НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

ЕРСТЕНЮК Ганна Михайлівна

УДК 576.32/36+616-022.915+616.155.1+001.891.5+615.099+546.48

БІОХІМІЧНІ МЕХАНІЗМИ ПОШКОДЖЕННЯ ЕРИТРОЦИТІВ

ЗА УМОВ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ІНТОКСИКАЦІЇ КАДМІЄМ

14.01.32 – Медична біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Івано-Франківській державній медичній академії Міністерства охорони здоров’я України

Науковий консультант: доктор медичних наук, професор,

член-коресподент АМН України,

ГУБСЬКИЙ Юрій Іванович,

Національний медичний університет

імені О.О.Богомольця,

завідувач кафедри біоорганічної, біологічної

та фармацевтичної хімії.

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор,

академік АМН України,

член-коресподент НАН України,

ТРАХТЕНБЕРГ Ісаак Михайлович,

Інститут медицини праці АМН України,

завідувач лабораторії промислової токсикології.

доктор біологічних наук, професор

ВИНОГРАДОВА Руфіна Петрівна

Інститут біохімії НАН України, провідний

науковий співробітник.

доктор біологічних наук, професор

КОВАЛЕНКО Валентина Миколаївна,

Інститут фармакології та токсикології

АМН України, завідувач відділу

загальної токсикології

Провідна установа: Тернопільська державна медична академія імені І.Я Горбачевського

Захист відбудеться „20” січня 2005р. о 13 год. 30 хв. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.003.07 Національного медичного університету імені О.О. Богомольця (03057, Київ, пр. Перемоги, 34, фізико-хімічний корпус НМУ)

Автореферат розісланий „18” грудня 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук О.І. Толстих

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Хімічне забруднення довкілля і проблема впливу ксенобіотиків на здоров’я людини залишаються в центрі уваги сучасної медичної і біологічної науки. Серед техногенних забруднювачів внутрішнього середовища біологічних систем одне з провідних місць посідають іони важких металів (І.М.Трахтенберг, 1993, 2000, 2004; Ю.І. Кундієв, 2004; М.Г. Проданчук, 2000; Ю.І. Губський, 2001; А.В. Скальний, 1999), що вже в мікродозах можуть спричиняти небезпечні ураження чутливих анатомо-фізіологічних систем і розвиток патологічних станів. Вміст у харчових продуктах ртуті, кадмію, свинцю, міді, миш’яку, цинку, заліза об’єднаною комісією ФАО та ВООЗ з харчового кодексу включено до числа параметрів, що підлягають обов’язковому контролю. За прогнозами та оцінками ряду дослідників у майбутньому важкі метали можуть стати більш небезпечними, ніж відходи атомних електростанцій і вийти на перше місце чи розділити його з пестицидами (М.П. Вашкулат і співавт., 2002; О.І. Волощенко, 1999; Т.А. Головкова, 2004; І.Т. Матасар, 1997; В.А. Николаев и соавт., 1999; В.І. Смоляр, 2000; О.І. Циганенко і співавт., 1998).

Одним з небезпечних важких металів є кадмій, який володіє високою міграційною швидкістю, біохімічною активністю, характеризується політропною токсичною дією і здатністю кумулюватись в органах і тканинах, має тривалий період напіввиведення із організму, що досягає 25-30 років (Г.О. Іутинська і співавт., 2000; А.В. Кленко, 2004; В.М. Магаляс і співавт., 2003; О.І. Циганенко і співавт, 1998; L.E. Rikans et al., 2000). Широке використання сполук кадмію у сучасній промисловості, а також високий вміст у продуктах нафтопереробних заводів, викидах теплових електростанцій зумовлює високий рівень кадмію не тільки у виробничих зонах, але й у віддалених регіонах, що створює небезпеку для здоров’я населення. Дані стосовно біохімічних механізмів, які лежать в основі розвитку кадмієвої інтоксикації, є роздрібненими і недостатніми, що не дозволяє створити сучасної концепції первинних біохімічних механізмів дії цього важкого металу. Оскільки еритроцити одними з перших клітин організму реагують із ксенобіотиками, в тому числі й сполуками кадмію, актуальними є дослідження біохімічних механізмів впливу іонів кадмію на морфо-функціональний стан еритроцитів і гемоглобін, встановлення первинних ланок і локалізації біохімічних ушкоджень еритроцитів, визначення ефективності антиоксидантної корекції кадмієвої інтоксикації.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є самостійною науково-дослідною роботою, виконаною згідно з планом наукових досліджень Івано-Франківської державної медичної академії МОЗ України, фрагментом комплексної наукової роботи „Морфо-функціональний стан органів травної, центральної та периферійної нервової системи за умов впливу токсичних факторів (малі дози радіації, пестициди, кадмій, хіміопрепарати)” (державний реєстраційний № 0102U001009).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було вивчити біохімічні механізми, які лежать в основі пошкоджуючої дії іонів кадмію на структурно-функціональний стан еритроцитів і дослідження ефективності використання антиоксидантів за умов експериментальної інтоксикації кадмієм.

Для досягнення цієї мети були поставлені наступні задачі:

1. Вивчити вплив експериментальної інтоксикації кадмієм на систему еритрону, лігандні форми гемоглобіну, оцінити функціонування біохімічної системи „церулоплазмін-трансферин” та кисневу ємність крові за умов впливу різних доз кадмію.

2. Дослідити вплив іонів кадмію на структурно-функціональний стан мембран еритроцитів, а саме: жирнокислотний склад ліпідів еритроцитарної мембрани, кислотну резистентність, інтенсивність процесів пероксидації ліпідів та білків еритроцитів і плазми крові, процеси антирадикального захисту.

3. На підставі одержаних експериментальних даних запропонувати концептуальну модель первинних біохімічних механізмів токсичного впливу іонів кадмію на еритроцити і гемоглобін. Обгрунтувати роль порушень у лігандному спектрі гемоглобіну та функціонуванні біохімічної системи „церулоплазмін-трансферин” в розвитку внутрішньоклітинного оксидативного стресу як ключового механізму ушкодження еритроцитів за токсичної дії іонів кадмію.

