національна академія наук україни

Інститут клітинної біології та генетичної інженерії

Довгалюк Аліна Іванівна

УДК 576.345: 576.356+576.356.7: 576.348.7

Порівняння цитогенетичної та

антимікротрубочкової активності

фітотоксичних металів

03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі клітинної біології та генетичної інженерії біологічного факультету Київського національного університету ім. Тараса Шевченка та у відділі клітинної біології і біотехнології Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук,

член-кореспондент НАН України

Блюм Ярослав Борисович,

завідувач відділу клітинної біології та біотехнології

Інституту клітинної біології та генетичної інженерії

НАН України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,

член-кореспондент НАН України

Кордюм Єлизавета Львівна,

завідувач відділу клітинної біології та анатомії рослин

Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України

доктор біологічних наук, професор

ГОЛОВКО Ераст Анатолійович

завідувач відділу алелопатії Національного

ботанічного саду ім. М.М. Гришка НАН України

Провідна установа: Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, м. Київ.

Захист дисертації відбудеться „18” березня 2004 р. о 1200 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.202.01 при Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, Київ-143, вул. Заболотного, 148, тел./факс: 3-8-044-266-71-04.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, Київ-143, вул. Заболотного, 148.

Автореферат розісланий „17” лютого 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Кравець О.А.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. З’ясування токсичного потенціалу важких металів стосовно рослинної клітини має важливе значення для розуміння механізмів дії цих полютантів на рослинний організм в цілому, а тому може слугувати основою для пошуку шляхів зменшення їхнього негативного впливу. На сьогодні достатньо повно висвітлені фізіологічні аспекти прояву фітотоксичності металів [Woolhouse, 1983; Sanita di Toppi & Gabbrielli, 1999; Mossor-Pietraszewska, 2001]. Вважається, що первинною реакцією рослинного організму на дію токсичних металів є пригнічення росту кореня, а найчутливішою зоною визнаний кореневий апекс, куди найшвидше проникають ці токсиканти. Рослинні клітини виробили низку захисних пристосувань, спрямованих на гальмування проникнення металів у протоплазму. Зокрема, це іммобілізація їх у клітинній стінці та зв’язування у клітинах з хелатуючими лігандами [Феник и др., 1995; Rengel, 1996]. Проте такі захисні механізми рослин не завжди достатньо ефективні. У випадках, коли вони не можуть забезпечити повної детоксикації іонів токсичних металів, спостерігаються різноманітні пошкодження субклітинних структур, включаючи генетичний апарат. Дані про цитогенетичну дію важких металів та алюмінію у рослинній клітині на сьогодні досить фрагментарні та несистематизовані. Що стосується субклітинних структур білкової природи, як можливих мішеней для токсичних металів у рослинних клітинах, тут існують ще більші прогалини в уявленнях про механізми пошкоджуючого впливу даних полютантів.

Серед імовірних внутрішньоклітинних мішеней токсичних металів надзвичайно важливими є цитоскелетні структури рослинних клітин, зокрема мікротрубочки, що проявляють високу чутливість до різноманітних ендогенних та екзогенних стимулів [Nick, 1999; Wasteneys, 2000, 2003]. Як відомо, ці динамічні утворення цитоскелету забезпечують нормальне проходження клітинного циклу, включаючи мітоз та цитокінез, а також задіяні в регуляції ключових процесів росту і диференціації рослинних клітин [Goddard et al., 1994; Lloyd, 1994; Wasteneys, 2002]. Накопичено чимало даних про дію токсичних металів на мікротрубочкові структури клітин тваринного походження [Chou, 1989; Perchellet et al., 1999; Liliom et al., 2000], проте донедавна дія токсичних металів на рослинний цитоскелет і, зокрема, мікротрубочки не вивчалася взагалі. В останні роки з’явились перші роботи, присвячені дослідженню антимікротрубочкової дії алюмінію в рослинних клітинах [Blancaflor et al., 1998; Sivaguru et al., 1999; Frantzios et al., 2000; Schwarzerova et al., 2002]. Вплив важких металів на цитоскелет рослинних клітин так і залишається практично ще не дослідженим.

Тому порівняльне вивчення цитогенетичної та антимікротрубочкової дії токсичних металів є надзвичайно актуальним питанням як для встановлення внутрішньоклітинних мішеней для цих токсикантів і розробки, в подальшому, відповідних стратегій захисту рослин, так і для запровадження нових тест-систем біологічного моніторингу.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась у рамках бюджетних тем Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України відділу цитофізіології та клітинної інженерії: № 2.3.3.6 "Вивчення молекулярно-генетичних процесів в реконструйованих клітинних системах і трансгенних рослинах" (1990–1995), № 2.28.2.9 "Вивчення молекулярно-біологічних і генетичних процесів в реконструйованих трансгеномних і трансгенних клітинних лініях і рослинах" (1995-1999); а також відділу клітинної біології та біотехнології: № 2.28.2.10 "З`ясування ролі цитоскелетних структур клітини у відповіді рослин на вплив абіотичних факторів та розробка біотехнологічних підходів для регуляції функціонування цитоскелету" (2000-2004, номер держреєстрації 0101U000395).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи – з'ясувати специфіку цитогенетичних та антимікротрубочкових ефектів кадмію, свинцю, нікелю, алюмінію, міді та цинку у меристемних клітинах рослин. Для досягнення поставленої мети були визначені такі конкретні завдання:

1) визначити діапазони токсичних концентрацій для кожного з іонів металів за допомогою модельного об’єкту цибулі звичайної (Allium cepa L.);

2) дослідити антимітотичну активність іонів важких металів та алюмінію в клітинах апікальної кореневої меристеми цибулі;

3) дати порівняльну оцінку цитотоксичності іонів кадмію, свинцю, нікелю, алюмінію, міді та цинку за допомогою Allium тесту;

4) виявити специфіку цитогенотоксичної активності іонів вищезгаданих металів у клітинах кореневої меристеми цибулі;

5) виявити ефекти іонів важких металів та алюмінію на мікротрубочкові утворення в клітинах кореневих апексів методом непрямої імунофлюоресцентної мікроскопії.

