ІНСТИТУТ ГЕРОНТОЛОГІЇ АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ
Інститут геронтології академії медичних наук України
Давидова Наталія Валентинівна
УДК 615. 275:582.725.4
Біохімічні Механізми антиоксидантної дії
екстракту родіоли рідкого
03.00.04 – біохімія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Київ - 2004
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Буковинській державній медичній академії
Науковий керівник – доктор біологічних наук, професор Мещишен Іван Федорович, Буковинська державна медична академія, завідувач кафедри медичної хімії
Офіційні опоненти: доктор медичних наук Літвінова Надія Володимирівна, Інститут фармакології і токсикології АМН України, головний науковий співробітник відділу біохімічної фармакології
доктор медичних наук, професор Луцюк Микола Борисович, Вінницький національний медичний університет ім. М.І. Пирогова, професор кафедри загальної та біологічної хімії
Провідна установа: Національний медичний університет імені О.О.Богомольця, кафедра біоорганічної, біологічної та фармацевтичної хімії, м. Київ
Захист відбудеться „10” лютого 2005 р. о 13 00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.551.01 Інституту геронтології АМН України ( 04114, м. Київ, вул. Вишгородська, 67).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту геронтології АМН України (04114, м.Київ, вул. Вишгородська, 67).
Автореферат розісланий „ 5 ” січня 2005 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат медичних наук Р. І. Потапенко
Загальна характеристика роботи
Актуальність теми. Проблеми антропогенного навантаження на внутрішнє середовище організму людини в останні роки гостро стоять як в Україні, так і за кордоном. Наслідком інтенсифікаціії виробництва є періодичні промислові аварії та хімічні катастрофи (Трахтенберг, 2000). Зростання кількості населення на планеті вимагає збільшення виробництва продуктів харчування, отже й залучання інтенсивних сільськогосподарських технологій з використанням пестицидів і агрохімікатів, штучних харчових домішок для збільшення тривалості зберігання, покращання зовнішнього вигляду та смакових якостей продуктів (Левицкий, 2001). Використання радіо- та електромагнітних хвиль як комунікативних засобів, посилення природного радіаційного фону, ультрафіолетового випромінювання сонця – всі ці фактори згубно впливають як на природу, так і на організм людини як її складову (Барабой, Сутковой, 1997; Єльський та ін., 2004).
Універсальним патогенетичним механізмом ушкодження клітин під впливом екстремальних факторів різної природи є окиснювальний стрес, який супроводжується інтенсифікацією вільнорадикальних процесів окиснення біомолекул (Буеверов, 2002). До числа захворювань, індукованих окиснювальним стресом, належать ті, які очолюють список першочергових проблем сучасної медицини: серцево-судинні розлади, порушення центральної та периферичної нервової системи, онкологічні, ендокринологічні та ін. (Барабой, Сутковой, 1997). За умов погіршення екологічної ситуації, активність власних систем антиоксидантного захисту організму доволі часто виявляється недостатньою для регуляції рівня вільнорадикальних процесів та потребує додаткового введення в організм екзогенних антиоксидантів.
Актуальною проблемою є пошук нових антиоксидантних препаратів зокрема рослинного походження, оскільки вони містять ряд природних антиоксидантів, які органічно та легко вступають у метаболічні процеси в організмі та практично не мають побічних ефектів, притаманних синтетичним препаратам (Арзамасцев и др., 1999; Катикова и др., 2001).
Екстракт родіоли рідкий є перспективним у цьому плані лікарським засобом. Родіола рожева містить значну кількість біологічно активних речовин, частина з яких є природними антиоксидантами (Быков, 1999; Ganzera, 2001; Ha et al., 2002; Linh et al., 2000). Існують поодинокі відомості про антиоксидантну активність екстракту родіоли та окремих діючих речовин, що виділені з нього, за умов in vitro (Гарифуллина и др., 1998; Сторожок и др., 2002). Клінічно доведена адаптогенна, імуностимулювальна, протипухлинна, антитоксична, антиаритмічна дії екстракту родіоли (Азизов, 1998; Маймескулова, 1998; Починок и др., 2001; Разина и др., 2000; Спасов и др., 2000). Дані щодо використання екстракту родіоли рідкого як антиоксидантного засобу обмежені (Ha, 2002; Wing, 2003).
Вивчення впливу екстракту родіоли рідкого на стан оксидантної та антиоксидантної систем організму за умов фізіологічної норми та окиснювального стресу допомогло б встановити механізм антиоксидантної дії екстракту, обгрунтувати ефективні терапевтичні дози препарату та значно розширити спектр його використання в клінічній практиці як антиоксидантного засобу.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота проводилась в рамках науково-дослідної роботи кафедр медичної хімії та пропедевтики внутрішніх хвороб Буковинської державної медичної академії „Вивчення нових сторін механізму терапевтичної дії лікарських рослин (девясилу високого, родіоли рожевої, гадючника звичайного, перстачу прямостоячого, ехінацеї пурпурової), пилку квіткового, ербісолу, етонію, додецонію та обґрунтування нових технологій їх застосування при лікуванні хворих на первинні, вторинні гастродуоденіти, холецистити, остеоартроз, хронічну серцеву недостатність”, номер державної реєстрації 0101U005248. Автор, як співвиконавець зазначеної теми, безпосередньо дослідила вплив екстракту родіоли рідкого на стан про- та антиоксидантної систем організму щурів за умов фізіологічної норми та моделей вільнорадикальних патологій, провела експериментальне патогенетичне обґрунтування застосування екстракту родіоли рідкого як антиоксидантного засобу, ефективної дози препарату та тривалості курсового прийому.
Мета і задачі дослідження. Обґрунтувати механізм антиоксидантної дії екстракту родіоли рідкого, його вплив на стан основних антиоксидантів крові, печінки та шлунка щурів за умов фізіологічної норми, токсичного гепатиту та ерозивно-виразкового ураження шлунка та дванадцятипалої кишки для розширення його використання в практичній медицині.
Для досягнення мети були поставлені такі задачі:
1. Вивчити фізико-хімічні показники екстракту родіоли рідкого та провести дослідження по виявленню в його складі природних антиоксидантів.
