатіоприну, а друга піддослідна – поєднання алопуринолу з азатіоприном.
Аналіз отриманих результатів показав найбільшу ефективність у лікуванні щурів при поєднанні азатіоприну та інгібітору КО алопуринолу по впливу на показники імунітету (табл. 10) і пуринового обміну (табл. 11). Поєднання в лікуванні цих препаратів достовірно знижує у крові піддослідних тварин аутоантитіла і підвищує ПРМ до антиґенів, а також майже нормалізуються показники пуринового обміну, в тому числі співвідношення цАМФ/цҐМФ, що є ознакою пригнічення імунної запальної реакції в орґанізмі тварин. Вміст ППОЛ також нормалізується.
Таблиця 10
Показники імунітету у щурів з аутоімунною моделлю у процесі лікування
Діаґностикуми та антигени | Ґрупи тварин
інтактні | без лікування | перша піддослідна | друга піддослідна
Антитіла до:
н-ДНК | 0,8 ± 0,05 | 3,6 ± 0,13* | 2,3 ± 0,15* | 1,8 ± 0,25**
Тимус | 0,96 ± 0,07 | 2,8 ± 0,15* | 2,1 ± 0,22* | 1,5 ± 0,21**
Нирка | 0,81 ± 0,05 | 3,4 ± 0,022* | 2,7 ± 0,34* | 2,2 ± 0,26**
Селезінка | 1,12 ± 0,02 | 3,6 ± 0,28* | 2,3 ± 0,23* | 1,7 ± 0,15**
ПРМ до:
н-ДНК | 98,2 ± 1,22 | 36,5 ± 2,85* | 68,2 ± 2,43* | 80,2 ± 1,12**
Тимус | 96,1 ± 2,15 | 42,4 ± 3,12* | 65,3 ± 2,31* | 85,3 ± 2,32**
Нирка | 99,3 ± 2,21 | 38,6 ± 3,45* | 62,3 ± 3,42* | 76,1 ± 3,13**
Селезінка | 97,2 ± 2,46 | 52,1 ± 3,13* | 70,3 ± 2,51* | 82,3 ± 3,34**
* ? різниця з показниками ґрупи інтактних достовірна;
** ? різниця з показниками першої ґрупи достовірна.
Таблиця 11
Показники пуринового обміну у щурів з аутоімунною моделлю у процесі лікування
Діаґностикуми та антиґени | Ґрупи тварин
інтактні | без лікування | перша піддослідна | друга піддослідна
СК (мкмоль/л) | 98,8 ± 9,79 | 145,2 ± 6,34 | 128,3 ± 3,14* | 86,2 ±4,32**
цАМФ (пкмоль/мл) | 16,1 ± 1,77 | 36,1 ± 3,81 | 25,6 ± 3,26* | 19,7 ±1,82**
цҐМФ (пкмоль/мл) | 9,1 ± 1,02 | 46,5 ± 4,52 | 18,2 ± 1,16* | 16,2 ±2,34**
КО(мкмоль/л) | 2,1 ± 0,28 | 10,2 ± 1,12 | 6,4 ± 0,84* | 2,3 ± 0,44**
ППОЛ (од/мл) | 4,2 ± 0,33 | 12,3 ± 1,14 | 8,6 ± 0,64* | 5,2 ± 0,82**
Для виявлення ефективності використання інгібіторів КО у комплексній терапії в динаміці до і після лікування обстежені дві ґрупи хворих на СЧВ.
