ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ІВАНА ФРАНКА

БИЧКОВА СОЛОМІЯ ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 612.014.42:612.31:591.431.2

РЕГУЛЯЦІЯ ВНУТРІШНЬОКЛІТИННИХ Ca2+-ТРАНСПОРТУВАЛЬНИХ

СИСТЕМ МАЛОКЛІТИННИХ ТРАВНИХ ЗАЛОЗ

03.00.13 – фізіологія людини і тварин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Львів – 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі фізіології людини і тварин

Львівського національного університету імені Івана Франка

Науковий керівник: | доктор біологічних наук, професор

Клевець Мирон Юрійович,

Львівський національний університет

імені Івана Франка Міністерства освіти і науки України,

завідувач кафедри фізіології людини і тварин

Офіційні опоненти: | доктор біологічних наук

Янчій Роман Іванович,

Інститут фізіології імені О.О. Богомольця НАН України,

провідний науковий співробітник відділу імунології та

цитотоксичних сироваток

кандидат біологічних наук

Рибальченко Тарас Володимирович,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка,

науковий співробітник кафедри біохімії

Провідна установа: | Національний медичний університет імені О.О. Богомольця

Захист відбудеться “ 17 ” червня 2004 р. о 1300 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К .051.14 у Львівському національному університеті імені Івана Франка за адресою: 79005, м. Львів, вул. Грушевського, , біологічний факультет Львівського національного університету імені Івана Франка, аудиторія № .

З дисертацією можна ознайомитися у науковій бібліотеці Львівського національного університету імені Івана Франка за адресою:

79005, м. Львів, вул. Драгоманова, .

Автореферат розісланий “ 14 ” травня 2004 р.

Виконуючий обов’язки вченого секретаря

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук,

доцент В.В. Манько

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У відповідь на дію зовнішніх стимулів клітини генерують Са2+-сигнали, які проявляються в коливному і тимчасовому підвищенні концентрації Са2+ у певних ділянках цитозолю. Під час ініціації Са2+-сигналів іони Са2+ вивільняються з внутрішньоклітинних депо, а також надходять у клітину ззовні. Вважали, що ІФ3-чутливі Са2+-канали є ключовими для вивільнення Са2+ у секреторних клітинах (Berridge, Irvine, 1984), а наявність ріанодинчутливих Са2+-каналів тривалий час заперечували. На сьогодні відомо, що до генерації Са2+-сигналів залученні різні типи каналів вивільнення Са2+ (Petersen et al., 1999). У секреторних клітинах вищих тварин були ідентифіковані усі три ізоформи ІФ3-чутливих Са2+-каналів і три ізоформи ріанодинчутливих Са2+-каналів (Lee et al., 1997; Leite et al. 1999; Zhang et al., 1999; Fitzsimmons et al., 2000), а також доведено наявність ІФ3-індукованого вивільнення Са2+ у секреторних клітинах безхребетних (Zimmermann, 1999; 2000). Однак взаємодія між каналами вивільнення Са2+ та іншими внутрішньоклітинними Са2+-транспортувальними системами, зокрема мітохондріальними, є не до кінця з’ясована. Відомо, що мітохондрії перебувають у тісному взаємозв’язку з каналами вивільнення Са2+ з внутрішньоклітинних депо і реагують на зміни концентрації Са2+ у цитозолі в стані спокою (Collins et al., 2000; 2001).

Крім того, залишається невивченим регулювання внутрішньоклітинних Са2+-транспортувальних систем ендогенними чинниками, які можуть модулювати Са2+-сигнали і визначати подальшу відповідь клітин. Знання про функціонування внутрішньоклітинних Са2+-транспортувальних систем потрібні для розуміння цілісної картини послідовності кальцієвої відповіді та для уявлення про механізми генерації Са2+-сигналу у секреторних клітинах, що дасть теоретичне підґрунтя для фармакологічної корекції патологій секреторних клітин. Тому наша увага була зосереджена на регулюванні цАМФ-аденілатциклазною, цГМФ-гуанілатциклазною та Са2+-кальмодуліновою системами ІФ3- та ріанодинчутливих Са2+-каналів, а також на вивченні взаємодії між цими каналами та іншими внутрішньоклітинними Са2+-транспортувальними системами.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана в рамках держбюджетних тем БЛ-10Б “Кальцієвий гомеостаз і енергетичний метаболізм секреторних клітин травних залоз та їх зміни під впливом екстремальних факторів”, № держреєстрації 0100 та БЛ-114Б “Механізми Са2+- і NO-залежної регуляції функціонування секреторних клітин”, № держреєстрації 0103 , а також за часткової підтримки у межах грантів для молодих вчених Західно-Українського центру біомедичних досліджень. Здобувачем проведено ідентифікацію ІФ3- і ріанодинчутливих каналів вивільнення Са2+ з внутрішньоклітинних депо та виявлено функціонування Са2+-уніпортера мітохондрій за відсутності стимуляції клітини. Крім того, досліджено регулювання каналів вивільнення Са2+ аденілатциклазою і цАМФ та роль SH-груп у функціонуванні внутрішньоклітинних Са2+-транспортувальних систем.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи полягала в одержанні функціонального підтвердження наявності ІФ3- та ріанодинчутливих Са2+-каналів, а також Са2+-уніпортера мітохондрій у секреторних клітинах слинних залоз личинки Chironomus plumosus L. (комара-дергуна) та у з’ясуванні особливостей регулювання внутрішньоклітинних Са2+-транспортувальних систем. У відповідності до поставленої мети нам необхідно було вирішити наступні завдання:

1. Підібрати умови для пермеабілізації секреторних клітин слинних залоз.

2. Ідентифікувати ІФ3- та ріанодинчутливі Са2+-канали у мембранах внутрішньоклітинних кальцієвих депо секреторних клітин та Са2+-уніпортер мітохондрій.

3. З’ясувати місце розташування мітохондрій для глибшого розуміння внеску Са2+-уніпортера у підтримання гомеостазу Са2+ у клітинах слинних залоз.

4. Дослідити регулювання внутрішньоклітинних Са2+-каналів цАМФ-аденілатциклазною, цГМФ-гуанілатциклазною та Са2+-кальмодуліновою системами.