Об'єкт дослідження: цитотоксичність і мутагенність важких металів та алюмінію.

Предмет дослідження: деструктивні зміни в ядрі та в мікротрубочковій частині цитоскелету рослинної клітини, зумовлені дією іонів важких металів та алюмінію.

Методи дослідження. Фітотоксичну дію важких металів та алюмінію вивчали за допомогою морфометричного та морфологічного аналізу коренів. Для дослідження індукованих металами порушень у меристемних клітинах використовували цитологічний та цитогенетичний аналізи. Вивчення структурної організації мікротрубочок проводили за допомогою непрямого імунофлюресцентного мікроскопічного аналізу. Статистичну обробку результатів досліджень здійснювали за стандартними методиками.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено систематичний порівняльний аналіз антимітотичної та цитогенетичної дії цілої низки фітотоксичних металів. Оцінено рівні цитогенетичного пошкодження рослин під впливом різних концентрацій кадмію, свинцю, нікелю, алюмінію, міді та цинку. Визначено, що для дії іонів кадмію, нікелю, свинцю та алюмінію характернішим є блокування мітозу та цитокінезу, ніж індукція хромосомних аберацій. За здатністю індукувати порушення в мітотичних та інтерфазних клітинах кореневої меристеми цибулі встановлено ряд анеугенної активності токсичних металів: Ni >> Cd > Al > Pb Cu > Zn.

Вперше досліджено вплив важких металів на мікротрубочкові структури рослинних клітин. Показано, що в апікальній кореневій меристемі цибулі Сd2+ і Pb2+ зумовлюють руйнування (деполімеризацію) мікротрубочкових утворень, Nі2+ сприяє зшиванню пучків мікротрубочок у великі розгалужені агрегати, що не можуть повноцінно функціонувати через втрату динамічної нестабільності, а Cu2+ i Zn2+ не проявляють пошкоджуючої дії на мікротрубочкові структури меристемних клітин цибулі. Виявлено стабілізуючий вплив іонів алюмінію на мікротрубочкові структури в клітинах цибулі. Встановлено, що солі важких металів проявляють свою токсичність через катіони, а кислотні залишки солей слабо впливають на цитотоксичну активність іонів металів.

Досліджені цитогенетичні та антимікротрубочкові ефекти фітотоксичних металів дають можливість глибше зрозуміти клітинні аспекти інгібуючого впливу цих речовин на рослини.

Практичне значення одержаних результатів. Запропонована модифікація Allium тесту шляхом заміни додаткових коренів цибулин на корінці проростків цибулі, що дозволяє підвищити рівень чутливості цього токсикологічного методу скринінгу мутагенів. Показано, що меристемні клітини проростків цибулі можуть бути використані для скринінгу речовин з антимікротрубочковою дією.

Встановлено, що ефективні токсичні концентрації міді, цинку і нікелю, визначені в наших експериментах, значно нижчі за офіційно прийняті гранично допустимі концентрації (ГДК) даних металів у ґрунті, що вказує на недостатню обґрунтованість існуючих ГДК для цих полютантів.

Матеріали і методичні розробки, у тому числі оптимізована методика візуалізації мікротрубочок на давлених препаратах рослинних клітин, може бути використана під час читання спецкурсів та практикумів з цитології, клітинної біології. На сьогодні результати даної роботи використовуються під час читання спецкурсу “Скелетні структури клітини та їх функції” для студентів спеціалізації „клітинна біологія та генетична інженерія” Київського національного університету ім. Тараса Шевченка.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто проведені всі основні експерименти та досліди, статистична обробка результатів, підбір та опрацювання даних літератури, написання наукових статей. Спільно з науковим керівником визначено напрямок та об’єкт досліджень, проведено обговорення отриманих результатів. Викладені у дисертації ідеї, наукові висновки та положення сформульовані автором самостійно.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися на Європейському конгресі з молекулярної та клітинної біології (Брайтон, Великобританія, 1997); Міжнародній конференції “Molecular Biology of Plants under Environmental Stress” (Познань, Польша, 1997); двох щорічних зїздах товариства експериментальної ботаніки (Кантербері, Великобританія, 1997 і Йорк, Великобританія, 1998); Міжнародній конференції “Цитоскелет и клеточная регуляция” (Пущино, Росія, 2000); 12-му конгресі Федерації Європейських товариств фізіологів рослин (Будапешт, Угорщина, 2000); VII конференції молодих вчених “Проблеми фізіології рослин і генетики на рубежі третього тисячоліття” (Київ, 2000); ІІІ науковій конференції молодих учених м. Львова “Наукові основи збереження біотичної різноманітності” (Львів, 2000); Міжнародному симпозіумі “Plants under Environmental Stress” (Москва, Росія, 2001); Міжнародному симпозіумі “The Plant Cytoskeleton: functional diversity and biotechnological implications” (Київ, 2002); VIII конференції молодих вчених “Сучасні напрямки у фізіології та генетиці рослин” (Київ, 2002) та IV Міжнародній конференції “Промислова ботаніка: стан і перспективи розвитку” (Донецьк, 2003).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 16 наукових праць, з них 6 статей у фахових журналах та 10 матеріалів і тез конференцій.

Структура та об’єм роботи. Дисертація складається із вступу, чотирьох розділів (огляд літератури, матеріали та методи досліджень, результати дослідження та їх обговорення, аналіз і узагальнення результатів досліджень), висновків та списку використаних джерел, який містить 315 найменувань. Робота викладена на 140 сторінках, ілюстрована 11 таблицями та 18 рисунками.

