НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

Долгова Тетяна Анатоліївна

УДК 633.1:615.849:575

ІНДУКЦІЯ ТА ПРОЯВ РАДІОАДАПТИВНОЇ ВІДПОВІДІ

У ПОКОЛІННЯХ РОСЛИН З РІЗНИМ ГЕНОТИПОМ

03.00.15 – генетика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Харківському національному університеті ім. В.Н. Каразіна

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Шестопалова Надія Григорівна,

Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук

Терновська Тамара Костянтинівна,

Інститут агроекології та біотехнології УААН,

завідувач лабораторії геномної та хромосомної

інженерії рослин;

доктор біологічних наук

Андрєйченко Сергій Вадимович

Інститут експериментальної радіології

Наукового центру радіаційної медицини АМН України,

завідувач лабораторії радіаційної біохімії

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка,

м. Київ

Захист відбудеться 20 травня 2004 року о 15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.202.01 Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, Київ, вул. акад. Заболотного, 148

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, Київ, вул. акад. Заболотного, 148

Автореферат розісланий “15” квітня 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук О.А. Кравець

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Останнім часом вивчення стійкості живих організмів до різних стресових чинників набуває все більшої актуальності. У відповідь на дію стресорів в клітинах відбуваються неспецифічні та специфічні реакції, поряд з адаптивними процесами можливий як розвиток пошкоджень, так і їх репарація (Гродзинський, 2000; Колупаєв, 2001). За висловом В.Я. Александрова “Адаптивное изменение устойчивости дает клетке возможность оставаться жизнеспособной и сохранять близкими к норме основные структурные и функциональные параметры при существенном отклонении состава среды от оптимума” (Александров, 1965). Така зміна стійкості пов’язана з репресією одних генів і активацією інших та може здійснюватися у короткий термін чи бути розтягнутою у часі (Веселовский, 1993).

При вивченні модифікації адаптивної реакції біологічних об’єктів було виявлено, що попередній вплив малих доз мутагену перед дією великої дози здатний індукувати у них захисну реакцію, яка призводить до підвищення виживання організмів. Це явище отримало назву “адаптивна відповідь” (Филиппович, 1991). Дослідження за цим напрямом показали, що адаптивна відповідь виявляється у біологічних об’єктів різного рівня організації (від бактерій до людини) і може викликатися впливом фізичних та хімічних агентів (Котеров, 1999). Неспецифічний характер реакції на широке коло фізичних та хімічних агентів свідчить про те, що адаптивна відповідь є загальнобіологічним феноменом, а в клітинах існує еволюційно закріплений комплекс розвитку адаптивних реакцій на зовнішній вплив.

Використання малих доз радіації як індуктора адаптивної відповіді призводить до формування у біологічних об’єктів радіоадаптивної відповіді (РАВ), прояв якої в основному досліджено на різних клітинах людини та тварин in vitro за зміною рівня хромосомного мутагенезу (Olivieri, 1990; Ikushima, 1996; Засухина, 1999) і значно менше у дослідах з рослинами (Корогодина, 1998; Михеев, 1998; Серебряный, 2001).

Рослини у більшості випадків являють собою зручні системи для розкриття механізмів формування захисних реакцій після мутагенного впливу іонізуючої радіації. Дослідження механізмів індукції захисних систем рослин показало, що у формуванні ефекту РАВ можуть брати участь молекулярно-генетичні процеси репарації ДНК, просування клітин за мітотичним циклом, а також стимульована репопуляція меристемних тканин (Шестопалова, 1997; Гродзинський, 2000; Серебряный, 2002). Тому важливе значення має вивчення прояву РАВ на рівні меристематичних тканин рослин, адже від їх структурно-функціонального стану залежать ступінь пошкодження, активність відновлення, реалізація генетичної програми розвитку (Гродзинський, 1982; Гудков, 1985).

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у Харківському національному університеті ім. В.Н. Каразіна у рамках завдання “Вивчити прояв кількісної спадковості у зв’язку з генетичними і фізичними параметрами ядерного геному в нормі та за умов впливу електромагнітних хвиль різних частот” (номер державної реєстрації 0100U003314).

Мета і завдання досліджень. Метою роботи було дослідження прояву радіаційно-індукованої адаптивної відповіді (РАВ) у поколіннях рослин з різним генотипом на клітинному та організмовому рівнях після впливу на насіння, що перебуває у стані спокою, адаптивної та тестової доз опромінення. У зв’язку з цим були поставлені такі завдання:

1. Вивчити можливість індукції РАВ після впливу обраних режимів гамма-опромінення насіння на проростках рослин двох видів Allium L. та трьох сортів Hordeum distichon L.

2. Дослідити ступінь прояву РАВ клітин кореневої меристеми проростків різних генотипів цибулі та ячменю у ранній пострадіаційний період (М0).

3. Вивчити прояв РАВ у поколіннях (М1 та М2) рослин різних сортів ячменю на клітинному та організмовому рівнях.

Об’єкт дослідження – радіаційно-індукована адаптивна відповідь рослин.

Предмет дослідження – прояв РАВ на рівні клітин утворювальної тканини проростків і вегетаційних рослин.

Методи дослідження. Морфометричні методи, цитологічний та цитогенетичний аналіз з використанням світлової мікроскопії, методи математичної статистики.

