НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

ІНСТИТУТ ФІЗИКИ НАПІВПРОВІДНИКІВ ІМ. В.Є. ЛАШКАРЬОВА

БОЛТОВЕЦЬ Прасковія Миколаївна

УДК 578.74; 578.85; 543.45

ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО

В УМОВАХ ПОВЕРХНЕВОГО ПЛАЗМОННОГО РЕЗОНАНСУ

ТА ЗАСТОСУВАННЯ ЦЬОГО ЯВИЩА

ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ ВІРУССПЕЦИФІЧНИХ МАКРОМОЛЕКУЛ

03.00.06 - вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі молекулярної біології вірусів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України та відділі функціональної оптоелектроніки Інституту фізики напівпровідників ім. В.Є. Лашкароьва НАН України

Наукові керівники: доктор біологічних наук, професор, член-кор. НАНУ

Дяченко Наталія Сергіївна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України,

завідувач відділу молекулярної біології вірусів

кандидат фізико-математичних наук,

Снопок Борис Анатолійович, Інститут фізики напівпровідників ім. В.Є. Лашкароьва НАН України,

старший науковий співробітник відділу функціональної оптоелектроніки

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Стародуб Микола Федорович, Інститут біохімії ім. О.В. Паладіна НАН України, завідувач відділу біохімії сенсорних та регуляторних систем

доктор медичних наук, с.н.с.

Рибалко Світлана Леонтіївна, Інститут епідеміології та інфекційних хвороб Міністерства охорони здоров’я України, завідувач лабораторії контролю якості імунобіологічних препаратів

Провідна установа: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України

Захист дисертації відбудеться “18” лютого 2004 р. о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: 03143, м.Київ, вул. Заболотного, 154.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154

Автореферат дисертації розіслано “15” січня 2004 р.

Вчений секретар спеціалізованої Вченої ради

кандидат біологічних наук Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Одним з важливих завдань сучасної вірусології є експресна, дешева і адекватна детекція вірусів у клінічному матеріалі (для вірусів людини і тварин), уражених рослинах (для вірусів рослин) та навколишньому середовищі. Наявність вірусних часток у досліджуваному матеріалі дозволяє робити висновки щодо наявності інфекційного процесу, екологічної і епідеміологічної ситуації. Необхідно також зазначити, що одні й ті самі клінічні прояви можуть викликатись різними вірусами, тому для встановлення етіології захворювання необхідна розробка високоспецифічних та експресних методів лабораторної діагностики вірусних хвороб.

Одним з перспективних шляхів розробки методів експрес-діагностики вірусних хвороб уявляється застосування оптоелектронних перетворювачів, зокрема, тих, що використовують ефект поверхневого плазмонного резонансу, ППР (surface plasmon resonance, SPR). Основні переваги використання подібного роду систем для діагностики вірусних захворювань перед традиційними методами дослідження імунохімічних взаємодій обумовлені можливістю експресного отримання інформації, безпосереднього дослідження міжмолекулярних взаємодій, та аналізу кінетичних параметрів процесу зв'язування, що дозволяє визначити механізм такого процесу, а також відсутністю необхідності використання дорогих мічених реактивів.

Для отримання достовірної інформації щодо білок-білкової взаємодії з використанням методу ППР суттєвою є процедура іммобілізації на сенсорній поверхні рецепторних центрів білків. З одного боку, їх закріплення повинне забезпечувати відсутність небажаних структурних змін на поверхні перетворювача, з іншого – сприяти впорядкованому орієнтованому розташуванню молекул. Оскільки загальновживані способи модифікації плівки золота, зокрема, створення карбоксиметилдекстранового шару на її поверхні, не дозволяють повною мірою реалізувати можливості методу в цьому напрямку (зокрема, внаслідок гідродинамічних обмежень для взаємодії партнерів), створення проміжного шару між досліджуваним білком і металом, який мав би одночасно захисні властивості і здатність орієнтувати молекули в просторі, представляє як теоретичний, так і практичний інтерес.

Простота і експресність методик, заснованих на використанні оптоелектронних перетворювачів, дозволяють розробляти зручні у практичному використанні процедури для оперативної діагностики вірусних інфекцій у клінічних умовах, а також для визначення вмісту вірусів у рослинах, у тому числі, тих, що мають сільськогосподарську цінність. Однак, незважаючи на досить широке застосування методу ППР для вивчення різноманітних білків, даний метод не знайшов ще широкого застосування для детекції вірусів та їх антигенів. Представляє інтерес розробка підходів до експресного виявлення білків важливих з медичної і сільськогосподарської точок зору вірусів, зокрема, мажорного білка капсиду аденовірусів гексону та структурного білка Х-вірусу картоплі. Як модельний об’єкт для відпрацювання системи детекції вірусів бажано використовувати вірус з добре знаною просторовою структурою і невеликими розмірами, яким є вірус тютюнової мозаїки.

