НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
Національна Академія Наук УкраЇнИ
Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця
ГАРМАТІНА ОЛЬГА ЮРІЇВНА
УДК 616.127-005.8:616.124+577.127+
612.173:612.13+612.17.015.3
ДОСЛІДЖЕННЯ ЕКСПРЕСІЇ І АКТИВНОСТІ
НІТРООКСИДСИНТАЗ І ФУНКЦІЇ СЕРЦЯ
ПРИ ІШЕМІЇ–РЕПЕРФУЗІЇ МІОКАРДА
14.03.04 – Патологічна фізіологія
Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Київ – 2004
Дисертацією є рукопис.
Роботу виконано у відділі експериментальної кардіології
Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України
Науковий керівник: доктор медичних наук, професор, академик НАНУ,
Мойбенко Олексій Олексійович,
завідувач відділу експериментальної кардіології,
Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України
Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор,
Ткаченко Михайло Миколайович,
Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України,
провідний науковий співробітник відділу кровообігу
доктор біологічних наук, професор кафедри біохімії,
Матишевська Ольга Павлівна,
Київський національний університет ім.. Тараса Шевченко,
професор кафедри біохімії
Провідна установа: Науково-дослідний Інститут кардіології ім. М.Д.Стражеска АМН України
Захист відбудеться “ 11 ” січня 2005 року о 14 00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України: за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.
Автореферат розісланий “ 11 ” грудня 2004 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
доктор біологічних наук |
З.О.Сорокіна-Маріна
Загальна характеристика роботи
Актуальність теми. Участь оксиду азоту (NO) в регуляції серцево-судинної системи зумовлює особливу роль цієї молекули в розвитку порушень міокарду. При вивченні ролі NO у розвитку патологічних станів серця з'являється все більше даних про його неоднозначний вплив на функцію міокарду. Сучасні дослідження показали, що в серці експресуються всі три ізоформи NO-синтаз (eNOS, nNOS, iNOS) [Takimoto Y. et al., 2000]. З конститутивними NOS пов'язують протективні властивості оксиду азоту, такі, як вазодилятація, пригнічення процесів агрегації, відкривання К(АТФ)–каналів, регуляція коронарної циркуляції та серцевих скорочень [Kojda & Kottenberg, 1999; Gewalting & Kojda, 2002]. При патологічних умовах, зокрема, при інфаркті міокарда, гіпертензії, стенокардії, кардіоміопатіях, серцевій недостатності та інших, збільшується експресія і активність індуцибельної NOS (iNOS), що приводить до значного збільшення рівня оксиду азоту в міокарді. З високою активністю іNOS пов'язують міокардіальну дисфункцію. Проте, як буде впливати NO/iNOS на діяльність серця за умов ішемії–реперфузії міокарда і досі не існує єдиної думки, а дані різних авторів з цього приводу суперечливі. З одного боку було виявлено кардіодепресивний ефект оксиду азоту, який супроводжується дисфункцією серця, некрозом кардіоміоцитів [Cui S. et al., 1998; Arstall M. et al., 1999; Feng Q. et al., 2001] і застосування блокаторів його синтезу приводить до відновлення функції та зменшення пошкодження міокарда [Wildhirt S. et al., 1996,1999; Matsuoka H. et al., 1998]. З другого боку є дані про кардіопротективний вплив оксиду азоту [Pabla R. et al., 1996; Guo Y. et al., 1999; Takano H. et al., 1999; Bolli R. et al., 2001; Zingarelli et al.., 2002].
На сьогодняшній день недостатньо дослідженим лишилось питання про ендогенну продукцію NO індуцибельною NO-синтазою, експресію та зміни активності NO-синтаз у ранні терміни ішемії–реперфузії міокарду, взаємозв'язок з модуляцією активності циклооксигеназного шляху метаболізму арахідонової кислоти та функцією серця. Мало вивченим виявилося питання про регуляцію утворення оксиду азоту в різних відділах серця, зокрема в правому і лівому шлуночках, а також питання про вплив оксиду азоту на кальцієвий гомеостаз серця, особливо на Са2+– поглинаючу функцію кальцієвими депо кардіоміоцитів..
Мета і задачі дослідження. Метою дослідження було з’ясування ролі індуцибельної NO-синтази в розвитку дисфункції міокарда і порушень коронарного кровообігу в ранні терміни ішемії–реперфузії серця.
Для її досягнення були поставлені такі задачі:
1. Провести порівняльний аналіз змін експресії iNOS і активності NO-синтаз в міокарді правого і лівого шлуночків при моделюванні ішемії–реперфузії ізольованого серця щура;
2. Вивчити зміни експресії iNOS і активності NO-синтаз в міокарді при індукції і специфічній блокаді iNOS та порівняти їх в міокарді правого та лівого шлуночків при ішемії–реперфузії ізольованого серця щура;
3. Дослідити вплив індукції iNOS за допомогою ліпополісахариду і специфічної блокади iNOS на функцію серця і коронарний кровообіг при моделюванні ішемії–реперфузії міокарда;
4. Провести порівняльний аналіз змін експресії iNOS і активності NO-синтаз з функцією серця при моделюванні ішемії–реперфузії міокарда;
5. Дослідити вплив оксиду азоту на швидкість поглинання кальцію саркоплазматичним ретикулумом міокарда щура за допомогою донора NO – SIN-1;
6. Вивчити вплив блокатора циклооксигенази – індометацина і простагландина Е2 на скоротливу функцію серця щура, експресію iNOS білка і активність NO-синтаз в міокарді при моделюванні ішемії–реперфузії серця.