2. Вивчити за умов in vitro вплив різних концентрацій екстракту родіоли рідкого на проникність мембран еритроцитів, стан оксидантної та антиоксидантної систем крові та печінки щурів.
3. Дослідити вплив екстракту родіоли рідкого на функціонування оксидантної та антиоксидантної систем печінки та крові щурів за умов фізіологічної норми.
4. Вивчити вплив екстракту родіоли рідкого на процеси вільнорадикального окиснення біомолекул, стан антиоксидантної системи крові, печінки та шлунка щурів за умов експериментального токсичного гепатиту та ерозивно-виразкового ураження гастродуоденальної зони.
Об’єкт дослідження: екстракт родіоли рідкий, кров, печінка, шлунок білих нелінійних щурів-самців.
Предмет дослідження: показники антиоксидантної системи, процеси пероксидного окиснення ліпідів, окиснювальної модифікації білків крові, печінки, шлунка щурів, морфологічні зміни в гепатобіліарній та гастродуоденальній системах.
Методи дослідження. Біохімічні дослідження: вміст продуктів пероксидного окиснення ліпідів, окисно модифікованих білків, показники антиоксидантної системи (загальна антиоксидантна активність плазми, вміст відновленого глутатіону, НS-груп, активність глутатіонредуктази, глутатіон-S-трансферази, глутатіонпероксидази, глюкозо-6-фосфатдегідрогенази, каталази, супероксиддисмутази, церулоплазміну). Гістологічні дослідження тканин печінки та шлунка щурів.
Наукова новизна одержаних результатів. В даній роботі вперше вивчено вплив екстракту родіоли рідкого на стан оксидантної системи та показники антиоксидантного захисту печінки та крові щурів за умов in vitro та in vivo. Доведено, що екстракт родіоли рідкий проявляє потужні антиоксидантні властивості за рахунок пригнічення процесів вільнорадикального окиснення біомолекул та активації компонентів антиоксидантного захисту в крові, печінці та шлунку щурів.
Вперше обґрунтовані біохімічні механізми антиоксидантної дії екстракту родіоли за умов фізіологічної норми та патологій - експериментальному токсичному гепатиті та ерозивно-виразковому ураженні гастродуоденальної зони. Експериментальними дослідженнями доведено, що основними напрямками механізму антиоксидантної дії екстракту родіоли рідкого є: гальмування процесів вільнорадикального окиснення біомолекул за рахунок зменшення в тканинах концентрації активних форм кисню; стабілізація мембран клітин; активація антиоксидантної системи захисту крові, печінки та шлунка щурів.
Вперше обґрунтовані ефективні терапевтичні дози екстракту родіоли рідкого. Встановлено, що найбільш повно антиоксидантний ефект екстракту родіоли рідкого проявляється за умов введення препарату в дозі 0,01 мл/кг маси тіла впродовж 5 діб за умов фізіологчної норми та 10 діб - за умов вільнорадикальних патологій.
Практичне значення одержаних результатів. Доведена ефективність застосування екстракту родіоли рідкого як антиоксидантного засобу, що обґрунтовує можливість його використання в медичній практиці як гепатопротектора та гастропротектора, особливо у пацієнтів із дезадаптаційними процесами в організмі, поліморбідним фоном.
Особистий внесок здобувача. Здобувачем разом із науковим керівником визначена мета та завдання даного дослідження, проаналізована наукова література з обраної проблеми. Особисто проведені всі біохімічні дослідження, аналіз та узагальнення результатів дослідження, написані всі розділи роботи, сформульовані висновки і практичні рекомендації, які відображені в опублікованих роботах. Тексти всіх публікацій написані здобувачем особисто. У наукових розробках, що висвітлені в статтях, опублікованих сумісно з співавторами, участь здобувача полягала в проведенні літературного пошуку, лабораторних досліджень, статистичній обробці отриманих даних, формулюванні висновків та підготовці публікацій до друку.
Апробація результатів дослідження. Результати досліджень, що включені до дисертації, доповідались та обговорювались на VIII Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002); науково-практичній конференції „Фітотерапія в реабілітації хворих” (Київ, 2003); конференції студентів та молодих вчених із міжнародною участю (Вінниця, 2004); 56-ій науковій конференції студентів та молодих вчених Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця з міжнародною участю (Київ, 2001); Всеукраїнській науково-практичній конференції студентів та молодих вчених „Актуальні проблеми клінічної, експериментальної, профілактичної медицини та стоматології” (Донецьк, 2003); міжнародній студентській науковій конференції „Молодь - медицині майбутнього” (Одеса, 2004); 57-ій міжнародній науково-практичній конференції студентів та молодих учених (Ужгород, 2004); науково-практичних конференціях Буковинської державної медичної академії, 2002- 2004 р.
Публікації. За темою дисертації опубліковано 16 робіт, з них 7 статей - у наукових фахових журналах (2 статті одноосібні), 9 робіт - в матеріалах і збірниках конференцій та конгресів.
Структура і обсяг роботи. Робота викладена на 182 сторінках і складається із дев’яти розділів. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, опису отриманих результатів (6 розділів), аналізу й узагальнення результатів дослідження, висновків, науково-практичних рекомендацій, списку використаних джерел (всього 278 назв). Робота містить 23 таблиці, 32 рисунки, 3 додатки.
Основний зміст роботи
У вступі обґрунтовано актуальність теми, сформульовано мету, завдання та методи досліджень, розкрито наукову новизну і практичне значення роботи, зазначено особистий внесок здобувача і апробацію результатів дисертації.
У першому розділі систематизовано й узагальнено літературні дані щодо сучасних уявлень про біохімічні механізми розвитку вільнорадикальних патологій, проаналізовані дані щодо біохімічних механізмів патогенезу експериментальних моделей вільнорадикальних патологій (експериментального токсичного гепатиту та ерозивно- виразкового ураження гастродуоденальної зони) та шляхи їх корекції. Узагальнені основні відомості щодо хімічного складу, фармакологічних властивостей та застосування в медицині екстракту родіоли рідкого.