Матеріали та методи досліджень

Дослідження були проведені на проростках цибулі звичайної (Allium cepa L.) сорту Донецька золотиста. Насіння пророщували в темряві при температурі 25C. Для дослідів використовували три-чотириденні проростки, зародкові корінці яких досягали 10-15мм. Для аналізу фітотоксичної дії іонів кадмію, свинцю, нікелю, алюмінію, міді та цинку по 10 відібраних проростків переносили на чашки Петрі з 10 мл відповідних розчинів солей. Для приготування тестових розчинів використовували CdCl2, Pb(CH3COO)23H2O, NiSO47H2O, Al(NO3)39H2O, CuSO45H2O, ZnSO47H2O. Для аналізу токсичних ефектів кожного металу, крім контролю, тестували сім концентрацій його іонів в розчині: 1; 5; 10; 50; 100; 500 і 1000 мкМ. Для розчинення солей металів та контролю використовували дистильовану воду (pH=5,8). Експозицію з металами проводили в темряві при температурі 25C впродовж 24 год. Усі експерименти проводились у трикратній повторності.

Морфологічний аналіз коренів. Перед зануренням до тестових розчинів вимірювали початкову довжину коренів. Після 24-годинної експозиції з металами проводили повторний морфометричний аналіз матеріалу: вимірювали кінцеву довжину, відмічали видимі зміни коренів (поява свелінгу, гачків, завитків, потемніння меристемних ділянок). На основі отриманих даних визначали відносний приріст (ВП) корінців проростків цибулі відносно контрольного приросту, прийнятого за 100%. Ініціальною (ЕК10), ефективною (ЕК50) та сублетальною (ЕК90) токсичними концентраціями кожної тестованої сполуки вважались ті, при яких спостерігалось інгібування приросту коренів відповідно на 10%, 50% і 90% порівняно з контролем. Значення цих концентрацій розраховували із графіків відносного приросту коренів.

Цитологічний аналіз апікальних ділянок коренів. Відразу після експозиції корінців з металами матеріал фіксували в суміші льодяної оцтової кислоти і 96-го етилового спирту (1:3) протягом 18 год при +10°С і зберігали в 70°-ному етанолі. Відсічені корені фіксованих проростків фарбували в 1%-ному розчині ацетоорсеїну впродовж 48 год, після чого мацерували їх кип’ятінням в 45% оцтовій кислоті протягом 1-2 хв. Тимчасові давлені препарати з апексів (1-2 мм) готували в 45%-ній молочній кислоті та аналізували під світловим мікроскопом при збільшенні х 1100. Особливості цитотоксичної дії солей металів оцінювали за змінами мітотичного індексу (МІ), процентного співвідношення (відносної тривалості) фаз мітозу, сумарного індексу аберацій (?ІА), відсотку клітин з пікнотичними ядрами, а також за частотою злипання хромосом у мітозах.

Цитогенетичний аналіз кореневої меристеми. Генотоксичні ефекти іонів металів виявляли шляхом аналізу частот виникнення різних типів цитогенетичних аномалій у меристемних клітинах кореневих апексів. Враховувались наступні параметри: відсоток клітин з хромосомними мостами, фрагментами хромосом, відставанням хромосом, мультиполярними мітозами, К-мітозами, вирахувані серед усіх клітин на стадіях мітозу; відсотки двоядерних, багатоядерних клітин, а також клітин з мікроядрами та лопатевими ядрами, вирахувані із загальної кількості (1000) меристемних клітин.

Зареєстровані цитогенетичні аберації розділяли на дві групи: кластогенні порушення (пов'язані з безпосереднім пошкодженням хромосом) та анеугенні (турбагенні) порушення, що є наслідком пошкодження веретена поділу та фрагмопласту. На основі порівняння індексів аберацій (ІАк, ІАт), що вказують на співвідношення між сумарним відсотком аберацій певного типу в різних варіантах і сумарним відсотком цих аберацій в контролі, робили висновок про специфіку цитогенотоксичної дії тестованих металів. Експерименти проводилися в 5 повторностях; таким чином, кількість клітин на кожну точку становила як мінімум 5000.

Імунофлюоресцентна мікроскопія мікротрубочок у меристемних клітинах цибулі. Візуалізацію мікротрубочкових утворень проводили за власною модифікованою методикою. Відсічені кінчики коренів проростків фіксували 1 год у 3,7%-ному розчині параформальдегіду в мікротрубочко-стабілізуючому буфері (МТСБ) (50 мМ PIPES, 5 мМ EGTA, 2 мМ MgSO4, 1% Тритону Х-100, pH 6,9), відмивали в МТСБ і ферментували 15 хв. у розчині 2% мацерозиму, 0,25% дріцелази, 0,25% онозуки, 2 мкМ лейпептину і 15 мкМ пепстатину А в МТСБ. Після виготовлення давлених препаратів у краплині МТСБ на скельцях, покритих полі-L-лізином, проводили додаткову відмивку зразків у стабілізуючому фосфатному буфері (СФБ) (0,13 М NaCl, 2,7 мM KCl, 5,1 мM Na2HPO4, 1,56 мM KH2PO4, pH 7,0). Надалі препарати інкубували з первинними мишачими антитілами до ?-тубуліну протягом 1,5 год. та із вторинними антимишачими антитілами, міченими ФІТЦ, впродовж 1 год. у темряві при кімнатній температурі. Антитіла розводили в СФБ у співвідношенні 1:100. Після трикратної відмивки зразків у СФБ з додаванням 0,5% БСА препарати покривали заливкою, що містила 50%-ний водний розчин гліцерину, 20 мМ Трис-HCl, 10 мг/мл парафенілендіаміну і аналізували під люмінісцентним мікроскопом у синьо-фіолетовій області спектру (світлофільтр ФС-4).

Статистична обробка результатів. Для цифрових результатів усіх вимірювань проведена варіаційно-статистична обробка. Достовірність між варіантами оцінювали за критерієм Ст’юдента, використовуючи 5% рівень значущості [Лакін, 1990].