4. Дослідити вплив унітіолу (2,3-димеркаптопропансульфонату натрію) та селеніту натрію при експериментальній інтоксикації кадмієм. Довести антиоксидантний механізм протекторної дії цих препаратів та обґрунтувати можливість використання інших антиоксидантних засобів за умов кадмієвої інтоксикації.

Об’єкти дослідження: щури, уражені хлоридом кадмію в умовах одноразового (12мг/кг маси тіла) та багаторазового (1,2 мг/кг протягом 10-ти днів) введення токсиканта, що відповідає 1/5 ЛД50 та 1/50 ЛД50.

Предмет дослідження: лігандні форми гемоглобіну, жирнокислотний склад ліпідів еритроцитів і плазми крові, пероксидні модифікації білків еритроцитів і плазми, пероксидні форми ліпідів, ферментативні антиоксидантні системи еритроцитів і плазми крові щурів, отруєних хлоридом кадмію.

Методи дослідження: біохімічні, біофізичні, гематологічні, цитологічні, варіаційно-статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. У результаті проведених досліджень вперше експериментально встановлено, що надходження іонів кадмію в організм тварин зумовлює виникнення вільнорадикальної патології, яка пов’язана, насамперед, з порушеннями структурно-функціонального стану еритроцитів і гемоглобіну. Досліджено, що за умов кадмієвої інтоксикації відбуваються зміни жирнокислотного складу ліпідів і окиснювальні модифікації білків еритроцитів, що призводить до порушення структури біомембран. Показано, що інтоксикація іонами кадмію спричинює порушення в середовищі існування еритроцитів, які проявляються змінами жирнокислотного складу ліпідів і модифікаціями білків плазми крові, порушенням прооксидантно-антиоксидантної рівноваги як в еритроцитах, так і в плазмі крові. Сформульовано концепцію біохімічних механізмів токсичної дії іонів кадмію на еритроцити, одним із провідних механізмів якої є оксидативний стрес, в основі якого лежать зміни лігандних форм гемоглобіну, порушення процесів відновлення гемоглобіну і кисневої ємності крові. Наслідком таких змін є порушення процесів оксигенації тканин і розвиток гіпоксії, що, у свою чергу, призводить до морфологічних змін, які підтверджені цитологічними і електронномікроскопічними дослідженнями тканин нирок та печінки.

Встановлено, що введення унітіолу та селеніту натрію зменшує токсичну дію іонів кадмію на еритроцити, сприяє покращенню функціональної здатності гемоглобіну, активізує біохімічні реакції антиоксидантного захисту, здійснює стабілізуючий вплив стосовно структури тканин печінки та нирок.

Практичне значення отриманих результатів. Робота відноситься до фундаментальних досліджень. Результати дисертаційної роботи мають практичне значення для медичної біохімії, фармакології та токсикології, поглиблюють та розширюють існуючі уявлення про механізми розвитку кадмієвої інтоксикації в умовах надходження іонів кадмію в оточуюче середовище, дають змогу запропонувати використання препаратів антиоксидантної дії з метою корекції інтоксикації важкими металами.

Результати експериментальних досліджень впроваджені у навчальному процесі та науковій роботі кафедр хімії, гістології, цитології та ембріології, стоматології факультету післядипломної освіти Івано-Франківської державної медичної академії МОЗ України, кафедри біоорганічної, біологічної та фармацевтичної хімії Національного медичного університету імені О.О. Бого-мольця. Крім того, одержані дані можуть бути використані в наукових дослідженнях НДІ гігієнічного профілю, що вивчають вплив важких металів як забруднювачів довкілля.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто обрано і обґрунтовано напрям наукової роботи, проведено критичний аналіз літературних даних у відповідності до сучасних уявлень про механізми впливу важких металів на живі системи, виконано патентний пошук з даної проблеми, сформульовані мета, основні задачі дисертаційної роботи, визначено репрезентативний об’єм наукового дослідження та комплекс методів, організовано і проведено експериментальні дослідження. Автором самостійно виконано гематологічні та біохімічні дослідження. Аналіз отриманих результатів, математична обробка матеріалу, його наукова інтерпретація, формулювання висновків, практичних рекомендацій та впровадження результатів досліджень у навчальний процес також проведено самостійно.

Цитологічні дослідження виконано спільно із співробітниками кафедри гістології, цитології та ембріології Івано-Франківської державної медичної академії МОЗ України. Електронномікроскопічні дослідження проведені спільно із співробітниками кафедри анатомії людини Івано-Франківської державної медичної академії МОЗ України.

Газохроматографічний аналіз жирнокислотного складу ліпідів досліджений разом із співробітниками ЦНДЛ Національного медичного університету імені О. О. Богомольця.

Автор висловлює слова щирої подяки за консультативну допомогу в процесі виконання роботи члену-коресподенту АМН України, професору, д.м.н. Ю.І. Губському; за допомогу в проведенні спільних досліджень завідувачам кафедр гістології, цитології та ембріології і анатомії людини Івано-Франківської державної медичної академії: проф. О.І Дєльцовій і проф. Б.В. Шутці; завідувачці ЦНДЛ Національного медичного університету імені О.О. Богомольця с. н. с. Т.С. Брюзгіній.