Об'єкт дослідження: ізольоване серце щурів, гомогенат міокарда.
Предмет дослідження: біохімічні показники активності ферментів, експресія білка, параметри кардіодинаміки.
Методи дослідження: У роботі були використані наступні методи:
фізіологічні – перфузія ізольованого серця за методом Лангендорфа, визначення показників скорочувальної функції серця та коронарного кровообігу;
біохімічні – визначення активності NO-синтаз, вестерн–блот–аналіз;
біофізичні – вимірювання поглинання Са2+ везикулами саркоплазматичного ретикулума.
Наукова новизна одержаних результатів. Отримано нові дані про роль системи оксиду азоту та її взаємозв'язок з циклооксигеназним шляхом метаболізму арахідонової кислоти в розвитку порушень діяльності серця при ішемії–реперфузії міокарду. Показано, що пригнічення скоротливої функції міокарду відбувається одночасно з підвищенням активності iNOS та може бути частково попереджено специфічним гальмуванням iNOS. Показано, що за умови індукції експресії iNOS індометацин і ПГЕ2 мають антиаритмічний ефект, можливо за рахунок пригнічення експресії та зниження активності iNOS в міокарді.
Вперше проведено порівняльний аналіз відмінностей експресії і активності NO-синтаз у правому і лівому шлуночках серця як на фоні індукції iNOS, так і без неї при моделюванні ішемії–реперфузії міокарду щура. Встановлено, що активність і експресія iNOS є вищими в міокарді правого шлуночка серця. Вперше показано, що зниження експресії iNOS під впливом ПГЕ2 більшою мірою відбувається в міокарді правого шлуночка. Показано, що прозапальні процеси в міокарді посилюють депресивні ефекти активованої iNOS при ішемії–реперфузії.
Теоретичне і практичне значення роботи. Отримані результати мають як теоретичне, так і практичне значення. Вони розширюють уявлення про механізми розвитку дисфункції міокарду за ішемії–реперфузії та сприяють глибшому розумінню її механізмів. Отримані дані мають значення для більш повного розуміння метаболізму оксиду азоту в різних відділах серця (правому і лівому шлуночках), що дозволяє пояснити відмінності в розвитку та перебігу патологічних процесів у великому і малому колах кровообігу.
Встановлення шляхів синтезу NO у міокарді за патологічних умов може бути підставою для розвитку нових і доповнення вже існуючих напрямів лікування захворювань серцево-судинної системи, особливо гострих процесів (інфаркту міокарду, стенокардії, операцій на серці, трансплантації), що розвиваються на фоні хронічних патологій.
Особистий внесок здобувача. Автором самостійно здійснено науковий пошук та обгрунтування напрямку досліджень. Самостійно проведено експериментальні дослідження, статистичну обробку одержаних результатів та їх аналіз, сформульовано основні висновки роботи, підготовлено до публікації матеріали експериментальних досліджень.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідалися на: ІІ міжнародній науково-практичній конференції “Дисфункція ендотелію” (Вітебськ, Білорусія 2002), міжнародній конференції “Автоматизований аналіз гіпоксичних станів” (Нальчік, Росія, 2003); міжнародній науковій конференції "Гомеостаз: фізіологія, патофізіологія, фармакологія та клініка" (Одеса, Україна, 2003); III-Всеросійській з міжнародною участю школі-конференції з фізіології кровообігу (Росія, Москва, 2004); 24-й щорічній науковій сесії Європейської секції досліджень серця (Дрезден, Германія, 2004), III-му Російському конгресі з патофізіології з міжнародною участю "Дисрегуляторна патологія" (Росія, Москва, 2004).
Публікації. Матеріали дисертації опубліковано у 9 роботах, з яких 5 – статті у наукових фахових виданнях, 4 - тези доповідей на наукових конференціях.
Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 163 сторінках друкованого тексту та ілюстровано 24 рисунками та 3 таблицями. Робота складається із списку скорочень, вступу, огляду літератури, розділів описання матеріалів і методів дослідження, результатів дослідження, обговорення результатів, висновків, списку використаних джерел, що нараховує 334 найменувань.
Основний зміст РОБОТи
Матеріали та методи досліджень. Досліди виконувались на щурах–самцях лінії Вістар вагою 250–350 г з дотриманням усіх вимог щодо роботи з лабораторними тваринами. Проведено 2 серії експериментів, які було поділено на такі групи: I – вплив індукції iNOS на скоротливу функцію міокарду і коронарний кровообіг при ішемії–реперфузії серця щура (рис.1): 1 – контрольна група: ішемія–реперфузія ізольованого серця щура без добавок; 2 – активація індукції iNOS за допомогою ліпополісахарида (ЛПС) в концентрації 0,25 мг/кг внутрішньоочеревинно за 18 годин до початку експерименту; 3 - специфічна блокада iNOS за допомогою 1.3-PBIT ("Sigma", США), який додавали в перфузійний розчин в кінцевій концентрації 50 нмоль/л; 4 - блокада циклооксигенази (СОХ) неспецифічним блокатором індометацином ("Sigma", США), який додавали в перфузійний розчин в кінцевій концентрації 100 мкмоль/л; 5 – вплив на фоні введення індометацина простагландина Е2 ("Sigma", США), який вводили в перфузійний розчин в концентрації 1 мкмоль/л протягом останніх 5 хв перед ішемією через мікрокатетер; II – дослідження впливу донора NO на швидкість поглинання кальцію саркоплазматичним ретикулумом в гомогенаті міокарда щура: 1 – контрольна група, 2 – специфічна блокада Са2+–уніпортера мітохондрій рутенієвим червоним (25 мкмоль/л) (РЧ), 3 – додавання в середовище інкубації донора NO – 3-морфоліносіднонімина (30 мкмоль/л) (SIN-1, "Sigma", США), 4 – додавання SIN-1 і рутенієвого червоного, 5 - додавання SIN-1 і L-метіоніна (20 ммоль/л) - скавенджера пероксинітрита; 6 - додавання SIN-1 і супероксиддисмутази (СОД, 100 од, "Sigma", США) - скавенджера супероксиданіона (О2).