Результати дослідження та їх обговорення

Фітотоксичність досліджуваних металів. Дані морфометричного аналізу коренів проростків цибулі після 24-годинної експозиції з розчинами тестованих сполук показали, що всі досліджувані іони металів дозозалежно інгібують ріст коренів. Як виявилось, інгібуюча дія Cd2+, Pb2+, Al3+, Ni2+ на ріст коренів цибулі проявляється вже за незначних концентрацій (5-10 мкМ). Найвищу серед досліджуваних металів токсичність проявляв Cu2+: уже в концентрації 1 мкM цього іона в розчині спостерігалось 40% пригнічення росту коренів порівняно з контролем. Поряд з цим обробка проростків сульфатом цинку в невисоких концентраціях мала навіть стимулюючий ефект на кореневий ріст: при концентрації 5 мкM Zn2+ в тестовому розчині відносний приріст становив 160 %. Підвищення концентрації всіх досліджуваних іонів металів до 50 мкM призводило до майже повного пригнічення росту корінців цибулі.

У результаті досліджень були виявлені дуже низькі значення ініціальних концентрацій ЕК10 пригнічення росту коренів для всіх металів ( 10 мкМ) (Табл. 1). Слід відмітити, що й ефективні концентрації ЕК50, при яких спостерігалося вже 50% інгібування росту, також виявились доволі низькими (2-28 мкМ) (Табл. 1). Порівняння діапазонів концентрацій ЕК50-10 та ЕК90-50 (див. Табл. 1) дозволило виявити високу інтенсивність зростання рістінгібуючої активності металів при низьких дозах (2-28 мкМ).

Таблиця 1

Ефективні концентрації інгібування приросту коренів та діапазони

діючих токсичних концентрацій іонів металів

Іони металів | ЕК10, мкМ | ЕК50, мкМ | ЕК90, мкМ | ЕК 50-10, мкМ | ЕК 90-50, мкМ | ЕК 90-10, мкМ

Cu2+ | <1 | 2,0 | 12,4 | 1 | 10,4 | 11,4

Cd2+ | 1,8 | 6,8 | 76,0 | 5,0 | 69,2 | 74,2

Ni2+ | 1,0 | 8,8 | 305,0 | 7,8 | 296,2 | 304,0

Pb2+ | 6,5 | 9,1 | 39,0 | 2,6 | 29,9 | 32,5

Al3+ | 5,6 | 16,2 | 377,0 | 10,6 | 360,8 | 371,4

Zn2+ | 9,1 | 28,0 | 93,0 | 18,9 | 65,0 | 83,9

На основі результатів аналізу росту коренів проростків цибулі, оброблених солями токсичних металів у діапазоні концентрацій 1-1000 мкМ, можна запропонувати два ряди фітотоксичності іонів тестованих металів: Cu2+>Cd2+>Ni2+>Pb2+>Al3+>Zn2+ (за ефективними рістінгібуючими концентраціями) та Cu2+>Pb2+>Cd2+>Zn2+>Ni2+>Al3+ (за сублетальними концентраціями пригнічення росту коренів).

До спектру реакцій чутливих рослин на дію несприятливих факторів середовища належать і морфогенетичні зміни коренів. У варіантах із свинцем та алюмінієм ми спостерігали свелінгові деформації та гачковидні згини кореневих апексів (Рис. 1).

Рис.1. Морфогенетичні зміни корінців проростків цибулі, спричинені іонами то- ксичних металів: а – контроль, б – свелінгова деформація кореня ( Pb2+, 10 мкМ); в – гачковидний згин кінчика кореня (Al3+, 100 мкМ), г – завиткоподібний згин кореня (Pb2+, (50 мкМ), д – "завиток" (Al3+, 100 мкМ).

Відомо, що в морфогенетичних подіях безпосередню участь беруть мікротрубочки, які є досить чутливими до дії різноманітних екзогенних та ендогенних стимулів Nick, 1998; Wasteneys, 2003. Тому подальше вивчення впливу металів на цитоскелетні утворення клітин кінчиків коренів видавалось нам досить доцільним.

Аналіз цитотоксичності важких металів та алюмінію. Зміна значень мітотичного індексу (МІ) меристемних клітин корінців цибулі після обробки тестованими сполуками добре корелює з даними про ризотоксичність металів, отриманими на основі аналізу їхніх ефективних рістінгібуючих концентрацій. Cd2+, Pb2+, Ni2+ та Al3+ в ініціальних концентраціях (1-5 мкМ) не змінюють або навіть підвищують мітотичну активність клітин кореневої меристеми (Рис. 2а-г). Починаючи з ефективних токсичних концентрацій ЕК50 цих металів спостерігається критичне зниження значень МІ. Збільшення концентрацій Zn2+, навпаки, незворотно підвищує МІ (Рис. 2е), причиною чого може бути синхронізація клітинного поділу, що підтверджується появою профазного блоку на препаратах після обробки цинком (Табл. 2).

Рис. 2. Динаміка проліферативного стану меристеми коренів цибулі після обробки різними концентраціями солей токсичних металів, мкМ: а – CdCl2; б – Pb(CH3COO)2; в – NiSO4; г – Al(NO3)3; д – CuSO4; е – ZnSO4.

За зміною МІ, так само як і за макроскопічними параметрами, іонам міді належить перше місце з токсичності серед досліджуваних металів. Субефективна концентрація Cu2+ (1 мкМ) підвищує мітотичний індекс у півтора рази порівняно з контролем (Рис. 2д), що на нашу думку відображає мітостатичну дію міді за рахунок індукції профазного блоку (Табл. 2).