Наукова новизна роботи. Вперше на клітинному та організмовому рівнях рослин з різним генотипом показана можливість індукції РАВ внаслідок впливу на насіння, що перебуває у стані спокою, адаптивною (окремо та сумісно мм- радіохвилі та гамма-радіація) і тестовою (гамма-радіація) дозами опромінення. Встановлено важливе значення рівня синхронізації першого мітозу при проростанні опроміненого насіння як показника стимуляції мітотичної активності за прояву РАВ. Вперше показано зберігання прояву РАВ у поколіннях опроміненого насіння за комплексом показників (проліферація клітин, ростові реакції, рівень хромосомного мутагенезу, урожайність).

Практичне значення одержаних результатів. Результати дослідження можуть бути використані при опроміненні насіння з метою стимуляції ростових реакцій цибулі та ячменю, при застосуванні радіаційного мутагенезу для розширення спектра генетичної мінливості рослин, а також при створенні оптимальних умов для індукції захисних систем рослин з метою зниження мутагенної дії пошкоджуючих доз радіації та підвищення урожайності сільськогосподарських рослин за екстремальних умов.

Особистий внесок здобувача. Результати досліджень, представлені у дисертації, отримані автором самостійно на кафедрі генетики та цитології Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна. Цитогенетичний аналіз зародкової меристеми Allium сера L. проведений разом із к.б.н., с.н.с. НДІ біології ХНУ ім. В.Н. Каразіна Л.В. Винокуровою.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертації були представлені на IV Міжнародному симпозіумі “Биологические механизмы старения” (Харьков, 2000); на конференцї з генетики та молекулярної біології для студентів і молодих вчених (Lviv, 2000); на Міжнародній науково-практичній конференції “Cerctari radiationale in republica Moldova” (Chisinau, 2000); на Міжнародній конференції молодих вчених “Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений” (Харьков, 2001); на Міжнародному симпозіумі “Millimetre and Submillimetre Waves” (Kharkov, 2001); на конференції для студентів, аспірантів і молодих вчених з молекулярної біології та генетики (Kyiv, 2001); на ХI з’їзді Українського ботанічного товариства (Харків, 2001); на 6-й Пущинській конференції молодих вчених “Биология - наука 21-го века” (Пущино, 2002); на V Міжнародному симпозіумі “Биологические механизмы старения” (Харьков, 2002); на VIII Конференції молодих вчених “Сучасні напрямки у фізіології та генетиці рослин” (Київ, 2002); на 2-й конференції Московського товариства генетиків і селекціонерів ім. М.І. Вавілова “Актуальные проблемы генетики” (Москва, 2003); на 7-й Пущинській конференції молодих вчених “Биология - наука 21-го века” (Пущино, 2003); на 2-й міжнародній конференції молодих вчених “Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений” (Харьков, 2003).

Публікації. Основні результати дисертаційної роботи були викладені у 6 статтях та 12 тезах доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, п’яти розділів, закінчення, висновків та списку використаних літературних джерел.

Робота викладена на 131 сторінках машинописного тексту, вміщує 23 рисунки та 11 таблиць. Список використаної літератури містить 181 джерело.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

Матеріалом для дослідження були клітини кореневої меристеми проростаючого насіння і рослини Allium L. двох видів: A. cepa L. (сорт Харківська 82) та A. fistulosum L. (сорт П’єро) селекції Інституту овочівництва і баштанництва УААН, а також Hordeum distichon L. трьох сортів: Одеський 100 і Спомин, створені у Селекційно-генетичному інституті УААН, та Джерело селекції інституту рослинництва ім. В.Я. Юр’єва УААН.

Опромінення насіння цибулі та ячменю проводили на одній стадії розвитку – стадії зрілого повітряно-сухого насіння, що перебуває у стані спокою. Його опромінювали гамма-радіацією, джерелом якої був 60Со, на установці “Исследователь” (потужність випромінювання – 3,21 Гр/хв) у Харківському національному університеті ім. В.Н. Каразіна, а також радіохвилями міліметрового діапазону (f - 61,5 ГГц, ЩПЕ – 100 мкВт/см2, час впливу - 20 хв), джерелом яких був генератор Г4-142 в Інституті радіофізики та електроніки НАНУ. За адаптуючі та пошкоджуючі дози використовували встановлені раніше (Шестопалова и др., 1991) і відомі з літератури (Володин и др., 1979; Преображенская, 1971; Савин, 1981) дози опромінення насіння.

Варіанти досліду: 1) контроль (неопромінене насіння); 2) адаптивне опромінення гамма-радіацією у дозах 40 Гр (цибуля) і 50 Гр (ячмінь); 3) адаптивне опромінення мм-радіохвилями (Р); 4) пошкоджуюче опромінення гамма-радіацією у дозах 200 Гр (цибуля, ячмінь) і 300 Гр (ячмінь); 5) опромінення адаптивною дозою гамма-радіації перед впливом пошкоджуючої дози (варіанти 40 Гр+200 Гр для цибулі, 50 Гр+200 Гр і 50 Гр+300 Гр для ячменю); 6) опромінення радіохвилями перед впливом пошкоджуючої дози (Р+200 Гр); 7) опромінення двома адаптивними режимами перед пошкоджуючою дозою (Р+50 Гр+200 Гр, Р+50 Гр+300 Гр). Стимулюючий та пригнічуючий впливи адаптивних та пошкоджуючих доз визначали при порівнянні з неопроміненим контролем. Прояв РАВ у варіантах з попереднім опромінюванням насіння оцінювали при порівнянні з показниками варіанта з пошкоджуючою дозою без попереднього адаптивного опромінення. Час між опроміненнями складав 3-4 години. Для кожної дослідної групи використовували по 100 штук насіння кожного виду Allium L. і 150 штук кожного сорту Hordeum distichon L.