Перфузія ізольованого серця за методом Лангендорфа. Тварин анестезували уретаном (125 мг/кг, в/о), вводили гепарин (250 од/кг) за 10 хв до вилучення серця. Проводили торакотомію, швидко видаляли серце, яке одразу поміщали в льодовий розчин Кребса. Серце ретроградно перфузували модифікованим розчином Кребса (37С, рН=7,4), насиченим карбогеном (95% O2 і 5% CO2). У порожнину лівого шлуночка вставляли латексний балончик, з'єднаний з тензодатчиком. Реєстрували перфузійний тиск у коронарних судинах (ТКС) за умов постійної об'ємної швидкості перфузії та тиск в лівому шлуночку (ТЛШ) за допомогою багатоканального полікардіографа Мінгограф–82 (“Elema”, Швеція). Кількість аритмій обраховувалась на ділянках, де на протязі 1 хв їх кількість була максимальною. Серце стабілізували 20 хв, після чого моделювали ішемію-реперфузію шляхом повної зупинки перфузії на 30 хв з подальшою реперфузією впродовж 40 хв.
Визначення активності NO-синтаз. Активність NO-синтаз в лівому шлуночку (з міжшлуночковою перегородкою) і в правому шлуночку серця визначали за допомогою комбінації методів [Moncada S. et al., 1991] та [Chin S. et al., 1999], пристосовану для спектрофотометричного вимірювання продукту реакції – нітрит–аніона [Vodovodz Y. et al., 1994]. Активність NOS представляли в пікомолях NO, що утворювався за 1 хв на 1 мг загального білка гомогенату серця. Вміст загального білка в пробах визначали методом Бредфорда [Bradford M., 1976]. Активность Ca2+-незалежної NO–синтази (iNOS) визначали аналогічним чином, додаючи в середовище інкубації 4 ммоль/л EGTA замість CaCl2 [Green L. et al., 1982]. Активність Ca2+-залежної NOS (сNOS) обраховували як різницю загальної активності NO-синтаз та активності Ca2+- незалежної NOS.*
Вестерн–блот–аналіз. Дослідження експресії іNOS в міокарді проводили за допомогою апаратного комплексу та протоколу Bio–Rad Laboratories (США) з використанням реагентів фірми "Sigma" (США). Тканини лівого (з міжшлуночковою перегородкою) і правого шлуночків серця механічно подрібнювали в рідкому азоті та гомогенізували в ультрагомогенізаторі, додаючи лізис-буфер і інкубували 30 хв на льоду, потім центрифугували 20 хв при 10 000g і 4?С. Вміст білка в пробі визначали за методом ВСА–1 ("Sigma", США). Супернатанти (по 50 мкг білка) розділяли на 7,5% SDS–PAGE і переносили на PVDF–мембрани ("Bio–Rad"), які блокували 4%-м розчином желатину 18-20 год, обробляли поліклональними анти–іNOS–антитілами ("Sigma", США) 2 год, після відмивання обробляли антикролячим IgG кози і забарвлювали за допомогою ExtrAvidinPeroxidase Staining Kit ("Sigma", США).
Вимірювання швидкості поглинання Са2+ саркоплазматичним ретикулумом (СР) в гомогенатах міокарда щурів в присутності оксалата. Швидкість поглінання Са2+ саркоплазматичним ретикулумом вимірювали в гомогенатах міокарда щурів [Loukianov E. et al., 1999; Saborido A. et al., 1999]. Тварин анестезували уретаном (125 мг/кг, в/о), вводили гепарин (250 ед/кг). Грудну порожнину відкривали і видаляли серце, яке одразу поміщали в льодовий фізіологічний розчин. Після видалення передсердь, великих судин і правого шлуночка міокард гомогенізували за допомогою гомогенізатора Поттера (тефлон/скло, 1000 об/хв). Протягом досліду гомогенати тримали на льоду. АТФ–азну активність мітохондрій (МХ) блокували азидом натрію (10 ммоль/л) [Kawata T. et al., 1988]. Накопичення Са2+ у присутності оксалату запускали АТФ (2 ммоль/л) та вимірювали кальційчутливим електродом (фірма “Orion”, США) у термостатованій камері (37оС). Швидкість транспорту вимірювали за умов специфічної блокади мітохондріального уніпортера рутенієвим червоним (РЧ) (25 мкмоль/л) і без такої. Швидкість поглинання Са2+ везикулами СР представляли в мікромолях Са2+ за 1 хв на 1 г тканини серця.
Експериментальні результати обробляли за допомогою статистичної програми "Origin 6.0". Статистичний аналіз отриманих даних проводився за допомогою методів варіаційної статистики з використанням t–критерію Стьюдента для оцінки вірогідності відмінностей груп даних. Статистично вірогідними вважалися результати, для яких Р<0,05. Результати дослідів представлені як середнє значення (n) ± середня квадратична похибка.