Зв’язок роботи з науковими програмами, темами. Робота була виконана в Інституті мікробіології і вірусології НАНУ та Інституті фізики напівпровідників НАНУ на протязі 1999-2002 рр. Робота відповідає основному напрямку науково-дослідних робіт відділу молекулярної біології вірусів Інституту мікробіології і вірусології НАНУ і відділу функціональної оптоелектроніки Інституту фізики напівпровідників НАНУ. Тема роботи була затверджена Вченою Радою ІМВ НАНУ. Робота виконувалась у рамках теми “Вивчення молекулярних механізмів взаємодії ДНК-геномних вірусів з клітиною як передумова розробки засобів етіотропної терапії та специфічної діагностики спричинених ними захворювань” (Постанова Бюро ВМББЕКФ НАНУ від 01.12.1999) та державної комплексної науково-технічної програми “Розробка технологій і організація виробництва напівпровідникових мікросенсорів, електронних приладів і систем на їх основі для екологічного моніторингу і енергозбереження”, 1996-2001 рр. (Доручення Кабінету Міністрів України від 16.05.96 № 9918/97), номер держ. реєстрації 0197U008668.

Мета і завдання дослідження. Метою дослідження було вивчення в умовах поверхневого плазмонного резонансу взаємодії антиген-антитіло (на таких прикладах, як: імуноглобуліни G (IgG) людини – антивидові IgG кози; структурний білок Х-вірусу картоплі (ХВК), гексон аденовірусу типу 2 (Ад2), вірус тютюнової мозаїки (ВТМ) – відповідні специфічні IgG) та розробка підходу до визначення ВТМ і вказаних білків з використанням ППР.

Для досягнення поставленої мети вирішувались такі задачі:

·

·

·

·

·

·

Об'єкт дослідження. Вірус тютюнової мозаїки (ВТМ), гомогенати інфікованих ВТМ клітин, поліклональна специфічна сироватка до ВТМ, IgG людини і антивидові IgG кози, специфічні до IgG людини, структурний білок ХВК, гексон Ад2 і відповідні специфічні сироватки, білок А St. aureus, трипсин (Т) і його соєвий інгібітор.

Предмет дослідження. Взаємодія в умовах поверхневого плазмонного резонансу між ВТМ, структурним білком ХВК, гексоном Ад2 і відповідними специфічними антитілами, IgG людини і антивидовими IgG кози, трипсином і його соєвим інгібітором на поверхні сенсора, що несе ефективний негативний заряд.

Методи дослідження. Поверхневий плазмонний резонанс, імуноферментний аналіз, преципітація в агаровому гелі, непрямий метод флюоресцюючих антитіл, світлова мікроскопія, спектрофотометрія, комп'ютерне моделювання.

Наукова новизна отриманих результатів. В умовах поверхневого плазмонного резонансу досліджено взаємодію між вірусними білками та іммобілізованими на модифікованій поверхні сенсора відповідними специфічними IgG на прикладі структурного білка ХВК і гексону Ад2. Розроблено новий підхід до визначення ВТМ і вказаних білків з використанням ППР.

Запропоновано нову методику модифікації поверхні сенсора для визначення вірусів чи їх білків шляхом формування на поверхні сенсора шару малих молекул з ефективним негативним зарядом, яка дозволяє запобігти денатурації білків, зокрема, імуноглобулінів G, і забезпечити їх орієнтовану іммобілізацію, а також уникнути стадії блокування незайнятих місць за допомогою бичачого сироваткового альбуміну (БСА).

На підставі комплексного вивчення біоспецифічних процесів поблизу поверхні сенсора показано, що її послідовна обробка тіоціанатом і білком А St. aureus забезпечує стабільну, відтворювану іммобілізацію імуноглобулінів G, що продемонстровано на прикладі взаємодії іммобілізованих специфічних IgG з антивидовими IgG і вірусними білками.

На основі комп'ютерної моделі зарядового стану білків і його зміни в залежності від зміни зовнішніх умов на прикладі STI і білка А St. aureus обґрунтована просторова структура білків на зарядженій поверхні. Зокрема, виявлено, що білок А St. aureus може формувати структури різної конформації з різною поверхневою щільністю в залежності від стану поверхні, що відповідно впливає на його здатність до орієнтованої іммобілізації антивірусних імуноглобулінів G.

Практичне значення отриманих результатів. Запропоновано нову оригінальну процедуру кількісного визначення вірусу шляхом іммобілізації комплексу специфічні IgG-вірус на модифіковану тіоціанатом і білком А St. aureus поверхню сенсора, яку продемонстровано на прикладі ВТМ.

Запропоновано зручний і експресний спосіб визначення вірусів або їх білків з використанням іммобілізованих специфічних IgG, орієнтуючого шару білка А St. aureus і мономолекулярного зарядженого шару NCS-, який продемонстровано на прикладі ВТМ, структурного білка ХВК і гексона Ад2. ВТМ виявлений у гомогенатах клітин зеленої водорості Bracteacoccus minor (Br. minor), інфікованої ВТМ на стадії зооспор і листя Nicotiana tabacum, інфікованого ВТМ.