Матеріали та методи дослідження. Експериментальні дослідження проведені на 284 білих безпородних статевозрілих щурах-самцях масою 150-180г. Тварини знаходилися на повноцінному раціоні віварію з вільним доступом до їжі та води при температурі 19-21°С. Всі тварини перед початком експерименту голодували впродовж 24 год.
У роботі використовували офіцинальний препарат - екстракт родіоли рідкий (Extractum Rhodiolae fluidum) виробництва ВАТ “Львівська фармацевтична фабрика”, м.Львів, Україна, реєстраційне посвідчення №П.05.02/04706 від 21.05.2002 р. Всі дослідження проведені на одній партії препарату.
Вплив екстракту родіоли рідкого на проникність мембран еритроцитів за умов гіпотонічного гемолізу вивчали за описаною раніше методикою (Мещишен, 1991). Антиоксидантну активність препарату за умов in vitro оцінювали за ступенем гальмування швидкості аскорбат-залежного пероксидного окиснення ендогенних ліпідів (ПОЛ) (Мещишен, 1991) та окиснювальної модифікації білків (ОМБ) плазми крові щурів (Дубініна, 1995), за впливом на стан основних антиоксидантів крові та гомогенатів печінки щурів при додаванні 0,1 мл екстракту родіоли рідкого в інкубаційне середовище в розведеннях від 10-1 до 10-10.
Вплив препарату на стан про- та антиоксидантної систем in vivo вивчали як за умов фізіологічної норми після введення препарату в дозах 0,001 - 0,75 мл/кг маси тіла, так і за умов моделей вільнорадикальних патологій. У роботі використані наступні моделі вільнорадикальних патологій. Ерозивно-виразкове ураження (ЕВУ) гастродуоденальної зони моделювали шляхом перорального введення тваринам суміші, що складалася з 10% розчину консервованої медичної жовчі (10 мл/кг), індометацину (3 мг/кг), ацетилсаліцилової кислоти (100 мг/кг) впродовж 12 діб (Волошин, Мещишен, 1986). Експериментальний токсичний гепатит у щурів викликали шляхом дворазового (через день) внутрішньошлункового введення тваринам тетрахлорметану (CCl4) із розрахунку 0,25 мл/ 100 г маси тіла щура у вигляді 50% олійного розчину (Мещишен, 1991).
Тварин розподілено на групи: 1- контроль, інтактні тварини; 2- тварини з моделлю експериментальної патології; 3- тварини, яким починаючи з останнього дня моделювання патології вводили екстракт родіоли рідкий щоденно внутрішньошлунково в дозі 0,01 мл/кг маси тіла. Тварин забивали декапітацією під легким ефірним наркозом. Кров відбирали в присутності етилендіамінтетраацетату в концентрації 1 мг/мл цільної крові. У цільній крові щурів визначали вміст сполук з ізольованими подвійними зв’язками (ІПЗ), дієнових кон’югатів (ДК), кетодієнів і спряжених триєнів (КД і СТ) (Волчегорский, 1989), глутатіону відновленого (Травина, 1955). В гомогенатах печінки та стінок шлунка визначали вміст сполук з ІПЗ, ДК, КД та СТ (Волчегорский, 1989), малонового альдегіду (Владимиров, Арчаков, 1972), окисно модифікованих білків (Мещишен, Яремій, 1998). Вміст малонового альдегіду (МА) в еритроцитах визначали за Н.В.Васильєвою та І.Ф.Мещишеним, 1998. У гемолізатах крові та гомогенатах печінки визначали активність антиоксидантних ферментів: супероксиддисмутази (СОД) [КФ 1.15.1.1] (Дубинина и соавт., 1983), каталази [КФ 1.11.1.6] (Королюк и соавт., 1988), глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (Г6ФДГ) [КФ 1.1.1.49] (Захарьин, 1967), глутатіонредуктази (ГР) [КФ 1.6.4.2] (Beutler, 1969), глутатіонпероксидази (ГП) [КФ 1.11.1.9] (Геруш, Мещишен, 1998), глутатіон-S-трансферази (ГSТ) [КФ 2.5.1.18] (Habig, 1974). У плазмі крові визначали вміст церулоплазміну (ЦП) за модифікованим методом Ревіна, окисно модифікованих білків (Мещишен, 1998), Sh-груп (Мещишен, Григор’єва, 2002), фукози, не зв’язаної з білками (Шараев и соавт., 1997).
Гістологічні препарати тканин печінки та шлунка готували загальноприйнятим методом, забарвлювали гематоксиліном та еозином, вивчали у світловому мікроскопі МБР-15 при різних збільшеннях із використанням об'єктивів мікроскопу від 3,5х до 90х.
Результати досліджень піддавали статистичному аналізу. Вірогідність отриманих результатів визначали, використовуючи t-критерій вірогідності Стьюдента. Зміни вважали вірогідними при р?0,05. Розрахунки проводили за допомогою пакету програм „Statistica 5.5”.
Фізико-хімічні характеристики екстракту родіоли рідкого. Згідно отриманих даних, екстракт родіоли рідкий містить комплекс біологічно активних речовин, які є природними антиоксидантами. Це, зокрема флавоноїди (0,034±0,0023%), поліфенольні сполуки (14,60±1,024%), салідрозид (0,51±0,021%), дубильні речовини (30,68±0,113 мг/мл), аскорбінова кислота (10,03±0,240 мг%), каротиноїди (5,55±0,064 мг%).
Вивчення спектру поглинання екстракту в ультрафіолетовій області довело, що в межах довжин хвиль від 190 до 350 нм препарат мав лише один чіткий максимум поглинання при довжині хвилі 205 нм поряд із невеликим підйомом кривої поглинання в діапазоні 250-280 нм.
Оптична густина екстракту родіоли рідкого при довжині хвилі 205 нм становила 5750 о.о.г. Концентрація однієї з основних діючих речовин препарату – салідрозиду складала 0,51 г/100 г екстракту.
