НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ФІЗИКО-ХІМІЧНИЙ ІНСТИТУТ ім. О.В. БОГАТСЬКОГО

ГРИШКОВЕЦЬ

Володимир Iванович

УДК 547.918:543.422:582.5/.9

ТРИТЕРПЕНОВI ГЛIКОЗИДИ АРАЛIЄВИХ:

ВИДІЛЕННЯ, ВСТАНОВЛЕННЯ БУДОВИ,

БІОЛОГІЧНА АКТИВНІСТЬ

ТА ХЕМОТАКСОНОМІЧНЕ ЗНАЧЕННЯ

02.00.10 - біоорганічна хімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора хімічних наук

Одеса – 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі органічної хімії Таврійського національного

університету ім. В.І. Вернадського Міністерства освіти і науки України.

Науковий консультант:

доктор хімічних наук, професор

Чирва Василь Якович,

Таврійський національний університет ім. В.І. Вернадського,

завідувач кафедри органічної хімії

Офіційні опоненти:

чл.-кор. НАН України, доктор хімічних наук, професор

Хиля Володимир Петрович,

Київський національний університет ім. Тараса Шевченка,

завідувач кафедри органічної хімії;

доктор хімічних наук, старший науковий співробітник

Макаєв Флюр Зайнутдинович,

Інститут хімії АН Республіки Молдова,

завідувач лабораторії органічного синтезу;

доктор хімічних наук, старший науковий співробітник

Іванов Едуард Іванович,

Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України,

провідний науковий співробітник.

Провідна установа:

Державний науковий центр лікарських засобів НАН та МОЗ України,

лабораторія хімії та технології фенольних препаратів, м. Харків.

Захист відбудеться “ 25 ” червня 2004 р. о 1000 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 41.219.02 при Фізико-хімічному інституті
ім. О.В. Богатського НАН України за адресою: 65080, м. Одеса, Люстдорфська

дорога, 86.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці

Фізико-хімічного інституту ім. О.В. Богатського НАН України.

Автореферат розісланий “ 21 ” травня 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

к.х.н, с.н.с. Литвинова Л.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Тритерпенові глікозиди, або сапоніни, являють собою один з чисельнних класів природних сполук, що належать до вторинних метаболітів складного, інакше, сумішного біогенезу. Значний інтерес до природних тритерпенових глікозидів обумовлений не тільки суто науковою стороною питань вилучення та встановлення структур нових глікозидів, часто з незвичайними структурами вуглеводних чи агліконних частин, використання відомостей щодо розповсюдження визначених глікозидів для рішення проблем відокремлення видів, родів, родин (тобто вирішення хемотаксономічних питань), але й тим, що сапоніни виявляють дуже широкий спектр біологічної активності. Більшість вивчених тритерпенових глікозидів мають той чи інший вид дії на клітинному або організменому рівні in vitro або in vivo. У сапонінів знайдені такі види біологічної активності: антимікробна, фунгіцидна, антибактеріальна, антивірусна, цитотоксична та антиракова, антимутагенна, іхтіотоксична, молюскоцидна, сперміцидна та контрацептивна, інсектицидна, антигельмінтна, діуретична, кардіоваскулярна, протизапальна, антиексудативна, анальгетична, імуномодулююча, адаптогенна, седативна, гіпоглікемічна, антиалергенна та інші, а також алелопатична активність у біоценозах.

Окрім того, сапоніни та екстракти сапоніноносних рослин в останній час все ширше використовуються в комерційних масштабах у харчовій промисловості, сільському господарстві та медицині. Особливе значення для медицини мають знайдені у деяких тритерпенових глікозидів, особливо з Південноамериканської рослини Quillaja saponaria, імуномодулюючі властивості, що широко досліджуються з точки зору можливого використання у вакцинах для людини.

Інтерес до тритерпенових глікозидів рослин родини аралієвих (Araliaceae) значною мірою обумовлений фармакологічними, головним чином стимулюючими центральну нервову систему, та адаптогенними властивостями препаратів на основі женьшеня (Panax ginseng), елеутерококу (Eleutherococcus senticosus), заманіхи (Oplopanax elatus), аралії (Aralia mandshurica), що давно отримали світове визнання, та діючим фактором яких є тритерпенові глікозиди. Розроблені в останній час препарати "Prospan" та "Hedelix" на основі плюща звичайного Hedera helix успішно використовуються при лікуванні гострих та хронічних запалень дихальних шляхів, кашлю та як спазмолітичні засоби. Значний ряд інших рослин родини аралієвих широко використовується у народній медицині при лікуванні різноманітних захворювань, а також займає значне місце у традиційній східній медицині.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження глікозидів проведено у рамках науково-дослідної роботи кафедри органічної хімії Таврійського національного університету ім. В.І. Вернадського за програмами “Вивчення будови і біологічних властивостей вуглеводів і вуглеводовмісних сполук

та біополімерів” (№ держ. реєстрації 0197U001964 – 1996–2000 рр.), за госбюджетними темами “Отримання нових біологічно активних сполук на основі мурамоїлдипептиду та природних тритерпеноїдів” (№ держ. реєстрації 0197U000423 – 1997–1999 рр.) і "Нові біологічно активні речовини на основі мурамоїлдипептиду та природных тритерпеноїдів" (№ держ. реєстрації 234/03 – 2000-2005 гг.). Дослідження виконані також і при частковій фінансовій підтримці Міжнародної Науково-Освітньої Програми (ISEP) (грант № APU073024).