5. З’ясувати роль SH-груп у функціонуванні внутрішньоклітинних Са2+-транспортувальних систем секреторних клітин слинних залоз.

6. Встановити наявність взаємодії між ІФ3- та ріанодинчутливими Са2+-каналами у цих клітинах.

Об’єкт досліджень – регулювання цитоплазматичної концентрації Са2+ у екзокринних секреторних клітинах.

Предмет досліджень – функціонування Са2+-транспортувальних систем мембран внутрішньоклітинних депо Са2+.

Методи досліджень – функціонування внутрішньоклітинних Са2+-транспортувальних систем секреторних клітин слинних залоз личинки комара-дергуна вивчали за допомогою визначення змін вмісту Са2+ в тканині залоз із використанням металохромного барвника арсеназо ІІІ. Для цього використовували інтактні слинні залози та залози, попередньо оброблені сапоніном з метою пермеабілізації клітин. Крім того, застосовували методи електронної мікроскопії для локалізації мітохондрій у клітинах, а також світлової мікроскопії для встановлення ступеня пермеабілізації плазматичної мембрани сапоніном.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше ідентифіковано ІФ3-чутливі Са2+-канали внутрішньоклітинних мембран секреторних клітин слинних залоз личинки Chironomus plumosus L. Підтверджено функціонування ріанодинчутливих Са2+-каналів та Са2+-уніпортера мітохондрій за відсутності стимуляції клітин. Візуалізація мітохондрій виявила їх переважне розташування у базальному полюсі клітини і відсутність мітохондріального кільця у апікальній частині секреторних клітин, що вказує на особливості функціонального вкладу мітохондрій у підтримання Са2+ гомеостазу секреторних клітин слинних залоз личинки комара-дегруна у порівнянні з секреторними клітинами вищих тварин.

Вперше для цих клітин досліджено регулювання цАМФ-аденілатциклазною, цГМФ-гуанілатциклазною та Са2+-кальмодуліновою системами внутрішньоклітинних каналів вивільнення Са2+. Доведено, що під дією екзогенного цАМФ вивільнення Са2+ ріанодинчутливими каналами активується, а ІФ3-чутливими Са2+-каналами – пригнічується.

На основі визначення змін вмісту Са2+ у тканині під впливом хлорпромазину за різних умов інкубації слинних залоз, оброблених сапоніном, встановлено модифікуючу роль кальмодуліну на вивільнення Са2+ з внутрішньоклітинних депо. Нами показано, що вивільнення Са2+ з ріанодинчутливого депо суттєво підсилюється кальмодуліном.

Встановлено, що SH-групи молекул внутрішньоклітинних Са2+-транспортувальних систем відіграють важливу роль у підтриманні кальцієвого гомеостазу секреторних клітин.

Вперше нами показано наявність чіткої взаємодії між ріанодин- та ІФ3-чутливими Са2+-каналами у секреторних клітинах. Ми припускаємо, що вивільнення Са2+ ріанодинчутливими каналами повністю залежить від стану ІФ3-чутливих Са2+-каналів і навпаки. Це вказує на роль вивільненого Са2+ у реалізації негативної та позитивної зворотної дії на подальше його вивільнення з депо.

Практичне значення роботи. Одержані результати розширюють уявлення про внутрішньоклітинні Са2+-транспортувальні системи, зокрема, про канали вивільнення Са2+ з депо і розкривають механізми їх взаємодії та регуляції і, у цілому, поглиблюють розуміння механізмів генерування Са2+-сигналів у секреторних клітинах. Отримані дані впроваджені у навчальний процес кафедри фізіології людини і тварин та кафедри біофізики і математичних методів у біології Львівського національного університету імені Івана Франка. Одержані результати можуть бути використані як теоретична основа для пояснення причин виникнення і розвитку патологій травних залоз, пов’язаних з порушенням кальцієвого гомеостазу, та розробки методів їхньої фармакологічної корекції, а тому мають значення для медицини та ветеринарії.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто виконано весь обсяг експериментальних досліджень, розроблено методику пермеабілізації слинних залоз личинки Chironomus plumosus L. сапоніном, проведено статистичне опрацювання результатів, їх аналіз на основі опрацьованої наукової літератури за темою дисертації.

Здобувач разом із науковим керівником та за участю доц. Манька В.В. здійснювали планування досліджень, аналізували одержані результати, формулювали основні висновки і готували публікації до друку.

У виконанні електронно-мікроскопічних досліджень брав участь с.н.с. Кулачковський О.Р.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень та основні положення, які включені до дисертації, були представлені на: 1-му Студенському міжнародному конгресі медичних наук (Бєлград, 2001 р.), конференції до 100-річчя з дня народження заслуженого діяча науки України професора Я.П.Склярова “Механізми фізіологічних функцій в експерименті та клініці” (Львів, 2001 р.), на Всеукраїнській науковій конференції “Актуальні проблеми гастроентерології” (Київ, 2001 р.), на Міжнародному симпозіумі “Внутрішньоклітинна сигналізація в рослинних та тваринних системах (ISPAS)” (Київ, 2001 р.), на 6-ій Пущинській школі-конференції молодих учених "Біологія – наука XXI віку" (Пущино, 2002 р.), на XVI з’їзді Українського фізіологічного товариства (Вінниця, 2002 р.), на 4-ій Парнасівській конференції “Молекулярні механізми клітинної активації: біологічний сигнал та його молекули-мішені” (Вроцлав, 2002 р.), на VIII Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002 р.), на ІІІ з'їзді Українського біофізичного товариства (Львів, 2002 р.), на Міжнародній конференції, присвяченій пам’яті професора Шостаковської І.В. (Львів, 2002 р.), на 5-му Слов’яно-Балтійському науковому форумі “Санкт-Петербург – Гастро-2003” (Санкт-Петербург, 2003), на Спільній зустрічі Британського фармакологічного та фізіологічного товариств у Манчестері, (Манчестер, 2003 р) та Зустрічі фізіологічного товариства (Кембрідж, 2003 р.), а також на щорічних звітних конференціях біологічного факультету Львівського національного університету імені Івана Франка (2000-2004 р.р.) та на міжкафедральному семінарі біологічного факультету Львівського національного університету імені Івана Франка у березні 2004 р.