Показано, що для забезпечення оптимальної розпізнавальної здатності антивірусних IgG на поверхні сенсора необхідна його послідовна обробка KNCS і білком А St. аureus. Показано, що така модифікація поверхні сенсора дозволяє адекватно визначати наявність ВТМ у пробі. Методика обґрунтована за допомогою зіставлення результатів з даними, отриманими методами ІФА і світлової мікроскопії.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проаналізовано наукову літературу за темою дисертації. Основний об’єм експериментальної роботи, обробка і аналіз отриманих результатів, формулювання висновків дисертаційної роботи здійснені здобувачем особисто. Безпосередньо автором були проведені експерименти з дослідження методом ППР взаємодії іммобілізованих на поверхні сенсора специфічних імуноглобулінів з відповідними вірусними білками, аналіз можливого впливу зарядового стану білка і зміни його конформації на процес його іммобілізації з допомогою комп'ютерного моделювання. Здобувачем особисто проведено модифікацію поверхні сенсора і імобілізацію комплекса STI-T на модифіковану поверхню сенсора; автор самостійно підібрала умови для оптимальної імобілізації білка А St. aureus на поверхні сенсора; здобувачем досліджено іммобілізацію імуноглобулінів на модифіковану поверхню та порівняно виявлення вірусу в гомогенатах клітин методами ППР і ІФА. Здобувачем самостійно проаналізовано отриманий матеріал, який викладено у ряді статей у спеціальних виданнях і тезах доповідей на вітчизняних і міжнародних конференціях.

ВТМ був отриманий від к.б.н. Т.П. Шевченко (Київський Національний Університет); структурний білок ХВК і гексон Ад2 і специфічні антисироватки до них були отримані від к.б.н. Л.Ф. Діденко і к.б.н. Л.М. Носач (Інститут мікробіології і вірусології НАН України); дослідження вмісту ВТМ в культурі Br. minor було здійснено спільно з В.Р. Бойко (Київський Національний Університет); визначення трипсину за методом Ерлангера було проведене спільно з к.б.н. С.В. Верьовкою (Інститут біохімії НАН України); обговорення особливостей зарядового стану модифікованої поверхні сенсора здійснювалось за участю д.х.н. Я.Д. Лампеки (Інститут фізичної хімії НАН України), які є співавторами відповідних публикацій. Науково-технічне забезпечення експерименту здійснювалось під керівництвом д.ф.-м.н., проф. Ю.М. Ширшова (Інститут фізики напівпровідників НАН України).

Планування основного напрямку дисертаційної роботи, обговорення результатів і їх узагальнення здійснювалися під керівництвом д.б.н., член-кор. НАНУ професора Н.С. Дяченко і к.ф.-м.н. Б.А. Снопка.

Апробація результатів роботи. Основні матеріали дисертації доповідалися на Конференції молодих учених “Актуальні проблеми фундаментальної та прикладної біохімії 2001”, травень 2001 р., Київ, Україна; 14th IFCC-FESCC European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, Prague, Czech Republic, 26.05-31.05 2001; 7й Международной научно-техничнеской конференции "Актуальные проблемы твердотельной электроники и микроэлектроники", 17.09-22.09 2000 г., Дивноморское, Россия; International Smart Sensing Symposium, 26.09-30.09 2000, Kyiv, Ukraine; 3й Міжнародній конференції “Біоресурси і віруси”, вересень 2001 р., Київ, Україна; 27th Meeting of the Federation of European Biochemical Societies, 30.06-05.07 2001, Lisbon, Portugal; Конференції молодих вчених і аспірантів з молекулярної біології і генетики, 20.09-22.09 2001 р., Київ, Україна; 3-й международной научно-технической конференции “Микроэлектронные преобразователи и приборы на их основе. Баку-Сумгаит 16.10-19.10 2001 г; Biology and taxonomy of green algae IV, International Symposium, Smolenice-Castle, Slovakia, 24.06-28.06 2002; Euresco Conference “Computational Biophysics: Integrating Theoretical Physics and Biology”, 7.09-12.09 2002, San Feliu de Guixols, Spain.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 18 робіт, серед яких 7 статей у профільних журналах та 11 тез доповідей на вітчизняних і міжнародних конференціях.

Структура і об’єм роботи. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, експериментальної частини, висновків і списку цитованої літератури, який містить 200 джерел. Робота викладена на 137 сторінках машинописного тексту, містить 69 рисунків і 3 таблиці.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Наведений огляд літератури, присвяченої методам вивчення взаємодій вірусів зі специфічними антитілами і рецепторами. Розглянуті основні підходи до іммобілізації рецепторних центрів білків на поверхні сенсора. Особлива увага приділена оптичним недеструктивним методам дослідження, зокрема, методу поверхневого плазмонного резонансу і його застосуванню для дослідження біоспецифічних взаємодій, а саме, взаємодій вірусів і вірусних білків зі специфічними рецепторами і антитілами. Виходячи з аналізу даних літератури, зроблено висновок про те, що метод ППР не знайшов ще достатньо широкого застосування для детекції вірусів і вивчення їх взаємодії зі специфічними антитілами.

РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Описані досліджувані матеріали, методи їх отримання, обробки і дослідження. Викладено фізичний принцип методу ППР, який полягає в тому, що в результаті процесів адсорбції-десорбції молекул на поверхні металевої плівки змінюється кут мінімальної інтенсивності відбитого плоскополяризованного світла. Фізичними параметрами, вимірюваними при протіканні реакції, є зміна коефіцієнту заломлення n і товщина реакційного шару d, знаючи які, можна визначити концентрацію речовини на поверхні за формулою

