КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
Цирюк Олена Іванівна
УДК 612.323.014.46+615.33
ВПЛИВ МАКРОЛІДІВ НА СЕКРЕТОРНУ ФУНКЦІЮ ШЛУНКА
03.00.13 – фізіологія людини і тварин
Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2004
Дисертація є рукопис.
Робота виконана у НДІ фізіології імені академіка Петра Богача
біологічного факультету Київського національного університету
імені Тараса Шевченка
Науковий керівник: доктор біологічних наук,
старший науковий співробітник
Берегова Тетяна Володимирівна
Київський національний університет імені Тараса Шевченка,
завідувач відділу фармако-фізіології біологічного факультету
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,
професор, академік УААН
Коваленко Віктор Федорович
Інститут свинарства УААН
завідувач лабораторії фізіології
доктор медичних наук, професор Скляров Олександр Якович
Львівський державний медичний університет ім. Данила
Галицького МОЗ України, завідувач кафедри біологічної хімії
Провідна установа:Львівський національний університет
імені Івана Франка (кафедра фізіології людини і тварин), м. Львів
Захист відбудеться “_15___”_вересня___2004 р. о “_16__” годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 при Київському національному
університеті імені Тараса Шевченка за адресою:
03022, Київ-22, пр. акад. Глушкова, 2, біологічний факультет.
Поштова адреса: 01033, Київ, вул. Володимирська, 64,
Київський національний університет імені Тараса Шевченка,
біологічний факультет.
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Київського
національного університету імені Тараса Шевченка за адресою:
01033, м. Київ, вул. Володимирська, 58.
Автореферат розісланий “3” серпня 2004 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 О.В. Цимбалюк
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Відкриття мотилінових рецепторів внесло значний вклад у фізіологію травлення, а саме в розуміння механізмів періодичної діяльності травного тракту. Встановлено, що антибіотики макроліди (еритроміцин, рокситроміцин, кларітроміцин) є агоністами мотилінових рецепторів і в неантибіотичних дозах викликають появу екстраперіоду роботи періодичної моторики травного тракту [Itoh, 1990;1997; Peeters, 1993; Черпак та співавт., 1996; Sarna et al., 1989]. Також встановлено, що їх прокінетичний ефект пов’язаний із збудженням мотилінових рецепторів [Weber et al., 1993; Tsuzuki et al., 1989; Peeters,1993; Sarna, 2000]. Поза увагою дослідників залишилося питання впливу макролідів на секреторну функцію шлунка, про що неодноразово зазначалося в літературі останніх 3-5 років. Відомо лише декілька робіт, присвячених впливу агоністів мотилінових рецепторів на шлункову секрецію: в одній мова йде про відсутність у мотиліну здатності впливати на секрецію соляної кислоти в шлунку [Brown, 1971], в інших – наводяться дані про пригнічуючу дію мотиліну та агоніста мотилінових рецепторів еритроміцина на шлункову секрецію [Черпак та співавт.,1996; Asai et al, 2000; Landry C. et al,1995; Nassar et al,1994; Konturek et al,1977]. В останніх роботах лише констатується феномен зменшення шлункової секреції, лише в одній роботі [Asai et al, 2000] мова йде про механізм даного феномену і припускається, що еритроміцин зменшує кислотність шлункового соку за рахунок прямої дії на обкладові клітини, можливо через мотилінові рецептори. Що стосується впливу мотилінових рецепторів на головні клітини залоз шлунка, в літературі є лише одне повідомлення про стимулюючий вплив мотиліну і еритроміцину на секрецію пепсиногену з ізольованих головних клітин шлунка мурчаків [Fiorucci et al., 1993], що, на думку авторів, свідчить про їх пряму дію на головні клітини. Вияснення механізму впливу макролідів на секреторну функцію шлунка має важливе теоретичне і практичне значення, так як знання механізмів регуляції секреторної функції шлунка дозволить зрозуміти механізми патогенезу ряду захворювань, в основі яких лежить порушення регуляторних механізмів. Так як макроліди є широко вживаною групою антибіотиків [Попкова, 2000], а також завдяки їхнім прокінетичним властивостям [Kaul, 2002; Longo et al.,1993; Ohtawa et al., 1993; Xu et al., 1998] в неантибіотичних дозах використовуються для стимуляції моторики в клініці у хворих з діабетичними гастропарезами [Dull et al.,1990; Janssens et al.,1990; Ueno et al., 2000; Tack et al., 1992; Vantrappen et al., 1989; Peeters T.L, 1992] та у хворих з післяопераційними порушеннями моторики [Kendall et al., 2002; Hanyu et al.,1991; Mozwecz et al., 1990; Tanaka et al., 1988], знання їх впливу на шлункову секрецію дозволить застосовувати їх з урахуванням стану секреторних залоз. Крім того, макроліди включені у комплекс лікування виразкової хвороби, що супроводжується хелікобактерним інфікуванням. Таким чином, теоретичне та практичне значення досліджень впливу макролідів на шлункову секрецію, обмежені дані літератури щодо цього питання та невідомий механізм дії на секреторну функцію шлунка обумовили вибір теми дисертаційної роботи та постановку конкретних задач досліджень.
Зв’язок роботи з науковими планами, темами. Дисертаційна робота виконана в рамках наукової теми відділу фармако- фізіології Науково-дослідного інституту фізіології імені академіка Петра Богача біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка “Дослідження ролі нехолінергічних факторів (мотилін, гістамін, ендотеліальні фактори) у регуляції функціонального стану шлунково-кишкового тракту”, № держреєстрації 0101U002485. Тема дисертаційної роботи затверджена на засіданні Вченої ради біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка, протокол №3/357 від 29 жовтня 2001 року. Відкоректована і перезатверджена тема на засіданні Вченої ради біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка, протокол №5 від 15 грудня 2003 р.
