НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

Гребенюк Сергій Едуардович

УДК [354.3 + 577.38]:577.352:612.822

Роль екстрасинаптичних НМДА рецепторів в СА3-СА1 збуджуючій синаптичній передачі у гипокампі щурів

03.00.02 – биофизика

Автореферат дисертації на здобуття вченого ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2004

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано в Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця Національної Академії Наук України

Науковий консультант: | академік, доктор біологічних наук Кришталь Олег Олександрович, зав відділом клітинної мембранології Інституту фізіології ім О.О.Богомольця

НАН України

Офіційні опоненти: |

доктор біологічних наук, професор Веселовський Микола Сергійович. - заступник директора Міжнародного центру Молекулярної Фізіології НАН України

доктор біологічних наук, професор Костерін Сергій Олексійович. - зав. відділом біохімії м’язів Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України

Провідна установа: Національний медичний університет ім.О.О.Богомольця, кафедра нормальної фізіології.

Захист відбудеться 28.10.2004 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.

Автореферат розісланий 27.09.2004 р.

Вчений секретар спеціалізовоної ради,

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ.

Донедавна вважалося, що (синаптична) передача хімічного сигналу від одного нейрона (пресинаптичного) іншому (постсинаптичному) здійснюється незалежно від інших синаптичних контактів. Відповідно до цього допущення Хеббом був постульований принцип модифікації зв'язку між нейронами в залежності від їхньої активності(Bertіl Hіlle, 2001). Однак, недавно був опублікований ряд робіт (Rusakov, 1998 59 /іd;Dіamond, 1998 ;Arnth-Jensen, 2002), у яких показано, що принцип незалежності синапсів може порушуватися в умовах збільшеної імовірності звільнення медіатора. Зокрема показано, що глутамат, який вивільнається при синаптичній передачі, може активувати N-метил-D-аспартат (НМДА) рецептори, що не належать даному синапсу. Сформувалася гіпотеза "спіловера", відповідно до якої медіатор, звільнений однією синаптичною терминалью, може шляхом дифузії активувати рецептори, що лежать поза постсинаптичною щільністю рецепторів. Таким чином, виникло припущення про "перехресну" активацію синапсів, коли активація одного синапса призводить до активації сусіднього. Явище перехресної активації синапсів вимагає пересмотрения поглядів, що сформувалися, на процес синаптичної передачі, як організованого процесу передачі інформації в структурованих інформаційних мережах.

Вихід медіатора далеко за межі синаптичної щілини при підвищеній нейрональній активності, може служити механізмом зв'язку нейрональної активності з багатьма патологічними процесами в мозку. Зокрема, епілептичні й ішемічні стани, травми мозку, нейродегенеративні процеси, порушення в активності вісі гіпоталамус-гіпофіз-надниркова залоза зв'язані з порушеннями нормальної роботи глутаматергичної передачі. Особлива роль в індукції нейродегенеративних процесів приділяється НМДА рецепторам. Гіперактивність цих рецепторів призводити до підвищеного входу кальцію в клітину й активації каскаду біохімічних реакцій, що призводять до загибелі нейронів. Відповідно, блокатори цих рецепторів активно досліджуються як протисудомні, анальгетичні і противоішемічні препарати.

Можна припустити, що ініціація і розвиток патологічних процесів можуть бути пов'язані з активацією "надлишкових" екстрасинаптических глутаматних рецепторів. Крім того, глутаматергічна передача лежить в основі пластичних змін синаптичної передачі; тому, роль екстрасинаптичних глутаматних НМДА рецепторів у процесах запам'ятовування може виявитися несподівано великою.

Ціль роботи полягала в з'ясуванні механізмів посилення постсинаптичного сигналу в СА3-СА1 збуджуючій синаптичній передачі в зрізах гипокампу щурів в умовах збільшеного викиду глутамату, зокрема, при пачковому характері пресинаптичної активності.

Для досягнення даної мети були поставлені наступні задачі.

Дослідити умови виникнення НМДА компонента ЗПСС із повільною кінетикою деактивации ("повільний компонент") при збільшеній імовірності викиду медіатора.

Перевірити припущення про те, що даний компонент опосередкований активацією екстрасинаптичних НМДА рецепторів.

Дослідити роль глутаматного транспорту в активації екстрасинаптичних рецепторів.

Дослідити довготривалі зміни синаптичної передачі, викликані пачковою активністю

Дослідження проводилися відповідно до планів наукової роботи відділу фізико-хімічної біології клітинних мембран Інституту фізіології ім. А.А.Богомольця НАН України і Міжнародного Центра молекулярної біології за темою "Вивчення физиологичеких механізмів, що забезпечують включення НМДА рецепторів у зоні СА1 гипокампау за патофізіологичних умов".

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ.

Матеріали та методи досліджень. В експериментах були використані білі щури лінії Вістар WAG\GSto (Москва, Росія) віком 18-30 діб, що підтримувалися на стандартній лабораторній дієті у віварії Інституту фізіології ім. А. А. Богомольця НАН України. Для дослідження синаптичної передачі в гипокампі щурів були використані наступні методичні підходи:

а) приготування зрізів гипокампу щурів;

б) реєстрація антидромно- і ортодромно- викликаних потенціалів дії у відповідь на електричну стимуляцію зрізу;

в) реєстрація збуджуючих постсинаптических струмів у нейроні СА1 при фіксації потенціалу;

г) моделювання біофізичних характеристик пірамідного нейрона CA1.

Приготування зрізів. Після декапитації тварини обидві півкулі мозку швидко переносили в чашку Петри, що містила охолоджений (~0оС) розчин наступного складу (у милимолях): NaCl 125; NaHCO3 26; KCl 5; MgCl2 3; глюкоза 20. Розчин постійно насичувався газовою сумішшю ПРО2 (95%) і CO2 (5%), рн розчину при цьому підтримувався на рівні 7,35-7,4. Для запобігання травматичного ушкодження внаслідок гіперактивації НMDA-рецепторов використовували розчин, що не містить іонів Са2+. Після охолодження гипокамп переносили на покритий фільтрувальним папіром вакуумний столик для відведення розчину, що подається зверху, та фіксації гиппокампа у певному положенні. Зрізи товщиною 300-600 мкм нарізали з використанням леза при постійному змочуванні поверхні гипокампу. Приготовані в такий спосіб зрізи витримувались 60-90 хв. перед експериментом.