Г=d(na-n0)(dn/dc)-1,

де Г – концентрація речовини на поверхні, що виражається в одиницях маси на одиницю площі, na і n0 – ефективні коефіцієнти заломлення адсорбованого шару і розчину відповідно, ?n= na - n0, d – товщина адсорбованого шару і інкремент dn/dc складає 0,19 см3/м для більшості шарів, утворених біологічними молекулами. Представлено загальний хід експерименту з вивчення білок-білкової взаємодії методом ППР (рис.1). На першому етапі досліду на поверхні сенсора іммобілізуються молекули – носії рецепторних центрів, що спостерігається як збільшення QSPR. Надлишок молекул, що не зв’язалися з поверхнею, видаляється промиванням поверхні буфером. На другому етапі здійснюється взаємодія між іммобілізованими носіями рецепторних центрів і досліджуваними молекулами. Утворення комплексу детектується як повторне збільшення QSPR, при якому рівень сигналу лишається стабільним після промивання поверхні буфером. Зв’язок |

між молекулами у комплексі розривається гліциновим буфером (рН 2.2). Зміна сигналу ППР (ДQSPR), а, отже, і зміна концентрації (чи маси) молекул на поверхні сенсорного елемента представляється як графік залежності ДQSPR від часу. Досліди здійснювалися за допомогою ППР-спектрометра “ПЛАЗМОН” (джерело збудження GaAs лазер, ?=670 нм).

Проаналізовані тривимірні моделі білків були отримані за допомогою аналізу відповідних *.pdb файлів, доступних на сайті The Protein Data Bank () з використанням програмам SWISS-MODEL 3.5 і WebLab ViewerPro 3.7. Моделювання кінетики

Рис.1. Загальний хід експерименту з вивчення білок-білкової взаємодії методом ППР на моделі IgG-антивидові IgG (б), QSPR - зсув мінімуму відбитого світла, к.с. – кутові секунди, t – час, с – секунди, Г – поверхневе покриття.

іммобілізації антивірусних IgG на модифіковану поверхню сенсора, а також взаємодії ВТМ з іммобілізованими специфічними IgG проводилося з допомогою комп'ютерної програми “Microcal Origin 6.0”.

В роботі використовувався очищений диференційним центрифугуванням препарат типового штаму ВТМ. Крім того, вірус був визначений у гомогенаті клітин зеленої водорості Br. minor, інфікованих ВТМ на стадії зооспор. В експерименті використовувались: культура Bracteаcoccus minor (Br. minor), інфікована ВТМ на стадії зооспор і культура Br. minor, інфікована ВТМ на стадії зооспор і двічі пересіяна (через 4 і 1 міс.). Також вірус визначався у гомогенатах листя Nicotiana tabacum, інфікованого ВТМ, взятого на різних стадіях інфекції. В роботі також був використаний структурний білок ХВК, отриманий гуанідин-хлоридним методом з виділеного методом диференційного центрифугування Х-вірусу картоплі. Джерелом гексону Ад2 слугував препарат очищеного в градієнті CsCl аденовірусу після дезінтеграції віріонів лужним діалізом. Були використані гіперімунні поліклональні сироватки кроля проти гексону і структурного білка ХВК. Робоче розведення сироваток визначалося методом преципітації в агарі і непрямим методом флюоресцюючих антитіл.

Імуноферментний аналіз досліджуваного матеріалу проводився за загальноприйнятими методиками з використанням мічених пероксидазою антитіл. Дослідження клітин Br. minor, інфікованих ВТМ на стадії зооспор, здійснювалися з допомогою світлового мікроскопа “Біолам” при збільшенні окуляра 7х, об'єктива – 90х.

РОЗДІЛ 3. ІММОБІЛІЗАЦІЯ СОЄВОГО ІНГІБІТОРА ТРИПСИНУ

НА МОДИФІКОВАНІЙ ПОВЕРХНІ СЕНСОРА

ЯК МОДЕЛЬНА СИСТЕМА

ДЛЯ ОРІЄНТОВАНОЇ ІММОБІЛІЗАЦІЇ БІЛКІВ

Описаний процес формування на поверхні золота тонкого шару молекул тіоціанату, солі якого у водному розчині дисоціюють на позитивно заряджений іон металу і іон NCS-. Оскільки сірка в складі різних сполук здатна взаємодіяти із золотом, при цьому утворюється мономолекулярний шар з ефективним зарядом, зумовленим CN- групами, що дозволяє припустити можливість орієнтованої іммобілізації білкових молекул на поверхні сенсора через позитивно заряджені амінокислотні залишки шляхом іонообміну з відповідними малими протийонами.

Як модельна система був розглянутий процес взаємодії іммобілізованого на модифікованій тіоціанатом поверхні золота STI з його специфічним партнером Т у залежності від рН зовнішнього середовища. Як показано на рис.2а, при рН<4,6 на поверхні адсорбується велика кількість STI. З огляду на те, що для STI рI=4,6, це можна пояснити тим, що при рН<pI заряд молекули буде позитивним, що і приводить до ефективної адсорбції STI. Але оскільки амінокислотні залишки з бічними ланцюгами, зарядженими при таких рН позитивно, переважно зосереджені в середній частині молекули, то орієнтація молекули на поверхні буде несприятливою для взаємодії з Т, оскільки молекули не будуть спрямовані рецепторним центром до розчину, що і було експериментально показано. При цьому попередня модифікація поверхні KNCS не впливає істотно на протікання реакції. |

3,0pH3,8 | 5,0pH6,6 | 7,0pH8,2

а | б | в | Рис.2. Іммобілізація STI на модифікованій тіоціанатом поверхні золота і йото взаємодія з трипсином при різних рН: РЦ – рецепторний центр, Au - золото, QSPR – зсув мінимуму відбитого світла, к.с. – кутові секунди, t – час, с – секунди, Г – поверхневе покриття, 1 – KNCS, 2 – H2O, 3 – STI, 4 – T, 5 – гліциновий буфер (рН2,2).

