КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

Болсунова Ольга Ігорівна

УДК 615.2:612.017+573.3

ІМУНОМОДУЛЮЮЧІ ВЛАСТИВОСТІ ПРОТИВІРУСНОГО ПРЕПАРАТУ

ІЗАТІЗОН

03.00.09 – імунологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації

на здобуття вченого ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ - 2004

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Інституті молекулярної біології і генетики НАН України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор

Малижев Вадим Олексійович,

завідувач лабораторії клінічної імунології Укр. НПЦ ендокринної хірургії і трансплантації ендокринних органів і тканин МОЗ України

Науковий консультант: кандидат медичних наук, доцент

Потопальський Анатолій Іванович,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, завідувач лабораторії модифікації структури біологічно активних речовин

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Гавриленко Тетяна Іллівна, Інститут кардіології

ім. М.Д. Стражеска АМН України, керівник

відділу імунології,

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Галазюк Людмила Веніамінівна, Інститут педіатрії, акушрства і гінекології АМН України, лабораторія імунології.

Провідна установа: Національний медичний університет ім.О.О.Богомольця.

Захист дисертації відбудеться „28” вересня 2004р. о 14.00 годині на

засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: 03127, м.Київ, проспект Глушкова, 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд.433 (конференцзал)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розіслано „20” серпня 2004р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук О.В.Молчанець

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИТКА РОБОТИ

Актуальність теми. Необхідність посилення боротьби з інфекційними хворобами постійно зростає, що ставить завдання розширення арсеналу противірусних засобів та вивчення механізмів їхньої дії. Останнім часом спалахи багатьох вірусних хвороб набувають загрозливого характеру і виходять на одне з чільних місць з-поміж захворювань людини та тварин [Покровский В.В. 1996]. Так, наприклад, антитіла до вірусу простого герпесу типу 1 і 2 (ВПГ 1 та ВПГ 2) виявляються у 98-100% дорослого населення [Baichwal V.R., 1988]. За літературними даними [Hill J.M., 1990р. та ін.] ВПГ уражає 30-40% населенння в другій половині життя, а смертність від герпетичної вірусної інфекції стоїть на другому місці після грипу як причина смерті від вірусних інфекцій і складає 15,8% [Степанчук В.А., 2002].

Для успішної боротьби з інфекційними хворобами необхідні противірусні препарати, які б не зашкоджували життєдіяльності самої клітини і мали, окрім того, імуномодулюючу дію. Попри те, що існуючі противірусні препарати мають низку позитивних властивостей, пошук ефективних хіміотерапевтичних засобів для лікування та профілактики вірусних інфекцій триває у зв’язку з тим, що віруси набувають стійкості до препартів, що використовуються на практиці. Це актуалізує подальші дослідження різноманітних як природних, так і синтезованих речовин на наявність противірусної активності та імуномодулюючої дії. Як правило, пошуки синтетичних лікарських препаратів противірусної дії проводили серед різноманітних органічних сполук з противірусною активністю [Альберт А., 1971, Першин Г.Н., 1973]: це неприродні нуклеозиди, похідні бензимедазолу, циклічні аміни, тіосемикарбазони, карбонільні сполуки та ін. По суті, сучасна хіміотерапія базується, на використанні метаболітного ефекту аналогів нуклеозидів та противірусного ефекту похідних адамантину [Поляк Р.Я., 1986].

За останні десятиріччя виконано чимало робіт, присвячених створенню та вивченню нових противірусних препаратів [Hozein Z.A., 1997], Серед них похідні ізатіну, зокрема N-метил-ізатін-?-тіосемикарбазон (ІВТ), або метисазон та його похідні. Згадані сполуки мають широку противірусну дію in vitro в дозах, які в 100-1000 разів нижче від токсичних. Вони пригнічують розмноження як ДНК- так і РНК-вмістних вірусів (аденовіруси, герпесвіруси, поксвіруси, параміксовіруси, віруси грипу типів А та В та ін.) і, що дуже важливо, розмноження ретровірусів.

Попри це, препаратів із похідних ізатінтіосемикарбазонів, які б могли застосовуватися у клінічній практиці, бракує, а роботи з їх вивчення, головним чином, були спрямовані на досліждення біохімічних та молекулярних аспектів противірусної та протибактеріальної дії. Дослідження їхнього впливу на імунну систему майже не проводилися і це пов’язано, на наш погляд, з низькою розчинністю цих речовин воді.

А.І. Потопальський зі співавторами у 1980 р. відкрили можливість одержати розчинну форму метисазону на основі застосування суміші розчинників поліетиленгліколю та диметилсульфоксиду, і розчинна форма препарату одержала назву ізатізон. Це відкрило широкі можливості для вивчення інших біологічних активностей похідних ізатіну, включаючи їхню дію на морфо-функціональний стан імунної системи. На жаль, цей аспект проблеми залишився майже не вивченим.

Таким чином, актуальність дисертаційної роботи обумовлена необхідністю створення та вивчення на основі вищезазначених сполук нових ефективних противірусних препаратів широкого спектру дії з імуномодулюючими властивостями. Безумовно, такий напрямок досліджень дасть можливість поповнити ветеринарну та клінічну медицину України новими засобами. Окрім цього, такі дослідження розширять наше розуміння особливостей противірусної дії препарату.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота відповідає планові наукових досліджень лабораторії модифікаціїї структури біологічно активних речовин Інституту молекулярної біології та генетики НАН України. Вона виконувалася в рамках Державної науково-технічної програми 01.07 “Розробка та вдосконалення методів та засобів захисту населення від найбільш розповсюдженних інфекціїних захворювань” за темами “Синтез і вивчення молекулярних механізмів противірусного ефекту похідних ізатін-тіосемикарбазону на моделі аденовірусної інфекції” (шифр 1.07.01/003) та “Вивчення зв’язку між будовою і антивірусною дією похідних ізатізону (сполука №1) та амітозину (сполука №2) в системі вірус-клітина” (шифр 2.28.2.7.2.28.2.10).