____________________________________
* Визначення біохімічних параметрів проводилися при консультативній допомозі ст.н.с.
Інституту біохімії ім.В.П.Паладіна НАН України Коцюруби А.В.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Зміни експресії iNOS і активності NO-синтаз за умов ішемії–реперфузії міокарду в різних відділах серця
Експресія iNOS і активність NO-синтаз в міокарді правого і лівого шлуночків за умов ішемії–реперфузії серця. В наших дослідах виявлено різний рівень експресії iNOS у міокарді щурів ще до початку ішемії: в міокарді правого шлуночка експресія iNOS була в 2 рази вищою, ніж в лівому (рис.2А, Б, 1, 4).
В період ішемії в міокарді лівого шлуночка експресія iNOS зростала на 49% порівняно з контролем (2), з більш слабкою інтенсифікацією в період реперфузії (на 28%) (3) порівняно з ішемічним рівнем (P<0,001) (рис.2А, Б). В міокарді правого шлуночка характер змін експресії iNOS був іншим: збільшення в період ішемії (на 66% порівняно з контролем) (5) з деяким її послабленням (на 38%) при реперфузії (6) (P<0,001) (рис.2А, Б). Таким чином, експресія iNOS при ішемії–реперфузії змінюється більшою мірою у міокарді правого шлуночка серця і відрізняється за характером змін від показників в лівому шлуночку. В усіх випадках експресія iNOS була значно більшою в міокарді правого (4), ніж лівого (1) шлуночка серця.
Активність iNOS до ішемії (контроль) в міокарді правого шлуночка серця була також в 2 рази вищою ніж в лівому (рис.2В, Г, 1, 4). В міокарді лівого шлуночка ішемія збільшувала активність iNOS в 5 раз, а реперфузія – в 8 раз відносно доішемічного рівня (Р<0,05) (рис.2В, 2, 3), динаміка змін активності iNOS в міокарді правого шлуночка зберігалась, але була в 2-2,5 рази вищою ніж в лівому на всіх етапах експеримента (рис.2Г).
Інші результати отримані при вивченні змін конститутивних NOS (рис.2Д, Е). В контролі активність cNOS була більш вираженою в міокарді лівого шлуночка (в 5 раз), ніж правого шлуночка серця. Виражена висока активність конститутивних NO-синтаз (сNOS) в міокарді лівого шлуночка в контролі зменшувалась в період ішемії на 59±9,6% (P<0,05) і відновлювалась до предішемічного рівня при реперфузії. В міокарді правого шлуночка під час ішемії цей показник збільшувався в 4–5 разів порівняно з передішемічним рівнем (P<0,05) і в подальшому не змінювався при реперфузії (рис.2Е).
Таким чином, нами виявлено збільшений рівень експресії iNOS і активності NO-синтаз у правому шлуночку серця порівняно з лівим та зміну співвідношення iNOS/cNOS при ішемії–реперфузії: у контролі в лівому шлуночку була підвищена активність cNOS, а на етапах ішемії і реперфузії – активність iNOS.
Вплив ЛПС на експресію iNOS і активність NO-синтаз в міокарді правого і лівого шлуночків при ішемії–реперфузії серця. Для вивчення впливу ендогенного NO на функцію серця нами було використано ліпополісахарид, широко відомий як активатор iNOS [Moncada S., 1991]. Попереднє введення ЛПС в наших експериментах призводило до підвищення експресії і активності iNOS до початку експеримента в обох шлуночках (рис.3).
Виражена експресія iNOS до ішемії міокарду в лівому шлуночку посилювалася після реперфузії на 16% порівняно з ішемічним показником, в правому – збільшення експресії спостерігалось при ішемії (на 15%) та зменшувалось при реперфузії на 12% від ішемічного рівня (рис.3А, Б). Таким чином, попереднє введення ЛПС призводило до підвищення рівня експресії iNOS в міокарді обох шлуночків, але динаміка його змін за умов ішемії–реперфузії була менш вираженою, ніж у контрольній групі без введення ЛПС.
Введення ЛПС приводило до підвищення активності iNOS до початку ішемії в міокарді лівого шлуночка в 6,4, а правого – в 4,4 рази порівняно з контролем (Р<0,05) (рис.3В, Г). Активність iNOS в міокарді лівого шлуночка після реперфузії зменшувалася в 2,6 рази проти початкових цифр (Р<0,05), в правому шлуночку – в 1,4 рази (Р<0,05) (рис.3В, Г). Активність iNOS переважала в тканині правого шлуночка на стадіях стабілізації і реперфузії. Активність cNOS в дослідах з попереднім введенням ЛПС до початку експерименту була знижена в міокарді лівого шлуночка в 2 рази, а в міокарді правого – збільшена в 5,5 разів порівняно з контрольними даними (Р<0,05) (рис.2Д, Е, 1, 4; рис.3Д, Е, 1, 4). Активність cNOS в міокарді правого шлуночка під час ішемії знижувалася в 1,5 рази і в 2 рази протягом реперфузії порівняно з контролем (рис.3Е), а в міокарді лівого шлуночка – збільшувалася під час ішемії в 1,5 рази і знижувалася в 2 рази під час реперфузії порівняно з контролем (рис.3Д). Отримані дані свідчать про те, що експресія і активність ферментів при ішемії–реперфузії при введенні ЛПС були більш вираженими в міокарді правого шлуночка серця, активність iNOS переважала над активністю сNOS в обох шлуночках і активність обох типів ферментів знижувалась при ішемії-реперфузії. Таким чином, зміни активності обох типів ферментів, які певною мірою залежать від її початкового рівня перед ішемією-реперфузією.