Мета і завдання дослідження. Метою дисертаційної роботи є розробка методів виділення, встановлення структури і біологічної активності тритерпенових глікозидів рослин родини аралієвих (Araliaceae) та встановлення можливості їх використання для вирішення хемотаксономічних завдань в дослідженому ряду.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

· оцінка вивченості тритерпенових глікозидів рослин родини аралієвих, вибір об'єктів та методів дослідження;

· розробка загальних варіантів попереднього ТШХ-аналізу для встановлення груп присутніх тритерпенових глікозидів та методик виділення, очищення та розподілу глікозидів залежно від їх природи;

· виділення тритерпенових глікозидів з ряду видів та різновидностей роду Hedera (H. canariensis, H. caucasigena, H. colchica, H. helix, H. helix var. baltica, H. pastuchovii, H. scotica, H. taurica,), а також з видів та різновидностей інших родів родини аралієвих (Acanthopanax, Aralia, Arthrophyllum, Brassaia, Brassaiopsis, Cussonia, Delarbrea, Dizygotheca, Fatsia, Kalopanax, Meryta, Neopanax, Oreopanax, Polyscias, Pseudopanax, Schefflera, Tetrapanax, Trevesia, Tupidanthus);

· встановлення будови виділених глікозидів комплексом хімічних та фізико-хімічних методів;

· порівняльна якісна та кількісна оцінка вмісту глікозидів у різних органах рослин, у окремих тканинах органів, а також у вікових формах рослин та окремих органів;

· таксономічний аналіз стрівальності тритерпенових глікозидів на рівнях підвидів (різновидностей), видів одного роду, родів та триб родів родини аралієвих;

· виведення хемотаксономічних висновків на основі структурних рис тритерпенових глікозидів (структур вуглеводних та агліконних частин) на рівнях підвидів (різновидностей), виду, родів, триб родів і родини у цілому та порівняння отриманих результатів з існуючими ботанічними системами окремих родів та всієї родини аралієвих;

· порівняльний хемосистематичний аналіз розподілу тритерпенових глікозидів на рівнях споріднених родин, порядків, підкласів та класів вищих рослин з можливими хемотаксономічними та філогенетичними висновками;

· оцінка можливих напрямків хімічної еволюції структур тритерпенових глікозидів в межах родини на підставі аналізу розповсюдження глікозидів у визначених таксонах з урахуванням даних по філогенії родини аралієвих;

· вивчення різноманітних видів біологічної активності (гемолитичної, іхтіотоксичної, цитостатичної, цитотоксичної та цитопротекторної, нейротропної, сперміцидної, антигельмінтної, імуномодулюючої) та оцінка структурних особливостей глікозидів відносно до виявляємих активностей.

Об'єкт дослідження: види рослин родини аралієвих.

Предмет дослідження: тритерпенові глікозиди.

Методи дослідження: одно- та двовимірна тонкошарова хроматографія, препаративна хроматографія, хімічні методи (повний та частковий кислотний гідролізи, лужний та м'який лужний гідролізи, метилування діазометаном, ацетилювання та часткове ацетилювання, деацетилювання, борогідридне відновлення, сульфатування), ферментативні гідролітичні методи, методи спектроскопії ЯМР (1H-ЯМР, 13С-ЯМР, COSY, TOCSY, HSQC, HMBC, ROESY), мас-спектрометрія, ІЧ-спектроскопія.

Наукова новизна отриманих результатів:

· Вперше запропоновано та обгрунтовано використання двомірного ТШХ-анализу та хроматографічних систем з різними рівнями рН для попереднього встановлення груп присутніх тритерпенових глікозидів.

· Вперше доведено ефективність використання оксиду та основного карбонату магнію як ефективних сорбентів для розподілу глікозидів, що відрізняються за кислотністю.

· Вперше для агліконних і вуглеводних фрагментів глікозидів виконані повні та однозначні віднесення сигналів у спектрах 1Н- та 13С-ЯМР.

· Вивчено тритерпенові глікозиди 50 видів з 24 родів родини аралієвих, з котрих 36 видів та 14 родів вивчалися вперше. З досліджених об'єктів виділено та встановлено повні структури 146 нових тритерпенових глікозидів, 16 раніше відомих глікозидів вперше знайдено у видах родини аралієвих.

· Встановлена структура нового тритерпеноїда - 23,27-дигідрокси-бетулінової кислоти, виділеної у вигляді її глікозида. Вперше у рослинах знайдені глікозиди еритродіолу і 30-норхедерагеніну та метилового естера хедерагеніну. У видах родини аралієвих вперше знайдені глікозиди каулофілогеніну та 27-гідроксиурсолової кислоти. Вперше встановлена широка розповсюдженість у родині аралієвих глікозидів эхіноцистової кислоти та глікозидів урсолової кислоти поряд з ізомерними глікозидами олеанолової кислоти.

· Виявлена широка розповсюдженість у видах родини аралієвих ацетильних похідних тритерпенових глікозидів, встановлені місця переважної локалізації ацетильных груп у вуглеводних фрагментах. Вперше у рослинах знайдено ацильний фрагмент транс-кофейної кислоти, а в діацильованих глікозидах – одночасна при-

сутність залишків транс-кофейної та оцтової кислот. У видах деяких родів вперше знайдені 3-сульфати олеанолової та ехіноцистової кислот, 23-сульфат хедерагеніну та їх 28-О-глікозиди.

· У складі тритерпенових глікозидів вивчених рослин знайдені раніше не відомі ди- , три-, тетра- та пентасахаридні фрагменти.

· Запропоновані прості методики синтезу 3- и 23-сульфатів тритерпеноїдів та тритерпенових глікозидів з частковоацетильованими первинноспиртовими групами.

· На підставі даних про структури тритерпенових глікозидів в окремих випадках та аналізу таксономічного розподілу тритерпенових глікозидів показана можливість вирішення таксономічних проблем на різних рівнях (види, роди, триби родів) як родини аралієвих, так і на більш високих таксономічних рівнях – порядків, надпорядків та підкласів квіткових рослин.