Для виконання лабораторного та польового експерименту з метою отримання М1 і М2 поколінь рослин опромінене та контрольне насіння ячменю розділили на дві частини. Одну частину використали для цитологічних досліджень (М0), а іншу – для посіву на дослідній ділянці та вирощування рослин до повної зрілості насіння (М1). Насіння М1 покоління теж було поділене на дві частини з метою цитологічного аналізу кореневої меристеми проростків (М1) та одержання рослин другого покоління (М2). Насіння М2 пророщували для цитологічних досліджень, а дорослі рослини використовували для детального аналізу морфометричних показників росту і компонентів структури врожаю. Для отримання М1 і М2 поколінь використовували дозріле насіння з середньої частини головного колосу. У кожному варіанті досліду висівали по 50 шт. насіння.

Опромінене та контрольне насіння пророщували у рулонах фільтрувального паперу при температурі 22-230С. Для дослідження відбирали насіння з однаковою швидкістю проростання та фіксували протягом перших мітотичних циклів: через кожні 3 години (з 44-ї по 68-у) початкового росту проростків для цибулі та через кожні 2 години (з 22-ї по 36-у) для ячменю. За цей період було проведено 9 і 8 фіксацій відповідно для цибулі та ячменю. Для кожного варіанта досліду відбирали по 6-10 корінців на одну фіксацію. Матеріал фіксували в оцтовому алкоголі (3:1), готували тимчасові давлені препарати, забарвлені реактивом Шиффа (фуксиносірчана кислота) за реакцією Фьольгена (Паушева, 1988).

Мітотичну активність меристеми визначали за мітотичним індексом (МІ, відношення кількості клітин, що діляться, до загальної кількості проаналізованих клітин (не менш 1000), %). Синхронність вступу клітин до першого мітозу визначали за максимальним значенням МІ першої хвилі мітозів після замочування насіння. Частку проростків з високими МІ обчислювали за відсотком МІ, які перевищують середнє його значення. Ана-телофазним методом визначали частоту клітин з хромосомними абераціями (ХА) на стадіях пізньої анафази та ранньої телофази. Враховували частоту інтерфазних клітин з мікроядрами. Класифікацію патологічних мітозів проводили за Аловим (Алов, 1972).

При пророщуванні опроміненого насіння визначали довжину коренів і стеблин проростків, кількість коренів одної рослини, суху масу і кількість аномальних (без кореня або колеоптиля) проростків на 6 добу після замочування насіння. Наприкінці вегетаційного періоду рослин ячменю М2 покоління враховували такі компоненти структури врожаю: виживання і продуктивну кущистість рослин, фертильність колосів, масу 1000 насінин, рослини на стадії повної зрілості насіння, висоту рослин, довжину та ширину зернівки, довжину колосу. Показники головних та бокових колосів враховували окремо.

Статистичну обробку одержаних даних проводили за стандартною методикою (Лакин, 1973). Вірогідність різниці оцінювали за допомогою критеріїв Стьюдента або Фішера. Різниця визнавалася вірогідною при Р?0,95.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Прояв РАВ за показниками росту проростків Allium L. Для вивчення можливості індукції РАВ рослин під впливом на насіння обраних режимів гамма-радіації на першому етапі дослідження основну увагу приділяли інтенсивності ростових процесів, як інтегральній біологічній реакції на опромінення. Припускали, що у ростових процесах виявиться активність індукованих попереднім опроміненням процесів відновлення, тобто формування РАВ. У зв’язку з вивченням можливих причин індукції РАВ ми не обмежувалися порівнянням варіантів з попереднім опроміненням і без нього, а вивчали також і реакцію на адаптивний вплив без наступного опромінення ударною дозою. Таке порівняння проведено з метою з’ясування залежності ступеня прояву РАВ від ступеня стимуляційного ефекту адаптувального опромінення.

Одержані результати показали, що доза 40 Гр виявляє незначний стимулюючий ефект на довжину кореня, суху масу проростків та схожість насіння A. сepa і суху масу проростків A. fistulosum (рис. 1), тобто ця доза не є оптимальною стимулюючою дозою для цибулі. Але вона вірогідно збільшує схожість насіння A. fistulosum на 6% і зменшує у 2,6 та 4 раза кількість аномальних проростків у A. сepa та A. fistulosum відповідно. Таке зменшення кількості проростків без кореня або колеоптиля є наслідком стимуляції росту під впливом дози 40 Гр. Велика доза гамма-опромінювання 200 Гр призводить до значного пригнічення ростових реакцій обох видів Allium L. за всіма показниками росту проростків. Попереднє опромінення насіння A. сepa та A. fistulosum дозою 40 Гр перед ударною дозою чинить адаптивний вплив при порівнянні з варіантом без адаптувального опромінення, що виявляється у збільшенні схожості насіння цих видів цибулі відповідно на 14 і 6%, сухої ваги проростків - на 36 і 21%, а також зменшенні кількості аномальних проростків у 2,9 і 4 раза (рис. 1).