Додавання специфічного блокатора iNOS PBIT (50 нмоль/л) в перфузійний розчин призводило до зниженням експресії iNOS під час ішемії–реперфузії в міокарді обох шлуночків ізольованого серця за умови попереднього введення ЛПС тваринам, цей вплив мав більш виражений характер в лівому шлуночку серця (рис.4А). Активність ферменту iNOS в міокарді лівого шлуночка під дією блокатора знижувалася в 28 разів (P<0,05), а в правому шлуночку - в 21 раз (P<0,001) порівняно з введенням ЛПС (рис.4Б); активність cNOS в міокарді лівого шлуночка знижувалася в 4,5 рази (P<0,05), а в міокарді правого шлуночка - не відрізнялась від показників з впливом ЛПС (рис.4В). Таким чином, специфічна блокада iNOS викликала виражене зменшення експресії і активності iNOS в обох шлуночках серця.
Вплив індометацину і ПГЕ2 на експресію iNOS в міокарді правого і лівого шлуночків серця за умов ішемії–реперфузії. Для дослідження впливу продуктів метаболізму арахідонової кислоти за циклооксигеназним шляхом на експресію і активність ферментів синтезу оксиду азоту при ішемії–реперфузії серця щура нами були проведені дослідження за умов попереднього введення ЛПС і перфузією індометацином. Введення індометацину знижувало експрессію iNOS в обох шлуночках в порівнянні з рівнем за присутності ЛПС (рис.4, 3), а додавання ПГЕ2 разом з індометацином значно зменшувало експресію iNOS в міокарді правого шлуночка в порівнянні з впливом індометацина і ЛПС (рис.4, ІІ, 4), не впливаючи на рівень експресії в лівому шлуночку (рис.4, І, 4). Таким чином, індометацин пригнічує індукцію iNOS в міокарді обох шлуночків, а екзогенний ПГЕ2 зменшує експресію iNOS в міокарді правого шлуночка серця, не змінюючи при цьому ефекту, викликаного індометацином, в лівому шлуночку.
Вплив модуляції активності NO–синтаз на скоротливу функцію серця і коронарний кровообіг за умов ішемії–реперфузії ізольованого серця щура
При ішемії–реперфузії міокарда у контрольній групі досліджень коронарний судинний опір (КСО) в постішемічному періоді наприкінці реперфузії серця був збільшений порівняно з вихідним рівнем в середньому на 16,2% (Р<0,05) (Рис.5, 1). Можна припустити, що це пов'язано з активацією коронароконстрикторних або зниженням вазодилятаторних впливів на судини серця, зокрема, зниженням рівня оксида азота під впливом ішемії міокарда.
У серії дослідів з попереднім впливом ЛПС (за 18 год до експеримента) спостерігалась інша динаміка змін КСО. Ці дослідження показали, що вихідний рівень КСО був знижений на 38% (Р<0,05) (Рис.5, 2) і його рівень в кінці реперфузії практично не змінювався, тобто коронароконстрикторний компонент реакції був відсутній. Ми припустили, що це було пов'язано з активацією системи NO під впливом ЛПС та його вазодилятаторним впливом. Це припущення знайшло підтвердження в серії дослідів зі специфічним інгібуванням iNOS (рис.5, 3). При дії PBIT (специфічного блокатора iNOS) КСО відновлювався до контрольного рівня та знову з'являлась вазоконстрикторна реакція після ішемії.
Як видно з рис.6 зміни активності iNOS могли досить інтенсивно впливати на скоротливу активність серця в процесі розвитку ішемії-реперфузії міокарда. В контрольних дослідах тиск в лівому шлуночку після різкого зниження при ішемії міокарда поступово відновлювався впродовж реперфузії, однак і через 40 хв не досягав вихідного рівня (рис.6,1). Аналогічна динаміка змін ТЛШ спостерігалась і в групі дослідів з попереднім введенням ЛПС, але рівень ТЛШ як до, так і після ішемічного епізоду був нижчим ніж в контрольній групі, що могло бути зв'язано з ефектом самого ЛПС або з підвищенням продукції NO в цій серії дослідів. Про останнє свідчили результати третьої серії дослідів зі специфічною блокадою iNOS. Як видно з рис.6,3 рівень скоротливої активності міокарду був не тільки статистично вище такого в дослідах з ЛПС, але був вищий в кінці реперфузії ніж на початку досліду. Ці данні свідчать про суттєву роль iNOS в кардіодепресорних реакціях при ішемії-реперфузії міокарда.
Таким чином, специфічна блокада iNOS і, мабуть, гальмування надмірної продукції NO, викликаної введенням ЛПС, попереджає розвиток кардіодепресії (зниження ТЛШ), в той же час приводить до значного підвищення тиску у коронарних судинах. Іншими словами, надмірний синтез NO приводить до різних по характеру впливів на серцевий і судинний компоненти реакції.
Отримані результати показали, що введення ЛПС не впливало на скоротливу функцію міокарду до ішемії в усіх групах, а ішемія–реперфузія на фоні ЛПС посилювала депресивні ефекти високої активності iNOS на скоротливу функцію міокарду і той факт, що ці ефекти знімались введенням специфічного блокатора iNOS, дозволяє припустити важливу роль iNOS в їх виникненні.