Мета і завдання дослідження. Метою роботи було дослідження впливу антибіотиків макролідів, агоністів мотилінових рецепторів, на секреторну функцію шлунка.
Відповідно до мети перед нами були визначені такі завдання:
1) Дослідити вплив макролідів еритроміцину та рокситроміцину на стимульовану інсуліном, карбахоліном, гістаміном та пентагастрином шлункову секрецію у собак з інтактною нервовою системою;
2) Вивчити вплив макролідів на стимульовану карбахоліном і гістаміном шлункову секрецію у собак з селективною та розширеною селективною проксимальною ваготомією шлунка;
3) Дослідити вплив рокситроміцину на шлункову секрецію кислоти, стимульовану карбахоліном, у щурів;
4) Дослідити вплив макролідів на шлункову секрецію у собак в умовах блокади синтезу оксиду азоту (NO) та провести визначення зміни вмісту NO2- в шлунковому соку під дією рокситроміцину;
5) Дослідити вплив макролідів на шлункову секрецію у щурів в умовах блокади виділення вазоактивного інтестинального пептиду (ВІП).
Об’єкт дослідження – механізми регуляції секреторної функції шлунка.
Предмет дослідження – рівень секреції шлункового соку та його основних неорганічних (соляна кислота і NO) та органічних (пепсин) компонентів під впливом агоністів мотилінових рецепторів - антибіотиків макролідів.
Методи дослідження – Дослідження проведені в умовах хронічного експерименту на 11 безпородних собаках з фістулами, вживленими в фундальний відділ шлунка та дванадцятипалу кишку, і в гострих експериментах на 40 білих нелінійних щурах-самцях. Вивчали вплив макролідів на шлункову секрецію у собак, стимульовану інсуліном, карбахоліном, гістаміном та пентагастрином. Для вивчення ролі центральних та периферичних мотилінових рецепторів в регуляції шлункової секреції у собак було використано метод хірургічного аналізу, а саме: досліджували вплив макролідів на шлункову секрецію у собак з інтактною нервовою системою та у собак після селективної та розширеної селективної проксимальної ваготомії шлунка. Досліджували наступні показники шлункової секреції: інтенсивність соковиділення, кислотність шлункового соку та вміст у ньому пепсину. Показником інтенсивності соковиділення був об’єм виділеного шлункового соку. Кислотність шлункового соку визначали за допомогою методу автоматичного титрування [Гройсман, 1988]. Концентрацію пепсину в шлунковому соку визначали за методом Ханта [Hunt, 1948]. Шлункову секрецію у щурів вивчали методом перфузії ізольованого шлунка за Гхошем та Шільдом [Ghosh et al., 1958].
Наукова новизна одержаних результатів. Робота містить нові дані про ефект та механізм дії агоністів мотилінових рецепторів – антибіотиків макролідів на секреторну функцію шлунка.
Вперше показано, що макроліди (еритроміцин та рокситроміцин) пригнічують шлункову секрецію, стимульовану карбахоліном, пентагастрином, гістаміном, та не впливають на інсулінову шлункову секрецію у собак з інтактною нервовою системою. Парасимпатична денервація шлунка не впливає на гальмівну дію макролідів на шлункову секрецію. Доведено, що мотилінові рецептори центральної нервової системи не беруть участі в регуляції секреторної функції шлунка, а гальмівний ефект макролідів на шлункову секрецію не є результатом їх прямої дії на секреторні клітини.
Встановлено, що гальмівна дія макролідів на шлункову секрецію не є видоспецифічною: рокситроміцин зменшував шлункову секрецію кислоти, стимульовану карбахоліном, як у собак, так і у щурів.
Вперше встановлено, що рокситроміцин збільшує вміст NO2- в шлунковому соку, а блокатор NO-синтази N-G-нітро-L-аргінінметилового ефіру (L-NAME) усуває гальмівний ефект рокситроміцину на гістамінову шлункову секрецію та усуває його стимулюючий вплив на виділення NO з шлунковим соком у собак. Блокатор ВІП усуває гальмівну дію рокситроміцину на шлункову секрецію кислоти, стимульовану карбахоліном, у щурів. Зроблено висновок, що гальмівний механізм дії макролідів на шлункову секрецію реалізується через їх вплив на мотилінові рецептори інтернейронів інтрамуральної нервової системи, що веде до виділення ацетилхоліну з аксонів даних нейронів, який, в свою чергу, збуджує NO- та ВІП-ергічні мотонейрони із закінчень яких виділяється NO та ВІП, які відповідно пригнічують гістамінову та карбахолінову секрецію.
Практичне значення одержаних результатів. Так як в патогенезі виразкової хвороби дванадцятипалої кишки доведена роль кислотно-пептичного фактора, то отримані дані не лише розширюють наші уявлення про механізм регуляції шлункової секреції, але і є передумовою для розробки і впровадження нових методів лікування виразкового дефекту.
Результати дисертаційного дослідження з 2003 року впроваджені в хірургічному відділенні Хмельницької обласної клінічної лікарні: включення макролідів в комплексну післяопераційну терапію хворих, які перенесли операцію екстрагастральної ваготомії з приводу виразки дванадцятипалої кишки, попереджає розвиток парезів та паралічів кишечника, утворення гострих виразок та полегшує стан хворих у післяопераційному періоді. Дані дисертації включені в курс лекцій „Фізіологічна фармакологія” на кафедрі фізіології людини і тварин біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.
Особистий внесок здобувача. Автор самостійно провів патентно-інформаційний пошук і аналіз наукової літератури за даною проблемою. Автором особисто виконано весь обсяг експериментальних досліджень на базі Інституту фізіології імені академіка Петра Богача біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка, проведено статистичне опрацювання одержаних результатів. Автор безпосередньо брав участь у виконанні хірургічних втручань пов’язаних з накладанням фістул на шлунок та дванадцятипалу кишку. У виконанні операцій накладання фістул та у післяопераційному догляді за тваринами брали участь кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник М.М. Харченко, провідні інженери Л.Ф Куровська, Т.В. Овчарик.