Дослідження впливу екстракту родіоли рідкого на проникність мембран еритроцитів. При дослідженні впливу різних розведень екстракту родіоли рідкого (10-1 до 10-12) на стійкість мембран еритроцитів до осмотичного гемолізу, встановлено, що препарат проявляв мембраностабілізуючу дію в широкому діапазоні концентрацій (у розведеннях 10-9 -10-1). Максимальна мембранопротекторна дія спостерігалась при розведенні препарату 10-5 та супроводжувалась 31% стабілізації мембран еритроцитів. Високі концентрації препарату не проявляли мембранолітичної дії. Додавання в пробу 0,2 мл екстракту в розведенні 10-1 супроводжувалось 13% стабілізації мембран.
Нами встановлена антиоксидантна дія екстракту родіоли рідкого на різних рівнях дослідження. В експериментах in vitro виявлено (рис. 1), що препарат в розведеннях 10-4-10-7 спричиняв гальмування швидкості аскорбат-залежного ПОЛ в гомогенаті печінки, максимально виражене при розведенні препарату 10-6– на 22%.
Рис. 1. Вплив екстракту родіоли рідкого на швидкість аскорбат-залежного пероксидного окиснення ліпідів у печінці щурів
Відмічене зниження вмісту ОМБ у плазмі крові при додаванні в інкубаційне середовище препарату в розведеннях 10-6-10-7 на 12% та 11% відповідно нижче рівня контролю (рис. 2).
Рис. 2. Вплив екстракту родіоли рідкого на швидкість окиснювальної модифікації білків плазми крові щурів
Антиоксидантна активність екстракту обумовлена вмістом у його складі поліфенольних сполук, флавоноїдів, дубильних речовин. Фенольна структура цих речовин здатна до легкої віддачі делокалізованих ?-електронів, що дає можливість їх молекулам виступати в ролі перехоплювачів вільних радикалів та знижувати інтенсивність вільнорадикальних процесів на рівні ініціації. Антирадикальну активність мають й аскорбінова кислота та каротиноїди, що також входять до складу екстракту.
Високі концентрації фенольних сполук в присутності кисню та іонів металів із змінною валентністю функціонують як прооксиданти, ініціюючи ланцюг вільнорадикального окиснення. Цим можна пояснити прооксидантний ефект розведень екстракту 10-1-10-3, які за умов in vitro викликали посилення процесів вільнорадикального окиснення ліпідів та білків (рис. 1, 2).
Екстракт родіоли рідкий проявляв стимулюючий вплив на активність антиоксидантних ферментів за умов ін вітро. Так, встановлено зростання активності глутатіон-S-трансферази крові при додаванні екстракту родіоли в інкубаційне середовище в розведеннях 10-5- 10-7 (на 12%, 22% та 15%). Вміст церулоплазміну в плазмі крові виявився вищим рівня контролю при розведеннях препарату 10-5- 10-8. Відмічене зростання активності каталази в крові вище рівня контролю при додаванні препарату в інкубаційне середовище в широкому діапазоні розведень (10-4-10-10). Жодна з досліджуваних концентрацій препарату in vitro вірогідно не змінювала активність СОД крові.
Високі концентрації препарату (розведення 10-1- 10-3) при додаванні в інкубаційне середовище знижували вміст НS-груп у плазмі крові, проявляли гальмуючий вплив на активність антиоксидантних ферментів крові: каталази, глутатіон-S-трансферази, глутатіонпероксидази.
Таким чином, екстракт родіоли рідкий за умов in vitro в розведеннях 10-6-10-7 проявляв антиоксидантну дію, знижуючи інтенсивність процесів вільнорадикального окиснення біомолекул та активуючи ферменти антиоксидантного захисту в крові щурів. Отримані результати використовувались при підборі діапазону досліджуваних доз препарату in vivo за умов фізіологічної норми.
Стан оксидантної та антиоксидантної систем крові та печінки щурів за умов фізіологічної норми та введення екстракту родіоли рідкого.
Інтактним тваринам, що голодували протягом 12 годин до початку експерименту, вводили екстракт родіоли рідкий внутрішньошлунково одноразово в дозах 0,001; 0,005; 0,01; 0,02; 0,1; 0,25 та 0,75 мл/кг маси тіла. Тварин декапітували під легким ефірним наркозом через 24 год після введення препарату. Показники оксидантної та антиоксидантної систем визначали в крові та постядерному супернатанті 5% гомогенату печінки щурів.
Встановлено (рис. 3), що одноразове введення екстракту родіоли рідкого в дозі 0,01 мл/кг маси вже через добу викликало зниження вмісту малонового альдегіду в печінці щурів на 23% у порівнянні з контролем. Введення екстракту в дозах 0,1; 0,25 та 0,75 мл/кг викликало прооксидантний ефект, про що свідчило зростання вмісту малонового альдегіду в печінці щурів на 42%, 80% та 108% відповідно вище рівня контролю.
Одноразове введення екстракту родіоли рідкого в дозах 0,01 та 0,02 мл/кг маси викликало й зниження вмісту ОМБ в печінці на 9% та 11% відповідно нижче контролю (рис. 3).
Рис. 3. Вплив екстракту родіоли рідкого на вміст малонового альдегіду та окисно модифікованих білків у печінці щурів за умов фізіологічної норми
Дози екстракту 0,25 та 0,75 мл/кг через 24 год викликали вірогідне зростання вмісту ОМБ в печінці на 30% та 38% відповідно. Подібний вплив екстракту родіоли на процеси вільнорадикального окиснення ліпідів та білків відмічений і в крові тварин, проте вираженість його, в порівнянні із змінами в печінці, була значно меншою, що може бути пов’язано із біотрансформацією препарату в печінці та ефектом первинного проходження.
За умов фізіологічної норми екстракт родіоли мав і безпосередній вплив на активність антиоксидантної системи печінки та крові щурів. Встановлено (табл. 1), що введення екстракту в дозах 0,01, 0,25 та 0,75 мл/кг супроводжувалось дозозалежним зростанням вмісту відновленого глутатіону в печінці на 18%, 30% та 50% вище рівня контролю відповідно. Подібні зміни відмічені й в крові щурів.
Екстракт родіоли впливав і на активність ферментів глутатіонової системи печінки: дози 0,001; 0,005; 0,01 та 0,02 мл/кг маси через 24 год викликали зростання активності глутатіонредуктази в печінці щурів на 29%, 68%, 62% та 31% відповідно (табл. 1). Доза 0,01 мл/кг викликала помірне зростання активності ГSТ в печінці – на 13% вище рівня контролю. Дози екстракту вище 0,1 мл/кг маси призводили до інгібування активності ГSТ та глутатонредуктази в печінці.