Електрофізіологічна реєстрація. Реєстрацію електрофізіологічних параметрів проводили при кімнатній температурі в экстраклеточному розчині наступного складу (у мМ): NaCl 135; NaHCO3 18; KCl 2,7; СаСl2 2,5; MgCl2 0,5; глюкоза 20 (p 7,35-7,4 при насиченні газовою сумішшю ПРО2 і CO2). Гальмівні впливи, опосередковані активацією ГАМКА- рецепторів усували, додаючи в позаклітинний розчин антагоністи цих рецепторів бікукулін чи пікротоксин у концентрації 25-50 мкм.

Реєстрація викликаних популяционных потенціалів. Для одержання викликаних синаптических відповідей у поле СА1 гиппокампа використовувалася біполярна стимуляція коллатералей Шаффера за допомогою подвійних, ізольованих по всій довжині, крім кінчиків, ніхромових електродів товщиною 50 мкм. Стимуляція імпульсами струму 0,1-1 мА чи напругою 3-30 мВ тривалістю 100-250 мкс забезпечувалося за допомогою гальванично ізольованого стимулятора. Для відведення популяційних потенціалів використовували електроди з низьким опором. Реєстрацію потенціалів чи ЗПСП проводили, занурюючи електрод на невелику глибину в зріз, відповідно в зону тіл пірамідних нейронів (stratum pyramіdale) і зону дендритів (stratum radіatum)

Реєстрація викликаних ЗПСС. Зріз гипокампу перерізали між stratum pyramіdale та stratum orіens тонким струменем экстраклеточного розчину. Потім видаляли частину альвеусу, чим забезпечували вільний доступ до тіл пірамідних нейронів. Також були ізольовані зони CA3 і CA1, шляхом перерізання аксонів нейронів СА3, для запобігання паразитної збудливості рекуррентных проекцій зони СА3. Реєстрацію ЗПСС проводили за методом петч-кламп (patch-clamp) у конфігурації "ціла клітина" за допомогою скляних мікропіпеток. Фіксацію мембранного потенціалу здійснювали шляхом подачі командного потенціалу на два хлор-срібних електроди, один із яких був занурений у позаклітинний, а інший у внутрішньоклітинний розчин. Внутрішньоклітинний розчин містив (у мм): Cs 100; Na2PO4 40; HEPES-CsOH 10; Trіs-Cl 10 (p 7.3). Після заповнення мікропіпетки внутрішньоклітинним розчином її опір складав 2-3 MОм. Сигнал перетерплював посилення і фільтрацію з частотою зрізу 1-3 кГц (підсилювач Bіologіc Іnc., Франція), далі був оцифрований з частотою дискретизації 1-10 кГц (у залежності від необхідності) і був записаний на твердий носій. Хід експерименту контролювався за допомогою комп'ютера, обладнаного платою АЦП/ЦАП.

Біофізична модель пірамідного нейрона CA1. У спробах врахувати вплив усіх можливих джерел погіршення контролю фіксації мембранного потенціалу була побудована і проаналізована біофізична модель типового нейрона CA1. Для побудови моделі використовувалося загальнодоступна і широко відомf програма NEURON v 5.3 2002 (John W. Moore, Mіchael Hіnes, Ted Carnevale).

Рис. Зміна кінетики ЗПСС при збільшенні амплітуди ЗПСС, отримане при аналізі моделі пірамідного нейрона CA1.

Модель була отримана шляхом модифікації моделі, що була використана у роботі (M.Mіglіore, 1999). Модифікована модель була позбавлена апікального дендритного дерева, що відображало видалення альвеолярного шару зрізу гипокампу. Оскільки перфузія постсинаптического нейрона Cs блокує функціонування потенциалзалежних кальцієвих та калієвих каналів, модельний нейрон також був позбавлений цих мембранних механізмів. Інші параметри моделі (опір піпетки, температура й ін.) були приведені у відповідність до експериментальних. У якості пресинаптических і постсинаптических механізмів використовувалися механізми, описані в (Destexhe, 1998).

Експерименти з модельним нейроном полягали в наступному. Збільшуючи щільність постсинаптического розташування НМДА синапсів, ми збільшували в такий спосіб величину ЗПСС, аналізуючи при цьому його кінетику. Результати експериментів наведені на . Результати свідчать, що кінетика спаду ЗПСС сповільнюється при збільшенні амплітуди. Але зміни у величинах перенесеного заряду при зміні амплітуди струму, отримані а наших электрофизиологических експериментах на порядок перевищують зміни, передбачені моделлю. Також, експерименти показали, що величина вхідного опору не робить значного впливу на кінетику ЗПСС, імовірно, тому що опір аксоплазмы вилучених дендритів перевищує опір піпетки. Отже, принаймні на якісному рівні, аналіз кінетики ЗПСС може бути використаній для отримання інформації про зміни властивостей синаптичної передачі.

Рис. Вольт-амперная характеристика НМДА каналів в експериментальних умовах

Вольт-амперна характеристика НМДА каналів. Використавши данні (Bertіl Hіlle, 2001) про проникність НМДА каналів для різних іонів і концентрації іонів в експериментальних розчинах, ми проаналізували теоретичну вольт-амперну залежність НМДА каналів для визначеності в інтерпретації експериментальних даних (). Розрахунки показали, що в загальному випадку амплітуда ЗПССНМДА при позитивному потенціалі приблизно в 2 рази менше, ніж при негативному потенціалі з тим же модулем. ЗПСС, зареєстровані в ході експериментів, відповідали отриманої теоретичної залежності.

Результати досліджень.