У процесі лікування в основній ґрупі значно поліпшується більшість показників неспецифічної та імунної реактивності хворих. Поліпшується фаґоцитарна активність (з 35,2 ± 3,15% до 67,5 ± 3,65% при р < 0,05), а також активність комплементу (з 30,1 ± 2,4 до 65,2 ± 3,25 при р < 0,05), концентрація лізоциму (з 6,5 ± 1,72 до 12,3 ± 1,68 мкг/мл при р < 0,05). Із імунолоґічних показників у хворих достовірно підвищується вміст Т-лімфоцитів (з 28,4 ± 2,16 до 40,3 ± 2,06% при р < 0,05) і їх субпопуляцій. Зменшується спонтанна РБТЛ і підвищується на ФГА (з 44,5 ± 3,52 до 55,3 ± 4,11% при р < 0,05), на КонА (з 24,2 ± 1,45 до 31,5 ± 2,26 при р < 0,05), знижується концентрація Ig G та M, ЦІК, зменшуються титри антитіл до н-ДНК (з 4,5 ± 0,26 до 2,3 ± 0,15 при р < 0,01) і підвищується РГМЛ до н-ДНК (з 45,2±2,34 до 72,1±3,45% при р < 0,01). На відміну від основної ґрупи, в контрольній ґрупі показники неспецифічної реактивності нормалізуються у значно меншій мірі.
Отримані результати свідчать про значні зміни показників пуринового обміну у процесі лікування в основній ґрупі: знижується концентрація СК (з 0,51 ± 0,071 до 0,28 ± 0,52 мкмоль/л при р < 0,01), активність КО, зменшується вміст у крові ДНК (з 158,0 ± 12,3 до 121,1 ± 8,42 мкг/мл, р < 0,05), підвищується концентрація амінокислот - попередників пурину, а також вміст цҐМФ та ППОЛ (з 10,2 ± 0,82 до 4,5 ± 0,61 од/мл, р < 0,05).
У хворих контрольної ґрупи не спостерігається нормалізації більшості показників пуринового обміну.
Таким чином, у комплексній терапії хворих на СЧВ із значними порушеннями пуринового обміну і гіперпродукцією ППОЛ доцільно використовувати інгібітори ксантиноксидази.
Висновки
В роботі вирішена актуальна наукова медична задача – з’ясовано характер порушень імунітету та пуринового обміну у хворих на системний червоний вовчак, встановлений їх взаємозв’язок, що дозволило запропонувати нові аспекти в розробці комплексної патоґенетичної терапії цього захворювання.
1. При комплексному імунолоґічному та біохімічному обстеженні хворих на СЧВ виявлені аутоімунні реакції гуморального і клітинного типів на тлі вираженого імунодефіциту Т-системи (збільшене співвідношення CD4/CD8) і гіперфункції В-системи (вірогідно підвищений вміст імуноґлобулінів G та М і імунних комплексів), суттєвий дисбаланс пуринового обміну (вірогідно підвищений в крові вміст сечової кислоти, ДНК, збільшена активність ксантиноксидази, підвищена концентрація циклічного ґуанозинмонофосфату), що тісно пов’язано з порушеннями імунітету.
2. На моделі генетично обумовленого аутоімунного захворювання у мишей лінії MRL/lpr, яке схоже на захворювання СЧВ у людей і яке розвивається у мишей з віком, виявлений паралелізм у розвитку аутоімунних реакцій гуморального і клітинного типів з порушеннями пуринового обміну.
3. На розробленій моделі системного проґресуючого аутоімунного захворювання на білих безпородних щурах виявлені значні імунологічні (зниження показника пригнічення розповсюдження макрофагів, підвищення титру антитіл до нативної ДНК в реакції пасивної гемаглютинації), біохімічні (в крові підвіщений вміст ДНК і сечової кислоти, титри антитіл до нативної ДНК, збільшення вмісту як циклічного аденозинмонофосфату, так і циклічного ґуанозинмонофосфату) та патоморфолоґічні (в орґанах центральної та периферійної імунної системи) зміни, які характерні для системних аутоімунних захворювань людини. При цьому порушення імунітету і пуринового обміну щільно пов’язані між собою.
4. В експериментах на мишах лінії MRL і моделі системного аутоімунного захворювання на білих безпородних щурах та щурах лінії Вістар доведена необхідність включення в комплексну терапію аутоімунних захворювань інгібіторів ксантиноксидази (алопуринолу) як одного із факторів, нормалізуючих пуриновий обмін.