Мета і завдання досліджень. Мета дослідження – охарактеризувати можливі імуномодулюючі властивості противірусного препарату ізатізон для розширення сфери його застосування у ветеринарній практиці і медицині.

Для її досягнення вирішували такі завдання:

Одержання препарату ізатізон та вивчення його структурних особливостей.

Вивчення противірусної дії ізатізону на моделі герпес-вірусної інфекції у мишей.

3. Визначити можливий вплив ізатізону на стан та функціонування специфічної системи імунітету.

4. Дослідити вплив ізатізону на прояви неспецифічних імунних реакцій.

5. Вивчити активність ізатізону щодо продуктивності курчат- бройлерів.

Об’єкт дослідження: механізми функціонування вродженого та специфічного імунітету; предмет дослідження – характер дії ізатізону на функціонування імунної системи у експериментальних тварин.

Методи дослідження: імунологічні, радіобіологічні, проточна цитофлуориметрія, спектрофотометрія. напівемпіричний квантово-хімічний метод АМ1 та МNDO/H, статистичний аналіз.

Наукова новизна одержаних результатів.

Вперше показано, що противірусний препарат ізатізон має виразні імуностимулюючі властивості, які проявляються у стимуляції утворення Т- і В-лімфоцитів, активації проліферації цих клітин та стимуляціі продукції ключових цитокінів – інтерлейкінів 1 та 2. Все це призводить до суттєвого підвищення здатності організму розвивати при антигенній стимуляції специфічні імунні реакції. Виявлено, що ізатізон відноситься до сполук з переважною дією на функціонування клітинної ланки імунітету і це може відзеркалювати доповнюючий механізм його противірусної активності.

Також вперше виявлено, що ізатізон посилює активність природних кілерів та макрофагів, тобто неспецифічних елементів імунної системи, які відіграють важливу роль в елімінації вірусів.

Вперше встановлено, що широкий спектр його біологічної активності можна пояснити конформаційно-лабільною структурою молекули метисазону – головного діючого компоненту ізатізону: в залежності від властивостей розчинника та мікрооточення вона може набувати різних конформацій, що забезпечує її проникнення до клітини.

Вказані імуномодулюючі властивості препарату можуть проявляти свою позитивну дію при застосуванні з метою профілактики вірусних захворювань курчат, що дає можливість не тільки підвищити їх загальну резистентність, але також сприяє зростанню продуктивності птахів.

Практичне значення одержаних результатів. Результати роботи можуть бути використані науковими закладами для подальшого вивчення імуномодулюючої дії ізатізону, який на даний час випробовується в лабораторiї контролю якості імунобіологічних препаратів Інституту епідеміології і інфекційних хвороб ім. Л.В.Громашевського АМН України саме у цього напрямку. Доцільно, на нашу думку, розпочати і клінічне випробовування препарату як імуностимулюючого агента при вірусних і бактеріальних інфекціях. У цьому відношенні він може бути використаний у ветеринарній практиці. Доцільність впровадження ізатізону у тваринництві України не викликає сумніву і підтверджується даними, які висвітлені у представленій роботі.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційну роботу виконано під керівництвом д.м.н.,проф. В.О.Малижева та наукового консультанта к.м.н.,доц. А.І. Потопальського. Здобувачем самостійо проведені дослідження впливу ізатізону на головні ланки імунної системи: проліферативну активність лімфоцитів, фагоцитоз, активність природних кіллерів, на експресію фенотипових маркерів лімфоцитів, на рівень реакції гіперчутливості сповільненого типу, продукцію лімфокінів ІЛ-1, та ІЛ-2, антитілопродукуючі клітини. Основний об’єм експериментальної роботи, обробка і аналіз отриманих результатів, формулювання висновків дисертаційної роботи виконані пошукачем у творчому співробітництві із науковим керівником, консультантом та співавторами наукових праць. Частину експериментів з вивчення антивірусної дії ізатізону на моделі герпесвірусної інфекції ВПГ 1 виконано у співробітництві з д.м.н., зав.лаб. контролю якості імунобіологічних препаратів НДІЕіІХ ім. Л.В.Громашевського АМН України С.Л.Рибалко. Усі дослідження проводилися за безпосередньої участі пошукувача. Конформаційний аналіз молекули метисазону препарату ізатізон виконано у співробітництві з д.б.н. професором Д.М.Говоруном. Дисертант висловлює щиру подяку д.м.н., зав лаб. С.Л.Рибалко і д.б.н., професору Д.М.Говоруну за співробітництво і корисні поради.

Апробація результатів роботи. Матеріали дисертації доповідалися на 1 Національному конгресі України з імунології, алергології та імунореабілітації, Алушта, Крим, 13-15 травня 1998р, Міжнародному симпозіумі “Intracellular Signaling in Plant and Animal Systems” (ISPAS), Київ, 9-14 вересня 2001р., VII міжнародній науково-практичній конференції „Проблеми ветеринарного обслуговування дрібних домашніх тварин”, 2-5 жовтня 2002 р., Київ, IV міждисциплінарній науково-практичній конференції „Епідеміологія, імунопатогенез, діагностика, лікування хламідіозу та TORCH-інфекцій”, 25-27 листопада 2002 р., Київ та на наукових семінарах відділу модифікації структури біологічно активних речовин ІМБіГ НАНУ.

Публікації. Основні положення дисертаційної роботи опубліковано в 11 наукових публікаціях (7 статей і 4 тез) у фахових вітчизняних журналах та збірках матеріалів з’їздів і конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 129 сторінках. Вона складається зі вступу, 6 розділів, висновків та списку використаних джерел, який нараховує 187 найменувань, містить 16 рисунків та 17 таблиць. Робота поділяється на три тематичні частини: розділ 3 присвячено структурно-функціональним особливостям молекули ізатізону, роділ 4 – протигерептичній дії ізатізону при герпесвірусній інфекції, і 5 розділ - впливу препарату на специфічну та вроджену ланки імунітету. Одержані результати узагальнено у 6-ому розділі.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали і методи досліджень. Експериментальнi дослiдження проводили на базі лабораторії модифiкацiї структури бiлогiчно активних речовин ІМБіГ НАН України. Окремi дослiдження проводилися в лабораторiї контролю якості імунобіологічних препаратів НДІЕіІХ ім. Л.В.Громашевського АМН України.