Моделювання збільшення імовірності викиду медіатора. У гипокампі калієві канали (Kv1.4, Kv1.1, Kv 1) розташовані поблизу збуджуючих синапсів з пресинаптичної сторони (Cooper, 1998). Для цих каналів, що швидко інактвуються, показана участь у регуляції входу кальцію в пресинаптичну терміналь (Geіger, 2000). Блокування або інактивація цих каналів призводить до зменшення реполяризуючої компоненти потенціалу дії (ПД) і, отже, до збільшення тривалості ПД. По прибуттю в пресинаптичну терміналь, ПД викликає більш тривалу деполяризацію мембрани і, отже, збільшений приплив іонів кальцію в терміналь, що у свою чергу призводить до збільшення імовірності злиття примембранных везикул із пресинаптичною мембраною. Збільшення імовірності викиду медіатора моделювалося або додаванням 4-амінопірідіну (блокатора калієвих каналів А-типу) або високочастотною стимуляцією. Висока частота проходження ПД перешкоджає виходу з інактивації калієвих каналів, що цілком аналогічно їхньому блокуванню.

Зміна кінетики ЗПСС при збільшенні імовірності викиду медіатора. Всі описані в роботі експерименти проводилися з ізольованим НМДА компонентом ЗПСС (реєстрація відбуваліся в присутності 10mkМ NBQX, антагоніста -аміно-3-гидроксі-5-метил-4-ізоксазол-пропіонова кіслота (АМПА) рецепторів, оскільки експерименти показують, що в умовах збільшеного викиду медіатора зміна кінетики є характерною тільки для НМДА компонента, хоча фасилітацию перетерплювали обидва компоненти (.)

Рис. . Зміни АМПА компоненти (в присутності 50мкМ APV, ліворуч) та НМДА компоненти (в присутності 10мкМ NBQX, праворуч) в результаті збільшення імовірності викиду медіатора. Vh = - 45 мВ.

ЗПССНМДА вимірювався в нейронах СА1 гипокампу при потенціалі +50 мВ або -45 мВ у відповідь на електричну стимуляцію колатералей Шаффера. Стимуляція велася поодинокими стимулами або короткими пачками (2-9 стимулів з частотою 200Гц, що імітує природний патерн активності (Dobrunz, 1999)). Після стимуляції пачкою спад ЗПССНМДА (ЗПССНМДАПАЧКА) драматично сповільнювався , B, запис a,c).

Рис. Ступінь уповільнення кінетики спаду ЗПССНМДА як функція кількості стимулів. А,B, залежність кінетики ЗПССНМДА від кількості стимулів. Велика амплітуда відповідає більшій кількості стимулів. Перенесений заряд при одиночній стимуляції прийнятий за одиницю. С, D, Окремий випадок даної залежності: a, запис ЗПССНМДА від одиночного стимулу, b,c, записи ЗПССНМДА після пачки з 7 стимулів. Запис с отриман при зменшенні сили стимулу в ~2 рази. D, Уповільнення кінетики спаду ЗПССНМДА після пачки з 7 стимулів кількісно виражається збільшенням перенесеного заряду.

Ми досліджували кінетику спаду ЗПССНМДАПАЧКА, змінюючи кількість стимулів у пачці. демонструє поступову зміну кінетики спаду ЗПССНМДАПАЧКА з ростом кількості стимулів, що їшли з частотою 200 Гц. На ,С оцінено залежність кількості Ca2+, що війшов у клітину від кількості стимулів у пачці. Темним кольором показана експериментально отримана залежність перенесеного заряду від кількості стимулів. Світлим кольором позначена залежність у гіпотетичних умовах, в яких кінетика ЗПССНМДА залишається постійною, а приріст перенесеного заряду здійснюється лише за рахунок збільшення амплітуди ЗПСС (описані умови відповідають тим, у яких відбувається зміна заряду, перенесеного АМПА компонентой ЗПСС). Таким чином, видно, що завдяки зміні кінетики ЗПСС від стимулу до стимулу, різниця в постсинаптичному сигналі між сусідніми стимулами стає набагато значнішою.

Ці спостереження знаходиться в повній відповідності з даними, отриманими раніше (Arnth-Jensen, 2002). Зміни кінетики ЗПССНМДАПАЧКА оцінювалися за допомогою нормалізації значення перенесеного заряду до амплітуди ЗПССНМДАПАЧКА. Більше значення перенесеного заряду відповідає більш повільній кінетиці спаду і навпаки. Нормалізоване значення перенесеного заряду ЗПССНМДАПАЧКА було на 240 ± 32 % більше аналогічного параметра для ЗПССНМДА, викликаного одиночним стимулом (ЗПССНМДАОДИН , p<0,001, n=10, , D).

Для даної кількості стимулів, велика сила стимулу викликала більший ефект , B запис c,d). Аналогічний стимулзалежний характер уповільнення спаду ЗПССНМДА спостерігався при додаванні 4-аминопірідіна (n = 10)

Активація екстрасинаптичних НМДА рецепторів при збільшенні імовірності вивільнення медіатора. Описані явища можна пояснити гіпотезою витікання (спіловера) L-глутамата із синаптичної щілини, що призводить до перехресної активації синапсів (Asztely, 1997 ;Dіamond, 2001 ;Arnth-Jensen, 2002), та/або активації екстрасинаптичних НМДА рецепторов (Lozovaya, 1999 1 /іd). Відмітною рисою екстрасинаптичних рецепторів є менша концентрація глутамата (у порівнянні із синаптичною), якою вони активуються. Це зумовлює меншу імовірність зв'язування глутамата з НМДА рецептором і відкриттям його каналу.

Ми використали цю особливість для дослідження питання про природу уповільнення кінетики спаду ВСПТНМДА.

Всі активні синаптичні НМДА канали були заблоковані за допомогою блокатора НМДА рецептор керованих каналів - МК-801. Оскільки блокування МК-801 відбувається тільки за умови, що НМДА рецептор керований канал є відкритим, блокуються тільки канали, що активуються при стимуляції синаптичних входів у СА1 полі гипокампу. Після повного зникнення ЗПССНМДА прикладався 4-АР протягом 15-20 хв при відсутності стимуляції входів. При поновленні стимуляції був зареєстрований струм, що вказує на те, що додавання 4-AP призводить до активації сімейства "мовчазних" НМДА рецепторів, що не приймають участі у синаптичній передачі в контрольних умовах ().