· Вперше для роду плющ (Hedera) та родини аралієвих у цілому виконані хемотаксономічні розмежування на підставі структур вуглеводних і агліконних частин глікозидів та проведено порівняння отриманих рішень з ботанічними системами роду плющ і усієї родини аралієвих та показана наявність лише слабких кореляцій між цими двома типами таксономічних рішень.

· Вперше виконана оцінка можливих напрямків еволюції елементів структур тритерпенових глікозидів аралієвих.

· Виявлено структурні элементи тритерпенових глікозидів, що відповідають за наявність гемолитичної активністі, і встановлено зв'язок між гемолітичною та іншими вивченими видами біологічної активності – іхтіотоксичною, антибактеріальною, антифунгальною, антигельмінтною, цитостатичною, сперміцидною, нейротропною, та знайдено найбільш активні глікозиди у кожному виді активності.

· У тритерпенових глікозидів з видів роду Hedera вперше знайдена імуноад'ювантна активність та спроможність викликати як гуморальні, так і клітинні імунні відповіді на різноманітні антигени, включаючи глікопептидні фрагменти імуногенних білків ВІЛ-1, виявлено глікозиди водночас з імуноад'ювантною та ВІЛ-інгібуючою активностями.

Практичне значення одержаних результатів:

· Запатентовано засіб стимулювання гуморальної та клітинної імунних відповідей на цільовий антиген з використанням тритерпенових глікозидів з видів роду Hedera як імуноад'ювантів і показано, що цей винахід може бути використаний для розробки вакцин.

· Один із глікозидів (3-сульфат-28-О--L-рамнопіранозил-(14)-О--D-глюкопіранозил-(16)-О--D-глюкопіранозид олеанолової кислоти), що має як імуноад'ювантні, так і ВІЛ-інгібуючі властивості, відібраний як найбільш перспективний ад'ювант при розробці вакцин для ВІЛ-інфікованих людей. Одержано

позитивні результати з проявом як гуморальної, так і клітинної проліферативної імунних відповідей при дослідженні ад'ювантних властивостей цього глікозиду у експериментальних ДНК-анти-ВІЛ-вакцинах.

· Значний практичний інтерес являє виявлена антифунгальна активність ряду тритерпенових глікозидів відносно до патогенних штамів кандид (Candida spp.). Одержані результати та знайдені найбільш активні глікозиди готуються до патентування як діючі речовини у засобах лікування кандидозів у людей.

· Практичний інтерес мають знайдені сперміцидні та антигельмінтні активності деяких глікозидів, оскільки вони зможуть поширити коло існуючих сперміцидних та антигельмінтних препаратів.

Особистий внесок здобувача полягає у визначенні наукового напрямку, постановці мети та завдань дослідження і знаходження шляхів їх здійснення. Основний об'єм экспериментальної роботи та обробка отриманих результатів, а також узагальнення, заключення та висновки виконані здобувачем особисто. У роботі дисертанта не використовувалися ідеї або будь які розробки, що належать співавторам публікацій. Частина експериментальної роботи з виділення та встановлення будови глікозидів видів родів Hedera, Fatsia та Tetrapanax виконана спільно з власними аспірантами Цветковим О.Я., Толкачовою Н.В., Яковішиним Л.О., Соболєвим Є.О. та Стригуновим В.С.

Структурні дослідження методом ЯМР виконані спільно з д.х.н., проф. Шашковим А.С. (Інститут органічної хімії ім. М.Д. Зелінського РАН, м. Москва) та його аспірантом Качала В.В. Однак більша частина інтерпретацій спектрів та отримання структурної інформації віконано здобувачем особисто.

Оцінка антигельмінтної активності глікозидів виконана д.вет.н. проф. Вишняускасом А. (Вільнюський відділ Інституту гельмінтології ім. К.І. Скрябіна).

Вивчення антибактеріальної, антивірусної, антифунгальної та сперміцидної активностей глікозидів проведено спільно з д.мед.н. Криворутченко Ю.Л. (кафедра мікробіології Кримського державного медичного університету ім. С.І. Георгієвського) та співробітниками кафедри.

Вплив тритерпенових глікозидів на електричну активність нейронів вивчено спільно з д.б.н., проф. Коренюком І.І. (кафедра фізіології людини і тварин Таврійського національного университету ім. В.І. Вернадського) і аспіранткою Костюченко О.В.

Дослідження імунологічної активності глікозидів проведено спільно з к.фарм.н., доц.. Дроздом Г.А (кафедра фармакогнозії Курського державного медичного університету) і аспіранткою Горбачовою Л.О, з д.мед.н. Криворутченко Ю.Л. (кафедра мікробіології Кримського державного медичного університету ім. С.І. Георгієвського) та співробітниками кафедри, зі співробітниками відділу вірусології Шведського інституту з контролю над інфекційними захворюваннями (Швеція, Стокгольм, керівник проекту –Wahren B.).

Вивчення гемолітичної, іхтіотоксичної та цитостатичної активностей глікозидів виконано головним чином самостійно або за участю власних аспірантів.