Рис. 1. Показники росту проростків Allium L. після гамма-опромінення насіння окремо і сумісно адаптивною та тестовою дозами. 1 – контроль, 2 – 40 Гр, 3 – 200 Гр, 4 – 40 Гр+200 Гр. *Р?0,95, **Р?0,99, ***Р?0,999

Прояв РАВ за цитогенетичними показниками проростків Allium L. Результати цитогенетичного аналізу показали, що всі режими гамма-опромінення значно підвищують рівень мутагенезу у клітинах цибулі (табл. 1). Доза 40 Гр збільшує кількість клітин з абераціями хромосом у A. сepa та A. fistulosum відповідно в 7,6 і 2,5 раза, а також збільшує кількість клітин з мікроядрами в 2,3 раза у A. fistulosum. Доза 200 Гр при порівнянні з контролем збільшує частоту клітин з мікроядрами, а також кількість клітин з абераціями хромосом в 17,1 і 5,2 раза у A. сepa та A. fistulosum відповідно.

Табл. 1. Частота клітин з ХА у кореневій меристемі

проростків Allium L. після гамма-опромінювання насіння

Варіант | Ана- і телофази | Клітини з мікроядрами

всього | з них з хромосомними абераціями | Час

появи,

год. |

%

шт. | %

A. cepa

Контроль | 249 | 6 | 2,4±0,3 | - | 0

40 Гр | 311 | 57 | 18,3±2,6** | 53 | 0,17±0,07

200 Гр | 61 | 25 | 41,0±3,2** | 59 | 0,55±0,12*

40+200 Гр | 93 | 21 | 22,6±2,8** | 56 | 0,34±0,09

A. fistulosum

Контроль | 650 | 58 | 8,9±0,6 | 53 | 0,10±0,02

40 Гр | 770 | 174 | 22,6±1,9** | 56 | 0,23±0,05*

200 Гр | 137 | 64 | 46,7±5,2** | 59 | 0,55±0,03**

40+200 Гр | 584 | 171 | 29,3±2,1* | 56 | 0,42±0,02**

*Р?0,99, **Р?0,999

Порівняння варіантів 200 Гр і 40 Гр+200 Гр виявило вірогідне зниження (в 1,8 у A. сepa та 1,6 раз у A. fistulosum) частоти клітин з мутаціями хромосом у варіантах з адаптивним опроміненням. У A. fistulosum у варіанті з індукованою адаптацією також знизилася і кількість клітин з мікроядрами в 1,3 раза. Таке зниження рівня хромосомного мутагенезу свідчить про захисні (відновлювальні) реакції, які мають місце у клітинах Allium L. після адаптивного впливу.

Таким чином, дослідження можливості підвищення індукованої стійкості рослин до іонізуючого випромінювання на тест-системі цибулі двох видів A. сepa та A. fistulosum виявило чіткий прояв РАВ внаслідок використаних у роботі режимів опромінення насіння за показниками росту проростків і хромосомного мутагенезу на початкових етапах онтогенезу рослин. При порівнянні двох видів цибулі більш радіочутливим виявився A. сepa.

Прояв РАВ за показниками росту проростків Hordeum distichon L. Доза 50 Гр викликала значний стимулюючий ефект за всіма показниками росту проростків ячменю сортів Одеський 100, Спомин і Джерело (табл. 2).

Табл. 2. Зміна показників росту проростків ячменю після впливу на насіння гамма-опромінювання та мм-радіохвиль (Р)

Варіанти

опромінювання | Довжина стеблини,

мм | Довжина первинного кореня, мм | Довжина бокових коренів, мм | Кількість коренів одної рослини, шт.

Одеський 100

Контроль | 69,1±9,5 | 23,2±2,1 | 14,6±1,2 | 6,7±0,2

50 Гр | 164,8±8,9*** | 36,4±1,8*** | 20,6±2,0* | 8,6±0,4***

300 Гр | 55,1±8,8 | 13,9±2,5** | 8,4±0,8*** | 6,0±0,2*

50 Гр+300 Гр | 118,7±8,2*** | 33,8±4,6** | 13,6±1,1** | 6,8±0,3

Джерело

Контроль | 36,4±3,2 | 14,8±0,8 | 8,9±0,7 | 5,3±0,2

50 Гр | 62,1±4,0*** | 29,8±1,6*** | 19,1±1,0*** | 6,3±0,1***

200 Гр | 29,5±3,1 | 13,6±0,9 | 8,0±1,1 | 5,2±0,2

50 Гр+200 Гр | 42,8±3,4** | 17,6±1,2* | 12,8±0,9** | 6,6±0,2***

Р+50 Гр+200 Гр | 48,8±3,0*** | 26,4±1,9*** | 17,8±1,2*** | 6,9±0,3***

Спомин

Контроль | 43,7±2,6 | 17,7±1,1 | - | 2,6±0,3

50 Гр | 56,5±5,3* | 28,2±1,7*** | - | 5,1±0,2***

200 Гр | 10,4±2,8*** | 9,8±1,2*** | - | 2,7±0,3

50 Гр+200 Гр | 23,9±3,4*** | 19,2±2,6** | - | 4,3±0,4**

Р+50 Гр+200 Гр | 28,5±2,2*** | 18,7±2,1** | - | 4,9±0,3***

*Р?0,95, **Р?0,99, ***Р?0,999

Доза 300 Гр пригнічувала ростові процеси рослин ячменю сорту Одеський 100. При цьому виживання рослин настільки знизилося, що отриманого матеріалу не вистачало для наступних польових та лабораторних досліджень. Тому в подальшому для одержання М1 і М2 поколінь використовували пошкоджуюче опромінення критичною для ячменю дозою 200 Гр, за якої виживання рослин, що здатні утворювати насіння, досягає 20-30% (Володин и др., 1979). Доза 200 Гр призвела до значного пригнічення росту проростків ячменю сорту Спомин, але такої реакції не виявили у сорту Джерело, в якого зменшення всіх вивчених показників було не вірогідним. Тобто, за показниками росту проростків ячмінь сорту Джерело виявився більш стійким до пошкоджуючого впливу дози 200 Гр, ніж сорт Спомин.