Екстракт родіоли рідкий, введений одноразово в дозах 0,01; 0,02; 0,1; 0,25 та 0,75 мл/кг, призводив до помірного зниження активності глюкозо-6-фосфатдегідрогенази в печінці на 9%, 14%, 16%, 17% та 27% нижче контролю відповідно (табл. 1).
Таблиця 1
Вплив екстракту родіоли рідкого на показники антиоксидантної системи печінки щурів за умов фізіологічної норми (М±m; n= 4-6)
Умови
досліду | Досліджувані показники
Глутатіон відновлений,
мкмоль/г тканини | Супероксид-дисмутаза, од/мг тканини | Каталаза, нмоль/ хв·мг тканини | Глутатіон-S-трансфе-раза, нмоль/ хв·мг білка | Глутатіон-редуктаза, нмоль/ хв·мг білка | Глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа,
нмоль/
хв·мг білка
Контроль | 8,04±0,804 | 0,958±0,132 | 45,6±1,16 | 57,9±5,96 | 3,33±0,416 | 13,9±0,50
Доза препарату | 0,001мл/кг | 8,27±0,695 | 0,900±0,145 | 48,5±2,40 | 60,4±7,59 | 4,31±0,481* | 13,5±0,73
0,005мл/кг | 7,88±0,759 | 0,972±0,123 | 51,4±3,71* | 61,2±4,84 | 5,59±0,509* | 13,0±0,40
0,01мл/кг | 8,23±0,722 | 0,867±0,016 | 52,7±2,92* | 66,5±4,15 | 5,38±0,513* | 12,7±0,59*
0,02мл/кг | 7,94±0,519 | 0,735±0,052* | 50,1±3,44* | 59,2±2,39 | 4,37±0,624* | 12,0±0,38*
0,1мл/кг | 9,51±0,139* | 0,859±0,034 | 42,7±2,38 | 54,9±3,33 | 3,43±0,146 | 11,7±0,35*
0,25мл/кг | 10,49±0,139* | 0,657±0,028* | 39,6±1,52* | 52,5±4,87 | 2,96±0,191 | 11,5±0,71*
0,75мл/кг | 12,06±0,139* | 0,598±0,028* | 36,7±1,37* | 46,5±4,61* | 2,64±0,249* | 10,1±0,26*
Примітка: * - вірогідність різниці показників контрольної та дослідних груп (р?0,05)
При введенні екстракту родіоли рідкого в дозі 0,005, 0,01 та 0,02 мл/кг відмічене зростання в печінці активності каталази на 13%, 19% та 10% вище контролю відповідно. Дози препарату 0,25 та 0,75 мл/кг призвели до зниження активності каталази в печінці на 13% та 20% нижче контролю відповідно. Ці ж дози препарату різко пригнічували активність супероксиддисмутази печінки.
Таким чином, за умов одноразового введення, доза екстракту 0,01мл/кг через 24 год проявляла помірні позитивні зміни оксидантно - антиоксидантного стану печінки та крові щурів. Дози препарату вище 0,1 мл/кг маси тіла сприяли посиленню процесів вільнорадикального окиснення біомолекул, що є свідченням прооксидантного впливу вказаних доз препарату.
Найбільш повно антиоксидантний ефект екстракту в дозі 0,1 мл/кг проявлявся в перші 5 діб введення. Більш тривале введення екстракту родіоли інтактним тваринам (7 та 10 діб) супроводжувалось прооксидантними змінами в організмі щурів, що, імовірно, пов’язано із кумуляцією препарату в організмі. Отже, в подальших дослідженнях для корекції порушень антиоксидантного захисту за умов експериментальних вільнорадикальних патологій використовували дозу екстракту 0,01 мл/кг маси.
Вплив екстракту родіоли рідкого на стан оксидантної та антиоксидантної систем за умов експериментального токсичного гепатиту. Експериментальний токсичний гепатит, викликаний введенням тетрахлорметану (ССl4) є класичною модельною системою токсичного ураження гепатоцитів. Одним із основних факторів альтерації гепатоцитів є потужний прооксидантний ефект вільнорадикальних похідних чотирихлористого вуглецю, які ініціюють ланцюг ліпопероксидації в мембранних структурах гепатоцитів.
Нашими дослідженнями підтверджено посилення процесів ліпопероксидації та окиснювальної модифікації білків у печінці щурів за умов інтоксикації ССl4 в усі терміни експерименту (табл. 2).
Таблиця 2
Вміст продуктів пероксидного окиснення ліпідів та окисно модифікованих білків у печінці щурів за умов експериментального токсичного гепатиту та введення екстракту родіоли рідкого (М±m; n=8)
Умови досліду | Досліджувані показники
ІПЗ,
Е220/ г тканини | ДК,
Е232/ г тканини | КД і СТ,
Е278/ г тканини | Малоновий альдегід, мкмоль/г тканини | ОМБ (370 нм), ммоль/г білка
Контроль | 44,03±1,965 | 17,07±1,146 | 10,47±0,984 | 38,95±4,75 | 1,99±0,281
5 доба | гепатит | 59,40±2,397* | 25,58±2,516* | 17,52±1,812* | 49,94±4,70* | 3,57±0,050*
гепатит+родіола | 51,48±3,862* | 19,56±1,147* | 12,96±1,854* | 45,55±3,00* | 3,08±0,364*
7 доба | гепатит | 55,23±1,807* | 21,54±2,517* | 17,11±1,421* | 56,14±5,39* | 3,60±0,178*
гепатит+родіола | 49,17±1,531* | 17,28±0,959 | 10,18±0,905 | 45,34±4,98* | 2,67±0,061*
10 доба | гепатит | 52,92±4,758* | 21,53±3,250* | 15,18±1,136* | 56,84±5,09* | 2,96±0,260*
гепатит+родіола | 42,07±4,718 | 17,49±2,329 | 9,37±0,635 | 40,89±5,87 | 2,46±0,293*
Примітка: * - вірогідність різниці показників контрольної та дослідних груп (р?0,05)
Отруєння ССl4 супроводжувалось наступними гістологічними змінами в тканині печінки: поєднанням зернистої та гідропічної дистрофії, мікровезикулярним стеатозом, морфологічними ознаками колікваційного некрозу гепатоцитів, що обумовлювало значну дископлексацію печінкових балок, апоптичними змінами гепатоцитів.