Пiд час роботи використовували iзатізон, виготовлений в умовах лабораторії МСБАР ІМБіГ НАН України.

В дослідах використовували експериментальних мишей ліній СВА, Balb/c, C57B1/6, (CВАхС57Bl/6)F1 із віварію ІМБіГ НАН України, курчат Бройлерів-6 із Білоцерківської птахофабрики. Об’єм та методи дослідження наведено у таблиці 1.

Таблиця 1

Об’єм та методи дослідження

Характер дослідження

-Об’єкт дослідження-Методи дослідження

Вивчення структурно- конформаційних особливостей молекули ізатізону -Молекула діючої речовини ізатізону-Напівемпіричні квантово - хімічні методи АМ1 та МNDO/H

Вивчення антивірусної дії ізатізону на моделі герпес віруса ВПГ-1.-Культура клітин Vero in vitro, білі безпородні миші in vivo (100 гол.) - Індекс ефективності препарату обчислювали за летальністю тварин

Визначення відносного процентного вмісту регуляторних субпо-пуляцій Т-лімфоцитів-Донорська кров, лімфоцити мишей лінії СВА -Проточна цитофлуориметрія

(БебешкоВ.Г., 1993)

Вивчення впливу ізатізону на функціональну активність лімфоцитів -Лімфоцити мишей лінії СВА in vitro та in vivo, (100 гол.), донорська кров in vitro-РБТЛ (радіометричий, Чумак А.А., 1998, колориметричний, Mosmsn T. 1983)

Вивчення впливу ізатізону на продукцію ІЛ-1.-Стимульовані макрофаги мишей лінії(CBAxС57Bl/6)F1 та тимоцити мишей in vitro-Двоступеневий радіометричний метод (за рівнем проліферації тимоцитів при додаванні надосаду з культури макрофагів)

Вивчення впливу препарату на продукцію ІЛ-2. -Спленоцити мишей лінії Ваlb/c in vitro-На культурі ІЛ-2 залежної лінії клітин СТLL-2 (CD8+-клітини) (колориметричий) (Jillis.S, 1978)

Визначення впливу препарату на рівень антитілогенезу до еритроцитів барана -Mиші (CВАхС57Bl/6)F1

in vivo (36 гол.)-Реакція локального гемолізу в гелі за Єрне

Вивчення впливу препарату на розвиток стану ГСТ -Миші лінії CBA in vivo

(50гол.)-Реакція збільшення лімфовузлів

(Lagrande P.H., 1974)

Вплив ізатізону на фагоцитарну активність-Макрофаги мишей Ваlb/c, С57Bl/6, донорська кров in vitro (CВАхС57Bl/6)F1, CВА in vivo (50 гол.)-НСТ- тест (колориметричний) та метод тест-мікроба

(Muller F., 1989, Пастер Е.У., 1989)

Вивчення впливу препарату на цитоток-сичність ПК-Донорська кров, миші лінії СВА in vitro, Ваlb/c in vivo (50гол.)-Кілінг (радіометричий)

(Зарецкая Ю.М., 1983)

Вивчення впливу аерозолю ізатізону на деякі показники імунобіологічної реактивності організму курчат. Вплив на продуктивність птахів-Курчата „Бройлер-6”

38 гол.-Лізоцимна активність сироватки крові (серійні. розведення), РБТЛ, синтез РНК і ДНК (атомно-адсорбційна хроматографія). Приріст живої маси курчат (Пастер Е.У., 1989,

Климов Н.В, 1970)

Культури клiтин еритроміелоїдної лінії К-562, лімфосаркоми щурів ЛСК одержані з клітинного банку ліній з тканин людини та тварин (науковий керівник д.б.н. Ю.Й.Кудрявець, Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.С. Кавецького НАН України). Культуру клітин Vero (клітини нирки зеленої мавпи), міелолейкозні клітини мишей СТLL-2 та JAK-1 люб’язно надані Іінститутом біоорганічної хімії ім. М.М. Шемякіна РАН).

Результати дослідження та їхне обговорення

Аналіз структурно-конформаційних особливостей метисазону та прототропної таутомерії ізатіну.

Ізатізон – це 2%-й розчин 1-метилізатін-?-тіосемикарбазону (метисазону) в універсальному розчиннику, до складу якого входять: димексид і поліетиленгліколь-400 у співвідношенні 1:3, виготовлений в умовах лабораторії МСБАР ІМБіГ НАНУ (патент України №1780, 1994, ТУ У 46.15 -341-98) Для розуміння біологічних механізмів дії ізатізону необхідно було дослідити структурно-конформаційні характеристики його діючої молекули – метисазону (рис.1).

Рис. 1. Конформації молекули метисазону за даними напівемпіричного квантово-хімічного методу АМ1. Пунктирними лініями зображено внутрішньомолекулярні Н-зв’язки. Для дзеркально-симетричних пар III, IV і VI, VII подано лише одну конформацію. Позначення: ?E – відносна енергія, ккал/моль; d– дипольний момент.

Встановлено, що локальним мінімумам гіперповерхні потенціальної енергії метисазону відповідають чотири планарних конформації (одна з яких є основною). Вперше встановлено шляхи та енергетику утворення високоенергетичних конформацій з основної. Це взаємоперетворення характеризується доволі високим бар’єром (близько 47 ккал/моль), оскільки конформаційний перехід супроводжується значними стеричними ускладненнями.

