НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ імені О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

__________________________________________________________________

Богуславський Андрій Юрійович

УДК 612.13+612.17.015.3/577.1.576.311.347.577.352.4

РОЛЬ МОНООКСИДУ АЗОТУ В РЕГУЛЯЦІЇ ЕФЕКТИВНОСТІ ВИКОРИСТАННЯ КИСНЮ ПРАЦЮЮЧИМ СКЕЛЕТНИМ М’ЯЗОМ

03. 00. 13 - фізіологія людини та тварин

Автореферат дисертації на здобуття наукового

ступеня кандидата біологічних наук

Київ - 2004

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі фізіології кровообігу

Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор, член-кор. НАНУ,

Сагач Вадим Федорович,

Завідувач відділу фізіології кровообігу,

Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

Янчук Петро Іванович,

ст. наук. співроб. відділу загальної фізіології

НДІ фізіології ім. П. Богача біологічного факультету

Київського національного університету імені Тараса Шевченка

доктор медичних наук,

Маньковська Ірина Микитівна,

завідувач відділу гіпоксичних станів

Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Провідна установа: Інститут ендокринології та обміну речовин

ім. В.П. Комісаренко АМН України

Захист відбудеться “_5_”_квітня___2005 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий “_3_”__березня___2005 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

Доктор біологічних наук З.О.Сорокіна-Маріна

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Дослідження останніх десятиріч в галузі біохімії та фізіології свідчать, що NO - не лише один із головних модуляторів судинного тонусу, а також потужний ендогенний регулятор інтенсивності клітинного дихання та внутрішньоклітинного рівня кисню [Borutaite V. et al., 2000]. Так, в роботах Брауна та ін. [Brown G.C., 1999; Steffen M. et al., 2001] показано, що NO, дозозалежно регулюючи активність мітохондріальних комплексів, оптимізує процеси клітинного дихання та енергоутворення. Ці процеси, в свою чергу, тісно пов’язані з відкриттям мітохондріальної пори (МП) [Griffiths E. et al., 1993; Ichas F. et al., 1997; Ravagnan L. et al., 2002]. Останнім часом стало відомо, що існують NO-залежні механізми регуляції чутливості МП до дії її активаторів [Bolli R. et al., 1997; Piantadosi C. et al., 2002]. Останні дослідження вказують на те, що індукція МП відіграє визначну роль у розвитку реперфузійних та токсичних пошкоджень серця. Незворотнє відкриття МП супроводжується колапсом мітохондріального мембранного потенціалу, різким порушенням іонного складу матриксу мітохондрій, пригніченням окисного фосфорилювання, вільнорадикальним вибухом та вивільненням у цитозоль клітини цілого ряду біологічно активних речовин - цитохрому С, прокаспаз, фактору індукції апоптозу тощо, що веде до розвитку апоптозу або/ та некрозу. Таким чином, регуляція дихальної активності мітохондрій, кисневих параметрів працюючого органу та чутливості МП до дії індукторів це взаємопов'язані ефекти модулюючого впливу NO. Проте, робіт з таким комплексним підходом ми не зустрічали. Переважна більшість досліджень, в яких вивчалась NO-залежна регуляція скорочувальної активності скелетних м’язів виконана в умовах ізольованих м’язових волокон, а результати цих досліджень досить розбіжні та неоднозначні [Xu L. et al., 2000; Galler S. et al., 1997; Marechal G. et al., 1999]. Що ж стосується вивчення ролі NO в регуляції кисневих параметрів роботи скелетного м’яза, то існуючі роботи дають неповне, фрагментарне уявлення про механізми NO-залежної регуляції. Роботи, присвячені вивченню ролі NO у регуляції ефективності використання кисню працюючим скелетним м’язом, в сучасній науковій літературі практично відсутні. Також, нам не вдалося знайти роботи, в яких досліджується роль NO-залежної модуляції чутливості МП в регуляції силових та кисневих параметрів роботи скелетного м’яза на рівні цілісного організму. На нашу думку, такі дослідження можуть значно доповнити та уточнити вже отримані результати, розкрити нові механізми, які обумовлюють розвиток втомлення скелетного м’яза та показати роль МП в фізіологічних умовах. Саме тому, вивчення ролі NO у регуляції ефективності використання кисню працюючим скелетним м’язом, на сучасному етапі розвитку фізіологічної науки постає дуже актуально.

Мета і завдання роботи. Метою нашого дослідження стало вивчення ролі NO у регуляції ефективності використання кисню працюючим скелетним м’язом. Відповідно до обраної мети були поставлені наступні задачі:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

Об’єкт дослідження: литковий м’яз собаки в умовах цілісного організму, сироватка крові собаки.

Предмет дослідження: показники гемодинаміки басейну стегнової артерії собаки, силові та кисневі параметри роботи литкового м’яза собаки, оптична густина поглинання сироватки крові.