В межах рН 5,0-6,6 кількість адсорбованого на поверхні STI практично не змінюється для поверхні, обробленої KNCS і співвідношення його з Т наближається до 1:1, в той час як для необробленої поверхні кількість адсорбованого STI зменшується, а Т – збільшується. При цьому рН через наявність негативно заряджених залишків аспарагінової і глутамінової кислот поблизу акцепторної ділянки молекули не прагнуть розташуватися рецепторним центром в напрямку до поверхні. З іншого боку, ці ж залишки, розташовані в середній частині молекул, зумовлюють їх взаємне відштовхування, внаслідок чого кількість адсорбованого поверхнею білка зменшується. Завдяки позитивно зарядженому при цьому рН залишку гістидину, що знаходиться в акцепторній ділянці, молекули STI у цих межах рН орієнтовано розташовуються на поверхні, яка має ефективний негативний заряд, при цьому рецепторний центр спрямований в напрямку від поверхні. Таким чином створюються оптимальні умови для взаємодії між STI і Т (рис.2б).

Як показано на рис.2в, в межах рН 7,0-8,2 кількість адсорбованого STI різко зменшується, при цьому зростає кількість Т на поверхні. Сумарний заряд молекули STI негативний притому, що розташований в акцепторній ділянці гістидин заряджений нейтрально. Таким чином, спостерігається відштовхування між молекулами STI і поверхнею, в результаті чого на поверхні залишається багато порожніх місць, де Т може адсорбуватися, без взаємодії з STI.

На прикладі модельної системи STI-Т була розглянута можливість іммобілізації попередньо отриманого комплексу молекул. Комплекс STI-T наносився на необроблену поверхню золота і поверхню, оброблену KNCS. Показано, що лише у випадку модифікації тіоціанатом поверхні сенсора реагенти можна розділити з допомогою обробки поверхні гліциновим буфером (рН 2,2). Це дозволяє стверджувати, що на модифікованій поверхні молекули STI розташовуються на поверхні сенсора орієнтовано, рецепторним центром в напрямку від поверхні, завдяки чому можна провести відокремлення реагентів. Отже, комбінація модифікації поверхні сенсора тіоціанатом і попереднього утворення комплексу STI-T з наступним відокремленням компонентів дозволяє одержати орієнтований шар молекул STI на поверхні сенсора.

Отже, показано, що модифікація плівки золота шляхом утворення на її поверхні шару NCS- приводить до формування організованого мономолекулярного покриття, тому на цій поверхні можлива орієнтована іммобілізація білків шляхом заміщення позитивно заряджених протийонів.

РОЗДІЛ 4. ВИВЧЕННЯ ОСОБЛИВОСТЕЙ ВЗАЄМОДІЇ

IgG-АНТИВИДОВІ IgG ТА ВИЗНАЧЕННЯ ВІРУСНИХ БІЛКІВ

НА МОДИФІКОВАНІЙ БІЛКОМ А St. aureus ПОВЕРХНІ СЕНСОРА

Для орієнтованої іммобілізації антивірусних IgG на поверхні плівки золота уявляється доцільним використання білка А St. aureus, який взаємодіє з Fc-фрагментом IgG, що робить можливою спрямованість Fab-фрагментів у бік розчину. При цьому надання поверхні ефективного заряду дозволяє уникнути стадії блокування незайнятих місць за допомогою БСА, оскільки при цьому іммобілізований білок займає максимальну площу.

Як модельна система для відпрацювання процедури орієнтованої іммобілізації антивірусних IgG використовувались IgG людини і антивидові IgG кози, специфічні до IgG людини. Було проаналізовано взаємодію між імуноглобулінами G на трьох типах поверхні: немодифіковане золото, золото, оброблене тіоціанатом, золото, послідовно оброблене тіоціанатом і білком А. Відокремлення реагентів здійснювали за допомогою гліцинового буфера (рН 2,2). На представлених на рис.3 діаграмах підсумовано результати двох серій експериментів.

У першій з них на трьох згаданих типах поверхні іммобілізували IgG кози до IgG людини. У другій серії дослідів на тих самих типах поверхні іммобілізували IgG людини. При іммобілізації IgG на необробленій поверхні золота чи на поверхні золота, обробленій тільки KNCS, кількість іммобілізованого білка нестабільна,

а б

Рис.3. Взаємодія між імуноглобулінами G на різних типах поверхні, QSPR – зсув мінимуму відбитого світла, к.с. – кутові секунди, t – час, Г – поверхневе покриття, рА – білок А St. aureus, Au – золото: а - іммобілізовані IgG кози специфічні до IgG людини (gIgG); б - іммобілізовані IgG людини (hIgG): 1 – необроблена поверхня золота; 2 – поверхня, оброблена KNCS; 3 – поверхня, послідовно оброблена KNCS і білком А St. аureus.