Звертає на себе увагу структурно-динамічна особливість молекули метисазону – її структурна „м'якість”: про це свідчить наявність чотирьох низьких частот фундаментальних коливань – 39, 46, 69 і 81 см-1 - у її коливальному спектрі. Очевидно, структурна „м'якість” поряд з конформаційними можливостями, а також здатність вступати у міжмолекулярні Н-зв’язки лежать в основі біологічної активності метисазону. Можна припустити, що саме наявність специфічного розчинника у складі ізатізону переводить молекулу із енергетично найвигіднішої конформації у високоенергетичну „робочу”, тобто біологічно активну.

Якісний стереохімічний аналіз молекули метисазону, свідчить про те, що він має п’ять молекулярних прототропних таутомерів. Прототропну таутомерію можна розцінювати як функціонально важливу форму структурної мінливості, яка, безумовно, використовується природою для функціональних потреб. Всі таутомери без винятку за даними розрахунків є планарними (симетрія Cs) структурами. Вперше розраховано геометричну структуру основної таутомерної форми ізатіну та деякі характеристики електронної структури, а саме – заряди на атомах. Ці параметри можуть виявитися корисними при з’ясуванні молекулярних механізмів біологічної активності в процесі взаємодії препарату з молекулярними мішенями.

Противірусна дія препарату ізатізон на моделі герпесвірусної ВПГ-1-інфекції.

Висока противірусна активність похідних тіосемикарбазонів може бути пов’язана саме з дією їх активних молекул, що ми і намагалися з’ясувати на моделі герпесвірусної інфекції, як такої, що легко відтворюється та має виразну симптоматику.

Вірус простого герпесу ВПГ-1 - облігатний внутрішньоклітинний паразит, який здатен до персистенції протягом всього життя людини в структурах центральної та периферичної нервової системи, а його репродукція в значній мірі залежить від метаболізму клітини-господаря. Таким чином, антивірусна програма лікування повинна бути спрямована на пригнічення реплікації вірусу та активацію противірусного імунітету. Основним критерієм ефективності лікування є зменшення важкості клінічних проявів хвороби.

Є всі підстави вважати, що ефективним противірусним засобом може виступати ізатізон. Саме тому ми вирішили випробувати дію цього препарату на перебіг герпесвірусної інфекції. При цьому ми вивчали дію ізатізону як in vitro, так і in vivo.

Встановлено, що максимально переносима концентрація на культурі клітин Vero становить 20 мкг/мл, мінімально активна концентрація визначена в межах 0,8 мкг/мл, а хіміотерапевтичний індекс для ізатізону становить 25,0.

Окрім того, вивчали профілактичну та лікувальну дію ізатізону в системі in vivo. Для цього використовували безпородних білих мишей. У першому дослідженні тваринам вводили ізатізон за 24 години до зараження вірусом герпесу одноразово по 0,25 мл внутрішньочеревинно (або 25 мг\кг маси тіла мишей). Ефект препарату оцінювали за летальністю тварин, а його дію порівнювали з дією віролексу, як визнаного засобу лікування герпесу. Встановлено, що ізатізон не володіє профілактичним захисним ефектом. Проте раннє лікування (через 24 год після зараження) ізатізоном мишей у дозі 25 мг/кг маси тіла має лікувальний ефект. Кратність захисту становила 2,0, і вона була практично ідентичною такій у віролекса. Зменшена доза препарату – 8 мг/кг виявилася ефективнішою при лікуванні: показник кратності захисту ізатізону значно підвищився, він досяг значення 3,5 (табл. 2)

Таблиця 2

Лікувальна дія ізатізону при герпесвірусній інфекції (через 24 год після зараження)

Препарат Доза, мг/кг Кількість мишей Із них

загинуло Летальність, % Кратність захисту Індекс ефективності

Ізатізон 8 14 4 28,0±2,77 3,5 71,3±7,05

Плацебо 14 14 100,0±0,01 - -

Віролекс 50 14 6 42,8±7,01 2,3 56.0±9,17

Препарат зменшував відсоток загибелі мишей від ВПГ-1 приблизно на 72%. Підкреслимо, що порівняльним препаратом був віролекс, коефіцієнт захисту якого дорівнював 2,3, ІЕ -56,0. Згідно критеріям оцінки активності антивірусної речовини за показниками індексу ефективності (ІЕ) для герпесвірусної інфекції, препарати, ІЕ яких переввищує 30% вважаються активними, а тим, які мають ІЕ 50% притаманна виразна ефективність. Досліджувані речовини у відповідності з МРІ-І, які мають ХТІ 8-16 та ІЕ 70% вважаються перспективними для поточних клінічних іспитів та детального токсико-фармакологічного вивчення. Отже, ізатізон являє собою ефективну противірусну лікарську форму з унікальним механізмом біологічної дії, яка може з успіхом використовуватися при лікуванні герпесвірусної інфекції та подальших наукових досліджень.

Дія ізатізону на специфічну систему імунітету. Вплив препарату на експресію фенотипових маркерів лімфоцитів. У дослідах використовували такі концентрації ізатізону, які за попередніми дослідженнями мали стимулюючий ефект: це дози 1 мкг/мл та 10 мкг/мл. При допомозі цитофлуориметра “FACScan” встановлено, що ізатізон достовірно підвищує у периферичній крові донорів кількість клітин з маркером Leu 23 (CD 69), який є специфічним маркером ранньої активації Т- і В-лімфоцитів, макрофагів та ПК-клітин людини (рис.2). Так, у дозі 1,0 мкг/мл ізатізон сприяв підвищенню відсотку відностної кількості цих клітин до 7,19 + 1,30% (р<0,05) проти 2,460,40% у контролі, а в дозі 10,0 мкг/мл – до 21,00 1,67% (р<0,001). Подібні результати одержано і в експериментах на мишах.