5. Використання у комплексній терапії хворих на СЧВ інгібіторів КО показало їх ефективність у сумісній корекції імунітету і пуринового обміну (використання алопуринолу дозволяє вдвічі знизити дозу цитостатиків).
6. Виявлені у хворих на СЧВ і в експериментах на тваринах з системними аутоімунними захворюваннями (миши лінії MRL/lpr і білі безпородні щури) взаємозв’язки порушень імунітету і пуринового обміну дозволяють використовувати їх для більш широкого вивчення патоґенезу аутоімунних захворювань і проводити пошук нових підходів до терапії цих захворювань.
Список наукових праць
1. Ананьева М.Н. Взаимосвязь нарушений иммунитета и пуринового обмена при системной красной волчанке // Архив клинической и экспериментальной медицины. - 1999. - Т 8, №1. –С. 26-29.
2. Ананьева М.Н. Новые подходы к иммуномодулирующей терапии системной красной волчанки // Актуальные проблемы акушерства и гинекологии, клинической иммунологии и медицинской генетики. Сборник научных работ. Киев - Луганск. - 2001. - Вып. 6. – С. 91-94.
3. Ананьева М.Н. Нарушения иммунитета и пуринового обмена у MRL/lpr мышей разного возраста // Вестник неотложной и восстановительной медицины. - 2003. - Т.4, №1. - С. 152-154.
4. Николенко Ю.И., Ананьева М.Н., Николенко В.Ю., Синяченко О.В., Баркалов А.П., Дубяга В.В. Новый подход к коррекции нарушений иммунитета и пуринового обмена при системном аутоиммунном заболевании в эксперименте на животных // Экспериментальная и клиническая медицина. - 1999. - №2. – С. 208-210.
Автором показана ефективність використання інгібіторів ксантиноксидази в нормалізації пуринового обміну.
5. Ніколенко В.Ю., Барика Д.А., Ніколенко Ю.І., Головченко Ю.І., Ананьева М.М., Синяченко О.В., Баркалов А.П. Імуномоделююче лікування при системному аутоімунному захворюванні з ураженням нервової системи в експерименті на щурах // Ліки. - 2000. - №1-2. - С 28-30.
Автором показана недостатність базисної терапії аутоімунних захворювань для корекції показників імунітету.
6. Ананьева М.Н., Николенко Ю.И., Николенко В.Ю., Звягина Т.В., Баркалов А.П., Щукин И.Н. Новые подходы к иммунокорригирующей терапии системной красной волчанки в эксперименте на животных и у больных // Вестник гигиены и эпидемиологии. - 2002. Т 6., №1. - С. 47-50.
Автор провела узагальнення імунокорегуючого лікування хворих на СЧВ в експерименті на моделі аутоімунного захворювання на тваринах.
7. Ананьєва М.Н., Николенко Ю.И., Николенко О.Ю., Щукин И.Н., Пшеничная О.А., Баркалов А.П. Профилактика нарушений иммунитета коррекцией пуринового обмена в эксперименте у линии MRL/lpr мышей // Вестник гигиены и эпидемиологии (приложение). - 2002. - Т 6, №2. - С. 177-179.
Автор показала ефективність корекції порушень імунітету і пуринового обміну у мишей лінії MRL/lpr з використанням у базисній терапії інгібіторів КО.
8. Ананьева М.Н. Иммунокоррекция у больных системной красной волчанкой с нарушениями пуринового обмена // Аллергология и иммунология. - Москва. - 2001. -Т 2, №2. -С 122.
9. Николенко В.Ю., Коломойцева М.Н. Поражение вегетативной нервной системы у больных системной красной волчанкой // Сборник научных трудов молодых ученых и специалистов, посвященный 65-летию Донецкого медицинского университета. – Донецк. - 1996. -С. 160-162.
Автор провела клініко-лабораторне обстеження хворих на СЧВ.