Апробація результатів досліджень. Основні положення дисертаційного дослідження доповідались та обговорювались на міжнародній науково-практичній конференції „Сучасний стан і проблеми експериментальної та клінічної біохімії” (Тернопіль, 2004), Установчому з’їзді Українського Товариства клітинної біології (Львів, 2004), 8-му Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002), на міжнародній науково-практичній конференції „Специфіка хімічних процесів у патогенезі внутрішніх захворювань” (Івано-Франківськ, 2002), науково-практичній конференції "Організація токсикологічної допомоги в Україні" (Київ, 2002), 1-му з’їзді токсикологів України (Київ, 2001), Проблемній комісії МОЗ та АМН України „Біологічна та медична хімія” (Київ, 2001), розширених наукових засіданнях кафедри біологічної хімії Івано-Франківської медичної академії МОЗ України (Івано-Франківськ, 2004), кафедри біоорганічної, біологічної та фармацевтичної хімії Національного медичного університету імені О.О. Богомольця (Київ, 2004).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 32 наукові роботи, в тому числі 23 статті у фахових наукових виданнях, 9 - в матеріалах з’їздів та конференцій, 8 статей написані автором одноосібно. Отримано 1 деклараційний патент України на винахід.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена українською мовою на 294 сторінках машинописного тексту і складається зі вступу, огляду літератури, розділу, присвяченого опису об’єктів та методів дослідження, 6 розділів, в яких викладено результати власних досліджень, розділу, присвяченого аналізу і узагальненню отриманих результатів, висновків, практичних рекомендацій, переліку використаних літературних джерел, що включає 315 найменувань, з них 252 українською та російською мовами, 63 – іншими мовами та додатків. Робота ілюстрована 34 таблицями, 74 рисунками, 3 схемами.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

ОБ’ЄКТИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Для розкриття біохімічних механізмів дії іонів кадмію згідно з метою дослідження доцільним було проведення експериментів на теплокровних тваринах, отруєних хлоридом кадмію. Об’єктом дослідження слугували інбредні щури – самці масою 140-180 г, яким одноразово внутрішньом’язово вводили розчин хлориду кадмію у дозі 1/5 ЛД50, (що відповідає 12 мг/кг маси тіла), та тварини, яким хлорид кадмію вводили протягом 10-ти днів (щоденна доза становила 1/50 ЛД50, тобто 1,2 мг/кг). Розрахунок необхідної для введення кількості речовин проводили, виходячи з даних про параметри токсичності хлориду кадмію (І.М. Трахтенберг, 1991; Г.И. Сидоренко і співавт., 1999; Б.М Штабський та ін., 1990) з розрахунку на чистий метал. Матеріал для дослідження забирали в гострому експерименті через 1, 2, 4, 6, 12 і 24 години після введення хлориду кадмію. При багаторазовому введенні токсиканту забір матеріалу проводився через 1, 7, 14, 21, 28 діб після завершення введення хлориду кадмію. Тварини утримувались в умовах стандартного харчового раціону віварію.

Згідно з поставленими задачами за умов багаторазового введення хлориду кадмію проводилось вивчення впливу унітіолу та селеніту натрію. У зв’язку з цим тварини (n=432) були розділені на такі групи:

· контрольна група (інтактні), яким вводили фізіологічний розчин;

· група №1 – тваринам вводили хлорид кадмію одноразово в дозі 1/5 ДЛ50 ;

· група №2 – тваринам вводили хлорид кадмію протягом 10-ти днів в дозі 1/50 ДЛ50;

· група №3 – тварини, яким після завершення введення хлориду кадмію, внутрішньом’язово вводили щоденно унітіол в дозі 5мг/кг маси тіла протягом відповідних періодів дослідження;

· група №4 – тварини, яким після завершення введення хлориду кадмію, вводили щоденно внутрішньом’язово селеніт натрію в дозі 30 мкг/кг маси тіла протягом відповідних термінів.

Програма досліджень включала вивчення структурно-функціонального стану еритроцитів за еритроцитарними індексами, кислотною резистентністю мембран еритроцитів, жирнокислотним складом ліпідів, ступенем окиснювальної модифікації білків, антиоксидантним захистом (активністю каталази); вивчення стану середовища існування еритроцитів за інтенсивністю процесів пероксидного окиснення ліпідів плазми крові (жирнокислотний склад ліпідів, хемілюмінесцентний аналіз, рівень дієнових кон’югатів і ТБК-активних продуктів), ступенем окиснювальної модифікації білків плазми крові, балансом про- і антиоксидантних систем (насиченість трансферину плазми крові і активність церулоплазміну); вивчення функціональної здатності гемоглобіну за спектральними характеристиками, співвідношенням лігандних форм гемоглобіну, інтенсивністю відновлення метгемоглобіну, параметрами кисневотранспортної функції; вивчення структури внутрішніх органів шляхом гістологічного та електронномікроскопічного дослідження тканин внутрішніх органів.

Для характеристики периферичної ланки еритрону використовували загальноприйняті гематологічні методи дослідження: підрахунок числа еритроцитів, визначення середнього об’єму еритроцитів, середній вміст гемоглобіну в одному еритроциті, показник гематокриту, число ретикулоцитів, концентрацію загального гемоглобіну (В.В. Меньшиков, 1987; Ф. Шиффман, 2000). Стан еритроцитарних мембран оцінювали також за допомогою визначення кислотної резистентності еритроцитів кінетичним методом (И.Б. Заводник, 1997; Н.О. Сибірна, М.М. Великий, 1997).

Для оцінки спектральних характеристик лігандних форм гемоглобіну використовували спектрофотометр „Spekord M40” (Німеччина), визначення вмісту окси-, мет- і сульфгемоглобіну проводили відповідно до максимумів поглинання кожної лігандної форми і згідно спектрофотометричних рівнянь (М.С. Кушаковский, 1968; Б.Ф. Сухомлинов і співавт., 1988), коефіцієнт Гюфнера і кисневу ємність крові визначали за Лауер (1978).

Жирнокислотний склад ліпідів еритроцитів і плазми крові вивчали за допомогою методу газової хроматографії на газовому хроматографі „Цвет” в ізотермічному режимі з полум’яноіонізаційним детектором (С.Г. Гичка і співавт., 1998). Накопичення продуктів пероксидації ліпідів оцінювали за інтенсивністю біохемілюмінесценції (БХЛ), реєстрацію проводили на хемілюмінометрі ХЛМ 1Ц – 01 (Ю.І. Губський і співавт., 2002; Г.О. Бабенко і співавт., 1986; Ю.А. Владимиров і співавт., 1992). Рівень дієнових кон’югатів визначали спектрофотометрично за методом В.Б. Гаврилової і співавт. (1988), вміст ТБК-активних продуктів визначали за методом Е.Н. Коробейникової (1989).