Рис.2. Вплив ізатізону і ОЛ-56 на експресію антигену Leu 23 (CD 69) лімфоцитами людини in vitro (у відсотках відносної кількості)

Лімфоцити мишей лінії СВА інкубували in vitro з препаратом в дозі 10 мкг/мл 17 год, після чого в суспензії визначали відсоток відносної кількості різних субпопуляцій Т лімфоцитів за такими маркерами, як Lit-1, Lit-2 та L3T4. Перші відносяться до клітин, які функціонально належать до Т-хелперів і Т-ефекторів гіперсенситивності сповільненого типу. Lit-2 клітини, головним чином, являють собою цитотоксичні Т-лімфоцити. L3T4+- лімфоцити відносяться до клітин з суто хелперною активністю.

Дані свідчать, що ізатізон в дозі 10 мкг/мл дійсно має властивість збільшувати кількість різних субпопуляцій Т-лімфоцитів (рис.3).

Рис.3. Вплив ізатізону на експресію Т-антигенних маркерів клітин перетонеального ексудату мишей лінії СВА.

Таким чином, проведені експерименти показали, що ізатізон, як і гормони тимусу, здатен індукувати диференціацію різних субпопуляцій зрілих у функціональному плані Т-лімфоцитів, що було підтверджено у дослідах, які викладені у наступних підрозділах.

Дослідження впливу препарату на проліферативну активность лімфоцитів. Реакція бласттрансформації розглядається як інтегральний тест на імунологічну реактивність. Саме тому ми провели дослідження дії ізатізону на проліферативну активність лімфоцитів in vivo та in vitro.

Експерименти проведені на лiмфоцитах мишей лiнiї СВА in vitro виявили мітогенну активність ізатізону, яка найбільш яскраво виявилася при застосуванні препарату в дозі 1 мкг/мл (р<0,001). Вищі і нижчі дози ізатізону, навпаки, пригнічували проліферативну активність лімфоцитів (100 мкг/мл відповідало 807±38 імп/хв, а 0,001 мкг/мл - 717±83 імп/хв, контроль - 2150±325 імп/хв, за включенням [3Н]-тимідину) У той же час ізатізон проявив пригнічуючий вплив на проліфертивну активність лімфоцитів в культурі, яка була стимульована такими мітогенами, як ФГА, КонА та ЛПС.

Введення ізатізону мишам викликає, особливо при застосуванні терапевтичної дози 10 мг/кг, збільшення спонтанної проліферації лімфоцитів селезінки (р<0,05), але як і у попередньому досліді при стимуляції цих клітин мітогенами ФГА, КонА та ЛПС відмічено пригнічення рівня згаданої реакції.

Таким чином, вищенаведені дані вказують на те, що в системах іn vivo та іn vitro спостерігається дозозалежна стимулююча дія препарату на проліферативну активність лімфоцитів.

Окремо проведено порівняльні дослідження дії ізатізону іn vitro на проліфертивну активність тимоцитів і спленоцитів мишей лінії СВА. Із даних досліду випливає, що ізатізону дійсно притаманна дозозалежна мітогенна активність як відносно тимоцитів, так і спленоцитів. Індекс стимуляції проліферації тимоцитів під впливом ізатізону в дозі 0,1 мкг/мл дорівнював 6,4 (р<0,01), що значно перевищувало цей показник при стимуляції оптимальними дозами ФГА, та майже дорівнював за цим параметром активності КонА. Спленоцити у цьому відношенні проявляли дещо іншу чутливість. Їх відповідь на оптимальні дози ізатізону і ФГА була практично ідентичною, але достовірно вищою у порівнянні з відповідью на Кон і ЛПС.

Отже, проведені дослідження виявили мітогенну активність ізатізону і саме ця обставина, можливо, відзеркалює його дію на мітогеніндуковану проліферцію лімфоцитів, оскільки відомо, що високі дози мітогенів викликають супресію бласттрансформації лімфоцитів в системі іn vitro.

Вивчення дії ізатізону на проліферацію імунних клітин проводили також на лімфоцитах периферичної донорської крові. Слід відмітити, що активні дози ізатізону у 5-20 разів нижче токсичних. В цьому дослідженні також виявлена дозозалежна відповідь лімфоцитів на препарат. Так дози препарату 1 мкг/мл і 10 мкг/мл майже втричі підвищували проліферацію лімфоцитів в культурі і в 1,6 рази перевищували відповідь лімфоцитів на ФГА (р <0,05).

Проте, таке явище відмічено не в усіх донорів. Ізатізон достовірно стимулював проліферативну активність лімфоцитів в дозі 10 мкг/мл у 6 донорів із 16 обстежених, у 5 донорів в концентрації 1 мкг/мл, і у 3 донорів - в концентрації 0,1 мкг/мл.

Із проведених досліджень можна зробити припущення, що існує індивідуальна чутливість людей до препарату.

Отже, результати цих експериментів підтверджують, що ізатізон має здатність індукувати проліферацію Т-лімфоцитів, які знаходяться на різних етапах дозрівання, що випливає з його дії на відповідь цих клітин на неспецифічні мітогени, такі як ФГА та КонА. З цих дослідів можна також зробити висновок про те, що стимулююча дія препарату розповсюджується не тільки на Т-лімфоцити, але і на В-клітини, оскілько ізатізон пригнічує проліферативну відповідь ЛПС-стимульованих лімфоцитів. Наявність у ізатізону дозозалежного впливу на рівень РБТЛ дозволяє розглядати його як імуномодулятор, який стимулює утворення лімфоцитів та збільшення їх кількості в периферичній крові та лімфоїдних органах.

Вплив ізатізону на продукцію інтерлейкіну-1. Для визначення впливу ізатізону на продукцію ІЛ-1 застосовували двоступеневий комітогенний тест, який базується на індукції ліпополісахаридом (ЛПС) продукції перитонеальними макрофагами ІЛ-1 та проліферації мишачих тимоцитів під впливом надосаду з макрофагів in vitro і субоптимальної дози мітогену ФГА [Дж. Клаус, 1990, Р.Г.Белевская, 2000].