Таблиця 2

Зміна відсоткового співвідношення фаз мітозу

у кореневій меристемі проростків цибулі іонами токсичних металів*

Токсичні катіони та їхні концентрації, мкМ |

Профаза |

Метафаза |

Анафаза |

Телофаза | Достовірна відмінність від контролю*

Cd2+ 0

10

50

100

500

1000 | 38,6 %

51,4 %

76,0 %

70,6 %

61,0 %

59,6 % | 20,7 %

32,5 %

7,6 %

3,2 %

3,4 %

0 | 11,4 %

4,0 %

0

2,4 %

1,7 %

1,0 % | 29,3 %

12,1 %

16,7 %

23,8 %

33,9 %

39,4 % |

+

+

+

+

+

Ni2+ 0

10

50

100

500

1000 | 36.9 %

28,1 %

37,5 %

18,7 %

47,0 %

35,1 % | 21,8 %

40,6 %

44,4 %

76,6 %

43,0 %

57,9 % | 13,5 %

18,0 %

5,6 %

0

1,7 %

3,2 % | 27,8 %

13,3 %

12,5 %

4,7 %
8,3 %

3,8 % |

+

+

+

+

+

Cu2+ 0

1 | 33.9 %

49,4 % | 23,3 %

19,8 % | 15,7 %

9,0 % | 27,1 %

21,8 % |

+

Zn2+ 0

50

100

500

1000 | 33.9 %

56,0 %

44,9 %

50,6 %

53,6 % | 23,3 %

21,3 %

30,1 %

20,5 %

17,9 % | 15,7 %

12,0 %

12,5 %

17,1 %

13,1 % | 27,1 %

10,7 %

12,5 %
11,8 %

15,4 % |

+

+

+

+

* в таблиці наведені тільки ті метали та їхні концентрації, які статистично достовірно змінювали відносну тривалість фаз мітозу

Після обробки іонами Сu2+ у вищій концентрації (5 мкМ) на препаратах апікальної кореневої меристеми не вдавалось знайти жодної клітини на стадіях мітозу; при цьому більшість інтерфазних ядер було зруйновано, що свідчило про некроз тканини. Наявність мітотичних клітин на препаратах після обробки міддю надлетальними концентраціями (50-1000 мкМ) (Рис. 2д, 3д) може пояснюватись тим, що у таких дозах метал діє як фіксатор, швидко вбиваючи клітини, але не пошкоджуючи ядерний матеріал.

Порівняння відносної тривалості фаз мітозу привертає увагу ще до двох тестованих катіонів — Cd2+ і Ni2+. Обидва метали статистично достовірно змінюють розподіл фаз мітозу серед клітин, що діляться (Табл. 2). Однак мітотичні пертурбації, зумовлені цими полютантами, відмінні. Кадмій, починаючи з ефективних токсичних концентрацій, сприяє суттєвому збільшенню відсотку профаз серед мітотичних клітин (Табл. 2) і одночасному зниженню інтенсивності клітинних поділів (Рис. 2). Така, на перший погляд, невідповідність між падінням МІ та формуванням профазного блоку в дослідах з Cd2+ може свідчити на користь того, що даний катіон не тільки перешкоджає конденсації хромосом, що затримує профазу, але й сильно пригнічує перехід клітин із G2 до М стадії клітинного циклу.

Іони Ni2+, на відміну від усіх інших катіонів, спричиняють статистично достовірне накопичення метафаз у популяції мітотичних клітин (Табл. 2), і також, як і у випадку з Cd2+, значно знижують мітотичний індекс (Рис. 2). Падіння МІ з одночасним блокуванням мітозу в метафазі також вказує на значне інгібування здатності клітин до поділу, а сам метафазний блок свідчить про порушення функціонування мітотичного апарату, основу якого складають мікротрубочки веретена поділу.

Крім вищезгаданих цитологічних параметрів, після обробки іонами токсичних металів виявлялись численні цитогенетичні порушення, які були підсумовані нами в загальний кількісний показник – індекс аберацій ?ІА (Рис. З). Серед виявлених порушень окремо варто виділити злипання хромосом (Рис. 4а). Ця хромосомна аберація вказує на високу токсичність діючих речовин, на ефект, що в більшості випадків не піддається репарації і призводить до клітинної смерті [Fiskesjo, 1995; El-Ghamery et al., 2003] і тому характеризує, як правило, летальні концентрації тестованих речовин. Про смерть клітин також свідчить пікноз ядерного матеріалу в інтерфазних

Рис. 3. Сумарний індекс аберацій, % в клітинах кореневої меристеми проростків цибулі після обробки різними концентраціями солей токсичних металів, мкМ: а – CdCl2; б – Pb(CH3COO)2; в – NiSO4; г – Al(NO3)3; д – CuSO4; е – ZnSO4.

клітинах (Рис. 4б). Аналіз відсотків клітин з пікнотичними ядрами та із злипанням хромосом після обробки солями тестованих металів дозволив зробити висновок про ступінь цитотоксичної дії досліджуваних речовин: Cu2+>Cd2+Pb2+>Zn2+>Ni2+>Al3+. Запропонований ряд цитотоксичності металів співпадає з рядом металів за сублетальними концентраціями інгібування росту коренів проростків A. cepa.

Цитогенетична активність важких металів та алюмінію. Усі зареєстровані цитогенетичні аномалії, індуковані тестованими металами в апікальній меристемі коренів проростків цибулі, умовно можна розділити на три основні групи: 1) патології, пов’язані з пошкодженням хромосом (кластогенний ефект); 2) патології, пов’язані з пошкодженням мітотичного апарату та 3) патології, що є наслідком порушення проходження цитокінезу. Аномалії 2-ої і 3-ої групи можна розглядати як анеугенні ефекти – цитогенетичні пошкодження на надхромосомному рівні.

Індукція хромосомних аберацій. При дії всіх тестованих солей металів відмічені утворення фрагментів хромосом та хромосомних мостів (Рис. 5б, в). Такі кластогенні ефекти були найхарактернішими для сублетальних токсичних концентрацій досліджуваних речовин (Табл. 3). Порівняльний аналіз індексів аберацій кластогенного типу (ІАк) дозволив побудувати ряд металів за здатністю індукувати хромосомні пошкодження. Найсильнішим кластогеном виявився Zn (у 13,6 рази здатний збільшувати частоту хромосомних аберацій у меристемній тканині порівняно з контролем); далі у порядку зниження кластогенної активності тестовані метали розташовуються в такій послідовності: Pb ( 5,7) Cd (4,8) Сu (4,3) Al (4,0) Ni(3,6) (Табл. 3).