Публікації. Результати дисертації опубліковані у 4 статтях фахових видань та в 13 тезах доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація включає вступ, огляд літератури, опис матеріалів і методів досліджень, результатів досліджень, їхнього обговорення, висновків, списку використаних джерел із 287 найменувань. Робота викладена на 159 сторінках (основна частина 117 сторінках), ілюстрована 38 рисунками і 5 таблицями.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Для досліджень функціонування Са2+-транспортувальних систем використовували слинні залози личинки комара-дергуна (Chironomus plumosus Linnaeus, 1758.).

Залози препарували за допомогою мікрохірургічних інструментів під мікроскопом. Базовий розчин для виділення та інкубації інтактних залоз містив, ммоль/л: NaCl 136,9, KCl 5,36, CaCl2 1,76, Na2HPO4 0,35, KH2PO4 0,44, MgCl2 0,95, глюкоза 5,55; рН 7,2. Для пермеабілізації секреторних клітин відпрепаровані слинні залози попередньо інкубували протягом 10 хв у базовому розчині, який містив сапонін у концентрації 0,1 мг/мл (рН 7,2). Робочу концентрацію сапоніну та час інкубації з ним підібрали експериментально. Залози відмивали від сапоніну, інкубували протягом 30 хв у водяній бані при температурі 25 С та помірному струшуванні. Вихідний розчин для інкубації залоз після обробки їх сапоніном містив (ммоль/л): NaCl 15,30, KCl 129,94, Na2HPO4 0,35, KH2PO4 0,44, глюкоза 5,55; рН ,0. Після інкубації вміст пробірок протягом 5 хв центрифугували при 1600Зливши супернатант, до осаду додавали 1 мл бідистильованої води і гомогенізували за допомогою скляного гомогенізатора. Отриманий гомогенат центрифугували протягом 10 хв. Про функціональний стан Са2+-транспортувальних систем судили за зміною вмісту Са2+ у тканині залоз, виміряного за допомогою арсеназо ІІІ з використанням стандартного набору реактивів фірми Simko Ltd (Львів). З метою блокування ІФ3-чутливих Са2+-каналів до базового розчину додавали гепарин (500 мкг/мл), для блокування Са2+-помпи ендоплазматичного ретикулуму (ЕПР) – тапсигаргін (1 мкмоль/л) і еозин(5, 10 і 20 мкмоль/л), а також використовували IФ3 у концентрації 10 мкмоль/л, ріанодин у концентраціях 5 і 500 нмоль/л, форсколін у концентрації 10 мкмоль/л, цАМФ та цГМФ у концентраціях 1, 10 і 100 мкмоль/л, парахлормеркурійбензоат (ПХМБ) у концентрації 1, 5, і 10 мкмоль/л та хлорпромазин у концентрації 100 мкмоль/л.

Для електронно-мікроскопічних досліджень двічі відмиті дистильованою водою інтактні залози фіксували охолодженим до 0 С 1,5розчином глутарового альдегіду на какодилатному буфері (рН=7,2) протягом 2 год, постфіксацію проводили 1розчином OsO4 у какодилатному буфері протягом 2 год при 0 С. Фіксовані зразки промивали і витримували у 1,5водному розчині уранілацетату 12 год, зневоднювали в зростаючих концентраціях етанолу, окису пропілену та переносили в епоксидну смолу Epon-812. Ультратонкі зрізи отримували на ультрамікротомі УМТП-6 і контрастували солями свинцю за Рейнольдом. Перегляд і фотографування зразків виконували на електронному трансмісійному мікроскопі ПЕМ-100.

Статистичне опрацювання даних здійснювали з використанням програмного пакета для персональних комп'ютерів Microsoft Excel. Достовірність змін встановлювали за Стьюдентом.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

1. Функціональний стан мембран пермеабілізованих секреторних клітин слинних залоз

Оскільки мета досліджень полягала в ідентифікації та з’ясуванні властивостей внутрішньоклітинних Са2+-транспортувальних систем, виникла потреба підібрати умови пермеабілізації секреторних клітин слинних залоз личинки комара-дергуна. Як детергент використовували алкалоїд рослинного походження – сапонін у концентраціях 0,001; ,01 і 0,1 мг/мл. Для встановлення ступеня пошкодження плазматичної мембрани (ПМ) сапоніном проводили підрахунок зафарбованих клітин залоз 1розчином трипанового синього. У залозах, оброблених сапоніном у концентрації 0,1 мг/мл забарвленими були 90клітин. Фарбування клітин трипановим синім свідчить про порушення цілісності ПМ. Проте не відомо, чи ушкоджена лише ПМ, чи і мембрана ЕПР. Для того, щоб перевірити цілісність мембрани ЕПР, ми тестували функціонування у ній Са2+-помпи за допомогою її блокаторів. Виявилося, що під впливом еозину (20 мкмоль/л) вміст Са2+ у тканині залоз, оброблених сапоніном, зменшувався на 20,27±6,92(Р<0,05, n=17), а під впливом тапсигаргіну (1 мкмоль/л) – на 40,61±9,91(Р<0,05, n=7). Внаслідок додавання АТФ у концентрації 100 мкмоль/л до середовища інкубації, яке містило катіони Mg2+ і Са2+, вміст Са2+ у тканині залоз недостовірно збільшився на 56,83±38,69Додавання до середовища інкубації АТФ у концентрації 1 ммоль/л викликало статистично достовірне збільшення вмісту Са2+ на 92,02±24,67(Р<0,05, n=6), а в концентрації 10 ммоль/л – на 105,05±28,33(P<0,01, n=6). Наведені результати свідчать про функціональну цілісність мембрани ЕПР.

2. Ідентифікація внутрішньоклітинних Са2+-транспортувальних систем

ІФ3-чутливі Са2+-канали секреторних клітин слинних залоз. Більшість дослідників є однодумцями про вирішальну роль ІФ3-чутливих Са2+-каналів для запуску внутрішньоклітинного Са2+-сигналу у секреторних клітинах (; ). Тому першочергове завдання ми вбачали в ідентифікації власне цих каналів вивільнення Са2+ з внутрішньоклітинного депо секреторних клітин слинних залоз комара-дергуна.