10. Ананьева М.Н. Взаимосвязь нарушений иммунитета и пуринового обмена при системной красной волчанке // Сборник научных трудов молодых ученых и специалистов, посвященный 65-летию Донецкого медицинского университета. - Донецк. - 1996. – С. 6-8.
11. Ніколенко В.Ю., Синяченко О.В., Ніколенко Ю.І., Ананьева М.М., Дуб’яга В.В. Спосіб моделювання системного аутоімунного захворювання// Деклараційний патент на винахід. UА29276А 009В23/28. Бюл. Промислова власність. 2000. - № 5-2.
12. Ніколенко Ю.І., Синяченко О.В., Ніколенко В.Ю., Ананьева М.М., Дуб’яга В.В. Спосіб лікування системного аутоімунного захворювання // Деклараційний патент на винахід. UА 30460А А61КЗ 1/505. Бюл. Промислова власність. 2000. - № 6-2.
Автор довела імунологічними і морфологічними методами ефективність моделювання системного аутоімунного захворювання на щурах.
13. Ніколенко Ю.І., Ніколенко В.Ю., Баркалов А.П., Ананьева М.М., Дуб’яга В.В. Спосіб визначення субпопуляцій лімфоцитів // Деклараційний патент на винахід. UА30461А А61В10/00. Бюл. Промислова власність. 2000. - № 6-2.
Автор встановила ефективність використання в комплексному лікуванні аутоімунних захворювань інгібіторів КО.
14. Николенко Ю.И., Синяченко О.В., Коломойцева М.Н. Нарушения иммунитета и пуринового обмена при аутоиммунных заболеваниях в клинике и эксперименте // Юбилейный сборник тезисов докладов научно-практической конференции акушеров-гинекологов, посвященной 60-летию основания кафедры акушерства и гинекологии № 1 Донецкого государственного медицинского института им. М. Горького. - Донецк. - 1993. - часть 2. – С. 12.
Автор показала порушення імунітету і пуринового обміну при СЧВ у клініці і експерименті на тваринах.
15. Михайличенко В.Ю., Субботина Ю.А., Ананьева М.Н., Николенко О.Ю., Шкиренко А.Ю. Эндокринологические аспекты ревматоидного артрита // Актуальні проблеми клінічної, експериментальної та профілактичної медицини (64 ітогова конференція СНТ ім. М.Д. Довгялло). – Донецьк. - 2002. - С. 90-91.
Автор показала важливість ендокринологічних порушень при системних аутоімунних захворюваннях.
16. Николенко Ю.И., Ананьева М.Н., Николенко В.Ю. Моделирование системной красной волчанки в эксперименте на животных // ІІІ съезд по радиационным исследованиям (радиобиология и радиоэкология). - Киев. - 2003 - С. 178.
17. Ананьева М.Н., Николенко О.Ю., Пшеничная О.А. Взаимосвязь нарушений иммунитета и пуринового обмена у мышей линии MRL/lpr разного возраста. // Матеріали Всеукраїнської науково-практичної конференції студентів та молодих вчених: “Актуальні проблеми клінічної, експерементальної, профілактичної медицини та стоматолоґії.” - Донецьк. - 2003 - С.128.
Автором проведене комплексне лабораторне обстеження тварин різних вікових ґруп.
18. Ананьева М.Н., Николенко О.Ю., Пшеничная О.А. Коррекция нарушений иммунитета и пуринового обмена у мышей линии MRL/lpr. // Матеріали Всеукраїнської науково-практичної конференції студентів та молодих вчених: “Актуальні проблеми клінічної, експерементальної, профілактичної медицини та стоматолоґії.” - Донецьк. - 2003 - С. 127-128.
Автор відпрацювала на моделі системного аутоімунного захворювання на щурах використання інгібіторів КО.