Введення екстракту родіоли рідкого тваринам на фоні отруєння ССl4 супроводжувалось нормалізацією рівня вільнорадикальних процесів у печінці щурів. Так, вже на 5 добу експерименту, коли вміст проміжних продуктів ПОЛ у спонтанно одужуючих тварин зростав максимально, введення екстракту супроводжувалось підвищенням вмісту сполук з ІПЗ, ДК , КД та СТ на 16%, 15%, та 24% (табл. 3). На 10 добу введення препарату спостерігалась нормалізація вмісту як проміжних, так кінцевого продуктів ПОЛ – малонового альдегіду в печінці щурів.
Екстракт родіоли викликав зниження вмісту окисно модифікованих білків у печінці інтоксикованих щурів у порівнянні з тваринами, що спонтанно одужували, проте на 10 добу введення препарату цей показник залишався вище контролю на 23% (табл. 2).
Таблиця 3
Показники антиоксидантної системи печінки щурів за умов експериментального токсичного гепатиту та введення екстракту родіоли рідкого (М ± m; n = 8)
Умови досліду | Досліджувані показники
Глутатіон відновлений, мкмоль/г тканини | Глутатіон-S-трансфераза, нмоль/хв·мг білка | Глутатіон-пероксидаза, нмоль/хв·мг білка | Глутатіон-редуктаза,
нмоль/хв·мг білка | Глюкозо-6-фосфат-дегідроге-наза,нмоль/хв·мг білка | Супероксид-дисмутаза, од/мг тканини | Каталаза, нмоль/хв·мг тканини
Контроль | 7,09±0,427 | 44,19±2,620 | 105,1±11,40 | 3,66 ± 0,23 | 6,94 ± 0,34 | 0,854±0,059 | 32,18±3,299
5 доба | гепатит | 11,80±1,017* | 32,33±2,570* | 145,5±7,13* | 5,20 ± 0,41* | 9,58 ± 0,04* | 0,557±0,075* | 17,65±2,836*
гепатит + родіола | 8,90±0,934* | 34,53±2,460* | 132,4±12,50* | 4,92 ± 0,16* | 11,28 ± 0,14* | 0,621±0,144* | 23,60±2,787*
7 доба | гепатит | 8,20±0,808* | 34,77±3,396* | 143,6±14,23* | 5,00 ± 0,34* | 8,18 ± 0,42* | 0,720±0,136* | 22,67±3,479*
гепатит + родіола | 7,10±0,795 | 41,60±2,406 | 125,8± 5,62* | 5,19 ± 0,34* | 8,06 ± 0,38* | 0,848±0,107 | 27,49±2,585*
10 доба | гепатит | 6,20±0,590* | 35,07±2,250* | 138,6±12,03* | 4,89 ± 0,32* | 8,11 ± 0,49* | 0,783±0,066* | 24,19±3,270*
гепатит + родіола | 6,82±0,651 | 45,06±3,362 | 108,2±12,46 | 4,85 ± 0,48* | 6,67 ± 0,37 | 0,826±0,050 | 29,35±2,700
Примітка: * - вірогідність різниці показників контрольної та дослідних груп (р ? 0,05)
Екстракт родіоли мав нормалізуючий вплив й на показники глутатіонової системи печінки щурів за умов токсичного гепатиту (табл. 3). Вміст відновленого глутатіону в печінці щурів із токсичним гепатитом після компенсаторного зростання на 5 та 7 доби (на 66% та 16% відповідно), вірогідно знижувався на 10 добу експерименту, що може свідчити про виснаження глутатіонової системи організму. Ведення екстракту родіоли викликало менш виражене зростання вмісту відновленого глутатіону в печінці щурів на 5 добу порівняно з нелікованими тваринами, а на 7 та 10 доби цей показник вірогідно не відрізнявся від контролю.
Введення екстракту викликало й зниження активності ферментів глутатіонової системи: ГР, Г6ФДГ, ГП, активності яких у тварин, що спонтанно одужували, були підвищені в усі терміни експерименту. На 10 добу введення препарату активності Г6ФДГ, ГП вірогідно не відрізнялись від показників контролю, активність ГР залишалась на 33% вище рівня контролю (табл. 3).
Семиденне введення препарату нормалізувало знижену за умов гепатиту активність глутатіон-S-трансферази печінки щурів. Екстракт родіоли рідкий за умов 10-денного введення мав нормалізуючий вплив й на активність каталази та СОД, ферментів першої лінії антиоксидантного захисту організму, активність яких у нелікованих тварин була різко зниженою в усі терміни експерименту.
Поряд із нормалізацією показників про- та антиоксидантної системи, 10-денне введення екстракту родіоли тваринам, ураженим СС14, призвело до повного відновлення гістологічної будови печінкової тканини.
Стан оксидантної та антиоксидантної систем організму щурів за умов ерозивно-виразкового ураження гастродуоденальної зони та введення екстракту родіоли рідкого.
Екстракт родіоли рідкий виявився ефективним антиоксидантом й за умов експериментального ерозивно-виразкового ураження гастродуоденальної зони (ЕВУ). Активація процесів вільнорадикального окиснення біомолекул у шлунку щурів із ЕВУ супроводжувалась зростанням вмісту молекулярних продуктів ПОЛ та ОМБ в усі терміни експерименту, максимально вираженим в термін моделювання патології. Наслідком деградації глікопротеїнів шлункового слизу було зростання вмісту фукози в плазмі крові на 69%, 61% та 49% на 5, 7 та 10 доби відповідно вище контролю. Введення екстракту вже протягом 7-10 діб викликало зниження до рівня контролю вмісту цих показників (табл. 4).