Таблиця 3

Порівняння індексів цитогенетичних аберацій, індукованих іонами токсичних металів у меристемних клітинах проростків цибулі

Іони тестованих металів та їхні концентрації, мкМ | Індекс кластогенних аберацій (ІАк) | Індекс турбагенних аберацій (ІАт)

в мітотичних клітинах | в інтерфазних клітинах

Cd2+ 0

1

5#

10

50

100

500 | 1

1,2±0,4

2,3±0,7

3,6±1,2

4,81,7

3,61,3

мк | 1

1,3±0,5

0,9±0,3

14,2±3,6

32,3±6,2

0,8±0,3

мк | 1

0,5±0,1

1,0±0,2

9,5±0,8

13,5±1,1

9,5±0,9

10,5±0,9

Pb2+ 0

1

5

10

50

100

500 | 1

0,6±0,2

2,3±0,7

4,2±1,3

5,7±1,8

1,3±0,4

мк | 1

0,3±0,2

1,2±0,3

1,3±0,5

8,0±1,8

7,7±1,9

мк | 1

0,5±0,1

0,5±0,1

1,0±0,2

4,5±0,5

4,5±0,6

9,0±0,8

Ni2+ 0

1

5

10

50

100

500

1000 | 1

1,0±0,3

1,6±0,5

1,3±0,5

3,6±1,1

3,0±0,9

3,2±1,0

5,4±1,7 | 1

1,3±0,4

1,5±0,4

9,4±2,5

36,6±4,1

69,6±8,2

45,7±5,0

48,1±8,2 | 1

1,1±0,2

0,6±0,1

7,8±0,8

15,6±1,3

17,8±1,6

16,7±1,6

10,0±0,9

Al3+ 0

1

5

10

50

100

500

1000 | 1

1,1±0,4

2,0±0,7

1,7±0,6

2,6±1,0

4,0±1,3

2,6±0,9

5,4±1,9 | 1

5,5±1,7

6,4±1,6

6,3±1,8

4,4±1,3

4,7±1,5

8,3±2,6

4,3±1,5 | 1

3,9±0,4

3,9±0,4

4,4±0,4

6,1±0,5

10,6±1,0

12,2±1,1

11,1±1,0

Cu2+ 0

1

5 | 1

4,3±1,4

мк | 1

4,4±1,2

мк | 1

7,5±0,9

мк

Zn2+ 0

1

5

10

50

100

500

1000 | 1

2,0±0,6

1,6±0,5

10,8±2,3

8,9±2,2

12,4±2,9

13,6±3,1

7,4±1,6 | 1

0,8±0,2

2,3±0,5

2,6±0,8

2,7±0,8

2,8±0,7

3,3±0,9

3,1±0,8 | 1

1,7±0,3

1,1±0,2

3,3±0,6

2,8±0,5

2,2±0,4

1,7±0,3

2,8±0,5

# виділені в таблиці дані відповідають середньоефективним токсичним концентраціям досліджуваних металів (EК50). Значення, розташовані в таблиці між контролем та ефективними концентраціями, відповідають ініціальним токсичним концентраціям (EК10), а ті, що розташовані нижче – сублетальним (EК90) та летальним дозам тестованих металів;

мк – на препаратах спостерігались тільки або переважно мертві клітини

Окремо хотілося б звернути увагу на мідь. За індексом аберацій кластогенного типу цей метал займає четверту позицію, однак, при врахуванні його дуже низької діючої концентрації (1 мкМ), можна говорити про його сильнішу кластогенність порівняно з іншими досліджуваними металами.

Мітотичні порушення, пов’язані з пошкодженням веретена поділу. Патології мітозу, пов’язані з пошкодженням мітотичного апарату, а саме відставання хромосом в анафазі (Рис. 6а), багатополюсний мітоз (Рис. 6б) та колхіциноподібний (К-) мітоз (Рис. 6в), спостерігались при дії всіх тестованих сполук. Така турбагенна дія солей важких металів та алюмінію мала дозозалежний характер (див. Табл. 3). Причому, при ініціальних (ЕК10) та середньоефективних (ЕК50) концентраціях досліджуваних токсикантів реєстрували, в основному, зростання кількості клітин з відставанням хромосом. Збільшення концентрацій солей металів до сублетальних (ЕК90) призводило до накопичення клітин із мультиполярними мітозами та К-мітозами. Припускається, що відставання хромосом є проявом слабкої антимікротрубочкової дії токсичних речовин, а багатополюсні та “колхіцинові” мітози характеризують, як правило, високі дози “мітотичних отрут” [Fiskesjo, 1995].

Аналізуючи зміни індексу аберацій за групою анеугенних порушень, виявлених у мітотичних клітинах (див. Табл. 3), можна побудувати ряд солей металів за їхньою здатністю пошкоджувати мітотичний апарат клітини: NiSO4 у 69,6 рази збільшує відсоток пошкоджень порівняно з контролем; CdCl2 – у 32,3 рази; Al(NO3)3 – у 8,3 рази; Pb(CH3COO)2 – у 8,0 раз; СuSO4 – у 4,4 рази і ZnSO4 – у 3,3 рази. Як бачимо, сполуки нікелю та кадмію мають набагато вищу турбагенну (анеугенну) активність, ніж інші тестовані речовини, що характеризує їх як сильні мітотичні отрути і, очевидно вказує на високу спорідненість до мікротрубочок веретена.