Нами встановлено, що інкубування оброблених сапоніном залоз у розчині, що містив ІФ3 спричинювало статистично достовірне (Р<0,05, n=12) зменшення вмісту Са2+ в тканині залоз на 41,14±11,75що прямо свідчить на користь існування ІФ3-чутливих Са2+-каналів внутрішньоклітинних депо. Це підтверджує і той факт, що присутність гепарину (500 мкг/мл) у базовому розчині інкубації повністю знімала ефект ІФ3. Сам по собі гепарин не впливав на вміст Са2+ у тканині залоз, оброблених сапоніном. Таким чином, ми робимо висновок про існування у внутрішньоклітинних мембранах секреторних клітин слинних залоз личинки Chironomus plumosus L. ІФ3-чутливих Са2+-каналів, які активуються інозитолтрифосфатом і блокуються гепарином.

Підтвердження функціонування ріанодинчутливих Са2+-каналів у секреторних клітинах слинних залоз. Відомо, що ріанодинчутливі Са2+-канали, відіграють важливу роль у поширенні хвилі Са2+ від апікального до базального полюсу у секреторних клітинах вищих тварин (Leite et al., 1999; Straub et al., 2000). Внаслідок досліджень, проведених на інтактних клітинах слинних залоз личинки комара-дергуна з використанням їхнього неселективного активатора ? кофеїну, було зроблено припущення про наявність у них ріанодинчутливих Са2+-каналів (Король та ін., 1999).

Нами з’ясовано, кофеїн не змінює статистично достовірно вміст Са2+ в тканині слинних залоз, оброблених сапоніном, як за відсутності, так і у присутності еозину Y у середовищі інкубації. Додавання ріанодину у концентрації 5 нмоль/л до середовища інкубації статистично достовірно (Р<0,01, n=13) зменшувало вміст Са2+ в тканині слинних залоз на 35,18±3,87а у концентрації 500 нмоль/л – достовірно (Р<0,05, n=7) збільшувало на 40,72±12,52На основі цього ми можемо стверджувати, що у секреторних клітинах слинних залоз личинки комара-дергуна наявні ріанодинчутливі Са2+-канали. Крім того, блокування високими концентраціями ріанодину вивільнення Са2+ з внутрішньоклітинних депо за відсутності стимуляції клітини, вказує на певний рівень активності цих каналів за умов експерименту.

Ідентифікація Са2+-уніпортера мітохондрій секреторних клітин. Рутеній червоний часто використовують у дослідженнях для пригнічення Ca2+-уніпортера мітохондрій багатьох типів клітин (Griffiths E.J., 2000; Kannurpattiet al., 2000). Ми встановили, що рутеній червоний (10-5 моль/л) статистично достовірно (Р<0,01, n = 8) зменшував вміст Са2+ у тканині інтактних залоз на 28,95± 6,70За наявності у середовищі блокатора Са2+-помпи еозинуу концентраціях 5, 10 і 20 мкмоль/л рутеній червоний практично не змінював вміст Са2+ у тканині інтактних залоз. Ми припустили, що зменшення вмісту Са2+ у тканині інтактних слинних залоз, яке спостерігається внаслідок додавання рутенію червоного до середовища інкубації, зумовлене зміною функціонування Са2+-помпи ПМ або ЕПР.

Діючи рутенієм червоним на тканину слинних залоз, оброблених сапоніном, за наявності у середовищі інкубації еозину(20 мкмоль/л), ми спостерігали статистично достовірне (P<0,05, n=7) зменшення вмісту Са2+ на 26,98 ± 9,00Тобто, присутність у розчині блокатора Са2+-АТФаз еозинуY вже не перешкоджає дії рутенію червоного, як це було у інтактних клітинах і його вплив реалізується через пригнічення Са2+-уніпортера мітохондрій. Це вказує на те, що він транспортує Ca2+ у мітохондрії в стані спокою клітини за відсутності стимуляції, а не лише за високих концентрацій Са2+ у цитозолі.

3. Локалізація мітохондрій у секреторних клітинах слинних залоз личинки комара-дергуна

Для того щоб глибше зрозуміти участь Са2+-уніпортера у підтриманні гомеостазу Са2+ у цих клітинах, ми досліджували розташування у них мітохондрій. Електронно-мікроскопічні дослідження ультраструктури секреторних клітин слинних залоз личинки комара-дергуна не виявили такого розташування мітохондрій, яке описане для клітин підшлункової залози вищих тварин (Tinel et al., 1999; Park et al., 2000; 2001). Мітохондрії досліджуваних секреторних клітин розміщені, в основному, вздовж базальної частини ПМ (рис. 1 Б), порівняно менше їх є навколо ядра, а поблизу апікальної ділянки їх зовсім нема (рис. 1 А). Цікаво, що мітохондрії у клітинах досліджуваних слинних залоз орієнтуються вздовж осі клітини і перпендикулярно ПМ. Таким чином, у секреторних клітинах слинних залоз личинки комара-дергуна малоймовірною є участь мітохондрій у обмеженні Са2+-сигналів апікальною ділянкою.

4. Взаємодія між внутрішньоклітинними каналами вивільнення Са2+

Дослідження, проведені на секреторних клітин вищих тварин (Cancela et al., 1999; 2000; Ashbi et al., 2003), свідчать про наявність координованого вивільнення Са2+ ріанодин- та ІФ3-чутливими Са2+-каналами. Тому наша мета полягала у встановлені взаємодії між названими каналами вивільнення Са2+ у секреторних клітинах слинних залоз личинки комара-дергуна.