Окиснювальну модифікацію білків визначали за рівнем 2,4-динітрофенілгідразонів (Е.Е. Дубініна і співавт., 1995). Активність церулоплазміну і насиченість трансферину залізом визначали за методом Г.О Бабенко (1968), активність каталази еритроцитів визначали за методом Баха і Зубкової (1968), активність лактатдегідрогенази (ЛДГ) спектрофотометричним методом за вмістом окисненої форми НАД з використанням стандартного набору реактивів фірми „LACHEMA”.

Для гістологічного дослідження шматочки печінки і нирки фіксували в 10% розчині формаліну. Зрізи з парафінованих блоків забарвлювали гематоксиліном і еозином. На препаратах нирок підраховували кількість ниркових тілець, об’єм ниркового тільця і судинного клубочка (Г.Г. Автандилов, 1990).

Для ультраструктурного вивчення клітин печінки і нирок шматочки органів забирали під легким ефірним наркозом і поміщали у розчин чотирьохокису осмію на фосфатному буфері з pH - 7,2-7,4. Електронномікроскопічні дослідження проводили за допомогою електронного мікроскопа ЭМВ-100 АК з прискорюючою напругою 75кВ.

Статистичну обробку одержаних експериментальних даних проводили за методом непов’язаних вибірок з використанням критерію „t” Стьюдента (С. Гланц, 1998) та показника вірогідності „p” за допомогою ліцензованої комп’ютерної програми „Statistik.

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

ВИВЧЕННЯ ВПЛИВУ ІНТОКСИКАЦІЇ КАДМІЄМ НА СИСТЕМУ

ЕРИТРОНУ

Гематологічні індекси периферичної крові щурів у динаміці інтоксикації кадмієм. Для з’ясування біохімічних механізмів токсичного впливу іонів кадмію проведене комплексне дослідження периферичної ланки еритрону у динаміці інтоксикації, спричиненої одноразовим та багаторазовим введенням хлориду кадмію. Встановлено суттєве зниження через 24 год після одноразового введення хлориду кадмію числа функціонуючих еритроцитів в середньому на 28%; за умов багаторазового введення токсиканту найбільш істотні зміни цього показника спостерігались через 7 (на 16%) і 14 (10%) діб експерименту. Концентрація загального гемоглобіну і вмісту гемоглобіну в одному еритроциті були достовірно нижчими (р < 0,01) порівняно з показниками інтактних тварин. Водночас збільшувався об’єм функціонуючих еритроцитів в середньому на 81% в процесі одноразової та на 25% - багаторазової інтоксикації, зростав показник гематокриту - на 31% і 21% відповідно. У периферичній крові тварин суттєво збільшувалось число ретикулоцитів – на 70% - одноразове, та на 37% - багаторазове введення токсиканту. Сукупність показників периферичної крові вказує на те, що при дії іонів кадмію відбуваються інтенсивні гемолітичні процеси, які можуть бути спричинені порушенням структурно-функціонального стану мембран еритроцитів, змінами метаболізму як в еритроцитах, так і середовищі їх функціонування. З іншого боку, спостерігалася компенсаторна реакція організму на токсичний вплив іонів кадмію, оскільки змінювались еритроцитарні індекси функціонуючих еритроцитів і зростало число ретикулоцитів. Такі процеси можна розцінювати як адаптивну відповідь організму, спрямовану на збереження сумарної дихальної поверхні за умов токсичного впливу іонів кадмію.

Параметри кислотних еритрограм за умов інтоксикації кадмієм. Структурно-метаболічний і функціональний статус клітин, в тому числі й еритроцитів, суттєво залежить від функціонування клітинних мембран. Аналіз кислотних еритрограм щурів за умов одноразової кадмієвої інтоксикації показав збільшення часу гемолізу і часу максимуму гемолізу, відповідно, в середньому на 40 і 34%, за умов багаторазової інтоксикації – на 36 і 68%. У периферичній популяції еритроцитів знижувалось число низько - та середньостійких клітин відповідно на 58 і 25 % за умов одноразового та на 47 і 21% при багаторазовому введенні хлориду кадмію (рис.1).

а)

б)

Рис.1. Динаміка змін різних груп еритроцитів за умов одноразового (а) та багаторазового (б) введення хлориду кадмію.

Із збільшенням тривалості процесу інтоксикації спостерігалось підвищення рівня високостійких і підвищеної стійкості еритроцитів як за умов одноразової, так і багаторазової інтоксикації іонами кадмію. Правобічний зсув кислотних еритрограм свідчить про модифікацію мембранних компонентів еритроцитів за умов дії кадмію, що може бути зумовлене порушенням структури ліпопротеїнового комплексу клітинної мембрани. Наслідком таких порушень є посилене проникнення протонів Н+ через плазматичну мембрану еритроцитів, протонування білків мембрани і гемоглобіну, що спричинює зниження стійкості червонокрівців до кислотного гемолізу і впливає на метаболізм еритроцитів (И.Б.Заводник та співавт., 1997).

Одержані результати вказують на вагомі порушення структурно-функціонального стану мембран еритроцитів за умов інтоксикації щурів іонами кадмію, що має важливе значення для метаболізму еритроцитів, функціонування гемоглобіну і підтримання кисневого гомеостазу організму в цілому.

ВИВЧЕННЯ ВПЛИВУ ІНТОКСИКАЦІЇ КАДМІЄМ НА ЛІГАНДНІ

ФОРМИ ГЕМОГЛОБІНУ І КИСНЕВУ ЄМНІСТЬ КРОВІ

Для ідентифікації типів гемоглобіну в еритроцитах, а також для визначення нативності його молекул використовують такі параметри: спектри поглинання гемоглобіну та його похідних, пероксидазну активність і здатність до утворення метгемоглобіну.