Ядерні аномалії в інтерфазних клітинах. Крім хромосомних та мітотичних порушень на препаратах були виявлені численні ядерні аномалії в інтерфазних клітинах, серед них мікроядра (Рис. 7а), лопатеві ядра (Рис. 7б) та багатоядерність (Рис. 7в). Клітини з мікроядрами можуть утворюватись як внаслідок виходу із мітозу клітин з відставанням хромосом, що передбачає можливість розвитку анеуплоїдії [Fiskesjo, 1995; Verhoeven et al., 1989], так і внаслідок деконденсації уламків хромосом при фрагментації Antoccia et al., 1991. Оскільки причини виникнення мікроядер у наших експериментах не зрозумілі, даний тип цитогенетичних порушень в інтерфазних клітинах не відносили ні до кластогенних, ні до анеугенних ефектів токсичних металів.

Реститутивні клітини (клітини з лопатевими ядрами (Рис. 7б) або полікаріоцити (Рис. 7в)) можуть утворюватись внаслідок виходу клітин із К-мітозу шляхом деконденсації хаотично розкиданих хромосом, минаючи стадію розходження хромосом та утворення клітинної стінки [Кундельчук, 2002; Verhoeven et al., 1989]. Такі ядерні аномалії інтерфазних клітин теж характеризували турбагенну дію досліджуваних металів. За результатами наших досліджень Cd2+, Ni2+ та Al3+ сприяють утворенню найбільшої кількості клітин з реститутивними ядрами.

Рис. 7. Ядерні аномалії в інтерфазних клітинах після експозиції з іонами токсичних металів: а – клітина з мікроядрами (50 мкМ Cd2+); б – лопатеве ядро (50 мкМ Pb2+); в – полікаріоцит (100 мкМ Ni2+); г – двоядерні клітини (100 мкМ Al3+). Масштаб: 10 мкм.

Порушення клітинного поділу третьої групи, пов’язанe із запізненням цитокінезу, призводить до утворення двоядерних клітин (Рис. 7г). Згідно з нашими даними, найвираженіший цитокінез-блокуючий ефект має Ni2+: вже при концентрації 10 мкМ відсоток двоядерних клітин на препаратах у 4 рази перевищував контрольний рівень. Cd2+, Pb2+ та Al3+ в діапазоні ефективних концентрацій майже не змінювали відсоток двоядерних клітин порівняно з контролем, проте суттєво збільшували його в сублетальних та летальних концентраціях (100-1000 мкМ). Іони ж Cu2+ та Zn2+ із зростанням концентрацій не сприяли помітному накопиченню двоядерних клітин у кореневій меристемі проростків цибулі.

За кількістю реститутивних та двоядерних клітин характеризували анеугенні ефекти досліджуваних металів в інтерфазних клітинах (див. Табл. 3). За індексом аберацій такого типу найсильнішим анеугеном є Ni (17,8). Далі, в порядку зниження анеугенної активності, тестовані метали розташовуються в такій послідовності: Cd (13,5) Al (12,2) > Сu (8,5) > Pb ( 4,5) > Zn (3,3).

Антимікротрубочкова дія тестованих токсичних агентів. Як видно із результатів цитогенетичного аналізу турбагенна (анеугенна) дія є характернішою для більшості токсичних металів, ніж здатність спричиняти кластогенні аберації. Оскільки прийнято вважати, що анеугенні ефекти виникають унаслідок пошкодження мікротрубочок веретена поділу та фрагмопласту, наступним етапом нашої роботи було дослідження впливу солей Cd, Pb, Ni, Al, Cu та Zn (у концентраціях, що сприяли виникненню найінтенсивніших анеугенних порушень) на мікротрубочкові структури інтерфазних та мітотичних клітин кореневої меристеми.

Залежно від стадій клітинного циклу мікротрубочки можуть формувати чотири типи структур: інтерфазну сітку (Рис. 8а), препрофазну стрічку (Рис. 8б), мітотичне веретено (Рис. 8в) та цитокінетичний апарат – фрагмопласт (Рис. 8г).

Експозиція проростків цибулі з CdCl2 у концентрації 50 мкM призводила до глибоких змін в організації мікротрубочкових структур у клітинах кореневої меристеми цибулі. Після обробки Cd2+ на препаратах із імуноміченим тубуліном не вдавалось виявити жодної типової для контролю мікротрубочкової структури. У таких клітинах спостерігались тільки численні короткі фрагменти мікротрубочок, локалізовані, в основному, на периферії клітини (Рис. 9а). Очевидно, іони цього металу здатні спричиняти жорстку розборку мікротрубочок, ініціюючи даний процес на незаякорених плюс-

кінцях. Подібну, але слабше виражену, картину спостерігали на препаратах після обробки 50 мкМ Pb2+ (Рис. 9б). У варіантах зі свинцем серед клітин із пошкодженими мікротрубочками траплялись клітини з майже нативною мікротрубочковою організацією.

Цілком інший тип пошкоджень мікротрубочок був виявлений у клітинах, експонованих з NiSO4. Обробка Ni2+ призводила до появи товстих зв’язок чи агрегатів мікротрубочок у перинуклеарній частині інтерфазних клітин з одночасною повною втратою мікротрубочок на клітинній периферії (Рис. 10а). У мітотичних клітинах на таких препаратах вдавалось ідентифікувати тільки уламки веретена поділу (Рис. 10б-г).

На відміну від вищеописаних сполук, Al(NO3)3 в концентрації 100 мкМ не пошкоджував жодну із мікротрубочкових структур, типових для контролю, однак індукував щільніше упаковування мікротрубочок в меристемних клітинах цибулі (Рис.11). Візуальний ефект алюмінію на мікротрубочки подібний до дії таксолу, однак механізми такого впливу, очевидно, відмінні.

В експериментах із сульфатами Cu та Zn в експонованих клітинах не виявлено жодних відмінностей в організації мікротрубочкових структур порівняно з контролем.

Таким чином, із шести досліджуваних іонів металів тільки Cd2+, Pb2+, Ni2+ та Al3+ здатні спричиняти помітні пошкодження мікротрубочкових утворень у меристемних клітинах, що, в свою чергу, може призводити до порушень мітозу і цитокінезу. Однак механізми антимікротрубочкової дії цих токсикантів відмінні, і, зокрема, вони можуть включати: а) різну спорідненість іонів металів до рослинного тубуліну; б) різні біохімічні механізми опосередкованого впливу на структуру мікротрубочок; в) додатковий вплив цих металів на інші цитоскелетні структури, що взаємодіють з мікротрубочками (наприклад, мікрофіламенти).