В той же час слід підкреслити, що вплив індукції iNOS на функціонування серця при ішемії–реперфузії був неоднозначний (табл.1). У експериментах з ЛПС час до повної зупинки серця був більшим на 68%, а в групі з PBIT - на 32% у порівнянні з контролем (Р<0,05) (табл.1). Тиск у лівому шлуночку відновлювався до передішемічного рівня тільки у випадку введення специфічного блокатора iNOS у перфузійний розчин (табл.1).
Кількість екстрасистол при постішемічній реперфузії в дослідах з ЛПС збільшувалася в 2,3 рази порівняно з контролем (Р<0,05), за рахунок появи групових екстрасистол. Введення блокатора iNOS зменшувало кількість екстрасистол в 3 рази (Р<0,05). З другого боку, час до початку скорочень в дослідах з ЛПС зменшувався в 4,3 рази в порівнянні з контролем (Р<0,05), і цей ефект знімався введенням блокатора (Р<0,05) (табл.1). Таким чином, введення ЛПС викликало неоднозначний ефект на функцію серця за умов ішемії-реперфузії: з одного боку падіння ТЛШ (депресивний ефект), з іншого – збільшення часу до зупинки серця та зменшення часу до початку скорочень після ішемії (протективний ефект). Спостережувані ефекти зменшувались після введення блокатора iNOS, що підтверджує нашу думку про важливе значення ендогенного NO в їх появі.
Поглинання Са2+ саркоплазматичним ретикулумом міокарда щура
Депресія міокарда, яку ми спостерігали в наших експериментах, може бути пов’язана зі збільшеною концентрацією кальція у кардіоміоцитах і порушенням його буферизації у Са2+-депо, що приводить до порушень функцій клітин і пошкодженню міокарда, а також до пов’язаних з Са2+ порушень функції серця, зокрема до аритмій, дисфункції. Сучасні дослідження показали, що регуляція акумуляції і виходу кальція у клітинах може відбуватись і при участі оксиду азоту [Stoyanovsky D. et al., 1997; Xu K. et al., 1999]. Оксид азоту змінює функцію серця, його метаболізм і впливає на кальцієвий гомеостаз та скоротливу функцію міокарда [Campbell D. et al., 1996; Kelly R. et al.,1996; Carmeliet E., 1999]. Але механізм його впливу на внутрішньоклітинні депо кальцію до останнього часу остаточно не з’ясован.
Для оцінки поглинання Са2+ СР нами було використано гомогенат міокарда щура. Було створено умови, оптимальні для накопичення Са2+ у везикулах СР, а саме введення у середовище інкубації оксалату калію (10 ммоль/л), інгібітора АТФ-азної активності мітохондрій азиду натрію (10 ммоль/л), АТФ (2 ммоль/л). При інкубації з оксалатом запобігається участь рианодинових рецепторів у зміні концентрації кальцію в середовищі інкубації. Середнє значення швидкості поглинання Са2+ везикулами саркоплазматичного ретикулума міокарду за цими умовами склало 5,2±0,5 мкмоль Са2+/хв на г тканини (n=6) (рис.7).
Для дослідження впливу мітохондрій на поглинання Са2+ ми використали високоспецифічний блокатор Са2+-уніпортера рутенієвий червоний (РЧ) (25 мкмоль/л) [Trolinger et al., 2000], що дозволило заблокувати вхід Са2+ в мітохондрії і виключити їх участь в поглинанні Са2+ з середовища інкубації. Це дозволило зареєструвати вхід Са2+ саме у везикули СР. В наших експериментах РЧ викликав збільшення швидкості поглинання Са2+ на 110% (Р<0,05, n=6) (рис.7). Ця величина відображає швидкість поглинання Са2+ Са2+-АТФазою СР.
Зміна поглинання кальцію саркоплазматичним ретикулумом міокарду у присутності донора NO - SIN-1 та скавенджерів активних форм кисню. Для визначення того, як змінюється швидкість поглинання Са2+ СР у присутності NO, ми застосували донор NO SIN-1 (30 мкмоль/л). Через 5 хв після внесення SIN-1 у гомогенат спостерігалось зниження швидкості поглинання кальцію до 0,70,06 мкмоль Са2+/хв на г тканини (Р<0,05; n=6) (рис.7). У присутності рутенієвого червоного швидкість поглинання Са2+ поверталась до контрольних значень (рис.7). Ці результати показали, що саме мітохондрії викликають цей ефект і зміни швидкісті поглинання Са2+ кальцієвими депо міокарда, зокрема, мітохондріями, можуть бути обумовлені продуктами розпаду SIN-1 (оксидом азоту, супероксидним радикалом і пероксинітритом).
Для дослідження впливу пероксинитрита на швидкість поглинання Са2+ СР ми використали його скавенджер L-метіонін (20 ммоль/л) [Kelm М. et al., 1997]. В наших дослідах введення його в середу інкубації одночасно з SIN-1 призводило до зниження швидкості транспорту кальцію (0,6±0,05 мкмоль Са2+/хв на г тканини, Р<0,05; n=6) порівняно з контролем (рис.7).
Таким чином, в наших дослідах ONOO- не впливає на швидкість поглинання Са2+ саркоплазматичним ретикулумом, можливо, основне значення в цьому ефекті відіграє оксид азоту і/або супероксидний радикал.