Методи дослідження: в роботі були використані фізіологічні та біофізичні методи. Фізіологічні методи: реєстрація показників гемодинаміки в басейні стегнової артерії собаки, визначення сили та ефективності використання кисню працюючим литковим м’язом собаки. Біофізичні методи: спектрофотометричні дослідження сироватки крові собаки.

Новизна одержаних результатів. Вперше, в умовах цілісного організму показано, що пригнічення синтезу NO, призводило до зменшення СМС та істотного збільшення кисневої вартості роботи (КВР) скелетного м'яза. Також було визначено, що активація МП та розвиток оксидативного стресу під дією ФАО супроводжувались вивільненням мітохондріального фактору (МФ), який є маркером відкриття МП. Одночасно відбувалось пригнічення функціональної гіперемії в басейні a. femoralis, вірогідне зменшення СМС та ефективності використання кисню працюючим скелетним м'язом.

Вперше, в експериментах in vivo встановлено, що попереднє введення нітропрусиду натрію (НН) ефективно попереджало відкриття МП, яке відбувалось під дією ФАО, сприяло збереженню адекватного кровопостачання працюючого м’яза, усувало різке пригнічення СМС та зниження ефективності використання кисню працюючим м'язом.

Вперше показано, що розвиток втомлення литкового м’яза супроводжувався появою у сироватці крові високого рівня МФ, що свідчило про відкриття МП. При цьому відбувалось виразне пригнічення СМС та істотне зменшення ефективності використання кисню працюючим м’язом. Показано, що при моделюванні м’язового втомлення, попереднє застосування мелатоніну пригнічувало відкриття МП, попереджало падіння скорочувальної активності м’яза, різке зростання КВР литкового м’яза, а також запобігало розвитку втомлення.

Вперше, в експериментах in vivo при тривалому навантажені литкового м’яза встановлено, що за умов блокади синтезу NO відбувалось не тільки зменшення амплітуди функціональної гіперемії, а також пригнічення СМС та виразне падіння ефективності використання кисню працюючим м’язом, що супроводжувалось появою у відтікаючій крові МФ, маркера відкриття МП. Вперше показано, що попереднє введення НН в цих умовах істотно збільшувало рівень перфузії кров’ю працюючого м’яза, попереджало активацію МП, виразне падіння СМС, різке зменшення ефективності використання кисню м’язом, а також розвиток втомлення литкового м’яза протягом його навантаження. Встановлено, що попереднє короткотривале навантаження литкового м’яза (прекондиціонування) пригнічує активацію МП, а також попереджає виразне падіння СМС та зменшення ефективності використання кисню працюючим м’язом протягом наступного моделювання втомлення.

Теоретичне та практичне значення роботи. Отримані результати на рівні цілісного організму визначають роль NO у регуляції СМС та ефективності використання кисню працюючим скелетним м’язом. Отримані дані належать до фундаментальних наукових розробок. Значне теоретичне значення мають нові дані, про вплив NO на чутливість МП до активації та функціональний стан скелетного м’яза під час його навантаження. Вперше в експериментах in vivo, була показана роль відкриття МП - у розвитку втомлення скелетного м’яза. Продемонстровано також, що ефект прекондиціонування реалізується за участю NO.

Вперше в дослідах in vivo було встановлено, що попереднє введення інгібітору відкриття МП та антиоксиданту мелатоніну ефективно попереджало відкриття МП та пригнічення функціонального стану литкового м’яза при моделюванні втомлення. Ці дані дають підстави для розширення області застосування цього препарату у клінічній практиці. Показано, що попереднє короткочасне навантаження литкового м’яза зменшувало чутливість МП до дії активаторів та, відповідно, попереджало виразне зменшення силових та кисневих параметрів роботи скелетного м’яза при моделюванні його втомлення. Розкриття додаткових механізмів, за якими може розвиватись втомлення скелетних м’язів має велике прикладне значення у фізіології спорту та праці. Отримані результати можуть бути включені до навчальних програм медичних та біологічних факультетів вищих навчальних закладів у курсі "Фізіологія людини та тварин".

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота виконана автором самостійно. Науковий пошук та обгрунтування напрямку досліджень, розробка методичної концепції та схеми експериментів були проведені у співпраці з науковим керівником чл.-кор. НАН України Сагачем В.Ф. Підготовка тварин, катетеризація та обрахунки проведені самостійно. Обговорення отриманих результатів та підготовка публікацій здійснювались у співпраці із вед. наук. спів., докт. мед. наук Дмитрієвою А.В.