Виявилось (рис. А), що за одночасної наявності у середовищі інкубації ріанодину у концентрації 5 нмоль/л та ІФ3 (10 мкмоль/л) не спостерігалось статистично достовірних (Р=0,65, n=6) змін вмісту Са2+ у тканині слинних залоз, оброблених сапоніном, відносно контролю (середовище, що не містило ні ріанодин, ні ІФ3). Отже, поєднання у інкубаційному середовищі ріанодину та ІФ3 не викликало простої сумації їх поодиноких ефектів, яке проявлялось би у ще більш вираженому вивільненні Са2+ з внутрішньоклітинних депо. Натомість спостерігаємо пригнічення вивільнення Са2+ за одночасної присутності ІФ3 і ріанодину у середовищі інкубації. Цікаво, що збільшення вмісту Са2+ в тканині слинних залоз, оброблених сапоніном, при одночасній дії ріанодину та ІФ3 є статистично достовірним і відносно середовища, що містить лише ІФ3 (Р=0,025, n=7), і відносно середовища, що містить лише ріанодин (Р=0,03, n=7). Виявилось (рис. Б), що при одночасній наявності у середовищі інкубації гепарину та ріанодину (500 нмоль/л) вміст Са2+ достовірно збільшувався на 59,44±23,13(Р=0,04, n=6) відносно контролю. За відсутності ріанодину гепарин статистично достовірно не змінював вміст Са2+ у тканині залоз (Р=0,51, n=6). Можливо, що активація ріанодинчутливих Са2+-каналів ріанодином збільшує кількість активних ІФ3-чутливих Са2+-каналів і цим підсилює блокуючу дію гепарину на них.

Отже, між каналами вивільнення Са2+ з внутрішньоклітинних депо існує тісна взаємодія, яка реалізується вивільненим Са2+ через позитивний зворотний зв’язок (підсилення подальшого вивільнення) та негативний зворотний зв’язок (запобігання подальшому вивільненню Са2+).

5. Регулювання внутрішньоклітинних Са2+-транспортувальних систем секреторних клітин

Роль цАМФ-аденілатциклазної системи. Для вивчення цАМФ-сигнального шляху застосовують активатор аденілатциклази рослинного походження форсколін (Zhang et al., 1999; Nezu, Tanimura, Tojyo, 1999; 2000; Bermingham et al., 2001). Нами встановлено, що під впливом форсколіну (10 мкмоль/л) статистично достовірно (Р=0,009, n=8) збільшувався вміст Са2+ у тканині слинних залоз, оброблених сапоніном, на 111,59±41,70Таке збільшення може відбуватись за рахунок стимуляції надходження Са2+ у депо або блокування неіндукованого вивільнення Са2+. Виявилось, що за наявності у середовищі інкубації гепарину вміст Са2+ у тканині залоз, оброблених сапоніном, під впливом форсколіну не збільшувався, а зменшувався (Р=0,05, n=8). Отже, заблоковане гепарином цАМФ-індуковане збільшення вмісту Са2+ у тканині залоз безпосередньо чи опосередковано пов'язане з функціонуванням ІФ3-чутливого депо Са2+. Встановлено також (рис. 3 А), що цАМФ у концентрації 1 мкмоль/л статистично достовірно (P<0,05, n=8) зменшував вміст Са2+ у тканині залоз на 41,09±9,22Під впливом цАМФ у концентрації 100 мкмоль/л зменшення виявилося менш суттєвим і становило лише 20,06±5,46при (P<0,05, n=8). Лише при 10 мкмоль/л цАМФ не спостерігалось статистично достовірних змін (Р=0,66, n=8) вмісту Са2+ в тканині слинних залоз, оброблених сапоніном. Це свідчить, що цАМФ залежно від концентрації впливає на функціонування різних внутрішньоклітинних Са2+-транспортувальних систем.

За наявності у середовищі гепарину (рис. 3 Б) середньоарифметичне значення вмісту Са2+ у тканині залоз під впливом цАМФ дозозалежно зменшувалося. Але статистично достовірною (Р=0,05, n=8) виявилася лише зміна при 100 мкмоль/л, яка становила 29,26±13,54Це вказує на активацію вивільнення Са2+ каналами, які не чутливі до гепарину, а отже ? на можливу участь ріанодинчутливих Са2+-каналів. Перевіряючи це припущення, ми використовували цАМФ (100 мкмоль/л) з ріанодином у концентрації 500 нмоль/л. Результати показали (рис. 4 Б), що одночасна наявність у середовищі інкубації цАМФ та ріанодину, викликає статистично достовірне збільшення вмісту Са2+ у пермеабілізованих клітинах слинних залоз на 104,13±38,41 % (Р<0,05, n=7). Ріанодин викликає статистично достовірне збільшення вмісту Са2+ у тканині залоз лише на 40,72±12,52Тобто, присутність у середовищі цАМФ підсилює більш ніж удвічі, ріанодин-спричинене збільшення вмісту Са2+ в тканині слинних залоз. Зауважимо, що одночасна дія ріанодину і цАМФ не викликає достовірних змін (Р=0,14, n=7) відносно середовища, де присутній лише ріанодин. Можна припустити, що при блокуванні ріанодинчутливих Са2+-каналів їх специфічним блокатором ? ріанодином, цАМФ не чинив на них активуючої дії. Однак стійка тенденція до збільшення вмісту Са2+ під впливом цАМФ на фоні ріанодину (рис. 4 Б), вказує на те, що ця речовина впливає і на ІФ3-чутливі Са2+-канали. Це підтверджує той факт, що одночасна присутність у середовищі інкубації обох блокаторів (ріанодину і гепарину) запобігала цілковито будь-якій зміні вмісту Са2+ під впливом цАМФ у концентрації 100 мкмоль/л (Р=0,86, n=6).

Нами було встановлено (рис. 4 А), що за наявності ІФ3 у середовищі інкубації цАМФ у концентрації 1 мкмоль/л не чинив статистично достовірних змін вмісту Са2+ в оброблених сапоніном слинних залозах (Р=0,11, n=7). Відносно контролю (середовище без цАМФ і без ІФ3) зміни вмісту Са2+ в тканині залоз, оброблених сапоніном, у середовищі з одночасною наявністю цАМФ та ІФ3 не досягають першого рівня достовірності (Р=0,29, n=7).

Таким чином, ми можемо зробити висновок, що у реалізації ефекту цАМФ залучені як ріанодин-, так і ІФ3-чутливі Са2+-канали. Але якщо дія цАМФ на ріанодинчутливі Са2+-канали прямо чи опосередковано підсилює мобілізацію депонованого Са2+, то на ІФ3-чутливі Са2+-канали такий вплив цАМФ справляє протилежний ефект – вивільнення Са2+ блокується.