Спектральні характеристики гемоглобіну за умов інтоксикації кадмієм. Дослідження спектральних характеристик лігандних форм гемоглобіну щурів у динаміці кадмієвої інтоксикації показали, що характерні максимуми поглинання для оксигемоглобіну (HbO2 ) знаходились в межах 541 і 576 нм. Для метгемоглобіну (MtHb) інтактних і отруєних іонами кадмію щурів властивий максимум поглинання при 630 нм, для сульфгемоглобіну (SHb) – 620 нм. Одержані нами результати спектрофотометричного дослідження лігандних форм гемоглобіну відповідають літературним даним (Б.Ф. Сухомлинов і співавт., 1988; М.С. Кушаковский, 1968; Н.Ф. Стародуб і співавт., 1989), що стало за основу для проведення кількісного визначення окремих дериватів гемоглобіну в динаміці кадмієвої інтоксикації. Спектральна ідентичність гемоглобінів людини і різних тварин дає підстави для використання експериментальних даних з метою характеристики впливу несприятливих чинників на лігандні форми і функціонування гемоглобіну людини.

Вивчення впливу інтоксикації кадмієм на рівень оксигемоглобіну. В основі дихальної функції крові лежить насичення гемоглобіну киснем з утворенням основної лігандної форми цього гемопротеїну – оксигемоглобіну. У процесі гострої інтоксикації тварин іонами кадмію спостерігалось зниження рівня HbO2, причому із тривалістю інтоксикації вміст його суттєво знижувався (табл.1) і через 24 год був нижчий за показники інтактних тварин на 32 %.

Після 10-ти-денного введення хлориду кадмію вміст HbO2 мав чітко виражену тенденцію до зниження, на 28-у добу багаторазової інтоксикації становив тільки 68% від концентрації загального гемоглобіну (табл.2).

Такі дані вказують на те, що за умов дії різних доз іонів кадмію спостерігалось суттєве зниження вмісту оксигемоглобіну в крові отруєних тварин, що свідчить про порушення процесів оксигенації та розвиток гіпоксичних процесів в органах тварин.

Таблиця 1

Вміст лігандних форм гемоглобіну за умов
гострої кадмієвої інтоксикації (M±m, n=7)

Період

експерименту | Загальний

Hb, г/л | HbO2, г/л | MtHb, г/л |

SHb, г/л

Інтактні | 132,34±0,92 | 120,55±1,94 | 0,90±0,01 | 0,82±0,01 | 1-а год. CdCl2 | 131,37±0,50 | 105,28±0,76** | 2,57±0,01** | 2,44±0,12*** | 2-а год. CdCl2 | 119,17±0,39*** | 89,22±0,81*** | 2,58±0,09*** | 2,93±0,09*** | 4-а год. CdCl2 | 110,60±0,39*** | 78,83±0,70*** | 3,93±0,09*** | 3,48±0,11*** | 6-а год. CdCl2 | 120,22±0,59*** | 79,73±0,65*** | 4,08±0,08*** | 3,99±0,08*** | 12-а год. CdCl2 | 128,83±0,28** | 78,57±0,55*** | 4,59±0,07*** | 4,95±0,12*** | 24-а год. CdCl2 | 87,12±0,34*** | 51,53±0,44*** | 6,54±0,07*** | 5,92±0,09*** | Примітка. * - р <0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 – достовірність порівняно з показниками інтактної групи тварин

Таблиця 2

Вміст лігандних форм гемоглобіну за умов багаторазової інтоксикації кадмієм та при введенні унітіолу і селеніту натрію (M±m, n=7)

Період

експерименту | Загальний

Hb, г/л | HbO2, г/л | MtHb, г/л | SHb, г/л | Інтактні | 132,34±0,92 | 120,55±1,94 | 0,90±0,01 | 0,82±0,01 | 1-а доба CdCl2 |

121,86±0,92* | 107,40±0,89* | 1,10±0,02* | 1,17±0,01* | 1-а доба СdCl2+ Унітіол | 109,17±0,40** | 104,44±0,35** | 0,90±0,01** | 0,81±0,02** | 1-а доба CdCl2+Селен | 113,61±0,53*** | 100,23±0,48*** | 0,89±0,01*** | 0,93±0,01*** | 7-а доба CdCl2 | 102,44±0,85* | 94,21±1,11* | 0,97±0,01* | 1,66±0,02* | 7-а доба CdCl2+ Унітіол | 117,94±0,28** | 109,82±0,25** | 0,94±0,01 | 1,49±0,02** | 7-а доба CdCl2+Селен | 113,31±0,33*** | 101,21±0,34*** | 0,94±0,01 | 0,89±0,01*** | 14-а доба CdCl2 | 97,54±0,36* | 80,51±0,94* | 1,12±0,02* | 1,89±0,02* | 14-а доба CdCl2+ Унітіол | 119,77±0,37** | 111,03±0,36** | 1,01±0,01** | 1,69±0,02** | 14-а доба СdCl2+Селен | 114,61±0,43*** | 102,21±0,53*** | 0,98±0,01*** | 0,89±0,01*** | 21-а доба CdCl2 | 119,06±0,35* | 86,21±2,35* | 2,02±0,03* | 2,09±0,01* | 21-а доба CdCl2 + Унітіол | 127,47±0,31** | 112,92±0,25** | 1,42±0,02** | 1,79±0,01** | 21-а доба CdCl2+ Селен | 120,89±0,34*** | 107,45±0,64*** | 0,89±0,01*** | 0,87±0,01*** | 28-а доба CdCl2 |

127,07±0,47* | 85,89±0,73* | 3,29±0,05* | 2,18±0,01* | 28-а доба CdCl2 + Унітіол | 131,91±0,54** | 120,50±0,24** | 1,60±0,02** | 1,88±0,02** | 28-а доба CdCl2

+ Селен | 126,94±0,46 | 113,43±0,70*** | 0,91±0,01*** | 0,75±0,02*** | Примітки: * - достовірні зміни порівняно з показниками інтактних тварин,

** і *** - достовірні зміни порівняно з показниками отруєних тварин.

Киснева ємність крові, зв’язування кисню і вуглекислого газу визначаються комплексним впливом багатьох факторів, зокрема фізико-хімічними умовами функціонування гемоглобіну, станом еритроцитарних мембран, метаболізмом в еритроциті і його оточенні. Одним із визначальних факторів спорідненості гемоглобіну до кисню є вміст його лігандних форм (Р. Моран, 1998; В.В.Зінчук і співавт. 2003), зокрема, мет-, сульф- та інших неактивних дериватів.