Апробація результатів дисертації. Основні положення й окремі фрагменти дисертації доповідалися на конференції: "Механизмы функционирования висцеральных систем" (Санкт-Петербург, Росія, 2003), ІІІ Всероссийской с международным участием школе-конференции по физиологии кровообращения (Москва, Росія, 2004), Ювілейному симпозіумі "Пурины и монооксид азота" (Мінськ, Білорусь, 2003), ІІІ Міжнародній науковопрактичній конференції "Дисфункция эндотелия" (Вітебськ, Білорусь, 2004), IV Національному конгресі патофізіологів України з міжнародною участю (Чернівці, 2004)

Публікації. Результати дисертації викладено у шістьох наукових статтях та трьох тезах доповідей.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду сучасної наукової літератури, опису матеріалів і методів дослідження, результатів досліджень, аналізу і узагальнення результатів дослідження, висновків та списку використаних джерел. Робота викладена на 136 сторінках машинописного тексту та проілюстрована 43 рисунками. Список літератури містить 27 джерел українською та російською мовами і 171 іноземне джерело.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Експерименти були проведені на 30 безпородних собаках з премедікацією кетаміном (5 мг/кг, в/м) під хлоралозо-уретановим наркозом (0,05 та 0,5 г/кг, в/в). Як антикоагулянт використовували гепарин – 500 од./кг.

Під час операційної підготовки відпрепаровували і катетеризували праву яремну вену, а також праві стегнові артерію і вену. Після катетеризації судин припиняли колатеральний кровотік шляхом накладання жорстких лігатур з двох сторін від судинного пучка. При проведені досліджень задню кінцівку собаки в колінному та заплюсневому суглобах жорстко фіксували у горизонтальному положенні, відпрепаровували та перерізали дистальний кінець ахіллового сухожилка. Після проведення гемостазу рану ушивали, а частину ахіллового сухожилка з’єднували нерозтяжимою лігатурою з тензометричним датчиком.

В дослідах реєстрували: тиск в стегновій артерії за допомогою тензодатчика 746 (Elema, Sweden) та кровотік F) у стегновій артерії за допомогою електромагнітного флоуметра РКЕ-2-БІ. Проточний флоуметричний датчик вмонтовували в екстракорпоральну ділянку. Розраховували величину середнього артеріального тиску (САТ) та судинного опору (СО) у басейні стегнової артерії. СМС вимірювали за допомогою тензометричного датчику.

Для відтворення скорочення литкового м’яза, стимуляційні електроди проводили по медіальній (І електрод) та латеральній (ІІ електрод) поверхнях м’яза. Стимуляцію проводили з частотою 8 та 40 Гц, напругою 20 В, тривалістю імпульсу 5 мс за допомогою ЕСЛ-2. Тривалість стимуляції м’яза складала 30 с, а інтервали між стимуляціями становили 20-25 хв [Сагач В.Ф. и др., 1991]. Модельне втомлення відтворювали шляхом довготривалого навантаження литкового м’яза за схемою: десять короткотривалих (30 с) електричних стимуляцій (8 Гц , 5 мс, 20 В) з інтервалом між ними 5 с. Час відпочинку між пачками стимуляцій становив не менше ніж 20-25 хв. Ефект прекондиціонування створювали шляхом попередньої короткочасної стимуляції литкового м’яза за схемою: три 30 с електричні стимуляції (8 Гц , 5 мс, 20 В) з інтервалами між ними 2 хв. Інтервал між попередньою стимуляцією та початком навантаження литкового м’яза становив 10 хв. М’язові скорочення реєстрували в режимі наближеному до ізометричного.

Показник кислотно-лужної рівноваги крові (рН) та парціальне напруження кисню (РО2) в артеріальній і змішаній венозній крові визначали за допомогою мікрогазоаналізатора BMS 3 Mk2 (Radiometer, Denmark). Проби крові забирали з правих стегнових артерії і вени. Вміст гемоглобіну в пробах крові визначали за методом Салі. Об’ємну швидкість споживання кисню працюючим м’язом визначали за методом Фіка. На основі визначення об’ємної швидкості споживання кисню та сили скорочень литкового м’яза ми визначали КВР.Реєстрацію всіх параметрів регіонарної гемодинаміки та скорочувальної активності м’яза проводили синхронно на 8-канальному полікардіографі “Mingograf-82” (Siemens-Elema, Germany-Swieden).

Проби крові для аналізу відбиралися до введення препаратів та після їх введення. В умовах довготривалого м’язового навантаження проби крові відбирали до введення препаратів та після їх введення на п’ятій стимуляції литкового м’яза. Проби крові центрифугували при 3000 об./хв. протягом 10 хвилин. Сироватку відбирали і додавали трихлороцтову кислоту (ТХУ) для забезпечення повного осадження білків. Потім центрифугували при 3000 об/хв. протягом 15 хвилин. Надосадний розчин відбирали і фільтрували через тонкий паперовий фільтр. Після цього проводили спектрофотометричні вимірювання надосадного розчину. Величину оптичної густини поглинання розчинів вимірювали за допомогою спектрофотометра СФ-46. Вимірювання проводили в ультрафіолетовій ділянці спектру при довжинах хвиль від 230 нм до 260 нм.