Роль цГМФ-гуанілатциклазної системи. Додавання цГМФ у концентраціях 1, 10 і 100 мкмоль/л до середовища інкубації пермеабілізованих клітин слинних залоз личинки комара-дергуна спричиняло збільшення вмісту Са2+, яке не досягало першого рівня достовірності у жодному з випадків (Р=0,62; P=0,96; P=0,80 відповідно, n=8). Тому ми почергово застосовували цГМФ у присутності блокаторів тих Са2+-транспортувальних систем, які могли б піддаватися регуляції цГМФ чи цГМФ-залежними протеїнкіназами. Виявилося, що за наявності у середовищі інкубації гепарину середньоарифметичні значення вмісту Са2+ в тканині залоз у контролі і під дією цГМФ майже не відрізнялися (Р=0,98, n=8). Так само не чинив цГМФ достовірної дії (Р=0,39, n=8) на вміст Са2+ в тканині залоз у присутності ріанодину (500 нмоль/л). Лише за наявності тапсигаргіну цГМФ статистично достовірно (Р=0,02, n=7) викликав збільшення вмісту Са2+ в тканині залоз на 50,65±17,44

Отже, за умов блокування Са2+-помпи ЕПР тапсигаргіном цГМФ пригнічує канали вивільнення Са2+. Це може відбуватись через фосфорилювання цГМФ-залежними протеїнкіназами цих каналів. Напевно, цГМФ також впливає і на Са2+-помпу, пригнічуючи її. Оскільки помпа і канали здійснюють транспортування Са2+ у протилежних напрямках, дія цГМФ не виявляється. Але згідно даних літератури малоймовірним є блокування цГМФ Са2+-помпи ЕПР. Тим не менше пригнічення неіндукованого вивільнення Са2+ цГМФ виявилось лише тоді, коли Са2+-помпа була заблокована.

Значення SH-груп у функціонуванні внутрішньоклітинних Cа2+-транспортувальних систем. У дослідженнях на інтактних слинних залозах личинки комара-дергуна було показано, що важливу роль у підтриманні гомеостазу Са2+ секреторних клітин належить SH-групам (Larina, Manko, Klevets, 2001). Нами встановлено, що інкубація оброблених сапоніном слинних залоз із ПХМБ концентрацях 1, 5 та 10 мкмоль/л не супруводжувалась статистично достовірними змінами вмісту Са2+ у тканині залоз (Р=0,10, Р=0,14, Р=0,56 відповідно, n=6). Проте за наявності у середовищі блокатора Са2+-помпи еозину(20 мкмоль/л) ПХМБ викликав зменшення вмісту Са2+ в тканині залоз. Таке зменшення досягало першого рівня достовірності (Р=0,05, n=6) при концентрації ПХМБ 10 мкмоль/л і становило 35,39±8,19 %. За наявності ПХМБ у цій концентрації ІФ3 збільшував вміст Са2+ в тканині залоз на 25,36±7,42(Р<0,05, n=6). Отриманий результат свідчить про те, що у реалізації впливу ПХМБ на вміст Са2+ у пермеабілізованих клітинах слинних залоз залучені безпосередньо чи опосередковано ІФ3-чутливі Са2+-канали, але участь інших каналів не виключена.

Регуляція кальмодуліном каналів вивільнення Са2+ з депо. У інтактних секреторних клітинах слинних залоз личинки комара-дергуна з використанням хлорпромазину виявлено важливу роль кальмодуліну у регуляції Са2+-транспортувальних систем ПМ (Манько та ін., 2000). Проте регуляція кальмодуліном внутрішньоклітинних Са2+-транспортувальних систем, які забезпечують вивільнення депонованого Са2+, ще не досліджено. Тому наша мета полягала у з’ясуванні участі кальмодуліну у процесах вивільнення Са2+ ІФ3- та ріанодинчутливими Са2+-каналами секреторних клітин.

Виявилось, що додавання хлорпромазину у концентрації 100 мкмоль/л до середовища інкубації слинних залоз, оброблених сапоніном, достовірно не змінює вміст Са2+ у тканині. За наявності хлорпромазину у середовищі, ріанодин у концентрації 5 нмоль/л не викликає статистично достовірних змін (n=7, P=0,19) вмісту Са2+ у тканині залоз (рис. ). Oтже, хлорпромазин запобігає ріанодиніндукованому вивільненню Са2+ з депо. ІФ3 за наявності хлорпромазину у середовищі інкубації не змінює статистично достовірно (P=0,83, n=6) вміст Са2+. Однак відносно контролю вміст Са2+ в тканині залоз, оброблених сапоніном, статистично достовірно зменшує за одночасної дії ІФ3 і хлорпромазину. Таким чином, хлорпромазин дещо послаблює ІФ3-індуковане вивільнення Са2+, але не пригнічує його цілком.

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Аналізуючи і узагальнюючи отримані експериментальні дані, ми дійшли до висновку, що у стані спокою певна кількість ріанодинчутливих Са2+-каналів є активними і вивільняють Са2+ з депо. Для повернення Са2+ у депо повинна функціонувати певна кількість Са2+-помп ЕПР. За таких умов не виникає Са2+-сигнал, але постійний потік іонів Са2+ через внутрішньоклітинні мембрани забезпечує підтримання Са2+-транспортувальних систем у стані готовності до відповіді клітин на зовнішні стимули. За відсутності стимуляції екзогенними чинниками спостерігається також і певна активність Са2+-уніпортера мітохондрій. Це вказує на те, що мітохондрії в стані спокою акумулюють Са2+, який вивільняється з внутрішньоклітинних депо. Таким чином, усі внутрішньоклітинні Са2+-транспортувальні системи функціонують взаємоузгоджено. Особливо чітке спряження спостерігається між процесами вивільнення Са2+ ріанодин- та ІФ3-чутливими каналами. Дія екзогенних чинників таких як хлорпромазин, цАМФ, цГМФ, ПХМБ та ін. обов’язково залучає до відповіді обидва рецептори. Навіть вивільнення Са2+ за дії ІФ3 підсилюється кальцієм, вивільненим ріанодинчутливими каналами і навпаки. Одночасна стимуляція обох рецепторів, яка спричинює локальні, але високі концентрації Са2+ у цитозолі, через негативний зворотний зв’язок пригнічує активність як ІФ3-, так і ріанодинчутливих Са2+-каналів. Отже, у секреторних клітинах слинних залоз личинки комара-дергуна існує спільна „осциляторна одиниця”, наявність якої показано у клітинах ацинусів підшлункової залози щурів (Сancela et al., 2000). Таке об’єднання передбачає, що тригером для первинного вивільнення Са2+ може бути як ІФ3-чутливі Са2+-канали, так й інший тип каналів вивільнення Са2+ з депо, однак підсилення цього процесу здійснюють спільно і ріанодин-, і ІФ3-чутливі Са2+-канали.