З метою розділення ефектів NO і О2 на швидкість поглинання Са2+ везикулами СР ми використали скавенджер О2 - СОД (100 од), яка вносилась в середовище інкубації одночасно з SIN-1. Внесення СОД не призводило до змін пригнічувального впливу SIN-1 на швидкість поглинання Са2+ СР і становило 1,7±0,2 мкмоль Са2+/хв на г тканини (Р<0,05, n=6).
Таким чином, як свідчать наведені результати, основну роль в змінах швидкості поглинання Са2+ СР при введенні SIN-1 відіграє NO, який вивільнюється при розпаді SIN-1. При цьому достовірна різниця двох серій дослідів з SIN-1 і СОД передбачає, що О2 також може впливати на швидкість поглинання Са2+ СР (Р<0,05). Однак його внесок, порівняно з впливом NO, відносно невеликий.
ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕНЬ
Найважливіший факт, отриманий нами при проведенні дослідження змін експресії iNOS і активності NO-синтаз при експериментальному моделюванні ішемії–реперфузії, - це значна різниця в експресії iNOS і активності NO-синтаз в міокарді лівого і правого шлуночків серця. Показано, що на всіх етапах експерименту експресія iNOS білка була значно більшою в правому, ніж в лівому шлуночку. Посилення експресії білка iNOS за допомогою ЛПС супроводжувалося зростанням активності ферменту в обох шлуночках, але більше в правому.
Проведені експерименти дозволили виявити динаміку зміни експресії iNOS та активностей індуцибельної і конститутивних форм NO-синтаз в міокарді шлуночків за умов ішемії–реперфузії серця: підвищення експресії і активності iNOS та зменшення активності cNOS у період ішемії, збільшення експресії iNOS і підвищення активності обох типів ферментів при реперфузії. Отримані дані узгоджуються з результатами інших авторів, що показали зниження активності eNOS в цілому серці собаки і щура під час ішемії–реперфузії [Giraldes R. et al., 1997; Мойбенко A.A. и др., 2000], що може бути пов'язано з денатурацією ферменту при ішемії під впливом гіпоксії, ацидозу, активних форм кисню [Hess M. et al,. 1984; Giraldes R. et al., 1997; Pou S. et al., 1999]. Збільшення базального рівня кальцію і ацидозу в постішемічному серці приводить до збільшення активності сNOS [Weiss J. et al., 1990; Zweier J. et al., 1995]. Збільшення експресії і підвищення активності iNOS при ішемії–реперфузії особливо виражені в серці при постішемічній реперфузії [Kanno S. et al., 2000; Zingarelli B. et al., 2002], що також можна пояснити гіпоксією, яка супроводжує ішемію і регулює велику кількість генів, зокрема, iNOS [Kitakaze M. et al., 1995; Jung F. et al., 2000; Vargiu C. et al., 2000].
В наших дослідженнях було показано збільшений синтез білка iNOS при ішемії–реперфузії. Цей ефект може бути пов'язаний з активацією mRNA NOS, яка до початку ішемії знаходиться в цитоплазмі в неактивному стані [Laufs U. et al., 1998; Searles C. et al., 1999]. Ішемічний стимул активує регуляторні білки (наприклад, для iNOS це РНК-зв'язуючий протеїн HuR (36 кДa) [Rodriguez-Pascual F. et al., 2000]), що змінює активність молекули mRNA iNOS. В наших експериментах в кінці реперфузійного періоду можна очевидно реєструвати вже синтезований de novo білок iNOS [Liu S. et al., 1997]. Збільшення активності iNOS при ішемії–реперфузії можна також пояснити і пригніченням протеасомальної активності, що може призводити до зниження розпаду і більш тривалому функціонуванню білка iNOS [Bulteau A. et al., 2001; Musial & Eissa, 2001]. Встановлена різниця рівней експресії iNOS в шлуночках серця, можливо, пов'язана з підвищеним рівнем mRNA iNOS в цитоплазмі клітин правого шлуночка серця, проте пояснення цього факту вимагає проведення додаткових досліджень.
Отримані результати показали, що активність iNOS в порівнянні з активністю eNOS була більш вираженою при ішемії–реперфузії. Це співпадає з даними, описаними іншими авторами при захворюваннях серця [Drexler H. et al., 1998; Heymes C. et al.,1999] і, ймовірно, пов'язано з перемиканням синтезу NO з конститутивних ізоформ ферменту на індуцибельну під дією цитокінів [Walter К. et al.,1994].
При ішемії–реперфузії сердець, індукованих ЛПС, нами спостерігалося збільшення експресії і активності iNOS в обох шлуночках під час ішемії з їх падінням при реперфузії. Цей ефект дозволяє припустити функціонування під час реперфузії механізму негативного зворотного зв'язку, що обумовлює інгібування активності NO-синтази надмірною кількістю оксиду азоту [Albakri C. et al.,1996; Taylor B. et al.,1997]. Введення специфічного блокатора iNOS – 1,3-PBIT - відміняло ефекти, викликані ЛПС, різко знижувало активність ферменту і зменшувало експресію iNOS в міокарді обох шлуночків. Такий вплив PBIT можна пояснити його конкуренцією з iNOS за субстрат L-аргінін та антиоксидантними властивостями [Alderton W. et al., 2001].
Нами було встановлено, що вплив індометацину і ПГЕ2 на експресію і активність NO-ферментів було аналогічним: обидва фармакологічні агенти зменшували експресію iNOS і знижували активність NO-синтаз при ішемії–реперфузії. Гальмівний вплив ПГЕ2 на експресію iNOS носив більш виражений характер в правому шлуночку серця, що може бути пов’язано зі зміною транскрипції або стабільності молекули mRNA iNOS під впливом індометацину і ПГЕ2 і/або їх впливом на чинники, що змінюють стабільність mRNA iNOS [Tetsuka T. et al., 1994].