Вибір теми дисертаційної роботи, постановка мети і задач, вибір об’єкта досліджень, а також методів, адекватних вирішенню задач дослідження, і формулювання висновків зроблені спільно з науковим керівником.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідались та обговорювались на: ІІІ міжнародному конгресі по цито- та органопротекції (Лонг Біч, США, 2000); 101-й щорічній конференції американського гастроентерологічного товариства (Сан Дієго, США, 2000); науковій конференції студентів та молодих вчених Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця з міжнародною участю (Київ, 2000);. міжнародній конференції присвяченій 75-річчю з дня народження А.М.Уголєва „Механізми функціонування вісцеральних систем” (Санкт-Петербург, Росія, 2001);. 12-й Європейській конференції для студентів медиків та молодих вчених (Берлін, Німеччина, 2001); науковій конференції присвяченій 100-річчю академіка Р.О.Файтельберга (Одеса, 2003); XYI з’їзді Українського фізіологічного товариства. (Вінниця, 2002 р); міжнародній конференції „Нейро-гуморальні і клітинні механізми регуляції процесів травлення” (Львів 2003).
Публікації. За результатами досліджень опубліковано 13 наукових праць (4 статті, з них 3 - у фахових наукових виданнях України та 9 тез - у матеріалах вітчизняних та міжнародних конференцій).
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, 2-ох розділів із викладом отриманих результатів, розділу, присвяченому аналізу і узагальненню результатів, висновків, практичних рекомендацій, списку літератури, який складається із 228 найменувань. Матеріали дисертаційної роботи викладені на 126 сторінках (основна частина 100 сторінок). Робота ілюстрована 20 рисунками і 7 таблицями.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи досліджень
Дослідження шлункової секреції у собак. Дослідження проводились в умовах хронічного експерименту на 2-ох групах безпородних собак масою 10-18 кг, яким були вживлені фістули в фундальний відділ шлунка та дванадцятипалу кишку за методом Басова – Павлова. І група - собаки з інтактною нервовою системою (ІНС) (7 тварин), ІІ група - собаки з парасимпатичною денервацією шлунка (4 тварини: 2 – з селективною ваготомією шлунка, 2 – із розширеною селективною проксимальною ваготомією шлунка).
Оперативні втручання виконували під загальним знечуленням з використанням нембуталу (35 мг/кг, внутрішньовенно) чи тіопенталу натрію (35 мг/кг, внутрішньовенно).
Шлункову секрецію у собак стимулювали гістаміном дигідрохлоридом (фармацевтична фірма “Здоров’я”, Україна ) в дозі 0,05 мг/кг [Берегова, 2001; Толстанова, 2003], невибірковим агоністом мускаринових рецепторів карбахоліном у дозах 0,0025 та 0,005 мг/кг [Михельсон, 1970; Doss, 1991], пентагастрином (Sigma Chemical Co, St. Louis, США) у дозі 0,012 мг/кг [Берегова, 2001; Helmer 2004; Wong, 1995], інсуліном (Lilly France S. A., Франція) в дозі 0,5 од./кг (Толстанова, 2003). Всі стимулятори шлункової секреції вводили підшкірно. Досліджували дію еритроміцину (Курганський завод) та рокситроміцину (Hoechst Roussel Uclef, Франція) в дозах 0,375 0,750 та 1,5 мг/кг при підшкірному та внутрішньокишковому (в/к) їх введеннях на стимульовану шлункову секрецію.
Протягом стимулюючої дії карбахоліну, гістаміну чи пентагастрину (1,5 години) та інсуліну (4 години) в 30-ти хвилинних пробах визначали інтенсивність секреторного процесу за об’ємом виділеного шлункового соку, автоелектротитрометрично визначали кислотність в титраційних одиницях [Гройсман и соавт., 1988] та концентрацію пепсину за Хантом [Hunt, 1948]. Після цього вираховували об’єм шлункового соку, що виділився за весь дослід, обчислювали дебіт кислоти та концентрацію і дебіт пепсину - в кожній пробі та за весь дослід.
Для дослідження механізму гальмівної дії макролідів на шлункову секрецію було використані неселективний блокатор NO-синтази L-NAME (Sigma-Aldrich Ltd, Німеччина) в дозі 2,5 мг/кг внутрішньовенно (Esplugues, 1993; Kato, 1998).
Дослідження шлункової секреції у щурів. Дослідження шлункової секреції кислоти у щурів проводилися в гострих дослідах методом перфузії ізольованого шлунка за Гхошем та Шільдом [Ghosh et al., 1958]. Щурів наркотизували уретаном (Sigma Chemichal Co, St. Louis, USA) у дозі 1,1 г/кг ваги (внутрішньоочеревинно). Вивчали вплив рокситроміцину (3 мг/кг, внутрішньоочеревинно) на карбахолінову (0,01 мг/кг, внутрішньоочеревинно) шлункову секрецію кислоти у щурів до та після попереднього введення блокатора вазоактивного інтестинального пептиду [Lys1,Pro2,5,Arg3,4,Tyr6] в дозі 10 нмоль/кг [Blank , 1990]. Протягом стимулюючої дії карбахоліну (2 години) в 10-ти хвилинних пробах перфузату електротитрометрично визначали кислотність [Гройсман и соавт., 1988].
Методика визначення вмісту оксиду азоту в шлунковому соку. Вміст аніонів нітриту (NO2-) в шлунковому соку оцінювався за допомогою реактива Грісса (Green, 1982). Отримані реакційні суміші підлягали спектрометричному (колорометричному) аналізу. Максимум поглинання світла забарвленим розчином відбувається при довжині хвилі =550 нм. Перерахунок одержаних даних в умовних одиницях екстинції проводили за калібрувальною кривою.