Список скорочень
1. СЧВ – системний червоний вовчак
2. н-ДНК – нативна дезоксирибонуклеїнова кислота
3. ПРМ – приґнічення розповсюдження макрофаґів
4. ЦІК – циркулюючі імунні комплекси
5. СК – сечова кислота
6. цАМФ – циклічний аденозинмонофосфат
7. цҐМФ – циклічній ґуанозинмонофосфат
8. КО – ксантиноксидаза
9. ППОЛ – продукти перекисного окислювання ліпідів
10. РБТЛ – реакція бластної трансформації лімфоцитів
11. ФГА – фітогемаґлютинін
12. КонА – конканавалін А
13. РГМЛ – реакція гальмування міґрації лейкоцитів
14. ПАФ – повний ад’ювант Фрейнда
15. ФІ – фаґоцитарний індекс
16. ФЧ – фаґоцитарне число
17. ФПК – формазанпозитивні клітки
18. ІА – індекс активації
19. ГУТ – гіперчутливість уповільненого типу
20. РПГА – реакція пасивної гемаґлютинації
Практичні рекомендації
Системний червоний вовчак є системним аутоімунним захворюванням з вираженими аутоімунними реакціями гуморального і клітинного типів, проявленнями імунодефіциту і значними порушеннями пуринового обміну, щільно пов’язаного з порушеннями імунітету. В зв’язку з цим при обстеженні і лікуванні хворих на СЧВ ми можемо рекомендувати:
1. Крім вивчення в динаміці стану імунітету, в комплексному обстеженні хворих на СЧВ треба визначати також показники пуринового обміну і вміст ППОЛ.
2. У випадку виявлення у хворих на СЧВ значних порушень імунітету і пуринового обміну використовувати у комплексній терапії інгібітори КО.
3. Розроблена модель системного проґресуючого аутоімунного захворювання на щурах є близьким аналоґом системних захворювань сполучної тканини у людини (СЧВ), що дозволяє рекомендувати використовувати її для розробки нових підходів до терапії цих захворювань.
Анотація
Ананьєва М.М. Взаємозв’язок порушень імунітету і пуринового обміну при системному червоному вовчаку (клініко-еспериментальне дослідження) – рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.08. – імунолоґія та алерґолоґія (медичні науки). Національний медичний університет ім.. О.О. Богомольця, Київ, 2003 р.
Дисертацію присвячено вивченню характеру взаємозв’язку між порушеннями імунітету і пуринового обміну для пошуку нових підходів до їх взаємної корекції у хворих на СЧВ. Для експериментів використали 150 мишей лінії MRL/lpr, 70 безпородних щурів і 70 щурів лінії Вістар. На моделі системних аутоімунних захворювань на мишах і щурах виявлені значні порушення імунітету і пуринового обміну, щільно пов’язані між собою.
У обстежених 70 хворих на СЧВ виявлені значні порушення неспецифічної і імунної реактивності з ураженням Т-системи імунітету з вираженими аутоімунними реакціями гуморального і клітинного типів. У них також реєструються гіперпродукція СК, підвищення активності КО, порушення співвідношення циклічних нуклеотидів. Порушення імунітету і пуринового обміну щільно пов’язані між собою.
В експериментах на лінії MRL/lpr мишах і щурах лінії Вістар доведена ефективність використання в комплексній терапії аутоімунних захворювань інгібіторів КО. У хворих на СЧВ показана ефективність використання в комплексній терапії інгібіторів КО.
Ключові слова: системний червоний вовчак, імунітет, пуриновий обмін.
Аннотация
Ананьева М.Н. Взаимосвязь нарушений иммунитета и пуринового обмена при системной красной волчанке (клинико-экспериментальное исследование) – рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.08. – иммунология и аллергология (медицинские науки). Национальный медицинский университет им. А.А. Богомольца, Киев, 2003 г.
Диссертация посвящена изучению характера взаимосвязи между нарушениями иммунитета и пуринового обмена в эксперименте на животных с аутоиммунными заболеваниями и больных СКВ для поисков новых подходов и их взаимной коррекции.
Для экспериментального изучения нарушений иммунитета и пуринового обмена использована генетически обусловленная модель системного проґрессирующего