В дослідах використовували інгібітор NO-синтази (NOS) NG- монометил-L-аргінін (L-NMMA, Sigma, USA) в дозі 2,7 мг/кг. Донор NO - нітропрусид натрію (НН) застосовували в дозі 0,2 мг/кг. Феніларсиноксид (ФАО, Sigma, USA) використовували в дозі 0,2 мг/кг з метою активації МП. Для пригнічення відкриття МП ми використовували мелатонін (Україна) в дозі 0,75 мг/кг, а також селективний інгібітор активації МП циклоспорин А (Sigma, USA) в дозі 0,012 мг/кг.

Статистичний аналіз отриманих результатів проводився за допомогою методів варіаційної статистики з використанням t-критерію Стьюдента (р) і різницевого методу. Статистично вірогідними вважалися результати для яких р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження впливу активації та пригнічення синтезу монооксиду азоту на показники регіонарної гемодинаміки, силові та кисневі параметри роботи литкового м’яза собаки при короткочасній електричній стимуляції.

Електрична стимуляція литкового м’яза в контрольних умовах супроводжувалась розвитком реакції функціональної гіперемії. З літератури добре відомо, що NO відіграє визначну роль у реалізації реакції робочої гіперемії [Сагач В.Ф. и др., 1993; Rubanyi G.M. et al., 1986]. Визначаючи СМС (рис. 1.) і КВР литкового м’яза при різних частотах стимуляції м’яза ми встановили, що короткотривале гладкотетанічне скорочення (40 Гц) для скелетного м'яза за ефективністю використання кисню є більш економічним (рис. 2. ).

Результати отримані нами за умов блокади NOS свідчать, що пригнічення синтезу NO призводило не тільки до очікуваного зменшення ендотелій–залежної реакції функціональної гіперемії, а також до пригнічення СМС. Так, при стимуляції м'яза з частотою 8 Гц СМС зменшувалась на 24,8±1,82 %, а при частоті стимуляції 40 Гц – на 20,42±1,68 %, що вірогідно менше за контрольні показники. Пригнічення СМС супроводжувалось виразним збільшенням КВР литкового м’яза на 79,43±6,8 % та 70,21±6,9 %, відповідно. Вплив L-NMMA на споживання кисню та КВР скелетного м'яза в наших експериментах співпадає з даними, які були отримані на ізольованому серці [Сагач В.Ф. та ін., 2000]. Зсув співвідношення сила - КВР вниз та вправо вказує на те, що при попередньому введенні L-NMMA істотно зменшується ефективність використання кисню працюючим литковим м’язом (рис. 2.).

Отже, пригнічення NOS за допомогою L-NMMA, призводило до пригнічення СМС та істотного зменшення ефективності використання кисню працюючим литковим м’язом. Таким чином, NO у фізіологічних дозах реалізує позитивний інотропний вплив на скорочувальну активність скелетного м’яза, а також оптимізує кисневі параметри роботи, збільшуючи ефективність використання кисню працюючим литковим м’язом. Щоб ще раз підтвердити це ствердження в наступній серії експериментів, ми пригнічували активність NOS за рахунок інших механізмів.

Показано, що пригнічення синтезу NO відбувається в результаті оксидативних пошкоджень конститутивних ізоформ NOS [Flavahan N.A., 1992; Weiss J.N. et al., 2003]. Також відомо, що активність Са2+-залежних конститутивних ізоформ NOS пригнічується під впливом високих доз NO, під час активації iNOS, яка супроводжується генерацією вільних радикалів. Тому, в наступній серії експериментів ми використовували активатор МП ФАО, який спричиняє підвищення рівню Са2+ та оксидативний вибух у клітині [Korge P. et al., 2001]. В наших експериментах відкриття МП і розвиток оксидативного стресу під дією ФАО призводили до вірогідного падіння амплітуди функціональної гіперемії. Концентрація МФ, зареєстрована у відтікаючій від м’яза крові в цих експериментах, була близькою до отриманої в умовах ішемії/реперфузії серця [Надточий С.М. та ін., 2003], і свідчила про значну активацію МП. Одночасно було зареєстроване зменшення СМС та ефективності використання кисню працюючим м'язом (рис. 3.). Таким чином, активація МП та розвиток оксидативного стресу під дією ФАО супроводжувались пригніченням ендотелій-залежної реакції функціональної гіперемії, а також вірогідним зменшенням СМС та ефективності використання кисню працюючим скелетним м'язом під час його електричної стимуляції. Слід підкреслити, що виразність падіння досліджуваних показників в цій серії експериментів була більшою, ніж в експериментах з попереднім введенням L-NMMA.