Автор висловлює глибоку вдячність своїм колегам, які брали участь у проведенні експериментальних досліджень і в обговоренні їх результатів.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені на VIII Всесоюзній конференції з хімії та біохімії вуглеводів (Тбілісі, 1987); на XVI-XIX Українських конференціях з органічної хімії (Тернопіль, 1992, Харків, 1995, Львів, 2001); на Міжнародному симпозіумі з сапонінів у рамках 210-го національного форуму Американського Хімічного Товариства, на Другому, Третьому, Четвертому та П'ятому Міжнародних симпозіумах з хімії природних сполук (Эскішехір, Туреччина, 1996; Бухара, Республіка Узбекістан, 1998; Іспарта, Туреччина, 2001; Ташкент, Узбекістан, 2003); Першому Міжнародному конгресі з алелопатії (Кадіс, Іспанія, 1996); Першій Всеросійській конференції з ботанічного ресурсознавства (Санкт-Петербург, Російська Федерація, 1996); Четвертій Міжнародній конференції з медичної ботаніки (Київ, Україна, 1997); на Міжнародній конференції з природних продуктів та фізіологічно активних речовин (Новосибірськ, Російська Федерація, 1998); Десятому Європейському симпозіумі з вуглеводів "Eurocarb X" (Голуей, Ірландія, 1999); Міжнародному симпозіумі “Сапоніни у їжі, кормах та медичних рослинах” (Пулави, Польща, 1999); на XIII Міжнародній конференції зі СНІДу (Дурбан, Південно-Африканська Республіка, 2000); на III Всеросійській конференції "Нові досягнення ЯМР в структурних дослідженнях (Казань, Російська Федерація, 2000); на 20-м и 21-м Міжнародних симпозіумах з вуглеводів (Гамбург, Німеччина, 2000; Каирнс, Австралія, 2002); на XIX Українській конференції з органичної хімії (Львів, Україна, 2001); на 11-му Європейському симпозіумі з вуглеводів (Лісабон, Португалія, 2001); на XVI Міжнародному симпозіумі з глікокон'югатів (Гаага, Нідерланди, 2001); на Науково-практичних семінарах "Пошук та розробка серцево-судинних засобів" (Алушта, Україна, 2001, Гурзуф, Україна, 2003); на Міжнародній науково-практичній конференції "Нові технології отримання та використання біологічно активних речовин (Алушта, Україна, 2002); на I Міжнародній конференції Молдавського Хімічного Товариства "Досягнення та перспективи сучасної хімії" (Кишинів, Молдова, 2003); на II Міжнародній конференції з колоїдної хімії та фізико-хімічної механіки (Мінськ, Беларусь, 2003).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 58 статтей, 1 патент, 6 публікацій у матеріалах (працях) симпозіумів та конференцій, 79 тез доповідей на симпозіумах та конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацыя складаеться з вступу, восьми роздiлiв, висновкiв, списку використаних джелел, що налiчуе 461 найменування, та трьох додаткiв. Дисертацiя викладана 460 сторiнках машинописного тексту, мiстить 106 таблиць та 19 рисункiв.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обгрунтовано актуальність теми, сформульовано мету та завдання дослідження, відображено наукову новизну та практичне значення одержаних результатів.

У першому розділі (огляді літературних даних) розглянуті основні принципи систематики (таксономії) рослин, основні принципи та обмеження у хемотаксономії рослин, тобто у використанні хімічних ознак для таксономічніх рішень. Дана загальна ботаніко-географічна характеристика родини аралієвих та роду плющ. Виконаний порівняльний розгляд та критичний аналіз основних існуючих систем родини аралієвих та роду плющ. Систематизовані літературні дані щодо тритерпенових глікозидів аралієвих за типами структур їх агліконних та вуглеводних частин та за стрівальністю в межах як окремих родів, так і родині взагалі. Зроблений висновок, що рівень таксономічної специфічності як агліконних, так і вуглеводних частин глікозидів не є постійним та не характеризує якусь визначену таксономічну категорію – вид, рід, триби родів або родину в цілому, хоча структури вуглеводних частин глікозидів порівняльно з агліконними мають більш високу специфічність та більшу діагностичну цінність у якості ознак-індикаторів у вирішенні хемотаксономічних завдань. Зроблений висновок в цілому про нерівномірну та недостатню дослідженість тритерпенових глікозидів родини аралієвих, про необхідність подальшого вивчення якнайбільшого кола як видів зовсім не досліджених родів родини, так і вже частково вивчених видів з метою отримання наукової інформації для хемотаксономічних робіт, а також з метою пошуку нових джерел біологично активних речовин.

У другому розділі (експериментальній частині) вказані джерела отримання рослинного матеріалу, наведені дані про прибори та методики фізико-хімічних методів аналізу, про матеріали та методики аналітичного ТШХ-аналізу та препаративного хроматографічного розподілу глікозидів. Наведені загальні умови (методики) хімічних та біохімічних методів аналізу (повний та частковий кислотний гідролізи, лужний та м'який лужний гідролізи, ферментативні гідролізи, метилування діазометаном, ацетилювання та часткове ацетилювання, деацетилювання, борогідридне відновлення, сульфатування). Описані засоби підготовки рослинного матеріалу, шляхи виділення, розподілу та очищення тритерпенових глікозидів стосовно до їх хімічної природи. Наведені методики визначення різноманітних видів біологічної активності глікозидів.

У третьому розділі розглянуті загальні методи аналізу, виділення та встановлення будови тритерпенових глікозидів, що використовувалися у роботі.

Розглянуто запропоновані засоби первинної якісної оцінки рослинного матеріалу щодо вмісту різних груп тритерпенових глікозидів (моно- та бісдесмозидних, що містять уронові кислоти, сульфатні або ацильні групи) за допомогою двовимірної ТШХ та цілеспрямованим використанням хроматографічних систем з різними рН. Розглянуто запропонований засіб напівкількісного визначення вмісту тритерпенових глікозидів у екстрактах та рослинній сировині на підставі встановленої залежності діаметру хроматографічної зони від маси проби.

Подано розгляд запропонованих оптимальних схем підготовки рослинної сировини, екстракції баластних сполук, суми цільових глікозидів та її очищення від фенольних сполук з урахуванням природи переважаючих глікозидів, а також прийоми хроматографічного розподілу суми глікозидів на вузькі фракцїї та індивідуальні сполуки з використанням різноманітних хроматографічних систем або адсорбентів. Обгрунтовується вперше запропоноване використання оксиду та основного карбонату магнію для розділення тритерпенових глікозидів, які відрізняються за кислотністю.