Рис. Активация семейства молчащих НМДА рецепторов при увеличении вероятности выброса медиатора.

Ми проаналізували кінетику блокування ЗПССНМДА в контрольних умовах та в присутності 4-AP. В контрольних умовах хід блокування найкраще був апроксімований одноекспонентною функцією виду Ae-t/ф с константою часу ? = 32.3 ± 0.5 (n = 5). В присутності 4-AP часовий хід розділявся на дві фази з параметрами A1 = 0.8 ± 0.01, ?1 = 25.15 ± 0.6, A2 = 0.2 ± 0.02, ф2 = 223.2 ± 13.6 (?проксімуючий багаточлен A1e-t/ф1 + A2e-t/ф2, MEAN±SD ,n=5.)

Прискорений хід блокування у швидкій фазі блоку ЗПСС (у присутності 4-AP) у порівнянні з контрольним, може бути пояснений збільшенням імовірності активації НМДА рецептор-керованих каналів і наступного їхнього блокування МК801 в умовах збільшенної імовірності викиду медіатора.

Поява повільної фази блокування може бути пояснено активацією групи НМДА-рецепторних комплексів, що відбуваться з низькою імовірністю, тобто НМДА рецепторів, що активуються низькими концентраціями глутамату, що може відбуватися при дифузії глутамата за межі синаптичної щілини й активації ектрасинаптичних рецепторів.

Для перевірки цього припущення ми провели аналогічний експеримент на тлі конкурентного низькоафінного антагоніста НМДА рецепторів D-амиіоадіпата (D-АА). Ступінь блокування екстрасинаптичних рецепторів, що активуються низькими концентраціями глутамата, повинна бути істотно вище, ніж ступінь блокування синаптичних рецепторів, що активуються високими концентраціями глутамата, що досягають у просторі синаптичної щілини, за літературними даними, 1-3 мМ, після вивільнення з везикули.

Рис. Аналіз кінетики блокування ЗПССНМДА MK-801 у присутності 4-AP і конкурентного антагоніста D-AA вказує на існування сімейства НМДА рецепторів, що активуються низькими концентраціями глутамату при збільшенні імовірності викиду медіатора.

Експерименти показують зникнення повільної фази (?1 = 34.00 ± 0.7, апроксимуючий багаточлен A1e-t/ф1, MEAN±SD ,n=5, ) і дозволяють зробити висновок про залучення популяції НМДА рецепторів, що активуються низькими концентраціями глутамата, що є ознакою активації екстрасинаптичних рецепторів.

Уповільнення кінетики ЗПСС при збільшенні викиду медіатора викликано активацією екстрасинаптических НМДА рецепторів, що мають повільну кінетику деактивації. Для нейронів CA1 гипокампа нещодавно була показана неоднорідність в експресії різних НМДА комплексів на поверхні постсинаптичної мембрани. Згідно з даними, у пірамідних нейронах гипокампу НМДА рецептори, що містять NR2A-суб’одиницю локалізовані переважно в постсинаптичній щільності, а рецептори, що містять NR2B суб’одиницю - навпроти, - в основному екстрасинаптичні (Tovar, 1999). Обидва типи рецепторів активуються при стимуляції колатералей Шаффера в зрізах гипокампу дорослих мишей (Kіrson, 1996). Неконкурентний антагоніст іфенпродил інгибує NR1/NR2B канали з високою спорідненістю (ІC50 = 0.34 µM), тоді як для NR1/NR2A рецепторів спостерігається 400-кратне зниження спорідненості (ІC50 = 146 µM) (Wіllіams, 1993). |

Рис. Зникнення повільної фази блокування ЗПССНМДА MK-801 у присутності 4-AP і неконкурентного селективного антагоніста NR2B суб’одиниць НМДА рецепторів свідчить про активацію екстрасинаптичних НМДА рецепторів.

Ми знайшли, що повільний компонент кінетики блоку ЗПСС, викликуваного МК801, є селективно чутливим до іфенпроділу (A1 = 0.6 ± 0.07, ?1 = 4.6 ± 0.6, A2 = 0.4 ± 0.08, ф2 = 28.5 ± 2.4, A1e-t/ф1 + A2e-t/ф2, MEAN±SD ,n=5,.), що вказує на те, що при збільшенні викиду медіатора і, відповідно, дифузії глутамата за межі синаптичної щілини істотно збільшується внесок NR2B підтипу НМДА рецепторів у синаптичну передачу за рахунок активації екстрасинаптичних NR2B рецепторів. Поява дуже швидкої фази блокування можливо, пов'язано з блокуванням відкритого каналу NR2A рецепторів іфенпроділом.

Описані експерименти не надають інформації про процеси, що відбуваються після максимуму ЗПСС, хоча основна частина заряду, що переноситься ЗПСС, опосередкована "хвостами" ЗПСС в тим більшій мірі, чим повільніше спад "хвоста" ЗПСС. Тому, у подальших дослідженнях наша увага акцентувалася на змінах кінетики ЗПССНМДА в експериментальних умовах. У цих експериментах збільшення викиду медіатора моделювалося короткими пачками стимулів, що краще відбиває процеси, що відбуваються в живому мозку.

Рис. Прискорення кінетики спаду ЗПССНМДА в присутності D-AA.

A, верхній ряд, ЗПСС, викликаний одним стимулом у контролі (a) і в присутності D-AA(b). Середній ряд, ЗПСС, викликаний пачкою з 7 стимулів (200 Гц) у контролі (c), зі зменшеною силою стимулу (d) і в присутності D-AA (e). Запис f демонструє винятковий внесок НМДА-рецептор опосередкованого струму в явища, що спостерігаються. Запис отриманий у присутності 5mk D-CPP. Нижній ряд, описані записи нормалізовані0 для візуального аналізу кінетики. B, Заряд, перенесений ЗПСС в експериментальних умовах. З, Відношення нормалізованого перенесеного заряду в контролі до заряду, перенесеному в присутності D-AA для одного і семи стимулів. D, Залежність ілюструє зменшену в порівнянні з одиночним стимулом ступінь блокування ЗПССНМДА в пачці.