Для перевірки розподілу на нормальність було застосовано W тест Шапіро-Уілксона. Імовірність похибки першого роду ? > 0,05. Оскільки наші дані виявилися нормально розподілені ми розраховували середнє значення (М), похибку середнього (m). Порівняння вибірок проводилося за допомогою t-критерію Стьюдента [Тюрин, 1998].
Результати досліджень та їх обговорення
Вплив еритроміцину та рокситроміцину на шлункову секрецію у собак з інтактною нервовою системою. У результаті проведених досліджень встановлено, що у собак з інтактною нервовою системою еритроміцин в дозі 0,375 мг/кг не впливав на інтенсивність секреції та дебіт кислоти шлункового соку, стимульованого карбахоліном. Дебіт пепсину зменшувався з 2,48 +0,33 до 1,43+0,18 мг, або на 42,3% (р<0,05, n=20).
Збільшення дози еритроміцину вдвічі (0,75 мг/кг) призводило до достовірних змін усіх досліджуваних показників шлункової секреції. Інтенсивність соковиділення зменшувалась з 52,2+ 3,5 до 29,6+2,7 мл, або на 43,2% (р<0,001, n=20), дебіт кислоти виділеного шлункового соку – з 4,0+0,26 до 2,12+0,3 ммоль, або на 47,2% (р<0,01, n=20), дебіт пепсину - з 2,15+0,2 до 0,84+0,21 мг, або на 60,9% (р<0,001, n=20).
Подальше збільшення дози еритроміцину до 1,5 мг/кг призводило до поглиблення його гальмівного впливу на карбахолінову шлункову секрецію: об’єм соку зменшувався на 50,8% (p<0,001), дебіт кислоти –на 56,7% (p<0,001), дебіт пепсину –на 70,4% (p<0,001) (рис.1).
Рис.1 Вплив еритроміцину (1,5 мг/кг) на шлункову секрецію, стимульовану периферичними стимуляторами:
1- карбахолін (0,005 мг/кг, n=22); 2- еритроміцин+ карбахолін (n=14);
3- гістамін (0,05 мг/кг, n=10); 4- еритроміцин+ гістамін (n=10);
5- пентагастрин (0,012 мг/кг, n=10); 6- еритроміцин+ пентагастрин (n=10).
Примітка: *** -р<0,001;** -р<0,01; * -р<0,05.
В дозі 0,375 мг/кг еритроміцин не впливав і на гістамінову шлункову секрецію, а в дозі 1,5 мг/кг зменшував інтенсивність гістамінової шлункової секреції на 50,9% (p<0,01). Дебіт кислоти та дебіт пепсину виділеного шлункового соку відповідно зменшувалися на 50,0% (p<0,05) та 45,6% (p<0,05). Найменший вплив еритроміцин справляв на пентагастринову шлункову секрецію: інтенсивність соковиділення зменшувалась на 26,2 % (p<0,001), дебіт кислоти виділеного шлункового соку - на 20,5 % (p<0,001), дебіт пепсину - на 31,6 % (p<0,01) (рис.1).
Аналогічним чином на шлункову секрецію впливав рокситроміцин. У собак з інтактною нервовою системою рокситроміцин у дозі 0,375 мг/кг не впливав на досліджувані показники шлункової секреції, стимульованої карбахоліном та гістаміном. Проте в дозі 1,5 мг/кг рокситроміцин зменшував інтенсивність карбахолінової шлункової секреції на 51,7% (p<0,01). Дебіт кислоти та дебіт пепсину виділеного шлункового соку відповідно зменшувалися на 65% (p<0,01) та 58% (p<0,01) (рис.2). У цій же дозі рокситроміцин зменшував інтенсивність гістамінової шлункової секреції на 64,3% (p<0,001), дебіт кислоти – на 65,2% (p<0,01), дебіт пепсину – на 55,4% (p<0,05). Як і еритроміцин, рокситроміцин найменше впливав на пентагастринову шлункову секрецію. Так, об’єм шлункового соку зменшувався на 26,5% (р<0,001), дебіт кислоти – на 36,5% (р<0,001), дебіт пепсину - на 26,3 % (р<0,01).
Рис.2 Вплив рокситроміцину (1,5 мг/кг) на шлункову секрецію, стимульовану периферичними стимуляторами:
1- карбахолін (0,005 мг/кг, n=11); 2- рокситроміцин+ карбахолін (n=12);
3- гістамін (0,05 мг/кг, n=9); 4- рокситроміцин+ гістамін(n=13);
5- пентагастрин (0,012 мг/кг, n=10); 6- рокситроміцин+ пентагастрин (n=10).
Примітка: *** -р<0,001;** -р<0,01; * -р<0,05.
Дослідження ролі центральних мотилінових рецепторів у гальмівній дії макролідів на шлункову секрецію. Враховуючи центральну та периферичну локалізацію мотилінових рецепторів [Korchak, 1984; Loftus, 1986; Feihner, 1999; Depoortere, 1993; 1991] та відсутність даних про особливості їх ролі в регуляції функцій травної системи, метою наступної серії досліджень було з’ясування участі центральних мотилінових рецепторів у регуляції шлункової секреції. Класичними методами, які використовуються в фізіології шлункової секреції, для з’ясування ролі рецепторів до тих чи інших субстанцій у центральній нервовій системі є експерименти з інтрацеребральним введенням речовин, експерименти на тваринах із ваготомією шлунка та застосування стимуляторів шлункової секреції з центральним та периферичним механізмом дії. Два останніх методи були використані нами для з’ясування ролі центральних мотилінових рецепторів в гальмівній дії макролідів на шлункову секрецію у собак. Дослідження розпочинали з контрольних експериментів, в яких собакам вводили лише стимулятор шлункової секреції – карбахолін. Ваготомовані собаки як з селективною ваготомією шлунка, так і з розширеною селективною проксимальною ваготомією шлунка, мали підвищену чутливість до карбахоліну, що проявлялось у блювоті, надмірному виділенню жовчі, дуодено-гастральному рефлюксі й інтенсивному соковиділенні. Явище підвищеної чутливості ваготомованих собак до холіноміметиків добре описано в літературі [Берегова, 2001; Ивашкин, 1981]. У результаті ми змушені були зменшити дозу карбахоліну вдвічі, і хоча інтенсивність шлункової секреції залишалася більшою, ніж у собак з інтактною нервовою системою, проте вона була меншою, ніж при дозі 0,005 мг/кг. Крім того, при введенні карбахоліну в дозі 0,0025 мг/кг блювота і дуодено-гастральний рефлюкс виникали рідко.