Обговорюються схеми використання найменьшої кількості хімічних методів (повні та часткові кислотні та лужні гідролізи вихідних глікозидів та їх прогенінів, метилування діазометаном та ін.) для встановлення часткових структур, що потребують мінімальної (декілька міліграмів) кількості глікозидів. Розглянуті можливості використання високоспецифічних ферментативних гідролітичних методів. На глікозидах з встановленою будовою вивчено дію суми глікозидаз із гепато-панкреатичного соку виноградного слимака та встановлена наявність не тільки відомих екзо-глюкозидазної та екзо-глюкуронідазної, а й сульфатазної та естеразної (до ацетильних груп) активностей. Досліджена дія запропонованого ферментативного препарату з листя та насіння видів плющу, що виявив значну та високоселективну активність відносно розщеплення ацилглікозидних зв'язків у виділених з аралієвих тритерпенових глікозидах та відсутність інших (зокрема естеразної до ацетильних груп) видів активності, та показана висока корисність цього препарату в структурних дослідженнях глікозидів при наявності нативиних ацильних груп. Обговорюються можливі обмеження при використанні ферментативних методів, які зумовлені специфічними структурними факторами та числом моносахаридних залишків у вуглеводних ланцюгах.

Обговорюються підходи до встановлення структури тритерпенових глікозидів на підставі одно- та двовимірної спектроскопії ЯМР (одновимірні 1Н і 13С ЯМР-спектри, одновимірні 13С ЯМР спектры з методиками "редагування", одновимірні експерименти за гомо- та гетероядерним подвійним резонансам, за спостереженням ЯЭО, двовимірні експерименти COSY-DQF, COSY+RCT, COSY+2RCT, TOCSY, ROESY, HSQC, HMBC, одновимірний варіант TOCSY – HOHAHA, одновимірний варіант ROESY – CAMELSPIN). На підставі накопичених експериментальних спектральних даних та на конкретних прикладах проаналізовано

принципи отримання структурної інформації (числа, природи моносахаридних залишків, природи та повної структури аглікону, типів та конфігурацій глікозидних зв'язків, місць локалізації вуглеводних ланцюгів у агліконній частині, абсолютної конфігурації моносахаридних залишків, наявності, природи та місць локалізації невуглеводних фрагментів) з одно- та двомірних методик, що використовувалися.

Обговорюються труднощі та обмеження конкретних методик ЯМР у вилученні структурної інформації, та схеми найбільш раціонального сполучення мінімальної кількості одно- та двовимірних методик ЯМР при розв'язанні різних структурних завдань (встановлення структури вуглеводних фрагментів при відомому агліконі, встановлення структури неідентифікованого аглікону, встановлення структури ацильних та інших невуглеводних залишків).

У четвертому розділі розглянуті питання встановлення структур агліконних частин вилучених глікозидів. На підставі попередніх хроматографічних і хімічних методів, а також з використанням комплексу фізико-хімічних методів (ІЧ-, Мас-спектрометрії і головним чином одно- та двовимірних методик ЯМР) встановлено повну хімічну будову агліконних частин, що представлені тритерпеноїдами -аміринового ряду (олеанолова (1), ехіноцистова (2) кислоти, еритродіол (3), хедерагенін (4), каулофілогенін (5) та гіпсогенін (6)), 30-нор--аміринового ряду (норолеанолова кислота (7) та норхедерагенін (8)), -аміринового ряду (урсолова кислота (9), 23-гідроксіурсолова (10) та 27-гідроксіурсолова (11) кислоти) і лупанового ряду (23-гідроксибетулінова (12) та 23,27-дигідроксибетулінова (13) кислоти). |

R1 | R2 | R3 | R

1 | -CH3 | -H | -COOH | 7 | -H

2 | -CH3 | -OH | -COOH | 8 | -OH

3 | -CH3 | -H | -CH2OH

4 | -CH2OH | -H | -COOH

5 | -CH2OH | -OH | -COOH

6 | -CHO | -H | -COOH

R1R2 | R

9 | -CH3 | -СН3 | 12 | -H

10 | -CH2OH | -СН3 | 13 | -OH

11 | -CH3 | -СН2ОH

Вперше для агліконних частин глікозидів виконані повні та однозначні віднесення сигналів атомів 1Н в спектрах ПМР. Окрім того, для агліконних частин з різним типом заміщення виконані повні та однозначні віднесення сигналів атомів 13С в спектрах 13С-ЯМР, що дозволило уточнити або суттєво виправити раніше відомі дані.

У ході роботи встановлена структура раніше не відомого тритерпеноїда – 23,27-дигідроксибетулінової кислоти, виділеного у вигляді його 28-О--L-рамнопіранозил-(14)-О--D-глюкопіранозил-(16)-О--D-глюкопіранозиду.

Рис. 1. Просторова структура тритерпеноїду та схема знайдених кореляцій у спектрі ROESY.

Встановлення будови цього тритерпеноїду було виконано виключно на підставі даних ЯМР-спектроскопії наступним чином. Наявність у низькопольній області 13С-ЯМР спектра сигналів С-атомів карбоксильної групи (175,4 м.ч.) та подвійного зв'язку (150 та 110 м.ч.) дозволило припустити належність тритерпеноїду до лупанового ряду. Аналіз ПМР-спектра у високопольній частині показав наявність у структурі чотирьох метильних груп у четвертинних С-атомів (синглетні трьохпротонні сигнали), а аналіз 13С-ЯМР спектра – трьох гідроксильованих С-атомів, з яких на підставі