співвідношення між іммобілізованим і зв'язаним IgG далеке від 1:1, що дозволяє говорити про денатурацію білків. З рис.3а видно, що модифікація поверхні золота білком А St. aureus не поліпшує її адсорбційної здатності по відношенню до IgG кози, що свідчить про відсутність впорядкованого орієнтованого шару молекул на поверхні. Інша картина спостерігається при адсорбції на послідовно оброблену KNCS і білком А St. aureus поверхню золота IgG людини.

З рис.3б видно, що подібна модифікація поверхні збільшує її адсорбційну здатність для IgG людини майже удвічі. Збільшується і кількість антитіл, що зв’язались з іммобілізованими таким чином IgG, при цьому їх співвідношення наближається до 1:1, що дозволяє говорити про утворення на поверхні золота орієнтованого шару IgG людини.

За допомогою отриманої системи було досліджено взаємодію між гіперімунною поліклональною сироваткою кроля проти гексону і IgG-фракцією гіперімунної поліклональної сироватки кроля проти структурного білка ХВК іммобілізованими на модифікованій поверхні сенсора та відповідними вірусними білками. Специфічність та активність антигексонової сироватки було досліджено непрямим методом флюоресцюючих антитіл (МФА). Сироватка в розведенні 1:32 була здатна виявляти антиген гексону в інфікованих аденовірусом клітинах. Як представлено на рис.4, гексон Ад2 зв’язується зі специфічою антисироваткою на поверхні сенсора, послідовно обробленій KNCS і білком А. При цьому сигнал залишається стабільним після промивання поверхні сенсора буфером, що свідчить про те, що зв’язування відбулось. Показано, що зв’язок між гексоном і антитілами розривається при застосуванні гліцинового буфера (рН 2,2). Це свідчить про те, що ні білок, ні компоненти антисироватки в цьому випадку не денатурують. |

Рис.4. Взаємодія між антисироваткою до гексону Ад2 і гексоном Ад2 (120 мкг/мл) на поверхні золота, послідовно обробленій KNCS і білком А St. аureus: QSPR - зсув мінімуму відбитого світла, к.с. – кутові секунди, t – час, с – секунди, Г – поверхневе покриття, буфер – карбонатний буфер рН 9,6.

Титр очищених IgG проти структурного білка ХВК було визначено методами подвійної імунодифузії в гелі та ІФА. У зв’язку з невеликими розмірами даного білка його наявність не була виявлена ППР безпосередньо. Тому отриманий комплекс був додатково оброблений IgG, специфічними до структурного білка ХВК. Відгук ППР, отриманий при цьому, і достатній рівень сигналу, що лишається після промивання поверхні сенсора буфером, свідчать про можливість виявлення білка таким способом (рис.5б). В контрольному досліді вірусний білок не вносився. У цьому випадку додаткова обробка поверхні IgG, специфічними до структурного білка ХВК, хоча і призводила до певного збільшення сигналу, однак, при промиванні поверхні буфером сигнал зменшувався до початкового рівня, що свідчить про відсутність неспецифічного зв’язування в цьому випадку (рис.5a).

а | б

Рис.6. Взаємодія між іммобілізованими специфічними IgG проти структурного білка ХВК і структурним білком ХВК (15 мкг/мл) на поверхні золота, послідовно обробленій КNCS і білком А St. аureus: а – контрольний експеримент без вірусного білка, б – експеримент із структурним білком ХВК: QSPR - зсув мінімуму відбитого світла, к.с. – кутові секунди, t – час, с – секунди, Г – поверхневе покриття, буфер – фосфатний буфер рН 7,4.

Таким чином, з представлених даних видно, що білок А St. aureus, іммобілізований на поверхні золота, попередньо обробленій тіоціанатом, у повній мірі зберігає здатність до орієнтованої іммобілізації IgG. Отже, отримана інформація дозволила оптимізувати умови і створити специфічну поверхневу структуру, необхідну для виявлення і кількісного визначення вірусів. Запропонований підхід дозволяє визначати вірусні білки, що продемонстровано на прикладі структурного білка ХВК і гексону Ад2.

РОЗДІЛ 5. ІМУНОХІМІЧНЕ ВИЗНАЧЕННЯ ВІРУСІВ

З ВИКОРИСТАННЯМ МЕТОДУ ППР

НА ПРИКЛАДІ ВІРУСУ ТЮТЮНОВОЇ МОЗАЇКИ

Модельним об’єктом був вибраний ВТМ як один з найбільш досліджених вірусів, який має добре вивчену просторову організацію і невеликі розміри (30018 нм), що дозволяє виявляти і кількісно визначати його методом ППР, один білок і велику кількість сайтів зв’язування. Крім того, для нього характерним є утворення в розчині щільноупакованих паракристалічниих структур при концентрації вірусу більше 10%.