Опромінення насіння ячменю адаптивною дозою 50 Гр перед дією пошкоджуючої дози гамма-опромінення значно збільшило показники росту проростків у всіх сортів ячменю (табл. 2). А використання нового в роботі адаптивного фактора мм-радіохвиль разом з адаптивною дозою гамма-радіації 50 Гр перед пошкоджуючим впливом ще більше підвищило показники росту проростків, тобто призвело до збільшення прояву РАВ. При цьому для всіх вивчених генотипів рослин (як цибулі, так і ячменю) притаманні подібні (односпрямовані) зміни ростових реакцій.

Одержані дані про зміни росту проростків стали передумовою для детальнішого дослідження прояву РАВ на клітинному рівні, а також у поколіннях рослин з різним генотипом.

РАДІОАДАПТИВНА ВІДПОВІДЬ КЛІТИН КОРЕНЕВОЇ МЕРИСТЕМИ ПРОРОСТКІВ НАСІННЯ ЦИБУЛІ ТА ЯЧМЕНЮ У РАННІЙ ПОСТРАДІАЦІЙНИЙ ПЕРІОД (М0)

Прояв РАВ за мітотичною активністю клітин проростків опроміненого насіння Allium L. Опромінення насіння дозою 40 Гр призводить до затримки вступу клітин у мітоз на 3 години у A. сepa та 9 годин у A. fistulosum (рис. 2). Але у цих варіантах максимальні значення МІ першої хвилі мітозів (тобто синхронізація) вірогідно перебільшують контроль на 1,1% у A. fistulosum, а за середніми значеннями МІ протягом усього експерименту – у обох видів цибулі (на 1,3% у A. сepa та 0,9% у A. fistulosum), що може бути зумовлено одночасним переходом із періоду G2 мітотичного циклу до мітозу більшої ніж у контролі кількості клітин за рахунок виходу частини клітин із стану відносного спокою.

Доза 200 Гр затримує клітинний поділ на 15 годин у A. сepa і 12 годин у A. fistulosum, а максимальні значення МІ першої хвилі мітозів в обох видів цибулі в 2,5 раза нижчі за контрольне значення і припадають на 62 годину досліду, коли в контролі відбувається друга хвиля мітозів.

Внаслідок адаптивного опромінення насіння перед ударною дозою час затримки мітозів скорочується порівняно з варіантом без попередньої адаптації на 6 годин у A. сepa і 3 години у A. fistulosum. При цьому синхронізація клітинного поділу у A. fistulosum збільшується у 2,5 раза, а у A. сepa зміни аналогічні хоч і менш виразні (рис. 2). Клітини з мікроядрами у варіантах з попереднім адаптивним опроміненням зареєстровані в обох видів цибулі на 3 години раніше, ніж у варіанті 200 Гр, що свідчить про більш раніше настання у цих варіантах другого мітотичного циклу та прискорення темпів поділу клітин. Такі процеси, що відбуваються у варіантах з попереднім опроміненням, є наслідком формування РАВ у клітинах насіння цибулі, яка більш чітко проявляється у A. fistulosum.

Рис. 2. Динаміка МІ клітин кореневої меристеми проростків Allium L. у початковий період проростання опроміненого насіння. 1 - контроль, 2 - 40 Гр, 3 - 200 Гр, 4 - 40 Гр+200 Гр. *Р?0,95, ***Р?0,999

Прояв РАВ за частотою клітин Allium L. з абераціями хромосом. Результати вивчення частоти і динаміки появи клітин з хромосомними абераціями показали, що всім дослідним варіантам притаманні однотипні криві: початок підйому кривої на 53-59 годину росту, досягнення максимального значення на 59-62 годину і подальше зниження відсотка аберантних клітин до 68 години. Різниця між варіантами стосується строків появи клітин з ХА та їх кількості. Максимальна кількість ХА у варіантах 40 Гр і 200 Гр складає відповідно 28,5±0,71 і 52,0±0,79% у A. сepa та 31,8±0,66 і 50,9±0,71% у A. fistulosum. У варіантах з попереднім адаптивним опроміненням дозою 40 Гр на всіх строках фіксації рівень хромосомного мутагенезу знижується порівняно з варіантом без попереднього опромінення, що є проявом більш високої стійкості клітин до пошкоджуючої дози, тобто розвитком радіаційно-індукованої адаптації клітин. Максимальне значення ХА у варіантах з попереднім опроміненням вірогідно зменшується в 1,3 раза у обох видів Allium L.