За показниками шлункової секреції в контрольних експериментах, так і в дослідах з введенням макролідів, собаки з селективною ваготомією та з селективною розширеною ваготомією, між собою не відрізнялись, тому вони були об’єднані в одну групу. У результаті проведених досліджень встановлено, що еритроміцин та рокситроміцин в дозі 0,375 мг/кг не справляли статистично достовірного впливу на шлункову секрецію, стимульовану карбахоліном, у собак з селективною ваготомією шлунка. У цих же собак макролід еритроміцин у дозі 1,5 мг/кг зменшував інтенсивність карбахолінової шлункової секреції з 119,8+8,1 до 26,7+3,3, або на 78,0% (p<0,001, n=22), дебіт виділеної кислоти – з 16,49+1,90 до 2,27+0,37 ммоль, або на 86,0% (p<0,001, n=22), дебіт пепсину – 4,21+0,87 до 0,95+0,14 мг, або на 77,0%(p<0,01, n=22).
Аналогічно еритроміцину на карбахолінову шлункову секрецію у ваготомованих собак впливав й інший агоніст мотилінових рецепторів – рокситроміцин. В дозі 1,5 мг/кг він зменшував інтенсивність шлункової секреції, стимульованої карбахоліном з 115,4+7,0 (n=10) до 58,4+4,5 мл n=10), дебіт кислоти - з 16,54+1,74 (n=10) до 6,45 +0,62 ммоль (n=10), дебіт пепсину - з 4,48+0,33 (n=10) до 2,40+0,24 мг (n=10). Це відповідало зменшенню об’єму соку на 49,4 % (p<0,001), дебіту кислоти на 61% (p<0,001), дебіту пепсину на 46,4% (p<0,001).
Таким чином, селективна ваготомія шлунка не усувала гальмівної дії еритроміцину на шлункову секрецію, стимульовану карбахоліном. Наші дані збігаються із даними Maскле та співавт. [Masclee, 1995], які показали, що у людей після операції стовбурової ваготомії еритроміцин не усував секрецію панкреатичного поліпептиду.
У собак з парасимпатичною денервацією шлунка рокситроміцин в дозі 1,5 мг/кг зменшував інтенсивність гістамінової шлункової секреції на 42,2 % (p<0,001, n=20), дебіт кислоти виділеного шлункового соку на 59 % (p<0,001, n=20) і не впливав на дебіт пепсину.
Встановлений факт, що ваготомія не усувала гальмівної дії макролідів на карбахолінову та гістамінову шлункову секрецію, дозволив нам заключити, що дія макролідів на секреторну функцію шлунка реалізується лише за рахунок взаємодії з периферичними мотиліновими рецепторами. Для перевірки нашого твердження ми провели дослідження впливу рокситроміцину та еритроміцину на шлункову секрецію, викликану центральним збудженням блукаючих нервів за допомогою інсулінової гіпоглікемії. Встановлено, що еритроміцин та рокситроміцин у дозі 1,5 мг/кг не впливали на секреторну відповідь шлунка, стимульовану інсуліном.
Враховуючи отримані результати, можна зробити узагальнюючий висновок, що мотилінові рецептори центральної нервової системи не беруть участі в регуляції шлункової секреції у собак, а гальмівний ефект агоністів мотилінових рецепторів на шлункову секрецію, викликану периферичними стимуляторами, обумовлений збудженням лише периферичних мотилінових рецепторів, локалізованих поза клітинами секреторних залоз шлунка. У протилежному разі зменшувалась би шлункова секреція, стимульована збудженням глюкосенситивної зони гіпоталамусу інсуліновою гіпоглікемією.
Влив еритроміцину і рокситроміцину на шлункову секрецію в умовах блокади NO-синтази. За даними літератури, агоністи мотилінових рецепторів стимулюють моторику фундального відділу шлунка та кишечника, проте пригнічують моторику пілоричного відділу шлунка [Parkman et al., 1996]. Особливу нашу увагу привернули роботи щодо дії макролідів на моторику пілоричного відділу шлунка, адже шлункову секрецію, стимульовану периферичними секретагогами, вони також пригнічували. Паркман та співавтори показали, що гальмівний ефект еритроміцину на моторику пілоруса зменшувався на фоні блокади NO-синтази і блокатора вазоактивного інтестинального поліпептиду [Parkman et al., 1996]. Автори зробили висновок, що гальмівний ефект еритроміцину на пілоричний відділ шлунка реалізується через активацію мотилінових рецепторів на гальмівних мотонейронах інтрамуральної нервово системи і що саме оксид азоту і вазоактивний інтестинальний поліпептид є медіаторами даного ефекту [Parkman H.P., 1996]. Ми також припустили, що медіаторами ефекту макролідів на шлункову секрецію є оксид азоту і вазоактивний інтестинальний поліпептид. У зв’язку з цим перед нами стояло завдання дослідити зміни шлункової секреції, які відбуваються при дії макролідів за умов блокади NO-синтази. В якості блокаторів NO-синтази ми використали неселективний блокатор NO-синтази N-G-нітро-L-аргінінметиловий ефір (L-NAME). Встановлено, що неселективний блокатор NO-синтази L-NAME (2,5 мг/кг, внутрішньовенно) не справляв достовірного впливу на досліджувані показники гістамінової шлункової секреції, але повністю усував гальмівну дію рокситроміцину на шлункову секрецію у собак, стимульовану гістаміном (рис.3).