З рисунку 4 видно, що інкубація макрофагів з ізатізоном призводить до підвищення активності надосаду, притаманній ІЛ-1, що і викликало посилення проліферативної активності тимоцитів при додаванні до їхньої культури надосаду з макрофагів.

Рис.4. Рівень проліферації тимоцитів мишей на субоптимальну дозу ФГА при додаванні надосаду культури

макрофагів.

Найбільш активною виявилася доза ізатізону 10 мкг/мл, при якій зафіксовано найвищу проліферативну активність тимоцитів (р<0,001). Доза 1 мкг/мл також стимулювала виділення ІЛ-1 макрофагами, але значно слабше, ніж доза 10 мкг/мл. Ізатізон в дозі 100 мкг/мл дещо пригнічувала синтез ІЛ-1 макрофагами. На відміну від ізатізону його аналог ОЛ-56 (5-ізатініл-2-S-карбоксіетил-меркаптотіазолін-2-он-4) чинив слабку індукуючу дію на синтез ІЛ-1 в усіх випробуваних дозах. Аналогічна картина для ізатізону спостерігається і на стимульованих ЛПС макрофагах, що правда, в цьому випадку доза 1 мкг/мл не викликала стимуляції продукції ІЛ-1. Аналог ізатізону – ОЛ-56 діяв на рівні контролю в усіх випробуваних дозах.

Отже, на основі одержаних даних можна дійти висновку, що ізатізон здатен стимулювати синтез ІЛ-1 макрофагами. Причому, ця дія ізатізону значно перевищує таку при додаванні в культуру його аналогу – ОЛ-56.

Вплив ізатізону на продукцію ІЛ-2. Визначення ІЛ-2 базується на його спроможності підтримувати ріст Т-клітинних ліній. Отже, вплив ізатізону іn vitro на продукцію ІЛ-2 Т-лімфоцитами селезінки мишей лінії Balb/c досліджували з використанням ІЛ-2-залежної лінії клітин СТLL-2. Аналізуючи дані з вивчення впливу кількох концентрації ізатізону і його аналогу ОЛ-56, відмітимо, що ізатізон у дозах від 0,1мкг/мл до 10,0мкг/мл індукував виділення цього медіатору (р<0,001). Ізатізон дозозалежно посилював продукцію ІЛ-2 лімфоцитами селезінки на фоні субоптимальної стимулюючої дози ФГА. Але на цій моделі виявилася також стимулююча дія препарату ОЛ-56. Для обох чинників характерна пряма дозова залежність впливу на активацію Тх-лімфоцитів.

Вплив ізатізону на генерацію антитілопродукуючих клітин (АПК.) При дослідженні впливу ізатізону на антитілопродукування (показник, який характеризує стан гуморального імунітету) in vivo у мишей лінії СВА, імунізованих еритроцитами барана, з’ясовано, що ізатізон не суттєво підвищував кількість АПК на чашку у випробуваних дозах: 1мг/кг (35,33,84 ) та 10мг/кг (31,05,5; контроль – 23,33,28). Кількість спленоцитів у селезінці мишей у досліді 20057,45±1264,5, у контролі - 16483,19± ±542,34.

Вплив ізатізону на розвиток стану гіперчутливості сповільненого типу (ГСТ). Реакція гіперчутливості сповільненого типу є важливим показником функціонального стану клітинного імунітету і часто корелює із здатністю Т-лімфоцитів давати проліферативну відповідь на Т-мітогени, а також з їх здатністю продукувати цитокіни [Петров Р.В., 2000]. Тому дослідження дії ізатізону та компоненту його розчинника на реакцію ГСТ сприятимуть з’ясуванню можливого стимулюючого впливу препарату на клітинний імунітет.

Дані досліду показують, що ізатізон стимулює рівень реакці ГСТ лімфоцитів, до того ж його стимулююча активність відмічена у всіх випробуваних дозах: 1 мг/кг, 10 мг/кг та 100 мг/кг Концентрація 10 мг/кг ефективно і достовірно стимулювала проліферативні процеси лімфоцитів у лімфовузлах у порівнянні з контролем: індекс реакції становив 2,8 ±0,08 (р<0,05). Компонент розчинника ПЕГ-400 у дозі 1,0 мг/кг дещо пригнічував інтенсивність реакції, а решта випробуваних доз впиву на реакцію не мала.

Таким чином, в цій реакції ізатізон проявив себе як імуномодулятор, що збігається із даними, які були одержані при вивченні дії ізатізону на фенотипові та функціональні зміни в популяції лімфоцитів.

Вплив ізатізону на неспецифічну ланку імунної системи. Вивчення впливу ізатізону на фагоцитоз. Одним із найважливіших критеріїв для відбору та вивчення препаратів, які мають властивість впливати на загальну резистентність організму, є їх стимулююча дія на імунну систему і, в першу чергу, на макрофагальну ланку. Дію ізатізону у широкому діапазоні різних концентрацій від 0,001 до 100 мкг/мл визначали in vitro на мишах лінії Ваlb/c. (Рис. 5)

Препарат у високій дозі (100,0 мкг/мл) дещо пригнічувував метаболізм клітин в НСТ-тесті (дослід- 0,2480,015; контроль – 0,3610.017), але в дозах 10,0 мкг/мл, 1,0 мкг/мл та 0,1 мкг/мл спостерігалося достовірне збільшення цього показника (0,7430,022, (р<0,05); 0,4760,007 (р<0,05); 0,5230,010 (р<0,001) - відповідно.

Рис.5 Метаболічна активність перитонеальних макрофагів мишей лінії Ваlb/c в НСТ- тесті під впливом ізатізону.

В дослідах in vivo мишам лінії СВА вводили ізатізон в дозі 100,0 мг/кг; 10,0 мг/кг та 1,0 мг/кг три дні поспіль, контрольним мишам вводили фізрозчин в дозі 0,05мл по тій самій схемі. Показано, що і за цих умов метаболічна активність перитонеальних макрофагів під впливом ізатізону суттєво активізувалася. Найефективнішою виявилася доза 10,0 мг/кг (0,7060,011, (р<0,05).