Вивчення впливу інтоксикації кадмієм на рівень метгемоглобіну. На тлі зниження концентрації оксигемоглобіну при кадмієвій інтоксикації спостерігалося зростання рівня неактивних стосовно транспорту кисню форм гемоглобіну, насамперед таких лігандів, як метгемоглобін і сульфгемоглобін.

Метгемоглобін утворюється в результаті окиснення гемоглобіну з утворенням супероксид-аніону, який служить первинним месенджером вільнорадикальних процесів і не тільки здійснює пошкоджуючий вплив на клітинні мембрани, а й ініціює появу інших хімічно активних та цитотоксичних форм кисню. Одноразова інтоксикація іонами кадмію зумовлювала суттєве збільшення вмісту MtHb, який через 24 год. в 7 разів перевищував концентрацію цієї форми в інтактних тварин. За умов багаторазової інтоксикації окиснення оксигемоглобіну до метгемоглобіну найвищою мірою спостерігалось через 21 і 28 діб інтоксикації іонами кадмію, що підтверджувалось підвищенням вмісту MtHb, який в середньому у 4 рази перевищував показники інтактних щурів. Висока інтенсивність процесів окиснення гемоглобіну за умов кадмієвої інтоксикації з утворенням метгемоглобіну може бути однією з причин розвитку оксидативного стресу, гемічної і тканинної гіпоксії.

Активність лактатдегідрогенази і відновлення метгемоглобіну в еритроцитах при кадмієвій інтоксикації. Відновлення MtHb за фізіологічних умов відбувається декількома шляхами, один з основних – використання відновленого нікотинамідаденіндинуклеотиду (НАДН2), який утворюється в лактатдегідрогеназній реакції гліколізу. За умов одно- та багаторазової інтоксикації іонами кадмію має місце фазовий характер змін активності ЛДГ (рис. 2-3). Високий рівень MtHb дозволяє припустити про вичерпання резервів відновленого НАД, і адаптивне збільшення активності ЛДГ є недостатнім для редукції утвореного в процесі інтоксикації метгемоглобіну. Порушення процесів відновлення метгемоглобіну можна розглядати як один із можливих первинних біохімічних механізмів токсичної дії іонів кадмію.

Наслідком цього є накопичення активних кисневих метаболітів, розвиток вільнорадикальних реакцій, які зумовлюють модифікаційні зміни ліпопротеїнових комплексів і порушення цілісності мембран еритроцитів. Такі зміни мембран червонокрівців впливають на кисневотранспортну функцію крові і сприяють розвиткові оксидативного стресу, що зумовлює ушкодження клітин печінки, нирок та інших органів і підтверджується істотним зростанням активності ЛДГ плазми крові та морфологічними дослідженнями цих органів при інтоксикації кадмієм.

Рис. 2. Активність ЛДГ еритроцитів за умов гострої інтоксикації кадмієм

Рис. 3. Активність ЛДГ еритроцитів за умов багаторазової інтоксикації кадмієм та при введенні унітіолу та селеніту натрію

Вивчення впливу інтоксикації кадмієм на рівень сульфгемоглобіну. Сульфгемоглобін утворюється шляхом розриву метинового мостика у структурі гема і супроводжується незворотнім ушкодженням цього білка з вивільненням іонів заліза. Дослідження SHb за умов кадмієвої інтоксикації є важливими, оскільки дозволяють з’ясувати рівень пошкодження гемоглобіну, доповнюють інформацію стосовно первинних біохімічних механізмів токсичної дії кадмію. При одноразовому введенні хлориду кадмію рівень SHb різко зростав протягом всього періоду спостережень і через 24 год. перевищував показники інтактних тварин у 7 разів. Через 28 діб багаторазової інтоксикації щурів кадмієм концентрація SHb зростала майже в 3 рази порівняно з інтактними тваринами. Високий рівень цієї лігандної форми за умов дії іонів кадмію вказує на інтенсифікацію процесів деградації гемоглобіну у функціонуючих еритроцитах, що в свою чергу зумовлює накопичення вільних іонів заліза, які є потужними ініціаторами вільнорадикальних процесів у біологічних системах.

Вивчення впливу інтоксикації кадмієм на вміст дисгемоглобінів. Ліганди гемоглобіну, які нездатні зворотно акцептувати кисень, прийнято називати дисгемоглобінами (dysHb). Вони є інформативним параметром, який використовують для характеристики кисневотранспортної здатності гемоглобіну (Р. Моран, 1998). Результати дослідження сумарного вмісту dysHb за умов гострої інтоксикації кадмієм дозволили встановити суттєве зростання цього показника протягом доби до 41% від загального гемоглобіну. Через 28 діб багаторазового отруєння хлоридом кадмію вміст dysHb досягав 32%. Такі результати дослідження узгоджуються з наведеними вище даними стосовно зниження рівня оксигенованої форми гемоглобіну за умов інтоксикації кадмієм.

Аналіз вмісту лігандних форм гемоглобіну в динаміці кадмієвої інтоксикації вказує на суттєві зміни основного білка еритроцитів, які можна пояснити здатністю іонів Cd2+ як кислоти Льюїса (Д.Мецлер, 1980) впливати на глобіновий компонент шляхом зв’язування з SH-групами, що супроводжується порушенням просторової структури гемоглобіну. З іншого боку, іони кадмію „атакують” простетичну групу, що зумовлює конкурентне витіснення іонів заліза із структури гема. Наслідком значного накопичення у крові неактивних дериватів гемоглобіну за умов кадмієвої інтоксикації є порушення кисневої ємності крові та розвиток гіпоксії гемічного характеру.