Ґрунтуючись на такій взаємодії між каналами вивільнення Са2+ з внутрішньоклітинних депо, ми припускаємо наступні механізми для регуляції цих каналів цАМФ. За дії цАМФ у концентрації 1 мкмоль/л відбувається стимуляція певної кількості ріанодинчутливих Са2+-каналів, що викликає незначне вивільнення Са2+, яке підсилюється через позитивний зворотний зв’язок вивільненням Са2+ з ІФ3-чутливого депо за схемою: цАМФ > ріанодинчутливі Са2+-канали > збільшення цитозольної концентрації Са2+ > збільшення кількості активованих ІФ3-чутливих Са2+-каналів > збільшення цитозольної концентрації Са2+ > підсилення активації ріанодинчутливих Са2+-каналів > зменшення вмісту Са2+ в тканині залоз. Саме це підсилення дії цАМФ на ріанодинчутливі Са2+-канали блокується гепарином. Однак за підвищеної концентрації ІФ3 наведена вище схема не реалізується, аналогічно до того, як не спостерігались статистично достовірні зміни вмісту Са2+ в тканині залоз за одночасної стимуляції ріанодинчутливих Са2+-каналів ріанодином і ІФ3-чутливих інозитолтрифосфатом. У концентрації 100 мкмоль/л цАМФ активує більшу кількість ріанодинчутливих Са2+-каналів, ніж у концентрації 1 мкмоль/л, і, крім того, пригнічує вивільнення Са2+ ІФ3-чутливими каналами.

При активації вивільнення Са2+ ІФ3- та ріанодинчутливими Са2+-каналами, коли концентрація Са2+ у цитоплазмі підвищується, хлорпромазин пригнічує вивільнення Са2+ з депо, а, отже, кальмодулін підсилює цей процес. Механізм такого впливу кальмодуліну може реалізуватись безпосередньо за рахунок наявності сайтів зв’язування на молекулі як ріанодинчутливого, так і ІФ3-чутливих Са2+-каналів. Таке підсилення кальмодуліном ріанодиніндукованого вивільнення Са2+ показано і для інших секреторних клітин (Ozawa, 2001; Zhang et al., 1997). Ми виявили відмінність між впливом хлорпромазину на ріанодинчутливі та на ІФ3-чутливі Са2+-канали. Спираючись на припущення щодо тісного взаємозв’язку між каналами вивільнення Са2+, можна висловити думку, що послаблення хлорпромазином вивільнення Са2+ ІФ3-чутливими каналами реалізується через пригнічення ним вивільнення Са2+ з ріанодинчутливого депо. Тому доцільно говорити не про активування кальмодуліном ІФ3-чутливих Са2+-каналів, а лише про підсилення вивільнення Са2+ з ІФ3-чутливих депо.

На основі отриманих результатів, ми пропонуємо схему взаємодії між внутрішньоклітинними Са2+-транпортувальними системами, які досліджували у цій роботі (рис. 6). Згідно цієї схеми стан спокою секреторної клітини – це стан динамічної рівноваги між усіма Са2+-транпортувальними системами, які підтримують сталою концентрацію Са2+ у клітинах, а дія зовнішніх чинників порушує цю рівновагу і спричинює генерування Са2+-сигналів.

ВИСНОВКИ

Для досягнення поставленої мети та вирішення основних завдань дисертаційної роботи нами розроблено метод пермеабілізації секреторних клітин слинних залоз личинки Chironomus plumosus L. сапоніном. Вимірювання вмісту Са2+ в тканині залоз, оброблених сапоніном, дозволило нам дослідити функціонування внутрішньоклітинних Са2+-транспортувальних систем і зробити наступні висновки.

1. Інозитол-1,4,5-трифосфат викликає зменшення вмісту Са2+ в тканині оброблених сапоніном залоз, яке блокувалось гепарином, що свідчить про функціонування ІФ3-чутливих Са2+-каналів у мембранах внутрішньоклітинних кальцієвих депо.

2. Під впливом ріанодину у концентрації 5 нмоль/л вміст Са2+ у тканині зменшувався, а у концентрації 500 нмоль/л ? збільшувався, що є підтвердженням наявності у секреторних клітинах слинних залоз личинки комара-дергуна ріанодинчутливих Са2+-каналів.

3. За наявності еозину Y у середовищі інкубації рутеній червоний зменшував вміст Са2+ у тканині залоз, оброблених сапоніном, що свідчить про функціонування у мембрані мітохондрій Са2+-уніпортера за відсутності стимуляції клітини.

4. На основі електронно-мікроскопічних досліджень встановлено, що розташування мітохондрій відрізняється у клітинах досліджуваних залоз від інших секреторних клітин вищих тварин. Ці органоїди відсутні в апікальній ділянці і зосереджені в основному на базальному полюсі клітини.

5. Залежно від концентрації цАМФ регулює функціонування різних каналів вивільнення Са2+ з внутрішньоклітинних депо: у концентрації 100 мкмоль/л цАМФ стимулює вивільнення Са2+ ріанодинчутливими каналами, а 1 мкмоль/л цАМФ ? пригнічує вивільнення Са2+ ІФ3-чутливими Са2+-каналами.

6. Циклічний ГМФ пригнічує вивільнення Са2+ внутрішньоклітинними Са2+-каналами лише за наявності тапсигаргіну у середовищі інкубації.