З літератури відомо, що NO у малих фізіологічних дозах зменшує чутливість МП до впливу її активаторів [Beresewicz A. et al., 2004; Bolli R. et al., 1997]. Тому, в наступній серії експериментів перед введенням активатора МП ми робили повільну інфузію донора NO НН. Попереднє введення НН попереджало або значно зменшувало ступінь активації МП, що було підтверджено значним зменшення концентрації МФ в сироватці крові, відтікаючої від працюючого м’яза (рис. 4.). В свою чергу це сприяло збереженню відповідного рівня кровопостачання працюючого м'яза, усувало різке пригнічення СМС. Так, при стимуляції з частотою 8 Гц СМС була на 46,6±3,8 %, а при 40 Гц – на 85,7±8,1 % вищою, ніж у попередній серії дослідів (р0,01). В цих умовах ми реєстрували значно більшу СМС при менших значеннях КВР, ніж в експериментах з поодиноким введенням активатору МП ФАО. Отже, при попередньому введенні НН ефективність використання кисню працюючим литковим м'язом достовірно зростала (рис. 3.) про це свідчив зсув співвідношення вліво і вверх.

Таким чином, попереднє введення НН ефективно попереджало активацію МП та розвиток оксидативного стресу під дією ФАО, що в свою чергу сприяло збереженню адекватного кровопостачання працюючого м'яза, усувало різке пригнічення СМС та зниження ефективності використання кисню працюючим м'язом. Отже, вплив НН, як екзогенного донора NO, носив виражений протекторний характер.

Роль активації та пригнічення синтезу монооксиду азоту у регуляції показників регіонарної гемодинаміки, силових та кисневих параметрів роботи литкового м’яза собаки в умовах моделювання м’язового втомлення.

За літературними даними та результатами, отриманими в наших експериментах, відкриття МП супроводжується пригніченням, як параметрів кровопостачання та скорочувальної активності м’язів, так і кисневих параметрів роботи органу [Надточий С.М. та ін., 2003; Сагач В.Ф. та ін., 2000; Weiss J.N. et al., 2003]. В той же час, ще в класичних роботах з фізіології втомлення відзначалось, що втомлення скелетного м’яза це перш за все виразне пригнічення силових та кисневих параметрів його роботи [Фольборт Г.В., 1962]. Аналіз цих даних дає змогу припустити, що відкриття МП може приймати участь у розвитку втомлення скелетного м’яза.

В ході моделювання м’язового втомлення ми встановили, що сила скорочення литкового м’яза впродовж стимуляцій в контрольній серії експериментів прогресивно знижується (рис. 5. А.). На п’ятій стимуляції зниження СМС, порівняно з вихідними показниками, було настільки виразним (40±2,9%), що можна було говорити про розвиток втомлення литкового м’яза. Слід зазначити, що за літературними даними про втомлення скелетного м’яза свідчить зменшення СМС більш ніж на 30% від вихідного рівня. Протягом наступних стимуляцій скорочувальна активність литкового м’яза прогресивно зменшувалась. Після п’ятої стимуляції ми зареєстрували в сироватці крові, відтікаючої від працюючого м’яза, значну концентрацію МФ, що свідчило про відкриття МП (рис. 6). Отриманні дані збігаються зі спектрофотометричними показниками, які ми реєстрували раніше за умов ішемії/реперфузії серця, чи застосування хімічного активатора МП ФАО [Надточий С.М. та ін., 2003]. Попереднє застосування селективного блокатору активації МП циклоспорину А в умовах моделювання втомлення литкового м’яза призводило до значного зменшення амплітуди оптичної густини поглинання сироватки з 0,272±0,02 до 0,012±0,007. Дані цих експериментів переконливо доводять, що зареєстроване нами в контрольних умовах збільшення амплітуди оптичної густини після п’ятої стимуляції литкового м’яза є МП-залежним. Різке та виразне пригнічення скорочувальної активності литкового м’яза під час моделювання втомлення супроводжувалось значним підвищенням КВР м’яза (більше ніж в 2,5 рази), відносно вихідного рівня. Співвідношення СМС та КВР литкового м’яза під час моделювання м’язового втомлення свідчило про значне зменшення ефективності використання кисню працюючим литковим м’язом при розвитку його втомлення (рис. 7. А.). Отримані дані збігаються з результатами наших попередніх досліджень, в яких було зареєстровано виразне пригнічення СМС та значне підвищення КВР литкового м’яза при попередньому введені активатора МП ФАО. Для того, щоб ще раз продемонструвати роль відкриття МП у розвитку втомлення литкового м’яза ми провели наступну серію експериментів з використанням інгібітору відкриття МП мелатоніном [Andrabi S.A. et al. 2004]. Примедікація мелатоніном значно зменшувала чутливість МП до дії негативних чинників при тривалому м’язовому скороченні та ефективно пригнічувала її відкриття протягом навантаження м’яза і тому попереджала розвиток втомлення литкового м’яза. При цьому не відбувалось такого різкого та значного пригнічення СМС (рис. 5. Б.). Так, після п’ятої стимуляції СМС зменшувалась лише на 15±1,3% порівняно з вихідними показниками, а під час десятої стимуляції падіння СМС складало лише 20,5±1,8% від вихідного рівня, тоді як в контрольних умовах цей показник становив 43±2,3% (р0,01). Таким чином, серія з десяти електричних стимуляцій на фоні примедікації мелатоніном не викликала втомлення литкового м’яза. Співвідношення СМС та КВР литкового м’яза під час моделювання м’язового втомлення на фоні дії мелатоніну свідчило про більш високу ефективність використання кисню працюючим литковим м’язом в цих умовах, ніж в контролі (рис. 7. А.).