Прояв РАВ за мітотичною активністю клітин проростків опроміненого насіння Hordeum distichon L. Під впливом адаптивних режимів опромінення, особливо мм-радіохвиль, відбувається зміна природного перебігу, а також ступеня синхронізації поділу клітин у бік його підвищення в усіх дослідних сортів ячменю (рис. 3).

Рис. 3. Зміни рівня синхронізації перших мітозів після замочування насіння ячменю внаслідок впливу адаптивних і пошкоджуючої доз опромінення. 1 - контроль, 2 - 50 Гр, 3 - радіохвилі, 4 - 200 Гр, 5 - 50 Гр+200 Гр, 6 - Р+200 Гр, 7 - Р+50 Гр+200 Гр. *Р?0,95, **Р?0,999

Така реакція клітин не була несподіваною, адже раніше була встановлена синхронізуюча дія цього режиму радіохвиль на поділ клітин насіння, що проростає (Шестопалова и др., 1991). Пошкоджуюча доза 200 Гр спричиняє затримку клітинного поділу на 4 години тільки у сорту Спомин. Але синхронізація перших мітозів знижується порівняно з контролем у 1,4 і 1,2 раза у сортів Спомин і Джерело відповідно.

В обох сортів ячменю в усіх варіантах з попереднім адаптивним опроміненням синхронізація перших мітозів вірогідно перевищує значення варіанта без нього. Підвищення синхронізації перших мітозів у досліді пов’язане, напевно, з впливом адаптивного опромінення на активацію і регуляцію подій у мітотичному циклі та перебіг самого мітозу. На підставі одержаних результатів можна зробити висновок про існування зв’язку між процесами активації мітотичної активності та індукованої адаптації до високої дози радіації. Порівняння значень мітотичної активності у сортів показало, що за середніми МІ ступінь прояву РАВ у сорту Спомин аналогічний максимальним значенням МІ першої хвилі мітозів. У сорту Джерело вірогідний прояв РАВ за середніми МІ (на відміну від максимальних) відсутній, а тенденція до його формування спостерігається тільки у варіантах, в яких у попередньому опроміненні присутні радіохвилі.

Прояв РАВ за частотою клітин ячменю з ХА. Вплив ударної дози 200 Гр на насіння ячменю призвів до утворення переважно фрагментів хромосом, які склали 4,6 і 3,8% у сортів Спомин і Джерело відповідно, а також множинних аберацій хромосом у меристемі сорту Спомин, яких було у 2,5 раза більше, ніж у сорту Джерело (рис. 4).

Поряд з цими структурними пошкодженнями у варіанті 200 Гр була виявлена невелика кількість мостів (менше 1%). Попередні адаптивні опромінення насіння спричинили зниження (у 1,5-1,9 раза) частоти клітин з множинними ХА у сорту Спомин. У ячменю сорту Джерело в 1,7 раз знижується частота клітин з фрагментами у варіанті Р+50 Гр+200 Гр, а кількість клітин з мостами і множинними абераціями у цьому варіанті досягає нульового значення, що, напевно, пов’язано з елімінацією таких клітин. Також у варіантах з адаптивним опроміненням в обох сортів знижується частка клітин з мікроядрами. Феномен РАВ за частотою клітин з ХА більш сильно виявляється у ячменю сорту Джерело у варіанті Р+50 Гр+200 Гр.

ПРОЯВ РАВ У НАСІННЕВИХ ПОКОЛІННЯХ РОСЛИН ЯЧМЕНЮ З РІЗНИМ ГЕНОТИПОМ НА КЛІТИННОМУ ТА ОРГАНІЗМЕНОМУ РІВНЯХ

Відомо, що пошкоджуючий вплив гамма-радіації на насіння не тільки здатний пригнічувати ріст і розвиток рослин, але й життєздатність їх нащадків (Позолотина, 1990). Тому досліджували прояв РАВ у М1 і М2 поколіннях рослин.

Прояв РАВ у М1 поколінні рослин ячменю за мітотичною активністю клітин. У першому поколінні в обох сортів ячменю зберігається стимулююча дія дози 50 Гр і пригнічуюча дія дози 200 Гр як за максимальними, так і за середніми значеннями МІ. В усіх варіантах з адаптивним опроміненням у сорту Спомин чітко виявляється РАВ у підвищенні мітотичної активності відносно варіанта без адаптації за обома показниками МІ (рис. 5). У сорту Джерело радіаційна адаптація після опромінення дозою 50 Гр виявляється меншою мірою, ніж у сорту Спомин, а у варіанті Р+200 Гр вона повністю відсутня. Найбільш чітко у сорту Джерело РАВ виявляється після опромінення насіння двома адаптивними факторами (варіант Р+50 Гр+200 Гр).

Рис. 4. Частота клітин за спектром ХА у кореневій меристемі проростків ячменю сортів Спомин і Джерело у ранній пострадіаційний період (М0). 1 - контроль, 2 - 50 Гр, 3 - радіохвилі, 4 - 200 Гр, 5 - 50 Гр+200 Гр, 6 - Р+200 Гр, 7 - Р+50 Гр+200 Гр. *Р?0,95

Прояв РАВ у М2 поколінні рослин ячменю за мітотичною активністю клітин. У другому поколінні рослин ячменю зберігається стимулююча дія радіохвиль і дози 50 Гр в обох сортів за синхронізацією перших мітозів.