Дослідження впливу ізатізону на нейтрофіли периферичної крові людей хворих на хронічний ревмокардит проводили, використовуючи метод тест-мікроба. Дані свідчать про стимулючий вплив ізатізону щодо збільшення кількості фагоцитуючих макрофагів в дозі 10 мг/мл (90,30,33, контроль 57,253,03 р<0,001 ) та 1мг/мл (67,5 0,50, р<0,05), та підвищення поглинальної активності окремого макрофагу. Отже, проведенні дослідження виявили здатність ізатізону підвищувати інтенсивність фагоцитозу життєздатних бактерій людськими нейтрофілами.

Таким чином встановлено, що ізатізон впливає на всі ланки фагоцитарного процесу: підвищує поглинальну здатність фагоцитів, стимулює метаболічну активність та посилює виведення чужорідних часточок з кровотоку.

Вплив ізатізону на цитотоксичну активність природних кілерів (ПК). Природні кілери є головними клітинними ефекторами системи імунологічного нагляду. При вивченнні впливу ізатізону на кiлерну актив-нiсть ПK-лiмфоцитiв in vitro на мишах лінії СВА ми також відмітили стійку тенденцію препарату до стимуляції ефекторної функції ПК-клітин.

Дію ізатізону на активність ПК-лімфоцитів периферичної крові донорів ми вивчали у порівнянні з імуномодуляторами - рекомбінантними ?2- і ?-інтерферонами та ІЛ-2. Препарат in vitro має здатність підсилювати цитотоксичні властивості ПК-лімфоцитів периферичної крові донорів. Так, ізатізон в дозі 10 мкг/мл викликав стимуляцію цитотоксичної активності ПК на рівні ?2-інтерферону і перевищував дію ?-інтерферону. Його стимулюючий вплив на природні кілери всього на ~12% був нижчим від такого у рекомбінантного ІЛ-2 (р<0,001).

Для оцінки біологічної дії препарату проводили також дослідження in vivo доз 1,0 мг/кг. 10,0 мг/кг та 100,0 мг/кг на мишах лінії Balb/c. Мишам з контрольної групи вводили фізрозчин (рис.6). В дозі 100,0 мг/кг препарат пригнічує цитотоксичність ПК-клітин (дослід - 24,61,0 %; контроль - 31,01,0%), в дозі 10,0 мг/кг відмічено тенденцію до її підсилення приблизно на 13%. Доза ізатізону 1,0 мг/кг достовірно (р<0,01) стимулювала цитотоксичність ПК у порівнянні з контролем.

Рис.6. Цитотоксична активність природних кілерів мишей лінії Balb/с in vivo.

У дослідах in vitro на лімфоцитах мишей лінії СВА (рис. 7) ми також відмітили стійку тенденцію до стимуляції ізатізоном ефекторної функції ПК-клітин.

Рис.7. Цитотоксичність природних кілерів мишей лінії СВА in vitro.

Найефективішою виявилась концентрація 0,1 мкг/мл, де активація кілерної активності підвищилася у порівнянні з контролем.

Таким чином, як показали досліди, ізатізон стимулює активність ПK-клітин як в системі in vivo, так і in vitro. Така дія препарату аналогічна ефектам інтерлейкіну-2 та ?2-інтерферону, в усякому разі в системі in vitro. Беручи до уваги те, що ізатізон стимулює Т0 і Тх1 лімфоцити, можна думати, що виявлена дія ізатізону опосередковано пов’язана саме з продукцією ІЛ-2

Вивчення впливу аерозолю ізатізону на деякі показники імунобіологічної реактивності організму курчат. Вплив на продуктивність птахів. Як бачимо з вище наведених дослiдженнь, iзатізон сприяє функціонуванню всіх ланок імунної системи і профілактиці розвитку імунодефіцитних станів, а це може супроводжуватися зменшенням захворюваності та підвищенням продуктивності курчат. З метою вивчення дії iзатізону на імунобіологічну реактивність органiзму in vivo вибрали як модель 30-денних курчат „Бройлер-6”. Дослідну групу птахів обробляли аерозольно розчином ізатізону 2мг/м3, застосовуючи пристрій САГ-3, а контрольну - фізрозчином. Визначали вміст нуклеїнових кислот в органах імунної системи, вплив препарату на лізоцимну активність крові, та проліферативну активність лімфоцитів. Окрім того, в процесі експерименту проводили вимірювання приросту живої маси курчат.

Спонтанна пролiферативна актив-нiсть лiмфоцитiв периферичної кровi дослiдних курчат на 15 день експерименту достовiрно вища вiд такої контрольних (р<0,05). На 30-й день у оброблених iзатізоном птахiв проліферція лімфоцитів була приблизно на 20% вища вiд такої у контрольних. Слід зазначити, що на фоні ізатізону оптимальна доза ФГА пригнічувала пролiферативну активнiсть лiмфоцитiв

Препарат не впливав також на число АПК, проте зазначимо, що незначне збільшення числа цих клітин спостерігалося у дослідній групі (дослід - 22,01,49; контроль - 20,25 1,42). Це дає можливість зробити припущення, що ізатізон не впливає на функціонування В-системи імунітету курчат.

Дослідження впливу iзатізону на лiзоцимну активнiсть си-роватки кровi птахiв показало, що препарат як на 15-й, так i на 30-й днi експерименту достовiрно стимулював її підвищеня – на 15 день у 2,4 рази (р<0,001), а на 30-й днь – у 1,9 рази (р< 0,001).

Крім того встановлено, що ізатізон дос-товiрно стимулює синтез як РНК, так i ДНК тiльки в селезiнцi (р<0,001). У бурсі Фабриціуса препарат не викликав змін синтезу нуклеїнових кислот.