Вміст компонентів антиоксидантної системи шлунка щурів також зазнав змін за умов ЕВУ (табл. 5). Відмічено зниження вмісту HS-груп в шлунку щурів в усі терміни експерименту. Посилене утворення супероксидного аніон-радикалу за умов ЕВУ призвело до зростання активності СОД у шлунку. Утворений в реакції дисмутації пероксид водню знешкоджується каталазою та пероксидазою, активність яких в шлунку щурів з ЕВУ була вірогідно зниженою. Введення екстракту родіоли впродовж 10 діб відновлювало порушений дисбаланс антиоксидантів у шлунку (табл. 5).
Таблиця 4
Вміст продуктів пероксидного окиснення ліпідів та окисно модифікованих білків у шлунку щурів за умов ерозивно-виразкового ураження гастродуоденальної зони та введення екстракту родіоли рідкого (М ± m; n = 8)
Умови досліду | Досліджувані показники
ІПЗ,
Е220/г тканини | ДК,
Е232/г тканини | КД СТ,
Е278/г тканини | Малоновий альдегід, мкмоль/г тканини | ОМБ(370нм),
ммоль/г білка | ОМБ(430нм),
о.о.г. /г білка
Контроль | 57,3±2,39 | 32,6±2,14 | 27,1±1,66 | 19,6±1,24 | 2,06±0,152 | 17,76±1,043
ЕВУ | 77,7±3,88* | 41,6±1,50* | 34,1±2,11* | 31,2±0,44* | 2,70±0,113* | 22,44±1,125*
5 доба | ЕВУ | 75,6±4,12* | 40,4±1,30* | 33,7±2,89* | 28,7±2,14* | 2,64±0,333* | 26,93±2,016*
ЕВУ+ родіола | 63,9±3,71* | 36,3±2,62* | 31,4±2,59* | 20,3±2,72 | 2,48±0,124* | 22,13±2,110*
7 доба | ЕВУ | 72,1±4,14* | 39,4±1,06* | 33,0±1,82* | 26,1±2,05* | 2,51±0,176* | 25,33±1,604*
ЕВУ+ родіола | 62,5±2,19* | 34,4±1,18 | 29,4±1,33* | 21,4±3,30 | 2,29±0,204* | 21,10±1,684*
10 доба | ЕВУ | 69,5±2,12* | 38,1±1,35* | 32,3±1,74* | 23,6±1,48* | 2,42±0,133* | 24,14±1,991*
ЕВУ+ родіола | 55,3±1,42 | 30,4±1,52 | 26,4±0,91 | 21,4±1,36 | 2,02±0,188 | 18,51±1,720
Примітка: * - вірогідність різниці показників контрольної та дослідних груп (р?0,05)
Екстракт родіоли викликав й нормалізацію вмісту відновленого глутатіону в шлунку щурів. Зниження вмісту відновленого глутатіону ймовірно пов’язано із посиленим використанням його глутатон-S-трансферазою, поряд із порушенням співвідношення ферментів його регенерації - зростання активності глутатіонредуктази, на фоні пригнічення глюкозо-6-фосфатдегідрогенази.
Введення екстракту родіоли рідкого впродовж 7-10 діб викликало нормалізацію активності ферментів глутатіонової системи (табл. 5).
Екстракт родіоли поряд із антиоксидантними, проявляв і репарантні властивості за умов ЕВУ. Патоморфологічні зміни слизової оболонки шлунка спостерігалися переважно в пілоричній його частині та були представлені різними етапами виразкоутворення: некрозом поверхневих відділів слизової оболонки без утворення дефекту, ерозіями та виразковими дефектами із ознаками гострого запалення навколо них. На 10-ту добу експерименту поряд із ерозивно-виразковими ураженнями шлунка відмічали процеси самозагоєння дефектів слизової оболонки, яке розвивалось за двома типами. Перше - утворення типової грануляційної тканини раннього типу в ділянках, які відповідали колишнім глибоким дефектам слизової оболонки. Заміщення поверхневих дефектів відбувалось шляхом компактного нагромадження фібробластів без утворення в цих областях кровоносних судин.
Таблиця 5
Стан антиоксидантної системи шлунка щурів за умов ерозивно-виразкового ураження гастродуоденальної зони та введення екстракту родіоли рідкого (М ± m; n = 6-8)
Умови досліду | Досліджувані показники
Глутатіон відновле-ний, мкмоль/г тканини | Глутатіон-S-трансфе-раза, нмоль/хв мг білка | Глутатіон-пероксидаза, нмоль/хв мг білка | Глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа, нмоль/
хв мг білка | Глутатіон-редуктаза, нмоль/хв мг білка | Супероксид
дисмутаза, од/мг тканини | Каталаза
нмоль/хв г тканини | HS- групи,
мкмоль/г тканини
Контроль | 1,17±0,149 | 3,52±0,296 | 138,4±11,07 | 4,85±0,356 | 5,65±0,606 | 0,120±0,013 | 1,27±0,068 | 6,24 ± 0,557
ЕВУ | 0,83±0,152* | 6,47±0,562* | 66,1±4,38* | 4,16±0,383* | 7,09±0,255* | 0,149±0,012* | 0,90± 0,083* | 3,95 ± 0,543*
5 доба | ЕВУ | 0,76±0,162* | 7,15±0,621* | 94,9±7,15* | 3,45±0,404* | 6,38±0,208* | 0,146±0,008* | 0,95±0,054* | 4,19 ± 0,798*
ЕВУ+ родіола | 0,77±0,177* | 5,02±0,639* | 122,2±5,13 | 3,56±0,357* | 5,45±0,287 | 0,139±0,012* | 1,17±0,096* | 4,93 ± 0,600*
7 доба | ЕВУ | 0,83±0,133* | 7,33±0,659* | 95,5±9,06* | 3,02±0,275* | 6,29±0,307* | 0,144±0,009* | 1,02±0,087* | 4,37±0,463*
ЕВУ+ родіола | 1,14±0,168 | 4,63±0,407* | 140,1±9,42 | 4,56±0,164 | 6,14±0,450 | 0,123±0,012 | 1,14±0,052* | 5,50±0,476*
10 доба | ЕВУ | 0,94±0,126* | 5,03±0,339* | 97,3±12,39* | 2,70±0,330* | 5,20±0,219 | 0,139±0,006* | 1,02±0,053* | 4,64 ± 0,475*
ЕВУ+ родіола | 1,21±0,187 | 3,22±0,296 | 165,3±12,33* | 4,68±0,483 | 5,30±0,323 | 0,111±0,016 | 1,39±0,054* | 6,10 ± 0,539
Примітка: * - вірогідність різниці показників контрольної та дослідних груп (р?0,05)
Введення екстракту родіоли супроводжувалось інтенсивними процесами регенерації дефектів слизової оболонки вже на 5 добу. На 10 добу введення препарату дефекти слизової оболонки були відсутні. Грануляційної тканини або поверхневих нагромаджень фібробластів, описаних при самозагоєнні, знайдено не було. За умов введення екстракту родіоли регенерація слизової оболонки шлунка відбулась з відновленням не тільки об'єму тканини, але і її якісного складу з цілком достатнім розвитком як стромального, так і епітеліального компонента.