Дані, отримані при спектрофотометричному вимірюванні проб сироватки крові, зібраних зі стегнової вени в цих умовах, свідчать про значне зменшення концентрації МФ (рис. 6.). Збільшення оптичної густини поглинання в цій серії експериментів становило лише 0,0160,008, що в 17 разів менше, ніж в контрольних умовах (р0,001). Таким чином, одержані результати свідчать про те, що при попередньому введені мелатоніну під час моделювання м’язового втомлення не відбувалось відкриття МП. Одержані результати свідчать, що відкриття МП може відігравати провідну роль у розвитку втомлення скелетного м’яза, спричинюючи прогресивне зменшення СМС та падіння ефективності використання кисню працюючим скелетним м’язом. Мелатонін, пригнічуючи чутливість МП до відкриття, ефективно попереджав падіння СМС та зменшення ефективності використання кисню працюючим литковим м’язом під час його тривалого навантаження.

Останнім часом в літературі з’явились роботи, які вказують на можливість NO-залежної модуляції чутливості МП до дії активуючих факторів [Balakirev M. et al., 1997; Brown G.C., 1999; Brookes P. et al., 2003]. Наші попередні дослідження свідчать, що фізіологічні концентрації NO в умовах цілісного організму попереджають відкриття МП, підвищують силу скорочень скелетного м’яза та ефективність використання кисню працюючим м’язом. Тому, ми провели наступні дві серії експериментів з моделюванням м’язового втомлення в умовах блокади NOS та при застосуванні донору NO.

Попереднє введення інгібітору NOS L-NMMA призводило до виразного зменшення амплітуди функціональної гіперемії. Зменшення кровопостачання працюючого м’яза супроводжувалось виразним пригніченням СМС. Так, сила м’язових скорочень на першій стимуляції становила лише 3,66±0,18 Н/кг, що значно менше, ніж в контрольних умовах (р0,001). Близькі за значенням результати були зареєстровані в розділі з поодинокою стимуляцією литкового м’яза на фоні дії L-NMMA. Пригнічення скорочувальної активності литкового м’яза в умовах блокади синтезу NO супроводжувалось різким підвищенням КВР м’яза (вихідні показники КВР більш ніж в 2,8 рази перевищують відповідні контрольні значення). Характер змін СМС та КВР м’яза в цій серії дослідів при моделюванні м’язового втомлення свідчив про критичне падіння ефективності використання кисню працюючим литковим м’язом, порівняно навіть з контрольними умовами (рис. 7. Б.). Проведення спектрофотометричного аналізу проб сироватки крові, зібраних зі стегнової вени після п’ятої стимуляції литкового м’яза на фоні дії блокатору NOS L-NMMA, показало наявність у пробах значної концентрації МФ, оптична густина поглинання сироватки крові збільшувалась на 0,220,02 (рис. 6.). Таким чином, одержані спектрофотометричні показники вказують на те, що втомлення литкового м’яза на фоні дії L-NMMA супроводжується відкриттям МП. Отже, блокада активності NOS істотно пригнічувала як вихідний функціональний стан литкового м’яза, так і потенціювала відкриття МП при подальшому м’язовому навантажені, що призводило до різкого та виразного зменшення СМС та ефективності використання кисню м’язом під час моделювання його втомлення.