Пошкоджуюча дія дози 200 Гр виявляється у ячменю сорту Спомин за максимальними і середніми значеннями МІ, часткою проростків з високими МІ і без мітозів. У варіанті 200 Гр М2 покоління сорту Джерело, навпаки, спостерігається збільшення значень максимальних і середніх МІ, а також частки проростків з високими МІ, що, напевно, зумовлено активнішими відновними процесами, які відбуваються на тканинному та клітинному рівнях. Про це свідчать і низькі порівняно з сортом Спомин значення частки проростків без мітозів в усіх варіантах.

Рис. 5. Прояв РАВ за максимальними і середніми значеннями МІ клітин меристеми проростків ячменю сортів Спомин і Джерело у М1 поколінні. 1 - 200 Гр, 2 - 50 Гр+200 Гр, 3 - Р+200 Гр, 4 - Р+50 Гр+200 Гр, *Р?0,95, **Р?0,99, ***Р?0,999

Прояв РАВ у другому поколінні рослин ячменю сорту Спомин спостерігається у варіантах 50 Гр+200 Гр і Р+50 Гр+200 Гр за всіма вивченими ознаками (рис. 6). У варіанті з попереднім опроміненням радіохвилями у сорту Спомин відбувається зниження показників мітотичної активності за максимальними і середніми значеннями МІ, а також частки проростків з високими МІ. РАВ у цьому варіанті виявляється тільки на рівні популяції клітин за зниженням частки проростків без мітозів. У сорту Джерело в М2 поколінні прояв РАВ у варіантах з попереднім опроміненням, як перевищення показників мітотичної активності над варіантом 200 Гр, не спостерігається. При цьому у варіанті Р+50 Гр+200 Гр значення максимальних і середніх МІ та частки проростків без мітозів наближаються до рівня контролю, а у варіанті Р+200 Гр навіть перевищують його, що свідчить про “одужання” рослин ячменю сорту Джерело у М2 поколінні.

Прояв РАВ у М2 поколінні рослин за частотою виходу клітин з ХА. Рівень цитогенетичних пошкоджень в М2 поколінні значно знижується в обох сортів ячменю порівняно з М0 (рис. 7). У варіанті 200 Гр тільки у сорту Спомин частка клітин з ХА перевищує контроль у 2,6 раза. В усіх варіантах з попереднім адаптивним опроміненням кількість клітин з пошкодженням хромосом у сорту Спомин вірогідно зменшується порівняно з варіантом без попереднього опромінення. Рівень ХА у сорту Джерело у варіанті Р+50 Гр+200 Гр досягає нульового значення.

Рис. 6. Прояв РАВ за показниками мітотичної активності проростків ячменю сортів Спомин і Джерело М2 покоління. 1 – 200 Гр, 2 – 50 Гр+200 Гр, 3 – Р+200 Гр, 4 – Р+50 Гр+200 Гр, 5 – контроль, *Р?0,999

Прояв РАВ за господарсько-цінними ознаками рослин. Результати дослідження показали, що попереднє адаптивне опромінення насіння М0 ячменю сорту Спомин підвищує стійкість рослин у М2 поколінні, про що свідчить перевищення значень у варіантах з адаптивним впливом над варіантом без нього за основними показниками структури врожаю: виживанням та продуктивною кущистістю рослин, фертильністю головного колосу, масою 1000 насінин, кількістю рослин на стадії повної зрілості насіння, висотою рослин. За всіма цими ознаками РАВ у рослин ячменю сорту Спомин чіткіше виявляється у варіанті з сумісним

Рис. 7. Зміна частоти клітин з ХА у кореневій меристемі проростків ячменю сортів Спомин і Джерело у М0 и М2 поколіннях рослин. 1- контроль, 2- 50 Гр, 3- радіохвилі, 4- 200 Гр, 5- 50 Гр+200 Гр, 6- Р+200 Гр, 7- Р+50 Гр+200 Гр. *Р?0,99, **Р?0,999

впливом двох адаптивних факторів. У ячменю сорту Джерело за основними показниками структури компонентів врожаю варіант 200 Гр невірогідно відрізняється від контролю, а за продуктивною кущистістю значно перевищує контрольне значення. Порівняння реакцій рослин ячменю сорту Джерело у варіантах 200 Гр, Р+200 Гр і Р+50 Гр+200 Гр показало, що за основними ознаками компонентів структури врожаю значення варіантів з адаптивним опроміненням наближаються до варіанта 200 Гр або незначно перебільшують його.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукового завдання, яке полягає у з’ясуванні можливості індукції РАВ внаслідок опромінення насіння, що перебуває у стані спокою, адаптивною та тестовою дозами радіації та визначенні прояву РАВ у поколіннях рослин з різним генотипом за комплексом показників. Вирішення наукового завдання призначене для використання індукції захисних систем рослин з метою зниження мутагенної дії пошкоджуючих доз радіації та підвищення урожайності сільськогосподарських рослин у екстремальних умовах.

1. Вплив на насіння двох видів цибулі (Allium cepa L. і Allium fistulosum L.) та трьох сортів ячменю (Hordeum distichon L.) адаптивних режимів гамма-опромінення і мм-радіохвиль індукують РАВ, яка виявляється на клітинному та організмовому рівнях у М0, а також М1 і М2 поколіннях рослин ячменю.

2. Попередні опромінювання насіння цибулі та ячменю радіацією в адаптивному режимі підвищують ступінь синхронізації перших мітозів та рівні мітотичної активності наступних поділів, збільшують мітотичний потенціал проростків і стимулюють їх ріст.