У відповідності до основних результатів, викладених у попередньому розділі, було перевірено вплив способу іммобілізації антивірусних IgG у складі поліклональної специфічної сироватки кроля до ВТМ на їх антигензв’язуючу здатність. При цьому порівнювалася ефективність зв'язування вірусу з антитілами, адсорбованими на чотири типи поверхні сенсора: (i) немодифіковане золото; (ii) золото, оброблене пентаазамакроциклічним комплексом нікелю, здатним утворювати на поверхні плівки золота ефективний заряджений шар, подібний тому, який утворюється при її модифікації KNCS; (iii) золото, оброблене NСS; (iv) золото, послідовно оброблене KNCS і білком А. Хоча антитіла до ВТМ адсорбуються на всі чотири типи поверхні, у всіх випадках спостерігається великий внесок неспецифічного компоненту, що видаляється промиванням буфером. Адсорбція компонентів сироватки на поверхні немодифікованого золота і золота, обробленого пентаазамакроциклічним комплексом нікелю, приводить до відносно невеликого збільшення QSPR. Обробка поверхні тіоціанатом приводить до значно більшої зміни QSPR, однак, при промиванні поверхні буфером відгук ППР зменшується більш, ніж у три рази. Послідовна обробка поверхні KNCS і білком А St. aureus приводить до найбільшого збільшення QSPR, і після промивання поверхні буфером сигнал залишається досить великим. |

Рис.6. Взаємодія між антисироваткою до ВТМ і ВТМ (100 мкг/мл) на поверхні золота, послідовно обробленій KNCS і білком А St. aureus: QSPR - зсув мінімуму відбитого світла, к.с. – кутові секунди, t - час, с – секунди, Г – поверхневе покриття.

Як показано на рис.6, послідовна обробка поверхні KNCS і білком А St. aureus дозволяє ефективно іммобілізувати IgG, що входять до складу відповідної специфічної антисироватки. Іммобілізовані антитіла зв’язують вірус з високою ефективністю, про що свідчить великий відгук на додавання вірусу, що залишається стабільним і після промивання поверхні буфером. При цьому зв’язок між вірусом і антитілами розривається при застосуванні гліцинового буфера (рН 2,2).

Моделювання кінетики іммобілізації IgG у складі специфічної антисироватки на модифікованій поверхні сенсора і їх подальшої взаємодії з очищеним ВТМ шляхом зіставлення наведених на рис.6 кінетичних залежностей з теоретичними моделями дозволяє зробити висновок про те, що як іммобілізація антивірусних IgG, так і зв’язування ними ВТМ відбувається

а б

Рис.7. Порівняння експериментальних даних щодо іммобілізації IgG у складі специфічної антисироватки на послідовно модифіковану KNCS і білком А St. aureus поверхню (а), та зв'язування ВТМ іммобілізлваними IgG (б) з теоретичною кривою, QSPR - зсув мінімуму відбитого світла, к.с. – кутові секунди, t – час, с – секунди, Г – поверхневе покриття.

за недифузно-обмеженою моделлю Лангмюра другого порядку (рис.7), що характеризує процес даної взаємодії як поступовий, супроводжуваний реорганізацією компонентів моношару в процесі його формування. Дана модель описується рівнянням

Г=Гmax(1-(1+ktranst)-1),

де Г – поверхневе покриття, ktrans – константа трансформації, t – час.

Найбільш важливою характеристикою іммобілізованих на поверхні специфічних IgG, що входять до складу поліклональної антисироватки є їх здатність специфічно зв'язувати вірус. IgG, іммобілізовані на немодифікованій поверхні золота, зв'язують вкрай незначну кількість вірусу, оскільки з одного боку кількість їх у сироватці невелика, з іншого – в цьому випадку розташування їх на поверхні не є орієнтованим. Кількості IgG і вірусу в цьому випадку непорівняні, що не дозволяє говорити про специфічність зв'язування. На поверхні, модифікованій пентаазамакроциклічним комплексом нікелю, IgG зв'язують незначну кількість вірусу, при цьому співвідношення між IgG і вірусом складає 1,92:1, однак цей зв’язок не є специфічним, оскільки не розривається гліциновим буфером (рН 2,2). IgG, іммобілізовані на модифікованій КNСS поверхні золота, зв’язують більшу кількість вірусу, однак значна його частина віддаляється простим промиванням буфером. Співвідношення між IgG і вірусом складає в цьому випадку 1,66:1. При цьому, як і в попередньому випадку, зв'язок між IgG і вірусом не розривається гліциновим буфером (рН 2,2), що свідчить про високий рівень неспецифічного зв’язування у цьому випадку. Лише послідовна обробка поверхні тіоціанатом і білком А St. aureus дозволяє іммобілізувати антитіла на поверхні золота таким чином, що вони в повній мірі зберігають здатність зв'язувати вірус, оскільки тільки в цьому випадку зв'язок між IgG і вірусом розривається гліциновим буфером (рН 2,2). Співвідношення між IgG і вірусом у цьому випадку складає 1,1:1. Оскільки розмір молекули IgG співставимий за абсолютним значенням з діаметром частки ВТМ, можна стверджувати, що саме останній спосіб іммобілізації антивірусних IgG є оптимальним для детекції вірусів.

Таким чином, було розроблено загальний підхід до виявлення вірусів методом ППР з використанням специфічних антитіл, іммобілізованих на модифікованій KNCS і білком А St. aureus поверхні сенсора.

Як приклад виявлення вірусу в клітинних гомогенатах методом ППР за допомогою сенсора, модифікованого тіоціанатом і білком А St. аureus, було досліджено вміст ВТМ в культурі зеленої водорості Br. minor, що була інфікована ВТМ на стадії зооспор і більш не пересівалася, і такій же культурі, що пройшла через два пасажі. З одного боку, схожість будови клітин зелених водоростей з будовою клітин вищих рослин дозволяє припустити, що вони можуть заражатися фітопатогенними вірусами, з іншого – саме стадія зооспор є найбільш сприятливою для інфекції, оскільки клітина на цій стадії не має зовнішньої оболонки. Як контрольний зразок використовувалися клітини, не заражені ВТМ. У результаті проведеного ППР аналізу встановлено, що вірус є присутнім в обох досліджених культурах, однак, у двічі пересіяній після зараження вірусом культурі Br. minor його кількість зменшується більш, ніж у два рази.