В наступній серії експериментів перед стимуляцією литкового м’яза фармакологічно збільшували рівень NO шляхом введення його донору НН. Введення донору NO принципово змінювало динаміку змін СМС протягом тривалого навантаження литкового м’яза. В цій серії експериментів ми не реєстрували значного та прогресуючого пригнічення СМС. Так, після п’ятої стимуляції, сила скорочення м’яза зменшувалась лише на 14±1,93% порівняно з вихідними показниками, а під час десятої стимуляції падіння СМС складало лише 19±2,3% від вихідного рівня, що вірогідно менше, ніж в контролі (р0,001). Одержані результати свідчать про те, що примедікація НН попереджала виражене пригнічення СМС та розвиток втомлення литкового м’яза. Отримані результати якісно подібні даним, зареєстрованим в умовах попереднього введення блокатору відкриття МП мелатоніну. Також, примедікація НН попереджала різке підвищення КВР литковим м’язом протягом його навантаження. Спектрофотометричне вимірювання проб сироватки крові, зібраних зі стегнової вени після п’ятої стимуляції литкового м’яза на фоні дії НН показало, що МФ в пробах був практично відсутній (рис. 6.). Зареєстроване підвищення оптичної густини поглинання у сироватці крові становило лише 0,0120,001, що в 20 разів менше, ніж в контрольних умовах (р0,001). Отже, застосування нітропрусиду натрію та підвищення рівня NO сприяло пригніченню відкриття МП, що в свою чергу ефективно попереджало прогресуюче зменшення СМС та ефективності використання кисню працюючим литковим м'язом. При цьому втомлення скелетного м’яза не розвивалось.

Щоб довести коректність раніше отриманих результатів та виключити небажані наслідки штучно підвищеного рівня NO ми провели останню серію експериментів з використанням прекондиціонування [Beresewicz A. et al., 2004; Weiss J.N. et al., 2003]. Не зважаючи на якісну подібність гемодинамічних реакцій, силові параметри роботи м’яза в цій серії дослідів значно відрізнялись від контрольних реакцій. Так, після прекондиціонування не відбувалось такого різкого та істотного пригнічення скорочувальної активності литкового м’яза протягом навантаження, як в контролі. При цьому, СМС на п’ятій стимуляції зменшувалась на 12±1,3 %, а під час десятої стимуляції на 18±1,06 %, що вірогідно менше, ніж було зареєстровано в контролі (р0,01). При цьому КВР протягом навантаження литкового м’яза не підвищувалась так виразно, як в контрольних умовах. Співвідношення СМС та КВР литкового м’яза під час моделювання м’язового втомлення при попередньому прекондиціонуванні свідчило про вірогідно більшу ефективність використання кисню працюючим м’язом в цих умовах, ніж в контрольній серії дослідів (рис. 7. В.) Зареєстровані в цій серії дослідів силові та кисневі параметри роботи литкового м’яза свідчать, що в цих умовах втомлення м’яза не розвивалося.

Спектрофотометричні вимірювання проб плазми крові, зібраних зі стегнової вени після п’ятої стимуляції литкового м’яза при попередньому прекондиціонуванні показали, що концентрація МФ за цих умов дуже низька. Зареєстроване підвищення амплітуди оптичної густини поглинання у відтікаючій сироватці крові складало лише 0,0280,0018 (рис. 6.), що вірогідно менше ніж в контрольній серії експериментів та в умовах дії блокатору NOS (р0,001).

Таким чином, проведення прекондиціонування пригнічує активацію МП, а також попереджає виражене падіння СМС та зменшення ефективності використання кисню працюючим литковим м’язом протягом його навантаження.

ЗАКЛЮЧЕННЯ

В публікаціях останнього часу показано, що NO є паракринним фізіологічним регулятором клітинного дихання та енергогенезу [Brookes P. et al., 2003; Moncada S. et al., 2002; Brown G.C., 1999]. Проте, роботи, в яких досліджується вплив NO на кисневі параметри роботи скелетних м’язів представлені значно менше. Нажаль, більшість сучасних досліджень в цьому напрямку проведена лише in vitro, а отримані результати досить розбіжні.

Останнім часом з’явилась велика кількість робіт, які вказують на те, що NO може модулювати чутливість МП до дії індукторів, що в свою чергу зумовлює пригнічення або потенціацію відкриття МП [Bolli R. et al., 1997; Piantadosi C. et al., 2002; Taimor G. et al., 2000]. На нашу думку вплив NO на ефективність використання кисню працюючим органом реалізується за механізмами тісно пов’язаними з феноменом відкриття МП. В той же час, роботи в яких би досліджувався цей зв’язок відсутні. Існуючі дані, про вплив NO на чутливість МП до відкриття, отримані переважно на рівні ізольованих мітохондрій або клітин, зустрічаються поодинокі роботи, виконані на рівні ізольованих органів.

Нами був розроблений метод реєстрації відкриття МП in vivo по визначенню у відтікаючій від органу крові МФ, який за попередніми даними є маркером відкриття МП [Надточий С.М. та ін., 2003; Сагач В.Ф. та ін., 2003]. Таким чином, ми дістали змогу дослідити зв’язок між рівнем NO і відкриттям МП та ефективністю використання кисню працюючим скелетним м’язом, на рівні цілісного організму.