3. Природний рівень мітотичної активності кореневої меристеми проростків ячменю сорту Джерело у 2 раза вищий, ніж у сорту Спомин. У зв’язку з цим радіаційна стимуляція та депресія поділу клітин, а також індукція РАВ більш чітко виявляються у сорту Спомин.

4. У М1 і М2 поколіннях рослин ячменю стимуляційний ефект попереднього опромінення насіння, пригнічуюча дія мітотичної активності пошкоджуючої дози гамма-радіації, а також РАВ відтворюються, але змінюється ступінь їх прояву залежно від режиму опромінення та відновних властивостей генотипу рослини. У сорту Джерело, якому притаманна висока мітотична активність, негативні наслідки високої дози гамма-радіації у М2 поколінні не спостерігаються.

5. Рівень хромосомного мутагенезу у меристемі проростків ячменю М0 знижується до М2 покоління, в якому чіткий прояв РАВ спостерігається у сорту Спомин. У сорту Джерело рівень хромосомного мутагенезу в варіанті 200 Гр знижається до рівня контролю.

6. За комплексом цитологічних і величиною генетично контрольованих кількісних ознак компонентів структури урожаю рослин М2 покоління РАВ більш чітко виявляється у ячменю сорту Спомин, а після сумісного впливу на насіння двох адаптивних факторів – в обох сортів ячменю.

7. Радіохвилі мм-діапазону підсилюють реакцію РАВ, що індукується адаптувальним впливом гамма-радіації, у М0 та М1 поколіннях в обох сортів ячменю, у М2 поколінні – тільки у сорту Спомин.

8. Важливою складовою прояву РАВ є стимуляція поділу клітин (підвищення ступеня синхронізації перших мітозів, стартового мітотичного потенціалу зародкової меристеми проростків) як необхідна умова репопуляційного відновлення у ранньому та віддалених пострадіаційних періодах.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Головина Л.Н., Долгова Т.А., Сенкевич Е.Б., Шестопалова Н.Г. Влияние миллиметровых волн на клетки зародышей семян ячменя // Радиофизика и электроника. - 1999. - Т.4, № 3. - С. 154-156.

50% авторства, особисто виконано частину цитологічних досліджень, прийнято участь у обґрунтуванні одержаних даних.

2. Долгова Т.А., Шестопалова Н.Г. Индукция и проявление радиоадаптивного ответа (РАО) клеток меристемы проростков в условиях раздельного и комбинированного действия ионизирующего и неионизирующего излучений // Труды по фундаментальной и прикладной генетике. Харьков: Штрих. - 2001. – С. 251-259.

80% авторства, особисто виконано цитологічні дослідження, прийнято участь у обґрунтуванні одержаних даних.

3. Долгова Т.А. Підвищення радіаційної адаптації клітин і рослин ячменю. Зв'язок радіорезистентності з врожайністю // Вісник Харківського національного університету. – 2002. - № 551, ч.2. – С. 194-198.

4. Шестопалова Н.Г., Долгова Т.А. Цитогенетичні прояви радіоадаптивної відповіді (РАВ) клітин меристеми у поколіннях рослин ячменю // Вісник проблем біології і медицини. – 2002. – Вип. 5. – С. 34-38.

90% авторства, особисто виконано цитогенетичні дослідження, прийнято участь у обґрунтуванні одержаних даних.

5. Шестопалова Н.Г., Долгова Т.А. Радиационная адаптация клеток на ранних этапах онтогенеза растений // Биологический вестник. – 2001. – Т.5, №1-2. – С. 112-115.

90% авторства, особисто виконано цитологічні дослідження, прийнято участь у обґрунтуванні отриманих даних.

6. Долгова Т.А. Проявление радиоадаптивного ответа клеток меристемы проростков ячменя в М2 поколении растений после облучения семян // Вісник Харківського національного аграрного університету. Серія Біологія. – 2003. - № 5(3). – С. 66-73.

7. Винокурова Л.В., Долгова Т.А., Шестопалова Н.Г. Проявление радиоадаптивного ответа (РАО) на ранних и поздних этапах онтогенеза растений с разным генотипом // Биологические механизмы старения. IV Международный симпозиум. - Харьков. - 2000. - С. 106.

80% авторства, особисто виконано цитологічні та морфологічні дослідження, прийнято участь у аналізі експериментальних даних.

8. Dolgova T.A., Voloshina T.S., Grebenuk I.V. Radioadaptive response (RAR) in the first generation of the plants with different genotype // Conference on genetics and molecular biology for students and young scientists devoted 100-th anniversary of genetics. - Lviv. - 2000. - P. 96.

90% авторства, особисто проведені основні вимірювання морфологічних ознак та обґрунтовані отримані дані.

9. Долгова Т.А., Шестопалова Н.Г. Индукция и проявление радиоадаптивного ответа (РАО) на уровне меристемных клеток проростков и вегетирующих растений ячменя // Cerctari radiationale in republica Moldova. Materialele conferintei internationale stiintifico-practice. - Chisinau (Moldova). - 2000. - С. 240-242.

80% авторства, особисто виконано цитологічні та морфологічні дослідження, прийнято участь у обґрунтуванні отриманих даних.

10. Dolgova T. The increase of the adaptive potential of the barley cells and plants with