Паралельно вірус був визначений у згадуваних зразках методом ІФА, що підтвердило високу концентрацію вірусу в культурі Br. minor, інфікованій ВТМ на стадії зооспор. В культурі Br. minor, інфікованій ВТМ на стадії зооспор і двічі пересіяній, концентрація вірусу за даними ІФА значно нижче, тобто дані, отримані за допомогою методів ППР і ІФА в цілому збігаються (рис.8). |

Рис.8. Порівняння результатів виявлення вірусу в клітинних гомогенатах, отриманих методами ППР і ІФА: 1 – неінфіковані клітини Br. minor; 2 –очищений ВТМ (100 мкг/мл); 3 – клітини Br. minor, інфіковані ВТМ на стадії зооспор; 4 - клітини Br. minor, інфіковані ВТМ на стадії зооспор і двічі пересіяні; QSPR - зсув мінімуму відбитого світла, к.с. – кутові секунди; OD – оптична густина.

Дослідження методом світлової мікроскопії також свідчать про характерні зміни, що виникають у клітинній культурі в зв'язку з зараженням клітин ВТМ. Зокрема, в культурі, зараженій ВТМ на стадії зооспор, змінюється морфологія клітин у порівнянні з контролем: спостерігається значна кількість гігантських клітин, клітин з потовщеними оболонками, руйнується внутрішній вміст клітин, утворюються гігантські спорангії, іде інтенсивне накопичення вторинних каротиноїдів. В той же час, культура, що пройшла два пасажі після зараження ВТМ не виявляє істотних відмінностей від контролю. Отже, дані світлової мікроскопії, також підтверджують інформацію, отриману методом ППР.

Іммобілізація комплексу специфічні IgG-вірус на поверхні сенсора, модифікованій тіоціанатом і білком А, дозволяє зробити процес виявлення вірусу більш експресним без відчутної втрати якості. Внаслідок того, що QSPR залежить не тільки від товщини шару молекул на поверхні, але і від щільності утворюваних на поверхні структур, кінцевий рівень відгуку ППР при такому підході буде прямо залежати від концентрації вірусу. Було реалізовано два підходи до визначення вірусу таким шляхом: визначення за допомогою відкритої системи (циркуляція рідини відсутня) і визначення за допомогою закритої проточної системи. Запропонований підхід було реалізовано на моделі специфічні IgG-ВТМ. Отримані концентраційні залежності були використані для визначення концентрації вірусу в культурі Br. minor, інфікованій ВТМ на стадії зооспор.

При іммобілізації комплексу специфічні IgG-вірус з різними концентраціями очищеного вірусу у відкритій системі була отримана залежність між концентрацією вірусу в зразку і QSPR (рис.9). При високих концентраціях вірусу рівень сигналу падає, що зумовлено утворенням у

аб Рис.9. Залежність між концентрацією вірусу в пробі і відгуком ППР для відкритої системи, QSPR – зсув мінимуму відбитого світла, к.с. – кутові секунди, t – час, с – секунди.

висококонцентрованому розчині паракристалічних структур. Враховуючи те, що чутливість окремих сенсорних елементів може відрізнятись, значення QSPR при переході між двома стандартними буферами (показано на рис.9а як “норма”) з відомими показниками заломлення було використано для стандартизації результатів вимірювання, що проводились на різних зразках. При цьому абсолютне значення відгуку на іммобілізацію комплексу IgG-вірус, виражене в кутових секундах, ділилося на абсолютне значення різниці між двома буферами, також виражене в кутових секундах. Отримана величина виражалась у відносних одиницях. Нормована таким чином залежність інформативного сигналу (тобто специфічної частини загального відгуку, що залишається після відмивки неспецифічної частини буфером) відносно необернено зв’язанної частини (яка залишається після промивання буфером з рН 2.2 для відкритої системи) наведена на рис.9б.

Для проточної системи також було проведено іммобілізацію комплексу специфічні IgG-вірус з різними концентраціями очищеного вірусу, а також з досліджуваними раніше клітинними гомогенатами. У даному випадку як норму було використано відгук при іммобілізації на поверхні сенсора білка А St. aureus (рис.10а). |

а | б | Рис.10. Залежність між концентрацією вірусу в пробі і відгуком ППР для проточної системи, QSPR – зсув мінимуму відбитого світла, к.с. – кутові секунди, t – час, с – секунди: зразок 1 - клітини Br. minor, інфіковані ВТМ на стадії зооспор, зразок 2 - клітини Br. minor, інфіковані ВТМ на стадії зооспор і двічі пересіяні.

Було отримано залежність між концентрацією вірусу в зразку і QSPR, за допомогою якої було визначено концентрацію вірусу у досліджуваних зразках, яка склала 6,5 мкг/мл для клітин Br. minor, інфікованих ВТМ на стадії зооспор і 4,5 мкг/мл для клітин Br. minor, інфікованих ВТМ на стадії зооспор і двічі пересіяних (рис.10б). |

На наступному етапі роботи