Рис. 3 Вплив рокситроміцину (1,5 мг/кг, в/к) на показники гістамінової шлункової секреції (0,05 мг/кг, п/ш) в умовах блокади NO-синтази за допомогою N-G-нітро-L-аргінінметилового ефіру (L-NAME):
1 - контроль (гістамін) (n=10); 2 – гістамін + рокситроміцин (n=10); 3 – гістамін + L-NAME (n=10); 4 – гістамін + L-NAME + рокситроміцин (n=10).
Примітка: *** -р<0,001.
Для перевірки нашого твердження про те, що еритроміцин стимулює виділення NO, ми провели визначення концентрації NO2- в шлунковому соку, стимульованому гістаміном, до і після введення еритроміцину. Виявилось, що еритроміцин статистично достовірно збільшував концентрацію NO2- з 11,41+0,72 до 15,38+0,27 мкмоль/л, або на 34,8% (р < 0,05, n=14). Блокатор NO-синтази L-NAME не лише усував гальмівну дію еритроміцину на гістамінову шлункову секрецію, але й усував стимулюючий вплив еритроміцину на виділення NO. Разом з тим L-NAME не тільки не усував, але і поглиблював гальмівний вплив рокситроміцину на карбахолінову шлункову секрецію.
Дослідження впливу рокситроміцину на шлункову секрецію у щурів. Секреторний процес у шлунку собак, у порівнянні з людиною, має певні особливості. Насамперед, це відсутність базальної секреції [Рибальченко, 2002]. Враховуючи, що дані відносно дії препаратів на шлункову
секрецію у собак, як правило, є експериментальним обгрунтуванням доцільності їх використання в клінічній практиці, слушним, на наш погляд, була перевірка видоспецифічності ефекту тих чи інших речовин на секреторний процес та встановлення регуляторних механізмів, однакових для різних видів ссавців. В зв’язку з цим метою даного розділу досліджень було вивчення впливу макроліда рокситроміцину на карбахолінову шлункову секрецію у щурів.
У результаті проведених досліджень встановлено, що у щурів рокситроміцин зменшував дебіт соляної кислоти шлункового соку, стимульованого карбахоліном на 30,8 % (р0,05, n=20), що свідчить про відсутність видоспецифічності ефекту макролідів на шлункову секрецію ссавців.
Як уже було сказано у попередньому розділі, у собак L-NAME – блокатор NO-синтази, фермента, за участю якого з L-аргініну утворюється NO, не впливає на гальмівний ефект рокситроміцину на карбахолінову секрецію. Даний результат свідчить, що якась інша гальмівна субстанція, а не NO, виконує роль трансмітера в гальмівному ефекті рокситроміцину на карбахолінову шлункову секрецію. Припустивши, що таким трансмітером є ВІП, нам слід було дослідити дію рокситроміцину на фоні блокади ендогенного ВІП.
З отриманих результатів зрозуміло, що блокатор ВІП [Lys1,Pro2,5,Arg3,4,Tyr6] не впливав на шлункову секрецію кислоти, стимульовану карбахоліном: дебіт кислоти в дослідах, в яких на фоні карбахолінової секреції вводили блокатор ВІП [Lys1,Pro2,5,Arg3,4,Tyr6], становив 11,86+0,08 титр. од./160 хв при 12,59+0,51 титр. од. в контролі (карбахолін). Проте блокада ендогенного ВІП усувала гальмівну дію рокситроміцину на секрецію кислоти, стимульовану карбахоліном. Навіть відбувалося незначне збільшення сумарного дебіту кислоти за весь дослід з 12,59+0,51 титр. од. до 13,01+0,71 титр. од./160 хв, але це збільшення було статистично недостовірним (рис.4).
Таким чином, зроблено висновок, що трансмітером гальмівної дії рокситроміцину на карбахолінову шлункову секрецію є ВІП. Схематично даний механізм можна уявити так: агоніст мотилінових рецепторів рокситроміцин збуджує мотилінові рецептори, які локалізовані на мембрані холінергічних інтернейронів підслизового плетива інтрамуральної нервової системи, що призводить до вивільнення ацетилхоліну і його взаємодії з нікотиновим ацетилхоліновим рецептором на мембрані гальмівного мотонейрону (рис.5). Збудження гальмівного мотонейрону спричиняє вивільнення з його закінчень гальмівної субстанції ВІП. На користь нашого твердження свідчать дані про наявність ВІП у міентеральних нервових плетивах шлунка, слизовій оболонці тонкого та товстого кишечника у різних видів тварин [Furness, 1990; Keast, 1985]. Також встановлено, що він присутній у нервових закінченнях слизової оболонки шлунка [Schubert, 1991; Lefebbvre, 1995].
Рис. 4 Влив блокатора вазоактивного інтестінального поліпептиду (ВІП) [Lys1,Pro2,5,Arg3,4,Tyr6] (10 нмоль/кг, в/в) на гальмівні ефекти рокситроміцину (3,0 мг/кг, в/о) на секрецію кислоти в шлунку щурів, стимульовану карбахоліном (0,01 мг/кг, в/о):
1- контроль карбахолін (n=10); 2- блокатор ВІП+карбахолін (n=10); 3- рокситроміцин + карбахолін (n=10); 4- рокситроміцин+ блокатор ВIП +карбахолін (n=10).
Примітка:*-р<0,05 відносно контролю.