Один з основних результатів проведених експериментів проілюстрований . У цьому експерименті реєструвалися ЗПСС, викликані одиночним стимулом і пачкою з 7 стимулів у контролі та в присутності D – аміноадипату (D-AA). Це речовина, слабкий конкурентний антагоніст НМДА-рецепторов, повинна зменшити внесок рецепторів, підданих меншої концентрації глутамата(Clements, 1992). Блокатор злегка змінив кінетику ЗПССНМДАОДИН: нормалізована величина перенесеного заряду склала 83 ± 6 % контрольної (p<0.04, n=6) (,A, записи a,b, B,C). Видимо, рецептори можуть бути активовані спиловером, викликаним навіть одним стимулом (відповідно до спостережень Дж.С.Даймонда (Dіamond, 2001)). У той же час, спад ЗПССНМДАПАЧКА виявився значно прискореним (A записи c,e, B,C). Нормалізована величина перенесеного заряду EPSCNMDAПАЧКА зменшувалася в присутності D-AA на 70 3 %, (p<0,001, n= 5) (,B,C).

Надзвичайно повільний спад ЗПСС при пачковій стимуляції, що обчислюється секундами, може відображати залучення екстрасинаптичних рецепторів з кінетичними параметрами, відмінними від тих, що їх мають рецептори у синаптичній щільністі. НМДА-комплекси, що складаються з NR1 і NR2D суб’одиниць, виявляють унікальні електрофізіологічні властивості, включаючи найвищу спорідненість до глутамату і гліцину (Іkeda, 1992), і маючи при цьому надзвичайно низьку швидкість деактивації (Monyer, 1994 ;Vіcіnі, 1998), часовий масштаб якої аналогічний масштабу спаду ЗПССНМДА після пачкової стимуляції. Ми припустили, що причиною повільного спаду ЗПССНМДАПАЧКА є "витікання" глутамата із синаптичної щілини та активація екстрасинаптичних NR2B та NR2D-мистячих рецепторів, що мають повільну кінетику деактивации. Для перевірки цієї гіпотези ми використовували агенти, що селективно блокують ті чи інші суб’одиниці НМДА рецепторів. Так, NR2D-мистячий НМДА-рецептор може бути виділений за допомогою R-(-)-3-(2-карбоксіпіперазин-4-іл)-пропил-1-фосфоновая кислота (D-CPP), що має високу селективность до NR2A/B у порівнянні з NR2D суб’одиницямі (Beaton, 1992 ;Buller, 1994). Значення Kі для D-CPP були оцінені для рекомбинантних NR2 суб’одиниць, що були експресовані з NR1a суб’одиницями в ооцітах Xenopus; відповідні значення Kі: NR2A, 65 ± 7 нМ; NR2B, 290 ± 18 нМ; NR2C, 820 ± 93 нМ; NR2D, 2768 ± 480 нМ. Спорідненість до NR2D-суб’одиниці статистично відрізнялося від кожного з гетеродимерів (p<0.001, n=5).

Рис. Уповільнений компонент ЗПССНМДАПАЧКА демонструє послаблену чутливість до D-CPP. (A) Хвіст ЗПССНМДАПАЧКА інгібується значно слабкіше ніж струм у піку. Верхній ряд: ЗПССНМДА, викликаний одиночним стимулом (a-контроль, b - D-CPP), і пачкою з 7 стимулів (200Гц, c - контроль, d - D-CPP); D-CPP не змінює кінетику ЗПССНМДАОДИН, однак сповільнює кінетику спаду ЗПССНМДАПАЧКА. Нижній ряд: відповідні записи нормалізовані. Підтримуваний потенціал на мембрані +50мВ. (C) Відношення нормалізованих величин перенесеного заряду ЗПССНМДА в присутності D-CPP і в контролі для ЗПСС викликаних 1 і 7 стимулами (QD-CPP/QCONTROL, де Q - нормализованній перенесенній заряд (Заряд / Амплітуда)

демонструє, що затриманий компонент ЗПССНМДАПАЧКА блокується D-CPP більш слабко, ніж струм у піку ЗПСС, тоді як змін кінетики ЗПССНМДАОДИН не спостерігалося. У присутності D-CPP, нормалізована величина перенесеного заряду ЗПССНМДАПАЧКА склала 125 ± 7 % контрольної, проти 98 ± 7 % для відповідних параметрів ЗПССНМДАОДИН (p<0.02, n=7, ,C). Ці зміни відбивають набагато більш повільну кінетику спаду ЗПССНМДАПАЧКА під дією D-CPP. Оскільки експресія NR2C-утримуючих НМДА рецепторів не була виявлена в гипокампе шурів у даному віці, результат може говорити про збільшення внеску NR2D-утримуючих НМДА рецепторів в умовах збільшеного викиду медіатора. Якщо ця гіпотеза вірна, селективне інгібування NR2D-мистячих рецепторів повинно |

Рис. Затриманий компонент ЗПССНМДАПАЧКА має велику чутливість до PPDA, ніж ЗПССНМДАОДИН

(А) Верхній ряд: ЗПССНМДА, викликаний одиночним стимулом (a,b), і пачкою з 7 стимулів (200Гц, c,d) у присутності PPDA (b,d) і в контролі (a,c). Пізній компонент ЗПССНМДАПАЧКА демонструє велику чутливість до PPDA у порівнянні з піком. Підтримуваний потенціал на мембрані +50мВ. Нижній ряд: відповідні записи нормалізовані. (B) Нормалізовані величини перенесеного заряду ЗПССНМДАПАЧКА і ЗПССНМДАОДИН у присутності PPDA і в контролі. (C) Відношення величин зарядів обчислені, відповідно до виразу 1- QPPDA/QCONTROL.