даних спектра з АРТ-редагуванням (встановлення числа безпосередньо зв'язаних атомів водню) та відомих величин хімічних зсувів один є С-атомом вторинноспиртової групи (С-3), а два інших належать С-атомам первинноспиртових груп. Зі спектру HSQC (С-Н кореляції через один зв'язок) знайдено положення сигналу Н-3 (як і положення сигналів усіх нижчезгаданих далі Н- або С-атомів за кореляціями с з відповідними С- або Н-атомами). П'ять протонів при С-1, С-2 та С-3 становять замкнуту спінову систему. Сумісний аналіз спектрів COSY (віцинальні Н-Н кореляції) та TOCSY (повні кореляції у ізольованих спінових системах) дозволив виконати повні віднесення сигналів цих Н-атомів. Наявність великої КССВ у сигналі Н-3 (>10 Гц) свідчить про його аксіальну орієнтацію у циклі А. Аналіз кореляційних піків від Н-3 у спектрах ROESY (ядерні ефекти Оверхаузера на просторово близьких Н-атомах) та HMBC (С-Н кореляції через три хімічних зв'язки) дозволив знайти усі С- та Н-атоми у найближчому оточенні. Так, наявність кореляційного піка Н-3 з С-атомом однієї з метильних груп дозволила ідентифікувати її як С-24. Наявність кореляційних піків від знайденого таким чином С-24 з АВ-протонами однієї з первинноспиртових груп дозволила ідентифікувати її як С-23 (СН2ОН). За кореляційними піками від Н-24 знайдені сигнали С-4 та С-5. Наявність від Н-5 кореляційного піка з Н-3 у спектрі ROESY свідчить про його аксіальну орієнтацію у кільці А, а дублет-дублетне розщеплення з великою (>10 Гц) та малою КССВ з протонами Н-6 – і про його аксіальну орієнтацію у кільці В, та транс-з'єднання циклів А/В.

У спектрі НМВС від протону Н-5 спостерігаються кореляційні піки з С-4 і С-24, а також з одним четвертинним С-атомом, С-атомом ще однієї метильної групи та двома С-атомами метиленових груп, що були ідентифіковані, відповідно, як С-10, С-25, С-6 та С-7. Відповідні протони Н-6,6' та Н-7,7' були знайдені сумісним аналізом спектрів HSQC та COSY (від протону Н-5). Ці протони також утворюють ізольовану спінову систему, що додатково підтверджено спектром TOCSY. Протони метильної групи (Н-25) у спектрі НМВС мають кореляційні піки з С-1, С-5 та С-атомом метинової групи, що дозволяє віднести його як атом С-9. З цим же атомом мають кореляційний пік протони іншої метильної групи, що дозволяє ідентифікувати її як С-26. Це додатково підтверждується кореляційним піком Н-26/С-7.

Метильні групи С-25 та С-26 займають у кільці В аксіальні положення, що підтверджується наявністю кореляційних піків у спектрі ROESY між протонами цих груп та протонами кожної з них і аксіальним протоном Н-6. Для атомів Н-26 у спектрі НМВС спостерігаються також і кореляційні піки з двома четвертинними С-атомами, для одного з яких є кореляційний пік з екваторіальним Н-6. Останній, звісно, є атомом С-8, а перший – С-14. Для цих атомів спостерігаються і кореляції з АВ-протонами другої первинноспиртової групи, що дозволило ідентифікувати її як аксіальну СН2ОН групу (С-27). Це додатково підтверджуется наявністю кореляційного піку між одним з атомів Н-27 та аксіальним Н-7 у спектрі ROESY.

Повні віднесення сигналів С- та Н-атомів (11, 12, 13) у циклі С було виконано аналізом спектрів COSY, TOCSY та HSQC, починаючи з протона Н-9. Ключовим

фактом для встановлення транс-з'єднання кілець С/D був доказ аксіального положення протона Н-13, що доведено наявністю великої КССВ з одним із Н-12, дуже інтенсивним кореляційним піком з С-27 у спектрі НМВС завдяки великій трансоїдній (s-trans) КССВ та наявністю кореляційного піка з протонами аксіальної метильної групи (С-26) у спектрі ROESY.

Для доказу транс-типу з'єднання кілець D/E було встановлено аксиальне положення протона Н-18, що підтверджується наявністю великої КССВ (>10Гц) з Н-13, та інтенсивного крос-піка з протонами Н-27 аксіальної СН2ОН групи. З іншого боку, Н-18 має й велику КССВ з Н-19, що визначав аксіальне положення Н-19 у циклі Е. Наявність лише одного протону у С-19 свідчить про імовірну присутність у цього атому ізопропенільної групи, що було точно доведено наявністю крос-піка Н-19 у спектрі ROESY з протонами останньої невіднесеної метильної групи (С-30) та одним з протонів при sp2-гібридному С-атомі (С-29), та крос-піка у спектрі НМВС між протонами Н-29 і С-19 та С-30. Далі аналізом спектрів COSY, TOCSY та HSQC, починаючи з протона Н-19, було виконано віднесення сигналів інших Н- та С-атомів кільця Е (21 та 22).

Оскільки атом С-28 карбоксильної групи у спектрі НМВС має кореляційні піки лише з трьома протонами, з яких два є вищезнайденими протонами Н-22, то протон, що залишився, належить до аксіального Н-16 з кільця D. Він входить до чотирьохспінової системи Н-15,15'–Н-16,16'. Сигнали цих атомів було віднесено аналізом спектрів COSY та TOCSY. Таким чином, завершується повне віднесення сигналів усіх С-та Н-атомів та доказ належності агликону до лупанового ряду, а саме, як 3,23,27-тригідроксилуп-20(29)-єн-28-ова кислота, або 23,27-дигідроксибетулінова кислота, що є новим тритерпеноїдом.

Відомі тритерпеноїди – еритродіол та 30-норхедерагенін вперше у вигляді глікозидів знайдені у рослинах. Каулофілогенін та 27-гідроксіурсолова кислота у якості агліконів вперше знайдені у складі тритерпенових глікозидів рослин родини аралієвих.

У п'ятому розділі розглянуті питання встановлення структур вуглеводних частин глікозидів, структур невуглеводних фрагментів та повних структур виділених глікозидів.