Якби фармакологічний антагонізм блокатора ВІП до ефекту рокситроміцину на карбахолінову шлункову секрецію кислоти був неповним, ми б вважали, що в даному ефекті беруть участь декілька гальмівних субстанцій. Нечутливість даного ефекту рокситроміцину до блокатора NО синтази і повна блокада його антагоністом ВІП свідчить, що ВІП є єдиним трансмітером гальмівної дії макроліду на карбахолінову шлункову секрецію. Тобто, нервова передача даного ефекту рокситроміцину є ВІП-ергічною, де ВІП діє без участі інших котрансмітерів, тоді як у випадку гістамінової шлункової секреції гальмівний ефект рокситроміцину повністю залежить від NО.
Нассар та співавт. шляхом в/в інфузії ВІП ваготомованим щурам показали, що у відсутності вагусного контролю ВІП може справляти прямий гальмівний вплив на базальну секрецію кислоти [Nassar, 1995]. Попередніми нашими дослідженнями було встановлено, що ваготомія не впливає на гальмівний ефект макролідів на карбахолінову шлункову секрецію, що теж може бути ще одним, опосередкованим, доказом участі ВІП в ефекті рокситроміцину на карбахолінову секрецію.
Таким чином, ми дійшли до висновку, що медіаторами гальмівної дії макролідів на шлункову секрецію є дві гальмівні субстанції, NO і ВІП, які виділяються паралельно гальмівними мотонейронами інтрамуральної нервової системи. Залежно від стимулятора секреції і проявляється дія тієї чи іншої субстанції.
Рис. 5 Гіпотетична схема впливу збудження мотилінових рецепторів в ентеральній нервовій системі на секрецію кислоти в шлунку.
ВИСНОВКИ
У дисертації, відповідно до поставленої мети, вирішене актуальне наукове завдання, що стосується участі мотилінових рецепторів у регуляції шлункової секреції, та зроблені такі висновки:
Макроліди гальмують шлункову секрецію шляхом збудження мотилінових рецепторів на інтернейронах ентеральної нервової системи, що призводить до вивільнення з аксонів цих нейронів ацетилхоліну, який, в свою чергу, збуджує гальмівні мотонейрони, із закінчень яких виділяються оксид азоту та вазоактивний інтестинальний поліпептид.
Агоністи мотилінових рецепторів макроліди еритроміцин та рокситроміцин гальмують шлункову секрецію у собак з інтактною нервовою системою, стимульовану карбахоліном, гістаміном, пентагастрином, та не впливають на інсулінову шлункову секрецію. Макроліди не мають прямого впливу на клітини секреторних залоз шлунка.
Селективна ваготомія та розширена селективна проксимальна ваготомія шлунка у собак не впливають на гальмівний ефект макролідів на шлункову секрецію. Активація мотилінових рецепторів не залежить від тонічних впливів, які передаються по блукаючих нервах з центральної нервової системи до парієтальних клітин.
Мотилінові рецептори центральної нервової системи не беруть участі в регуляції секреторної функції шлунка у собак.
Рокситроміцин пригнічує секрецію соляної кислоти, стимульовану карбахоліном у щурів, що є свідченням відсутності видоспецифічності ефекту макролідів на шлункову секрецію.
Рокситроміцин збільшує концентрацію оксиду азоту в шлунковому соку, стимульованому гістаміном. Блокатор NO-синтази L-NAME усуває гальмівний вплив рокситроміцину на гістамінову шлункову секрецію та не впливає на його гальмівну дію на карбахолінову шлункову секрецію.
Блокатор вазоактивного інтестинального поліпептиду [Lys1,Pro2,5,Arg3,4,Tyr6] усуває гальмівну дію рокситроміцину на карбахолінову секрецію кислоти в шлунку щурів.
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
Суходоля А.І., Берегова Т.В., Харченко М.М., Штанова Л.Я., Цирюк О.І. Розширена проксимальна селективна ваготомія // Клінічна хірургія.- 1999.-№7.- С.45-46. (Здобувачем особисто проведені експериментальні дослідження, статистична обробка та аналіз результатів, підготовка матеріалів до друку. Співавтори: Суходоля А.І. – проведення операції розширеної проксимальної ваготомії; Берегова Т.В. – загальне керівництво роботою, редагування; Харченко М.М. – післяопераційний догляд за тваринами; Штанова Л.Я. – визначення концентрації пепсину в шлунковому соку.)
БереговаТ.В., Цирюк О.І., Куровська Л.Ф., Овчарик Т.В. Вплив еритроміцину на шлункову секрецію у собак // Вісник Київського національного університету імені Тараса Шевченка проблеми регуляції фізіологічних функцій. – №40. - 2003.– С.76-78. (Здобувачем особисто проведені експериментальні дослідження, аналіз одержаних результатів, їх статистична обробка. Співавтори: Берегова Т.В. – консультативна допомога в проведенні дослідів, інтерпретація результатів; Куровська Л.Ф. - визначення концентрації пепсину в шлунковому соку; Овчарик Т.В. - визначення кислотності в шлунковому соку.)
Берегова Т.В., Цирюк О.І., Куровська Л.Ф., Овчарик Т.В. Дослідження ролі центральних і периферичних мотилінових рецепторів в регуляції шлункової секреції у собак // Вісник Київського національного університету імені Тараса Шевченка. Проблеми регуляції фізіологічних функцій. – №41. - 2003.– С.162-163. (Здобувачем особисто проведені експериментальні дослідження, аналіз одержаних результатів, їх статистична обробка. Співавтори: Берегова Т.В. – ідея дослідження, загальне редагування; Куровська Л.Ф. - визначення концентрації пепсину в шлунковому соку; Овчарик Т.В. - визначення кислотності в шлунковому соку.)
Цирюк О.І., Овчарик Т.В., Куровська Л.Ф., Харченко М.М. Дослідення механізму дії агоністів мотилінових рецепторів на секреторну функцію шлунка // Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології. - №1(54). – Київ-Луганськ-Харків. – 2004. – С.252-258. (Здобувачем особисто проведені експериментальні дослідження, зроблено визначення кислотності шлункового соку, проведена статистична обробка та аналіз одержаних результатів, підготовка матеріалів до друку. Співавтори: Харченко М.М. – проведення хірургічних втручань; Куровська Л.Ф. - визначення концентрації пепсину в шлунковому соку; Овчарик Т.В. - післяопераційний догляд за тваринами.)