призводити до протилежного ефекту: прискоренню спаду. З існуючих селективних антагоністів НМДА рецепторів, нам відомий антагоніст [±]-цис-1-[фенантрен-2-іл-карбоніл]піперазин-2,3-дікарбоксилинова кислота (PPDA), селективний до NR2D-мистючих НМДА рецепторів. Величини Kі для PPDA для рекомбінантних NMDA рецепторах, експресованих у ооцитах Xenopus наступні (у M) 0.68 ± 0.17 для NR1a/NR2A, 0.35 ± 0.02 для NR1a/NR2B, 0.070 ± 0.015 для NR1a/NR2C і 0.108 ± 0.032 для NR1a/NR2D рецепторів(Hrabetova, 2000).

Ми знайшли, що PPDA (10 µM) значно прискорює швидкість спаду ЗПССНМДАПАЧКА () Відповідно, нормалізована величина перенесеного заряду PPDA-чутливим компонентом ЗПССНМДАПАЧКА склала 62 ± 8 % контрольної, у той час, як та ж величина для ЗПССНМДАОДИН склала 9 ± 3 %, p<0.003, n=5. Прискорення спаду ЗПССНМДАПАЧКА в присутності PPDA може бути опосередкована (принаймні , частково) також NR2B-мистючими рецепторами. Однак, усунення "надповільної" компоненти (секундного масштабу) ЗПССНМДАПАЧКА також вказує на функціонування NR2D-мистючих рецепторів.

Відповідно до гіпотези спіловеру, внесок переважно екстрасинаптичних NR1/NR2B рецепорів у ЗПСС, викликаного пачкою стимулів, повинний збільшуватися, аналогічно вищезгаданому випадку з NR2D рецепторами.

Рис. Збільшений внесок іфенпродил-чутливого компоненту ЗПССНМДАПАЧКА.

(A) Іфенпродил прискорює спад ЗПССНМДАПАЧКА. Інгибування ЗПССНМДАОДИН (a,b) ЗПССНМДАПАЧКА (7 імульсів, 200Гц c,d). Підтримуваний потенціал на мембрані +50мВ. Нижній ряд: записи нормалізовані.

(B) Нормалізовані величини перенесеного заряду ЗПССНМДАОДИН і ЗПССНМДАПАЧКА зареєстровані в контролі та у присутності іфенпродила.

(C) Внесок іфенпродил-чутливих рецепторів для ЗПССНМДАПАЧКА і ЗПССНМДАОДИН був оцінений за формулою 1-QIFEN/QCONTROL.

(D) Посилення блоку вчиненого іфенпродилом у піку ЗПССНМДАПАЧКА

Справді, затриманий компонент ЗПССНМДАПАЧКА блокується іфенпродилом набагато сильніше, ніж струм у піку ЗПСС (, записи c,d). Нормалізована величина перенесеного заряду, спричиненого іфенпродил-чутливим компонентом ЗПССНМДАПАЧКА склала 39 ± 3 % контрольної, коли відповідна величина ЗПССНМДАОДИН склала 11 ± 2 %, (p<0.001, n=7, , B,C). Слід зазначити, що на противагу конкурентному антагоністу D-AA, неконкурентний антагоніст іфенпродил (30 M) інгібує пік ЗПССНМДАПАЧКА сильніше аніж пік ЗПССНМДАОДИН (40±2% інгібування в порівнянні з 77 ± 4% для одиночних стимулів, p<0,001 n=7) (, D). Це підтверджує наше припущення про збільшення внеску іфенпродил-чутливих рецепторів у пік ЗПСС в умовах збільшення імовірності викиду медіатора.

Таким чином, коротка пачка стимулів, що імітує природні зразки нейрональної активності, збільшує імовірність викиду медіатора, що, у свою чергу, призводить до залучення "повільних" NR2B і NR2D екстрасинаптичних рецепторів у ЗПССНМДА.

Процеси пластичності і високочастотна активність. Ми робили довготривалу потенціацію у зоні CA1 гипокампу, прикладаючи протокол високочастотної стимуляції (ВЧС, - шість 200 Гц пачок з 7 стимулів, що їдуть один за одним через 20 с.), що імітує природну нейронну активність(Dobrunz, 1999) до колатералей Шаффера. Середня посттетанична зміна склала 210 ± 42 % (p<0.01, n=4) для амплітуд популяційних спайків і 161 ± 21 %, (p<0.02, n=5) для амплітуд ЗПССНМДАОДИН. Причому, ЗПССНМДА, викликаний 5Гц пачкою виявляв значне і довготривале (до 90 хв.) уповільнення кінетики спаду, тоді як кінетика ЗПССНМДАОДИН мінялася злегка або залишалася незмінною. Відношення нормалізованих величин перенесеного заряду ЗПССНМДАПАЧКА до ЗПССНМДАОДИН склало 136 ± 13 %, p<0.07, n=5. В контрольних експериментах, при відсутності високочастотної стимуляції, змін кінетики ЗПСС, викликаного пачкою 5 Гц, не спостерігалося. Таким чином, довготривала потенціація, викликана декількома пачками стимулів, супроводжується довготривалим збільшенням внеску екстрасинаптичних рецепторів у ЗПССНМДАПАЧКА .

Синаптичні глутаматні рецептори ізольовані від позаклітинного глутамата. Додавання субмілімолярних концентрацій L-глутамата (200-500 мкМ) на зрізи гипокампу щурів (Р24-26) прзиводило до швидкого і значного пригнічення як ортодромно-, так і антидромно- викликаних популяційних потенціалів дії (12±6%, n=14, 41±7%, n=15, відповідно), що реєструвались у полі СА1 гипокампу, в той же час амплітуда ЗПСС, що реєструвались у нейронах цієї ж зони, зберігалася незмінною. Додавання оптичного ізомеру D-глутамата, що не переноситься системами глутаматного транспорту (СГТ), крім пригнічення популяційних спайків (10±10%, n=5 і 53±9%, n=6 для ортодромних і антидромних спайків відповідно) викликало придушення ЗПСС (57±17%, n=5). Імовірно, екстрасинаптичний глутамат не досягає рецепторів, що знаходяться в постсинаптичній щільності, а впливає тільки на збудливість постсинаптичного нейрона і, таким чином, діє, очевидно, тільки на екстрасинаптичні глутаматні рецептори.