За нашими дослідженнями препарат сприяв збільшенню ваги тіла курчат: на 15 день дослiду збiльшилася жива маса курчат дослiдної групи (дослiд - 798,89+43,38, контроль 622,22+63,28; р<0,05), а на 30-й день експеримнту середня вага окремого дослiдного курчати переважала на ~133 г вагу конт-рольного (контроль - 1059,17+87,9; дослiд-1192,50+96,27).

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі представлено експериментальні і теоретичні узагальнення та практичне вирішення наукової задачі – виявлення нових властивостей противірусного препарату ізатізон, а саме - його здатності стимулювати неспецифічні фактори резистентності та специфічну ланку імунітету, що дає можливість використання препарату як самостійного імуномодулюючого засобу.

1. Молекула метисазону – головного діючого компоненту ізатізону є конформаційно-лабільною структурою, яка при застосуванні у якості розчинника суміші поліетиленгліколю і диметилсульфоксиду набуває найбільш високоенергетичного „робочого” стану, що полегшує проникнення препарату до клітини та лежить в основі проявів широкого спектру біологічної дії ізатізону.

2. Ізатізону притаманний високий противірусний ефект за герпесвірусної менінгоенцефалітної інфекції у мишей: при застосуванні його у хворих тварин в дозі 8мг/кг виживання мишей досягає ~ 72%, тоді як загибель тварин у контролі становила 100%.

3. Окрім противірусної активності ізатізон проявляє виразні імуномодулюючі властивості:

- у системі in vitro ізатізон в дозі 10 мкг/мл сприяє зростанню числа Т-лімфоцитів з фенотиповими ознаками хелперів в культурі спленоцитів та клітин перитонеального ексудату мишей.

- в культурі лімфоцитів in vitro ізатізон майже вдвічі збільшує кількості клітин, які експресують фенотиповий макркер їхньої активації - CD 69.

- ізатізон активує проліферацію Т- і В-лімфоцитів, в системі in vitro та in vivo.

- ізатізон достовірно стимулює синтез макрофагами інтерлейкіну-1 та синтез Т- лімфоцитами інтерлейкіну-2 в системі in vitro.

- у експериментах in vivo показано, що ізатізон стимулює формування стану гіперчутливості сповільненого типу, але недостовірно активує розвиток гуморальних реакцій імунітету, що вказує на переважну імуномодулюючу дію препарату щодо формування саме клітинних імунних реакцій.

4. Ізатізон є активатором неспецифічних факторів резистентності, що випливає з його стимулюючої дії на прояви метаболічної та фагоцитарної функції макрофагів, на активність природних кілерів і синтез лізоциму.

5. Аерозольна обробка ізатізоном курчат Бройлер-6 стимулює синтез нуклеїнових кислот в селезінці, підвищує проліферативну активність лімфоцитів крові, стимулює активність лізоциму крові та сприяєє підвищенню продуктивності курчат.

Практичні рекомендації.

1.Оскільки ізатізону, як противірусному засобу, притаманні також імуномодулюючі властивості, він може застосовуватися як самостійний імуномодулятор, особливо у випадках пригнічення неспецифічної ланки імунітету та Т-клітинних імунодефіцитних станів.

2.Ізатізон рекомендується застосовувати для профілактики і лікування інфекційних захворювань та підвищення продуктивності у птахівництві.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Заика Л.А., Болсу-нова О.И., Пацковский Ю.В., Рубашевский Е.Л Дядюн С.Т., Рыбалко С.Л., Потопальский А.И. Антивирусный препарат изатизон не обладает мутагенным действием и стимулирует пролиферацию клеток иммунной системы // Биополимеры и клетка.- 1995.- Т.11, № 5.- С.69-78.

Особистий внесок дисертанта – аналіз літератури, постановка задачі, проведення експериментів з визначення проліфетаивної активності лімфоцитів в РБТЛ, аналіз, інтерпретація отриманих результатів. Підготовка статті до друку здійснена разом зі співавторами.

2. Заїка Л.А., Потопальський А.I., Болсунова О.I, Волощук Т.П. Вплив антивiрусного та антилейкозного препарату iзатізон на резистентнiсть курчат // Ве-теринарна медицина України. – 1997. - №12. - С.6-7.

Особистий внесок дисертанта – проведення експериментів з визначення лізоцимної активності крові курчат, виділення лімфоцитів та визначення рівня їхньої проліферативної активності під впливом ізатізону. Аналіз одержаних результатів та їх інтерпретація виконані разом зі співавторами.

3. Заїка Л.А., Болсунова О.І., Потопальський А.І., Малижев В.О. Ізатізон впливає на цитотоксичну активність натуральних кілерів (НК) // Імунологія та алергологія. – 2002. - № 1. - С.43 – 45.

Особистий внесок дисертанта – постановка задачі, виділення лімфоцитів, проведення експериментів з визначення радіометричним та спектрофотометричним методами кілерної активності природних кілерів. Аналіз, інтерпретація отриманих результатів та підготовка статті до друку здійснена разом зі співавторами.

4. Заїка Л.А., Болсунова О.І., Потопальський А.І., Волощук Т.П., Юркевич Л.Н., Окунєв О.О., Малижев В.О., Сольська Т.В., Бебешко П.С. Похідне ізатін-?-тіосемікарбазонів – ізатізон впливає на активність фагоцитарних клітин // Імунологія та алергологія. – 2002. - №1. - С.45 – 47.

Особистий внесок дисертанта – аналіз літератури, виділення макрофагів та проведення експериментів з визначення їх фагоцитарної активності. Написання та підготовка статті до друку проведено зі співавторами.

5. Л.А.Заїка, О.І.Болсунова, А.І.Потопальський, С.Л. Рибалко, С,Т. Дядюн Вивчення антивірусної дії препарату ізатізон на моделі герпес віруса простого І (ВПГ І) //Імунологія та алергологія. - 2002. - №