Beregova T., Gonchar G., Tsyryuk O., Polinkevich B. Тhe influence of motilides on the function of gastrointestinal tract and experimental ulcerogenesis // 3-rd International Simposium on Cell / Tissue Injury and Cytoprotection / Organoprotection - Long Beach, USA-2000. – Р. 23. (Здобувачем особисто проведені експериментальні дослідження, зроблено визначення кислотності та концентрації пепсину в шлунковому соку. Співавтори: Берегова Т.В. – загальне керівництво роботою, аналіз одержаних результатів; Полінкевич Б.С. – проведення хірургічних операцій; Гончар Г.М. – післяопераційний догляд за тваринами.)
Beregova T., Gonchar G., Tsyryuk O., Polinkevich B. Тhe influence of motilides on the function of gastrointestinal tract and experimental ulcerogenesis // Gastroenterology.-2000.-Vol.118.-N4.- A1162. (Здобувачем особисто проведені експериментальні дослідження, зроблено визначення кислотності та концентрації пепсину в шлунковому соку аналіз одержаних результатів. Співавтори: Берегова Т.В. – загальне керівництво роботою, Полінкевич Б.С. – проведення хірургічних операцій; Гончар Г.М. – післяопераційний догляд за тваринами.)
Beregova T., Tsyryuk O. Тhe influence of motilides on the function of gastrointestinal tract and experimental ulcerogenesis // Official Journal of The Society for Experimental Biology and Medicine.-2000.-Vol.225.-N2.-A.162. (Здобувачем особисто проведені експериментальні дослідження, зроблено визначення кислотності та концентрації пепсину в шлунковому соку, статистична обробка результатів. Співавтори: Берегова Т.В. – консультативна допомога).
Beregova T., Tsyryuk O. New propeties of motilides // Тези Наукової конференції студентів та молодих вчених Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця з міжнародною участю. - 2000.- C. 18-19. (Здобувачем особисто проведені експериментальні дослідження, зроблено визначення кислотності та пепсину в шлунковому соку, проведена статистична обробка та аналіз одержаних результатів. Співавтори: Берегова Т.В. – загальне керівництво роботою.)
Берегова Т.В., Цирюк О.И., Преображенская Т.Д., Степанов Ю.В. О механизме антиязвенного действия эритромицина // Тезисы докладов Международной конференции, посвященной 75-летию со дня рождения А.М.Уголева: “Механизмы функционирования висцеральных систем” Санкт- Петербург. - 2001. – С.390-391. (Здобувач - проведення експерименту, статистична обробка та аналіз результатів, підготовка матеріалів до друку. Співавтори: Берегова Т.В. – загальне редагування; Преображенская Т.Д. – визначення ТБК-активних продуктів в слизовій оболонці шлунка щурів; Степанов Ю.В. – визначення загального вмісту білка у слизовій оболонці шлунка щурів.)
Beregova T., Tsyryuk O., Preobrazhenska T., Polinkevich B. The new propeties of erythromycin // 12-th European Students Conference for Medical Studens and Young Doctors.- Berlin.- 2001.- Р.238. (Здобувач - проведення експерименту, статистична обробка та аналіз результатів, інтерпретація даних, підготовка матеріалів до друку. Співавтори: Берегова Т.В. – ідея дослідження, загальне редагування; Полінкевич Б.С. - проведення хірургічних операцій; Преображенская Т.Д. – визначення ТБК-активних продуктів у слизовій оболонці шлунка щурів.)
БереговаТ.В., Цирюк О.І., Куровська Л.Ф., Омельченко Д.І., Харченко М.М. Вплив стимуляції мотилінових рецепторів на шлункову секрецію // Фізіологічний журнал.-2002.- №2, т.48.-С. 129-130. (Здобувачем особисто проведені експериментальні дослідження, статистична обробка та аналіз результатів, підготовка матеріалів до друку. Співавтори: Берегова Т.В. – загальне керівництво роботою, редагування; Харченко М.М. – післяопераційний догляд за тваринами; Куровська Л.Ф. – визначення концентрації пепсину в шлунковому соку; Омельченко Д.І. – підготовка тварин до досліду та технічне забезпечення його виконання.)
Цирюк О.І., БереговаТ.В., Овчарик Т.В. Вплив збудження мотилінових рецепторів на шлункову секрецію у собак // Материалы конференции, посвященной 100- летию со дня рождения профессора, академика Р.О. Файтельберга.- Одесса.- 2003.- С.134. (Здобувачем особисто проведені експериментальні дослідження, зроблено визначення кислотності шлункового соку, проведена статистична обробка та аналіз одержаних підготовка матеріалів до друку. Співавтори: Берегова Т.В. – загальне керівництво роботою; Овчарик Т.В. - післяопераційний догляд за тваринами.)
Tsyryuk O., Beregova T., Ovcharyk T., Kurovska L. The influence of roxythromycin on histamine gastric secretion in dogs // Abstract of international Conference “Neuro-humoral and cellular regulatory mechanisms of digestion processes”.-2003. –P. 47-48. (Здобувачем особисто проведені експериментальні дослідження, зроблено визначення кислотності шлункового соку, проведена статистична обробка та аналіз одержаних результатів підготовка матеріалів до друку. Співавтори: Берегова Т.В. – загальне керівництво роботою, Куровська Л.Ф. - визначення концентрації пепсину в шлунковому соку; Овчарик Т.В. - післяопераційний догляд за тваринами.)
АНОТАЦІЯ
Цирюк О.І. Вплив макролідів на секреторну функцію шлунка. – Рукопис.
Дисертація