Встановлення структур вуглеводних частин виділених глікозидів та місць їх приєднання до агліконних частин було здійснено за допомогою хімічних методів та головним чином спектроскопії ЯМР. Хімічні гідролітичні методи дозволяли встановити вуглеводний склад глікозидів (повний кислотний гідролиз), послідовність з'єднання моносахаридних залишків (частковий кислотний гідролиз), місця локалізації вуглеводних ланцюгів (лужний гідролиз). Біохімічні (ферментативні) методи дозволяли встановити наявність кінцевих залишків глюкопіранози, отримати нативні (з ацильними групами) прогеніни та вуглеводні ланцюги, що приєднані до аглікону ацилглікозидним зв'язком. Після використання

хімічних та біохімічних методів різноманітні варианти спектроскопії ЯМР дозволяли встановити повну структуру глікозидів. Вкажемо лише найбільш оптимальну послідовність у використанні методик ЯМР при встановленні повних структур вуглеводних фрагментів (та місць їх локалізації у агліконних частинах):

а) встановлення загального числа моносахаридних залишків за числом сигналів аномерних С-атомів в області 95-109 м.ч. спектра 13С-ЯМР;

б) знаходження дублетних сигналів аномерних атомів водню моносахаридних залишків в області 4,6–6,3 м.ч. спектра 1Н-ЯМР;

в) аналіз двовимірного спектра HSQC та знаходження кореляцій між відповідними аномерними протонами та атомами вуглецю;

г) аналіз двовимірного спектра TOCSY (від хімічних зсувів аномерних протонів або протонів Н-6 залишків рамноз) и виявлення протонних сигналів кожного моносахаридного залишку;

д) сумісний аналіз двовимірних спектрів TOCSY и COSY та виконання віднесень сигналів скелетних протонів кожного моносахаридного залишку;

е) аналіз перетинів спектра TOCSY та встановлення мультиплетності і величин КССВ сигналів протонів моносахаридніх залишків, та встановлення на цій основі природи моносахаридних залишків і конфігурації глікозидних зв'язків;

ж) сумісний аналіз спектрів HSQC і TOCSY та виконання віднесень сигналів С-атомів моносахаридних залишків, аналіз величин хімічних зсувів С-атомів у порівнянні з даними для незаміщених моносахаридних залишків та виявлення ефектів заміщення, встановлення природи замісника завдяки кількісній оцінці - та -ефектів заміщення;

з) сумісний аналіз спектрів ROESY і TOCSY та знаходження міжглікозидних крос-піків від аномерних протонів Н-1 для підтвердження типів глікозидних зв'язків та встановлення послідовності у з'єднанні моносахаридних залишків;

и) сумісний аналіз спектрів HMBC та HSQC зі знаходженням у спектрі HMBC міжглікозидних крос-піків через три зв'язки від аномерних Н-1 та аномерних С-1 атомів для додаткового підтвердження типів глікозидних зв'язків та послідовностей з'єднання моносахаридних залишків.

Встановлення місць приєднання вуглеводних ланцюгів до аглікону на основі даних ЯМР-спектроскопії проводилось наступним чином:

а) аналіз спектра HSQC и встановлення ефектів глікозилювания на агліконних С-атомах у порівнянні з незаміщеним агліконом;

б) сумісний аналіз спектрів ROESY і HSQC та знаходження крос-піка між сигналом аномерного протону одного з моносахаридних залишків та протоном Н-3 або Н-23 агліконної частини глікозиду;

г) сумісний аналіз спектрів HMBC і HSQC та знаходження крос-піків крізь три зв'язки між сигналами аномерних протонів моносахаридних залишків та атомами вуглецю (С-28, С-3 или С-23) агліконної частини глікозиду.

У таблиці 1 наведено встановлені структури вуглеводних частин глікозидів та місця їх локалізації у агліконних частинах.

Таблиця 1

Структури вуглеводних фрагментів

у виділених глікозидах рослин родини Araliaceae

Вуглеводний

фрагмент | Атом

аглікону | Вуглеводний

фрагмент | Атом

аглікону

Xyl | 3 | Glc4GlcUA | 3

Ara | 3 | Glc2GlcUA | 3

Glc | 3; 23; 28 | Gal2GlcUA | 3

GlcUA | 3 | Xyl3Rha2Ara | 3

Rha2Xyl | 3 | Rha4Glc6Glc | 28

Rha2Ara | 3 | [Glc4]-[Rha2]-Ara | 3

Glc2Ara | 3 | [Glc3]-[Gal2]-Ara | 3

Gal2Ara | 3 | Glc2Gal2GlcUA | 3

Glc3Ara | 3 | [Araf4]-[Gal2]-GlcUA | 3

Rha2Glc | 3 | [Araf4]-[Gal2]-GlcUA | 3

Glc2Glc | 3 | [Araf4]-[Gal2]-GlcUA | 3

Gal2Glc | 3 | Glc4Xyl3Rha2Ara | 3

Glc6Glc | 28 | [Rha4Glc4]-[Rha2]-Ara | 3

Araf4GlcUA | 3 | Rha4Glc6Glc4Rha2Ara | 3

Xyl4GlcUA | 3

Відомі вуглеводні фрагменти Rha2Xyl, Gal2Ara, Gal2Glc та Glc4Xyl3Rha2Ara вперше знайдені у глікозидах рослин родини аралієвих. У виділених глікозидах встановлені структури розгалужених три- та тетрасахаридних фрагментів [Glc3]-[Gal2]-Ara и [Rha4Glc4]-[Rha2]-Ara, що раніше не зустрічалися, та лінійного пентасахаридного фрагменту Rha4Glc6Glc4Rha2Ara. Вперше у рослинах родини аралієвих знайдені глікозиди з залишком глюкопіранози у гідроксильній групі у С-23 атому залишка хедерагеніну.