Тестування впливу кислотного залишку на токсичність важкого металу. Для з’ясування ефекту кислотного залишку на токсичну дію солей важких металів було вирішено порівняти цитогенетичну та антимікротрубочкову активність двох різних сполук (органічної та неорганічної) одного металу – ацетату та нітрату свинцю. Виявлені при цитогенетичному аналізі відмінності в частоті виникнення кластогенних та анеугенних пошкоджень були статистично недостовірними. Візуалізація мікротрубочкових структур в меристемі проростків, оброблених 50 мкМ Pb(CH3COO)2 та 50 мкМ Pb(NO3)2, також підтвердила думку, що токсичність солей металів зумовлюють катіони, а кислотні залишки сполук суттєво не впливають на специфіку дії іонів металів.

Порівняння ЕК50 та ГДК для важких металів та алюмінію. У Табл. 4 порівнюються ЕК50 металів, визначені в наших експериментах, та ЕК50 таких же металів, запропоновані з класичного Allium тесту, з офіційно визнаними ГДК цих металів у ґрунті. Як бачимо, модифікований нами Allium тест (заміна додаткових коренів дорослих цибулин на корінці проростків цибулі) є

Таблиця 4

Гранично допустимі концентрації (ГДК)1 для важких металів та алюмінію та їхні ефективні токсичні концентрації (ЕК50), виявлені в Allium тесті

Метали | ГДК валового вмісту металів у ґрунті,мг/кг | ГДК рухомих форм металів у ґрунті, мг/кг | ЕК50 у класичному? Allium тесті,

мг/л (мкМ)? | ЕК50 у модифікованому Allium тесті,

мг/л (мкМ)?

Cd | 3,0 | 0,7 | 3,4 (31) | 0,76 (6,8)

Pb | 32 | 2,0 | 2,5 (12) | 1,88 (9,1)

Ni | 85 | 4,0 | 1,0 (17) | 0,52 (8,8)

Al– | 0,5 | 21,6 (800) | 0,44 (16,2)

Cu | 55 | 3,0 | 0,17 (2,7) | 0,13 (2,0)

Zn | 100 | 23– | 1,82 (28,0)

1 – інформацію про ГДК використано із книги “Земельні ресурси України” [ред. Медведєв, Лактіонова, 1998];

І – ?К50, визначені для металів у дослідах з додатковими коренями цибулин, використано з Wierzbicka, 1994 (для Pb); Fiskesjх, 1995 (?ля решти металів)

набагато чутливішим за класичний стандарт-метод екологічного моніторингу, він виявляє токсичними навіть ті концентрації металів, що є загальновизнано безпечними і допустимими у навколишньому середовищі. Особливо неадекватними, з точки зору результатів наших досліджень, є офіційно визнані гранично допустимі концентрації рухомих форм Ni, Cu та Zn в ґрунті. Зокрема нікель виявляє фітотоксичність вже за концентрацій у 8 раз нижчих від гранично допустимих, цинк за концентрацій, у 12,5 раз нижчих, а мідь є потенційно небезпечною в концентраціях, нижчих за гранично допустимі у 23 рази. Можливо, враховуючи такі дані, варто переглянути існуючі ГДК і внести до них відповідні зміни.

ВИСНовки

У дисертаційній роботі проведено дослідження ризотоксичної, цитотоксичної, генотоксичної та антимікротрубочкової дії широкого діапазону концентрацій кадмію, свинцю, нікелю, алюмінію, міді та цинку в меристемних клітинах проростків цибулі.

1. Показано, що всі досліджувані метали дозозалежно інгібують кореневий ріст, однак найбільша ризотоксичність характерна для Cu. За ефективними токсичними концентраціями (ЕК50) метали розташовуються в такій послідовності: Cu > Cd > Ni > Pb > Al > Zn; а за концентраціями повного пригнічення росту коренів ряд металів дещо змінюється: Cu > Pb > Cd > Zn > Ni > Al.

2. Встановлено, що за зміною показників мітотичного індексу та співвідношення фаз мітозу найсильніший антимітотичний ефект мають Ni і Cd, а найслабший вплив на мітотичну активність клітин проявляє Al.

3. Виявлено високу кореляцію між ризотоксичністю кадмію, свинцю, нікелю, алюмінію, міді та цинку і їхньою цитотоксичністю для апікальної кореневої меристеми. Ряди токсичності металів за цими показниками співпадають.

4. Цитогенетична активність тестованих металів характеризується як кластогенною, так і анеугенною дією, причому здатність спричиняти порушення ходу мітозу й цитокінезу (анеугенні ефекти) є більш властивою для досліджуваних сполук, ніж індукція хромосомних аберацій.

5. За кількістю хромосомних пошкоджень, що виникають під впливом важких металів та алюмінію у кореневій меристемі, запропоновано такий ряд кластогенності тестованих металів: Zn > Pb = Cd = Cu = Al = Ni.

6. За здатністю індукувати анеугенні порушення в мітотичних та інтерфазних клітинах кореневої меристеми цибулі токсичні метали розташовуються в такій послідовності: Ni >> Cd > Al > Pb > Cu > Zn.

7. Вперше показано антимікротрубочкові ефекти нікелю, кадмію та свинцю у рослинних клітинах. Виявлено, що кадмій і свинець характеризуються подібним механізмом дії, спричиняючи руйнацію окремих мікротрубочок, тоді як нікель зумовлює агрегацію мікротрубочок у товсті нефункціональні пучки.

8. Виявлено стабілізуючий вплив іонів алюмінію на мікротрубочкові структури в клітинах цибулі.

9. На основі порівняння цитогенетичних та антимікротрубочкових ефектів ацетату й нітрату