Відмінності експресії і активності NO-синтаз в різних відділах серця можуть бути пов'язані з анатомо-функціональними особливостями цих відділів [Lopez-Sendon J. et al., 1994; Kopelman H. et al., 1985; Shah P. et al., 1985] та наявністю потужних компенсаторних механізмів, які зумовлюють готовність і стійкість правих відділів серця до патологічних впливів.
При дослідженні впливу ЛПС на роботу ізольованого серця щура нами було встановлено, що через 18 годин з моменту введення, після ішемії розвивалася депресія міокарду, яка проявлялась вираженим зниженням ТЛШ і відсутністю відновлення тиску в лівому шлуночку до передішемічного рівня, це супроводжувалось збільшенням кількості білка iNOS і зменшенням активності iNOS в міокарді. Проте, спостерігалось збільшення часу до зупинки серця та зменшення часу до початку скорочень після ішемії. Отримані результати узгоджуються з літературними даними, які показали, що підвищений рівень NO при збільшеній активності iNOS і збільшена продукція активних форм кисню під час ішемії і реперфузії негативно впливають на функцію міокарду [Wildhirt S. et al., 1999; Ferdinandy P. et al., 2000; Xiong et al.,2002]. Прозапальні цитокіни (ТНФ-альфа, ИЛ-1), що синтезуються під дією ЛПС [Panas D. et al., 1998; Grandel U. et al., 2000], індукують iNOS і викликають кардіодепресивний ефект за NO-залежним механізмом [Meldrum D. et al., 1998], який супроводжується виснаженням запасів АТФ в міокарді, інгібуванням поглинання кисню і збільшенням внутрішньоклітинного Са2+ [Node K. et al., 1996; Wildhirt S. et al., 1998; Mungrue E. et al., 2002].
Для уточнення значення саме iNOS в розвитку кардіодепресії при моделюванні ішемії–реперфузії, ми вивчили вплив специфічного інгібітору iNOS (1,3-PBIT) [Garvey E. et al., 1994] на показники кардіодінаміки при введенні ЛПС. Збільшення активності і експресії iNOS ферменту розглядається як один з основних механізмів пошкодження міокарду при ішемії–реперфузії, тому його інгібування в наших дослідах за допомогою блокаторів поліпшує функцію серця.
Перфузія ізольованого серця розчином з PBIT призводила до поступового відновлення ТЛШ, зменшення кількості екстрасистол, що може бути пов'язане із зниженням рівня NO, ОNOО- і антиоксидантними властивостями блокатора [Ferdinandy P. et al., 2000; Alderton W. et al., 2001]. Це дозволяє припустити, що важлива роль в постішемічній депресії і дисфункції міокарду належить саме активації iNOS, а також можливо і вільним радикалам, які у великій кількості утворюються при ішемії–реперфузії.
Відомою причиною порушення функції міокарду є дисбаланс в роботі внутрішньоклітинних кальцієвих депо, що призводить до збільшення цитозольного Са2+. З метою дослідження механізмів розвитку порушень міокарда при ішемії–реперфузії, нами було проведено визначення впливу NO на швидкість поглинання Са2+ саркоплазматичним ретикулумом міокарду, впливу мітохондрій на цей процес і взаємозв'язку кальцієвих депо в цих умовах. Дослідження з використанням донора NO - SIN-1 показали зниження поглинання Са2+ везикулами саркоплазматичного ретикулуму міокарду, що може бути пов'язано з високим рівнем NO в середовищі інкубації і зміною функції мітохондрій під його впливом [Hotta Y. et al., 1999]. Високий рівень NO, а також закислення середовища інкубації, знижують поглинання Са2+ саркоплазматичним ретикулумом міокарду шляхом пригнічення Са2+-АТФази [Mubagwa K., 1995; Adachi T. et al., 2001]. Додаткові дослідження у присутності SIN-1 і рутенієвого червоного (який знижує утворення NO mtNOS і має антиоксидантні властивості [Meinicke A. et al., 1998; Dedkova E. et al., 2004]), показали, що пригнічуючий ефект SIN-1 на швидкість поглинання Са2+ саркоплазматичним ретикулумом міокарду зникав з відновленням показників до контрольного рівня (P<0,05). Результати досліджень підтвердили наше припущення про мітохондріальну природу даного ефекту.
Застосування донорів NO супроводжується синтезом супероксидного радикала (О2) і пероксинитрита (ONOO-), які є могутніми оксидантами, здатні змінювати транспорт кальцію і порушувати функцію міокарда [Stoyanovsky D. et al., 1997; Okabe E., 1998]. Додавання скавенджера ONOO- (L-methionine) і скавенджера О2 (СОД) у присутності SIN-1 не значно змінювало швидкість поглинання Са2+ СР. Ці дані дозволяють припустити, що провідну роль у зміні Са2+–гомеостазу надає саме NO, менш виражений вплив має О2.
Таким чином, NO може брати участь в регуляції внутрішньоклітинного кальцію і сприяти розвитку порушень функції серця.
Отримані нами результати дозволяють припустити важливу роль NO/iNOS в розвитку змін і порушень при ішемії–реперфузії міокарда, зокрема, у розвитку кардіодепресії, порушенні ритму;