Киснева ємність крові щурів за умов інтоксикації кадмієм. Підтвердженням порушення кисневого гомеостазу за умов токсичної дії іонів кадмію є зміни коефіцієнта Гюфнера і кисневої ємності (КЄ) крові. При багаторазовій інтоксикації найбільш виражені зміни спостерігались протягом перших 14 діб - показник КЄ знижувався на в середньому на 20% (рис.4), а за умов гострої дії - на 29%.

При аналізі функціональної здатності еритроцитів за умов кадмієвої інтоксикації, слід враховувати описані вище зміни в популяції циркулюючих еритроцитів, зокрема, зростання високостійких і підвищеної стійкості клітин, що передбачає зменшення їхньої деформованості і тим самим здатності ефективно доставляти кисень та інші метаболіти до тканин-мішеней, що можна розглядати як одну із причин розвитку гіпоксії.

Сукупність одержаних даних дозволила дійти висновку, що зниження вмісту HbO2 і КЄ при дії іонів кадмію може бути обумовленим цілим рядом факторів, а саме: порушенням морфо-функціонального стану еритроцитів, структури гемоглобіну, лігандних форм гемоглобіну, спорідненості гемоглобіну до кисню.

Рис. 4. Динаміка змін кисневої ємності крові щурів за умов багаторазової інтоксикації кадмієм та при введенні унітіолу та селеніту натрію

ПЕРОКСИДНА МОДИФІКАЦІЯ ЛІПІДІВ ТА БІЛКІВ ЕРИТРОЦИТІВ І ПЛАЗМИ КРОВІ ЗА УМОВ КАДМІЄВОЇ ІНТОКСИКАЦІЇ

Внаслідок порушень у лігандному спектрі гемоглобіну в еритроцитах за умов токсичної дії іонів кадмію формується агресивне прооксидантне середовище, яке може мати безпосередній вплив на структурно-метаболічні і функціональні зміни в червонокрівцях, що в свою чергу призводять до порушень кисневої ємності крові і забезпечення тканин киснем.

Жирнокислотний склад еритроцитів та плазми крові і процеси пероксидного окиснення ліпідів за умов інтоксикації кадмієм. Аналіз жирнокислотного складу фосфоліпідів мембран еритроцитів у тварин, отруєних хлоридом кадмію, дозволив встановити зниження відносного вмісту ненасичених жирних кислот, зокрема, олеїнової - на 32%, арахідонової – на 22% на тлі підвищення ейкозотрієнової кислоти на 81%. Зростання вмісту ейкозотрієнової кислоти може вказувати на зменшення пероксидної стійкості еритроцитів і стійкості до гемолізу, що підтверджується зниженням числа еритроцитів у периферичній крові тварин в динаміці кадмієвої інтоксикації. Встановлені порушення жирнокислотного спектру ліпідів мембран еритроцитів можуть бути індукованими збільшенням активних форм кисню, які інтенсивно утворюються при окисненні оксигемоглобіну до метгемоглобіну та атакують подвійні зв’язки у молекулах ненасичених жирних кислот з утворенням органічних пероксидів. Як наслідок генерації активних форм кисню спостерігається пероксидація ліпідів мембран еритроцитів, що спричинює їх гемоліз.

Структурно-функціональний стан еритроцитарних мембран великою мірою залежить від прооксидантно-антиоксидантної рівноваги в плазмі крові. Як засвідчили результати дослідження продуктів пероксидації ліпідів, інтоксикація тварин кадмієм спричиняє вірогідне зростання показника SCXЛ впродовж всього періоду досліджень, збільшення в 1,8 раз вмісту дієнових кон’югатів і в 2,9 раз ТБК-активних продуктів (рис. 5). Підтвердженням змін ліпідів плазми крові є зниження рівня ненасичених жирних кислот, зокрема арахідонової в 1,8 рази, ейкозотрієнової і пальмітоолеїнової кислот (p<0,05).

Рис. 5. Вміст ТБК-активних продуктів у плазмі крові тварин за умов кадмієвої інтоксикації та при введенні унітіолу та селеніту натрію

Зміни ліпідного спектру крові можуть мати істотний вплив на мембрану формених елементів крові та кисневотранспортну функцію еритроцитів. Виходячи з того, що між ліпідами мембран еритроцитів та плазми крові відбувається постійний обмін, можна припустити, що зміни в ліпідному складі плазми здійснюють модифікуючий вплив стосовно ліпідних компонентів мембран еритроцитів.

Окиснювальна модифікація білків еритроцитів та плазми крові за умов інтоксикації кадмієм. Стабілізація еритроцитарної мембрани значною мірою залежить від цитоскелету та інтегральних білків, які забезпечують жорсткість структури і визначають іон-транспортні та ферментативні властивості мембран. Дослідження окиснювальної модифікації білків (ОМБ) еритроцитів за умов дії іонів кадмію засвідчило, що як за умов одноразової, так і багаторазової кадмієвої інтоксикації спостерігалось інтенсивне накопичення карбонільних похідних білків еритроцитів. Зокрема, через 24 год дії кадмію вміст альдегідо- і кетонопохідних нейтрального характеру перевищував показники інтактних тварин в середньому у 6 разів, рівень динітрофенілгідразонів основного характеру зростав у 4-7 разів. При багаторазовому введенні хлориду кадмію найбільш виражені зміни білкової компоненти еритроцитів спостерігались через 14 діб. Окиснювальні деструкції білків еритроцитів при отруєнні іонами кадмію можуть бути спричинені як безпосередньою взаємодією іонів Cd2+ з активними SH-групами амінокислотних залишків на поверхні білкових молекул, так і продуктами пероксидації ліпідів, які інтенсивно утворюються при дії іонів кадмію, як показано вище. Показники ОМБ плазми крові вказують на суттєве зростання альдегідо- і кетонопохідних (у 2-3 рази) нейтрального характеру через 24 год одноразової та через 14-28 діб багаторазової інтоксикації. Внаслідок таких порушень можуть відбуватись структурні та функціональні зміни мембран еритроцитів, які одними з перших зазнають токсичного впливу іонів кадмію, що зменшує здатність до деформації, підвищує жорсткість мембран та в’язкість еритроцитарної суспензії, порушуючи кисневотранспортну функцію. Таким чином, проведені дослідження модифікацій білків та ліпідів за умов експериментальної інтоксикації кадмієм є підтвердженням того, що активні форми кисню, виступаючи у ролі первинних медіаторів окислювального стресу, можуть спричиняти деструктивні зміни біологічно важливих молекул. Виходячи з цього, обґрунтованим є дослідження системи антиоксидантного захисту еритроцитів і плазми крові.