Був проведений наступний експеримент. Зрізи гипокампу інкубувались протягом 15 хвилин у присутності суміші глутамата і необоротного блокатора НМДА каналів МК-801. Антагоніст АМПА рецепторів був присутній у розчині протягом всього експерименту. Оскільки блокування НМДА каналів МК-801 відбувається тільки в тому випадку, коли ці канали відкриті, МК-801 може заблокувати тільки канали, активовані глутаматом. Якщо рецептори, що знаходяться в постсинаптичній щільності, доступні позаклітинному глутамату, додавання МК-801 призвело б до необоротного блоку синаптичних НМДА рецепторів, і наступна стимуляція пресинаптичниих волокон не активувала б НМДА-опосередкований ЗПСС. Однак, після початку стимуляції виявилося, що істотна частина ЗПСС (32±10%, (n=5) зберігається, і, отже, синаптичні рецептори ізольовані від дії позаклітинного глутамату. Коли в аналогічних експериментах замість глутамата був використаний селективний агонист НМДА рецепторів – НМДА, який не зв’язується системами глутаматного транспорту, ЗПСС після початку стимуляції синаптичних входів не активувався (n=7). Останнє, вирогідно, вказує на те, що ізоляція синаптичного простору здійснюється за допомогою СГТ. Перевірка припущення полягала в наступному. Селективний інгібітор GLT-1 підтипу глутаматних транспортерів дігідрокаінат (DHK) викликав значне блокування амплітуди популяційних спайків (49±9, n=5 для антидромных і 23 ±6, n=4 для ортодромных). Глутамат, прикладений на тлі дигидрокаината, призводив, у свою чергу, до помітного блокування амплітуди ЗПСС 58±8%.

Обговорення результатів

Активація екстрасинаптичних рецепторних сайтов. Під час обговорення питання, яким чином пресинаптичне збільшення кількості звільненого медіатора призводить до уповільнення кінетики спаду ЗПССНМДА, слід зазначити, що в роботах Куллмана і співробітників, було виявлено, що НMDA рецептори можуть бути активовані молекулами глутамата, що дифундують із сусідніх синаптичних щілин при везикулярному звільненні нейромедиатора, у той час, як АМПА рецептори не беруть участь в подібній межсинаптичній сигналізації, внаслідок низької спорідненості до глутамату (Patneau, 1990 ;Mіn, 1998). У літературі це явище було названо "спіловер" (англ. spіllover - С.Г.) - переливання глутамату із синаптичної щілини в екстрасинаптичний простір. Подальші дослідження цієї ж групи вчених показали, що дифузія глутамата за межі синаптичної щілини, регулюється системами зворотного захоплення глутамата (Asztely, 1997). Спіловер посилювався в присутності дігідрокаіната, антагоніста насосів зворотного захоплення, але послаблювався при підвищенні температури до фізіологічних значень у результаті більш інтенсивної активності глутаматних транспортерів.

Для перевірки припущення про активацию екстрасинаптичних рецепторів ми застосували аналіз кінетики інгібування ЗПССНМДА блокатором відкритих НМДА каналів MK-801. Експерименти з МК-801 дійсно свідчать про активацію екстрасинптичних НМДА рецепторів, оскільки ці рецептори явно активуються меншими (в порівнянні із синаптичними) концентраціями глутамата.

Оскільки була показана переважно екстрасинаптична експресія NR2B рецепторів на постсинаптичній мембрані, з'явилася можливість одержати додаткові свідчення на користь активації екстрасинаптичних рецепторів в умовах збільшеної імовірності викиду медіатора. Була проаналізована кінетика блокування ЗПССНМДА блокатором MK801 у присутності іфенпродила, селективного інгібітору NR2B рецепторів. Як у випадку з D-AA, "повільний" компонент зникав, що свідчить про те, що рецептори, які активуються малою концентрацією глутамата є екстрасинаптичні.

Дані про те, що НМДА рецептори, що містять суб’одиницю NR2B мають повільну кінетику, а NR2D - кінетику надповільну (час спаду - секунди), змусили нас припустити, що саме активація цих рецепторів обумовлює настільки повільний спад ЗПСС, що був зареєстрований в наших експериментах. Тому, ми звернулися до аналізу кінетики ЗПССНМДА. Потрібно сказати, що внесок помилки фіксації в зміни кінетики ЗПСС не дає можливості надати строгий фізичний зміст чисельним оцінкам зміни кінетики, отриманим в експериментах. Проте, ми виконали якісне порівняння оцінок.

Був проведений експеримент, в якому аналізувався спад ЗПССНМДА в присутності D-AA. Логіка експерименту припускає, що медіатор із синаптичної щілини буде активувати "повільні" NR2B рецептори меншою концентрацією і з затримкою відносно синаптических рецепторів. Додавання конкурентного антагоніста повинно зменшити внесок екстрасинаптичних рецепторів. Порівняння нормалізованого перенесеного заряду ЗПССНМДАПАЧКА в контролі й у присутності D-AA показує прискорення кінетики спаду ЗПСС у присутності D-AA, що говорить про активацію экстрасинаптических рецепторів і підтверджує логіку експерименту. Ми знайшли, що фармакологічні агенти, що блокують переважно “повільнні” НМДА рецептори, значно прискорюють кінетику ЗПССНМДАПАЧКА , у той час як D-CPP, що є найбільш ефективним антагоністом для швидких NR2A/B рецепторів, істотно сповільнює кінетику спаду ЗПССНМДАПАЧКА. При цьому у всіх випадках кінетика ЗПССНМДА, викликаного одиночним стимулом залишалася майже незмінною.

Результати цих експериментів мають дуже важливе значення, оскільки дають подальший розвиток гіпотези спиловера. Дані експерименти - вагоме свідчення на користь того, що саме активація "повільних" рецепторів лежить в основі драматичного уповільнення кінетики ЗПСС.