Пригнічення NOS за допомогою L-NMMA, призводило не лише до очікуваних порушень регіонарної гемодинаміки, а також до пригнічення СМС та істотного зменшення ефективності використання кисню працюючим литковим м’язом. В той же час, активація МП та розвиток оксидативного стресу під дією ФАО супроводжувались ще більш виразним пригніченням ендотелій-залежної реакції функціональної гіперемії, зменшенням СМС та ефективності використання кисню працюючим скелетним м'язом, ніж при попередньому введенні блокатору NOS L-NMMA. Зміни гемодинамічних реакцій, силових та кисневих параметрів роботи литкового м’яза при індукованому ФАО відкритті МП якісно подібні до результатів експериментів з попереднім введенням L-NMMA та можуть вказувати на те, що NO-залежна регуляція силових та кисневих параметрів роботи скелетного м’яза може реалізуватися за рахунок модулюючого впливу NO на чутливість МП до дії індукторів. Це ствердження підтверджують результати, які були отримані в дослідах з послідовним введенням донору NO НН та ФАО. Так, попереднє введення НН ефективно попереджало активацію МП та розвиток оксидативного стресу, які індукуються ФАО, що в свою чергу сприяло збереженню адекватного кровопостачання працюючого м'яза, усувало різке пригнічення СМС та зниження ефективності використання кисню працюючим м'язом. Про тісний зв’язок між NO-залежною регуляцією силових і кисневих параметрів роботи скелетного м’яза та модуляцією чутливості МП до дії активаторів свідчать дані, отримані при моделюванні м’язового втомлення. В цих дослідах було показано, що відкриття МП може бути одним із основних чинників розвитку втомлення скелетного м’яза. В той же час, втомлення литкового м’яза супроводжувалось виразним пригніченням СМС та істотним зменшенням ефективності використання кисню працюючим м’язом. Виключну роль відкриття МП у механізмах розвитку м’язового втомлення доводять результати експериментів з використанням селективного блокатору відкриття МП циклоспорину А та антиоксиданту і блокатору активації МП мелатоніну. Примедікація мелатоніном значно зменшувала чутливість МП до дії індукторів та пригнічувала її відкриття протягом тривалого навантаження м’яза, що попереджало розвиток втомлення литкового м’яза. При цьому не відбувалось такого різкого та значного пригнічення СМС та зменшення ефективності використання кисню працюючим м’язом, як в контрольних умовах. Таким чином, серія з десяти електричних стимуляцій на фоні примедікація мелатоніном не викликала втомлення литкового м’яза. Літературні дані та результати наших попередніх досліджень вказують на існування NO-залежної модуляції чутливості МП до дії активуючих факторів [Bolli R. et al., 1997; Piantadosi C. et al., 2002; Taimor G. et al., 2000]. На користь цього свідчать результати експериментів, з моделюванням м’язового втомлення при різному рівні NO: в умовах блокади NOS та при застосуванні донору NO. Так, при блокаді синтезу NO відбувалось відкриття МП, що супроводжувалось різким зменшення робочої гіперемії, пригніченням СМС та виразним падінням ефективності використання кисню працюючим литковим м’язом. Слід зазначити, що на фоні дії L-NMMA навіть вихідні силові та кисневі показники роботи литкового м’яза свідчили про значно гірший функціональний стан скелетного м’яза, порівняно з контролем. При подальшому навантаженні литкового м’яза сила м’язових скорочень та ефективність використання кисню пригнічувались ще в більшій мірі – розвивалось виразне втомлення м’яза. В той же час, попереднє введення нітропрусиду натрію попереджало відкриття МП, істотно збільшувало рівень перфузії кров’ю працюючого м’яза, запобігало виразному падінню СМС, а також різкому зменшенню ефективності використання кисню працюючим литковим м’язом. При цьому втомлення скелетного м’яза не розвивалось. З літератури відомо, що прекондиціонування є ефективним нефармакологічним інгібітором активації МП. В основі фізіологічних механізмів реалізації ефекту прекондиціонування полягають короткотривалі гіпоксичні стимули, які призводять до збільшення експресії конститутивних ізоформ NOS та підвищення рівня ендогенного NO. Результати дослідів, отримані в серії з прекондиціонуванням свідчать, що аутентичний NO пригнічуючи відкриття МП, попереджав зменшення ефективності використання кисню працюючим м’язом та запобігав розвитку втомлення литкового м’яза. Щоб остаточно довести роль відкриття МП у NO-залежних механізмах регуляції силових та кисневих параметрів роботи скелетного м’яза ми провели кореляційний аналіз між величиною МФ та значеннями СМС і КВР литкового м’яза, які були зареєстровані в умовах стимуляції та пригнічення активності NOS. Отримані високі значення коефіцієнту кореляції (r=-0,89; r=0,72, відповідно) переконливо свідчать про справедливість наших висновків. В той же час, ці дані вказують на те, що величина оптичної густини поглинання сироватки крові, яка відображає концентрацію МФ, може використовуватись, як надійна прогностична ознака порушення функціонального стану працюючих м’язів в фізіологічних та патологічних умовах.

ВИСНОВКИ

1.

2.

3.

4.

5.