7. Кальмодулін не впливає на функціонування внутрішньоклітинних Са2+-транспортувальних систем за відсутності стимуляції клітин. Однак активація вивільнення Са2+ ріанодин- та ІФ3-чутливими Са2+-каналами суттєво підсилюється кальмодуліном.

8. SH-групи молекул внутрішньоклітинних Са2+-транспортувальних систем відіграють важливу роль у модуляції вивільнення Са2+ з депо.

СПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Манько В.В., Клевець М.Ю., Ларіна О.А., Стельмах (Бичкова) С.В. Слинні залози личинки Chironomus plumosus L. як об’єкт для дослідження Са2+-транспортних систем секреторних клітин // Біологічний вісник Харк. ун-ту. – 2001. – Т.5, №1-2. – С. . (Здобувач провела дослідження по з’ясуванню вкладу Са2+-уніпортера мітохондрій у підтримання гомеостазу Са2+ у інтактних клітинах слинних залоз, брала участь у аналізі експериментальних даних.)

2. Манько В.В., Стельмах (Бичкова) С.В. Вплив рутенію червоного на вміст Са2+ у тканині слинних залоз личинки Сhironomus plumosus // Вісник Львів. ун-ту. Серія біологічна. – 2002. – Вип. 29. – С. 171-176. (Здобувач самостійно провела усі дослідження та статистичне опрацювання результатів, взяла участь в аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні статті.)

3. Бичкова С.В., Манько В.В. Вплив цАМФ на функціонування внутрішньоклітинних Са2+-транспортних систем секреторних клітин // Вісник Львів. ун-ту. Серія біологічна. – 2003. – Вип. 32. – С.222-228. (Здобувач самостійно провела усі дослідження та статистичне опрацювання результаті, взяла участь в аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні статті.)

4. Манько В.В., Бичкова С.В., Клевець М.Ю. Ідентифікація каналів вивільнення Са2+ в секреторних клітинах слинних залоз личинки комара-дергуна // Укр. біохім. журн. – 2004. – Т. , № . – С. . (Здобувач самостійно провела дослідження та статистичне опрацювання результатів, взяла участь в аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні статті.)

5. Stelmakh (Bychkova) S.V., Manko V.V., Larina O.A. The influence ruthenium red on Ca2+-transport systems of secretory cells // 1st Student’ International Congress of Medical Science (SICOMS), May 21-25 2001, Belgrade, Yugoslavia: Scientific program outline and abstracts. – Medicinsky podmladak. – 2001. – Suppl. to Vol. , 1 May. – P. 198. (Здобувач самостійно провела дослідження та статистичне опрацювання результатів, взяла участь в аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез доповіді.)

6. Манько В.В., Стельмах (Бичкова) С.В., Ларіна О.А. Вплив рутенію червоного на Ca2+-транспортні системи секреторних клітин слинних залоз личинки Chironomus plumosus L // Механізми фізіологічних функцій у клініці та експерименті. Тези доповідей конференції до 100 річчя з дня народження проф. Склярова Я.П., Львів, Жовтень-2001. (Здобувач самостійно провела дослідження та статистичне опрацювання результатів, взяла участь в аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез доповіді.)

7. Manko V.V., Tkachenko G.M., Stelmakh (Bychkova) S.V. Lipid peroxidation induction and calcium homeostasis of secretory cells // Program and Abstracts of International Symposium “Intracellular Signaling in Plant and Animal Systems (ISPAS)”, 9-14 September, 2001, Kiev, Ukraine. – S.l., 2001. – P. 80. (Здобувач брала участь у проведенні досліджень, в аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез доповіді.)

8. Манько В.В., Стельмах (Бичкова) С.В., Клевець М.Ю. Влив гепарину на вміст Са2+ у тканині слинних залоз личинки Chironomus plumosus // Актуальні проблеми гастроентерології: Тези доповідей Всеукраїнської наукової конференції, Київ, 20-21 грудня 2001 р. – Київ, 2001. – С. 31. (Здобувач самостійно провела дослідження та статистичне опрацювання результатів, взяла участь в аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез доповіді.)

9. Стельмах (Бичкова) С.В., Манько В.В., Клевец М.Ю. Влияние цАМФ на функционирование внутриклеточных Са2+-транспортных систем секреторных клеток // 6-я Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология – наука XXI века", Пущино, 20-24 мая 2002 г.: Сборник тезисов. – Т. . – Пущино, 2002. – С. 34-35. (Здобувач самостійно провела дослідження та статистичне опрацювання результатів, взяла участь в аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез доповіді.)

10. Stelmakh (Bychkova) S.V., Manko V.V., Klevets M.Yu. The identify of IP3-channels in salivary glands secretory cells of Chironomus plumosus larvae // Programme & Abstracts of 4th Parnas conference “Molecular mechanisms of cell activation: Biological signals and their target enzymes”, September 15-17, 2002, Wrocіaw. – S.l., 2002. – P. 110. (Здобувач самостійно провела дослідження та статистичне опрацювання результатів, взяла участь в аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез доповіді.)

11. Манько В.В., Стельмах (Бичкова) С.В., Ларіна О.А. Пермеабілізовані клітини слинних залоз личинки Chironomus plumosus як об’єкт для дослідження внутрішньоклітинних Са2+-транспортувальних систем секреторних клітин // Матеріали VIII Укр. біохім. з’їзду, 1-3 жовтня 2002 р., м. Чернівці. – Укр. біохім. журн. – 2002. – Т. 64, № а (додаток 1). – С. . (Здобувач самостійно провела дослідження і експериментально підібрала умови пермеабілізації клітин сапоніном, провела статистичне опрацювання результатів, взяла участь в аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез доповіді.)

12. Манько В.В., Стельмах (Bychkova) С.В., Клевець М.Ю. Вплив цАМФ на внутрішньоклітинний гомеостаз Са2+ секреторних клітин // Тези доповідей ІІІ з'їзду Українського біофізичного товариства, 8-11 жовтня 2002 р., м. Львів. – Львів, 2002. – С. 150. (Здобувач самостійно провела дослідження та статистичне опрацювання результатів, взяла участь в