Отже, за умов вільнорадикальних патологій екстракт родіоли рідкий у підібраній нами дозі проявляв виражену антиоксидантну дію та відновлював порушений оксидантно- антиоксидантний гомеостаз за рахунок наступних механізмів:
1) гальмування процесів вільнорадикального окиснення біомолекул за рахунок зменшення в тканинах концентрації активних форм кисню, що обумовлено антирадикальними властивостями фенольних сполук в складі екстракту;
2) стабілізації мембран клітин;
3) активації ферментів антиоксидантного захисту в крові, печінці та шлунку щурів (каталази, глутатіон-S-трансферази, церулоплазміну в крові за умов in vitro; каталази, глутатіонредуктази, глутатіон-S-трансферази в печінці in vivo за умов фізіологічної норми).
Висновки
У дисертаційній роботі наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукового завдання, яке полягало у встановленні біохімічних механізмів антиоксидантної дії екстракту родіоли рідкого. Це наукове завдання вирішене шляхом вивчення стану оксидантної та антиоксидантної систем організму щурів за умов фізіологічної норми, моделей вільнорадикальних патологій та можливості корекції його порушень екстрактом родіоли рідким.
1. Моделі вільнорадикальних патологій (експериментальний токсичний гепатит та ерозивно-виразкове ураження шлунка та дванадцятипалої кишки) супроводжуються суттєвим зростанням процесів вільнорадикального окиснення біомолекул. Це проявляється накопиченням у тканинах тварин окисно модифікованих білків, проміжних і кінцевих продуктів пероксидного окиснення ліпідів – сполук з ізольованими подвійними зв’язками, дієнових кон’югатів, кетодієнів та спряжених триєнів, малонового альдегіду.
2. Екстракт родіоли рідкий в умовах гіпотонічного гемолізу проявляє виражену мембраностабілізуючу дію в широкому діапазоні концентрацій (10-1-10-9), що може слугувати одним із критеріїв розуміння антиоксидантної та терапевтичної дії препарату, розширення діапазону його клінічного застосування.
3. Вплив екстракту родіоли рідкого на показники оксидантно- антиоксидантної системи печінки та крові щурів за умов in vitro має двохфазний характер. Розведення екстракту 10-6-10-7 проявляли помірний антиоксидантний ефект, тоді як високі концентрації препарату (розведення 10-1-10-2) – виражений прооксидантний вплив.
4. Екстракт родіоли рідкий проявляє антиоксидантні властивості за умов фізіологічної норми in vivo, про що свідчить зниження вмісту в печінці та крові щурів малонового альдегіду, окисно модифікованих білків, а також помірне зростання активності каталази, глутатіон-S-трансферази та церулоплазміну.
5. Найбільш повно антиоксидантний ефект екстракту родіоли проявляється при введенні препарату в дозі 0,01 мл/кг маси тіла впродовж 5 діб, що є ефективною терапевтичною дозою екстракту за умов фізіологічної норми у щурів.
6. Введення екстракту родіоли рідкого за умов вільнорадикальних патологій (експериментального токсичного гепатиту та ерозивно-виразкового ураження дванадцятипалої кишки) у дозі 0,01 мл/кг маси тіла впродовж 10 діб сприяє нормалізації інтенсивності вільнорадикальних процесів та активності компонентів антиоксидантного захисту в крові, печінці та шлунку щурів.
7. Екстракт родіоли рідкий проявляє виражені репарантні властивості, сприяючи повному відновленню гістологічної будови тканин печінки та стінки шлунка за умов експериментального токсичного гепатиту та ерозивно-виразкового ураження гастродуоденальної зони.
8. Основними напрямками механізму антиоксидантної дії екстракту родіоли рідкого є: гальмування процесів вільнорадикального окиснення ліпідів та білків за рахунок зменшення в тканинах концентрації активних форм кисню; стабілізація мембран клітин; активація ферментів антиоксидантної системи захисту крові, печінки та шлунка щурів.
Список опублікованих праць за темою дисертації
1. Давидова Н.В. Стан глутатіонової системи печінки щурів за умов експериментального токсичного гепатиту та введення екстракту родіоли рідкого// Буковинський медичний вісник.-2003.-Т.7, №2.-С.140-142.
2. Давидова Н.В. Вплив екстракту родіоли рідкого на стан оксидної та антиоксидної систем печінки і крові щурів за умов експериментального токсичного гепатиту//Медична хімія.-2003.-Т.5, №3.-С.56-59.
3. Давидова Н.В., Мещишен І.Ф. Вплив екстракту родіоли рідкого на стан оксидантно- антиоксидантної системи крові щурів за умов експериментального ерозивно-виразкового ураження гастродуоденальної зони// Буковинський медичний вісник.-2003.-Т.7,№4.- С.143-145.
4. Давидова Н.В., Мещишен І.Ф. Вплив екстракту родіоли рідкого на стан глутатіонової системи шлунка щурів за умов ерозивно-виразкового ураження гастродуоденальної зони// Вісник проблем біології і медицини.- 2004.- Вип.2.- С.40-43.
5. Давидова Н.В., Мещишен І.Ф. Вплив екстракту родіоли рідкого на стан оксидантно-антиоксидантної