Перешкодозахищеність синаптичної передачі. Наші дані свідчать про існування нейрональной системи зворотного захоплення (переносники GLT-1 типу), що перешкоджає проникненню глутамата в простір синаптичної щілини ззовні. Однак захисні властивості цієї системи мають межу: 1,6 мМ глутамата інгібують амплітуду ЗПСС наполовину. Оскільки в момент викиду медіатора, його концентрація може досягати декількох мілімолей, малоймовірно, щоб ця система була суттевою перешкодою для витікання глутамата, що був звільнений, за межі синаптичної щілини. Однак, система цілком може служити бар'єром для глутамата екстрасинаптичного, концентрації якого, згідно, наприклад, даним Дж.Клементса, на відстані в 500 нм від місця викиду (середина середньої відстані між синапсами (Ventura, 1999 22 /іd)) ніколи не перевищує 200µМ. Таким чином, переносники GLT-1 типу утворять (напівпровідний) механізм ізоляції синаптичних подій від зовнішніх впливів.

Можна зробити висновок, що взаємодія між активними синапсами (яка виражена в активації НМДА рецепторів при підсумовуванні профілів концентрацій нейромедиатора) відбувається винятково в екстрасинаптичному просторі, не торкаючись процесів передачі інформації, що відбуваються в синаптическом просторі.

Таким чином, спіловер не порушує принцип незалежності синапсів і в той же час збільшує динамічний діапазон синаптического сигналу збільшуючи різницю в постсинаптическом сигналі між сусідніми стимулами.

ВИСНОВКИ

Використовуючи электрофизиологические методи реєстрації нейронной активності (метод фіксації потенціалу, вимір популяционной активності нейронів), ми піддали докладному вивченню явище уповільнення ВПСТ в умовах збільшеної імовірності звільнення медіатора.

1. Показано, що уповільнення кінетики ЗПСС пов'язано з затриманою активацією глутаматних рецепторів. Ступінь уповільнення залежить від сили стимулу, що свідчить про залежність ефекту від кількості активних пресинаптичних нервових волокон. Висунуто гіпотезу про те, що мінімальні концентрації глутамата, що залишає активні синапси, підсумовуються в позаклітинному просторі, активуючи дістальні неактивні синапси. Затримана активація останніх і призводить до уповільнення кінетики ВПСТ.

2. Умовою збільшення постсинаптичного сигналу, вираженого в уповільненні кінетики ЗПСС, є ефекти кооперативності синапсів, що виникають при активації достатньої кількості синапсів і полягають у спільній активації екстрасинаптичних НМДА рецепторів.

3. Кількість активних синапсів залежить від частоти проходження пресинаптичних ПД, а також від числа ПД у пачці. Частка синапсів, що активуються у відповідь на одиночний пресинаптичний потенціал дії мала у порівнянні з загальною кількісттю синапсів і недостатня для виникнення ефектів кооперативності синапсів.

4. Аналіз ролі глутаматного транспорту в синаптичній передачі дозволив знайти, що постсинаптична щільність захищена від позаклітинного простору механізмами зворотного захоплення медіатора GLT-1 типу, що не допускають проникнення низьких концентрацій медіатора в простір постсинаптичної щільності ззовні. Таким чином, місцем кооперативності є винятково екстрасинаптична область позаклітинного простору.

5. Захист синаптичного простору від впливу "сторонніх" молекул медіатора забезпечує специфічність синаптичної передачі в умовах високочастотної активності, допускаючи при цьому спільну роботу синапсів у процесах активації екстрасинаптичних рецепторів.

6. Аналіз кінетики блокування ЗПСС і аналіз кінетики ЗПСС у присутності фармакологічних агентів дозволив з'ясувати механізми збільшення постсинаптичного сигналу в умовах збільшеної імовірності звільнення медіатора. Виявлено, що в основі уповільнення кінетики ЗПСС лежить активація екстрасинаптичних НМДА рецепторів, що маіють дуже повільну кінетикою деактивации в порівнянні із синаптичними рецепторами.

7. Пачкова активність залишає свій слід у нейрональній активності, позначаючись не тільки на амплітуді постсинаптичних струмів, але і на їхній кінетиці. Довготривале уповільнення кінетики ЗПСС, викликаного низькочастотною пачкою (але не одиночним стимулом), очевидно викликане довготривалою активацією екстрасинаптичних НМДА рецепторів.

Доповіді за темою дисертації.

1. Перший установчий з’їзд з клітинної біології. м. Київ, 2004 р.

2. Конференція у Howard Hughes Medical Institute, м. Меріленд, США, 2003 р.

Перелік опублікованих праць за темою дисертації.

1. S. I. Melnik; N. A. Lozovaya; T. Sh. Tsintsadze; S. E. Grebenuk; O. A. Krishtal. Glutamate Postsynaptic Receptors Under The Cap: Strictly Limited Access To Receptors In The Postsynaptic Density By Non-Synaptically Released Glutamate. //Neurophysiology – 2002. т. 34 №2. – с. 102-105.

2. Sergei E. Grebenyuk, Natasha A. Lozovaya, Timur S. Tsintsadze аnd Oleg A. Krishtal. Post-synaptic N-methyl-d-aspartate signalling in hippocampal neurons of rat: spillover increases the impact of each spike in a short burst discharge. //Neuroscience Letters. – 2004. т. 361 № 1-3. – с. 60-63.

3. Natasha Lozovaya, Sergei Melnik, Timur Tsintsadze, Sergei Grebenyuk, Yuri Kirichok and Oleg Krishtal. Protective cap over CA1 synapses: extrasynaptic glutamate does not reach the postsynaptic density. //Brain Research. – 2004. т. 1011 № 2. - с. 195-205.

Гребенюк С.Е. Роль екстрасинаптичних НМДА рецепторів в СА3-СА1 збуджуючій синаптичній передачі у гипокампі щурів. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за фахом 03.00.02. - Біофізика. - Інститут фізіології ім. А.А. Богомольця НАН Украниы, Київ, 2004.

Робота присвячена вивченню механізмів зміни постсинаптического сигналу в умовах високочастотної активності пресинаптичннх СА3 нейронів. При зміні зразка електричної активності пресинаптичного СА3 нейрона від одиночних спайків до коротких високочастотних пачок відбувається істотне збільшення постсинаптичного сигналу, що реєструється в постсинаптичному СА1 нейроні.