Активність каталази еритроцитів за умов інтоксикації кадмієм. Вивчення активності каталази еритроцитів показало, що за гострої дії іонів кадмію спостерігається фазовий характер змін цього показника, який виражався зростанням на 34% (6-а год) з наступним суттєвим зниженням на 28% (24 год). При багаторазовій інтоксикації активність каталази еритроцитів знижувалась і через 28 діб була вірогідно нижчою (p<0,01), ніж в інтактних тварин, що вказує на зниження інтенсивності антирадикального захисту еритроцитів і накопичення в клітинах пероксиду водню. Вивільнення іонів Fe2+ в результаті деградації гемоглобіну і збільшення рівня пероксиду водню зумовлюють перебіг реакції Фентона та утворення гідроксильного радикалу ОН·, що має високу реакційну здатність, виступає в ролі модифікатора ліпідів і протеїнів еритроцитів і пошкоджує клітинні структури. Підвищення активності каталази через 2-6 год після введення токсиканту можна розцінювати як адаптивний синтез ферменту у відповідь на високий рівень продуктів ліпопероксидації. Зниження активності каталази еритроцитів при отруєнні кадмієм може бути наслідком впливу активних кисневих метаболітів, які, взаємодіючи з амінокислотними радикалами поліпептидних ланцюгів, змінюють конформацію молекули ферментного білку, а відповідно - її активність. Крім того, кадмій може спричинити гальмування активності каталази внаслідок конкурентної взаємодії з іонами металу, що входять до складу активного центру ферменту. При недостатній активності каталази еритроцитів у плазму крові мігрують супероксид-аніон, пероксид водню та інші активні форми кисню (АФК), які інактивуються переважно антиоксидантним білком плазми - церулоплазміном (J.G.Kim, S.Y. Park, 1998; F. Regoli, 1998; Н.А. Осипова і співавт., 2001).

Активність церулоплазміну і насиченість трансферину за умов інтоксикації кадмієм. Активність церулоплазміну (ЦП) за умов гострої кадмієвої інтоксикації істотно знижувалась (на 51% ) протягом 24 год. При багаторазовому отруєнні тварин активність ЦП вірогідно знижувалась і через 28 діб була нижчою на 28% у порівняні до інтактних тварин (рис.6). ЦП функціонально пов’язаний з трансферином, який здатний до хелатування і транспорту заліза. Вивчення насиченості трансферину залізом (НТФ) показало зниження цього показника за умов гострої інтоксикації кадмієм на 48%, при тривалій інтоксикації найнижчі значення спостерігались через 7-14 діб.

Рис. 6. Активність церулоплазміну плазми крові щурів за умов кадмієвої інтоксикації та при введенні унітіолу та селеніту натрію

Зміни в активності ЦП і НТФ можуть бути спричинені цілим рядом факторів, зокрема: інгібіруючою дією кадмію на зазначені металоферменти, впливом АФК, порушенням білоксинтезуючого апарату печінки. При гіпоцерулоплазмії порушується окиснення Fe2+ до Fe3+, що спричинює накопичення іонів Fe2+, а також іонів міді, які є ініціаторами вільнорадикальних процесів. Такі порушення у функціонуванні системи „церулоплазмін-трансферин” за умов кадмієвої інтоксикації призводять до пероксидації ліпідів і окиснювальної модифікації білків у плазмі крові, мають важливе значення для процесів синтезу гемоглобіну, регуляції вільнорадикальних процесів, підтримання гомеостазу еритроцитів і організму в цілому.

ДОСЛІДЖЕННЯ СТРУКТУРИ ТКАНИН ВНУТРІШНІХ

ОРГАНІВ ЩУРІВ ЗА УМОВ ІНТОКСИКАЦІЇ КАДМІЄМ

Гістоструктурні зміни тканин печінки та нирок за умов інтоксикації кадмієм. Результати проведених гістологічних досліджень вказують на те, що в ранньому періоді кадмієвої інтоксикації загальна структура печінкових часточок не порушувалась, гепатоцити печінкових балок у стані набряку, їх ядра мають різні розміри. З тривалістю інтоксикації глибина дистрофічних процесів у гепатоцитах зростала, спостерігалась дискомплексація печінкових пластин. Дистрофічні зміни в гепатоцитах, що розвивались в ході адаптаційно-компенсаторних процесів, поступово переростали в деструктивні порушення, що проявлялися змінами структури мітохондрій, активацією лізосом, утворенням ділянок парціального некрозу.

Гістологічні дослідження тканин нирок в ранньому періоді кадмієвої інтоксикації дозволили виявити виражене повнокрів’я кровоносних судин усіх калібрів, спостерігались деформовані ниркові тільця. Нефроцити канальців були у стані набряку з явищами білкової дистрофії; частина ниркових тілець деформована, просвіт їх капсули нерівномірно звужений. З тривалістю інтоксикації спостерігали поглиблення гістоструктурних змін нефронів. Більшість ниркових тілець контуруються нечітко. Судини ниркового клубочка нерівномірно розширені. Наростала вираженість атрофічних процесів у всіх частинах нефрона. Морфометричні дослідження показали зменшення кількості і об’єму ниркових тілець.

Ультрамікроскопічні зміни тканин печінки та нирок