У деяких виділених глікозидів встановлено наявність одного або двох залишків карбонових кислот, що ацилюють вуглеводні ланцюги. За допомогою хімічних, фер-

ментативних методів та ЯМР-спектроскопії встановлена будова ацильних фрагментів, що є залишками оцтової та транс-кофейної кислот. Наявність залишку кофейної кислоти у деяких виділених глікозидах було доведено наступним чином. Глікозиди легко метилувалися ефірним розчином діазометану з утворенням диметилових етерів фенолів за даними інтегральної інтенсивності та величинами хімічних зсувів сигналів метоксильних протонів у ПМР-спектрах. У спектрі 13С-ЯМР порівняно з дезацетильованим глікозидом додатково спостерігалися сигнали одного С-атома карбоксильної групи, що спряжена з кратним зв'язком або ароматичним кільцем та сигнали ще восьми sp2-гібридних С-атомів. За спектром 13С-ЯМР з АРТ-редагуванням три з цих атомів є четвертинними, а решта – третинними (у складі СН-груп).

У ПМР-спектрі було знайдено два однопротонних дублетних сигнали при 6,63 и 7,97 м.ч. зі спільною КССВ 16 Гц. Аналіз спектра COSY підтвердив наявність між ними спін-спинової взаємодії та те, що вони становлять ізольовану спінову систему, оскільки не мають крос-піків з якимись іншими протонами. На основі спектру HSQC знайдені і відповідні їм сигнали вуглецевих атомів. Аналіз величин хімічних зсувів сигналів цих С- та Н-атомів та величини КССВ дозволив вирішити, що вони становлять несиметрично заміщений транс-олефіновый фрагмент R–СН=СН–R', де додатковими радикалами є карбоксильна група та ароматичне кільце з двома фенольними гідроксильними групами.

Дві групи сигналів у ПМР-спектрі метилового ефіру глікозида при 7,19 (двопротонний мультиплет) та однопротонний дублет при 6,91 м.ч. з КССВ 9,0 Гц за даними спектра COSY мають спільний крос-пік та також становлять ізольовану спинову систему. Оскільки усі ці протони за величиною хімічного зсува безумовно належать ароматичним протонам, то характер розщеплення протону при 6,91 м.д. та величина КССВ дозволяють визначити, що один із протонів при 7,19 м.ч. розташований відносно до нього у орто-положенні (Jорто 9,0 Гц), а другий – у пара-положені (Jпара0 Гц). Для остаточного встановлення структури ацильного фрагменту було проаналізовано двовимірний спектр HMBC що дозволяє простежити кореляції між вуглецевими та водневими атомами через три хімічних зв'язки.

Від сигналу карбоксильного С-атома при 167,4 м.ч. у спектрі HMBC простежено крос-піки з протонами при кратному зв'язку – інтенсивний з протоном при 7,97 м.ч. та значно слабкіший – з протоном при 6,63 м.ч., що дозволило ідентифікувати їх як протони у - та -вуглецевих атомів, відповідно, оскільки у спектрі HMBC найбільш ефективно спостерігаються кореляції через три хімічних зв'язки. Від -протона простежено інтенсивний крос-пік з четвертинним С-атомом при 127,9 м.ч. , що дозволяє ідентифікувати його як атом С-1 ароматичного кільця. Далі від -протона простежено інтенсивні крос-піки з третинними С-атомами при 111,1 та 123,3 м.ч., що є атомами С-2 и С-6 ароматичного кільця. Від протонів при цих атомах (7,19 м.ч.) у спектрі HMBC спостерігається крос-пік з одним четвертинним С-

атомом при 152,1 м.ч., що, безумовно, є атомом С-4 з фенольним гідроксилом. Далі від знайденого сигналу атома С-1 ароматичного кільця спостерігається крос-пік з протоном при 6,91 м.ч., що є атомом Н-5. Від протону Н-5 знайдено крос-пік з четвертинним С-атомом при 150,1 м.ч., що дозволяє ідентифікувати його як атом С-3 з фенольним гідроксилом. Від протону Н-5 спостерігається також слабкий крос-пік (через два зв'язки) з атомом С-6 при 123,3 м.ч. Це дозволило уникнути первинної неоднозначності у взаємному віднесенні сигналів атомів С-2 і С-6, що виникала завдяки близькості сигналів відповідних протонів. Наявність крос-піиків через три з'язки від сигналів протонів метоксильних груп (при 3,81 і 3,74 м.ч.) з четвертинними С-атомами при 150,1 і 152,1 м.ч. додатково підтверджує їх зв'язок з метоксильними групами та їх віднесеня до атомів С-3 і С-4. Таким чином, метильований ацильний фрагмент є залишком (Е)-3-(3,4-диметоксифеніл)-2-пропенової кислоти, інакше транс-3,4-диметоксикоричної кислоти:

Оскільки у нативному неметильованому глікозиді не спостерігається сигнал фенольної метоксильної групи, це виключає можливі версії про наявність ферулової або ізоферулової кислот (монометилові ефіри коричної кислоти у фенольних гідроксильних груп) та дозволяє однозначно встановити нативний ацильний фрагмент як залишок транс-кофейної кислоти.

На підставі аналізу ефектів ацилювання у порівнянні з неацильованими глікозидами (від +0,5 до +1,5 м.ч.на -Н атомах, від +1,5 до +3,5 м.ч на -С-атомах. та від –2,0 до –3,5 м.ч.на -С-атомах) та з огляду на знаходження крос-піків у спектрі НМВС між сигналом карбонільного С-атому залишку ацилюючої карбонової килоти та скелетним протоном С-атома, що містить О-ацильну групу, встановлено місця приєднання ацильних груп до вуглеводних частин – за гідроксильними групами у С-2, С-3 або С-4 залишку арабінопіранози, що зв'язана з С-3 атомом аглікону, за гідроксильними групами у С-6 внутрішнього залишку глюкопіранози або за гідроксильними групами у С-2, С-3 або С-4 кінцевого залишку рамнопіранози у трисахаридному фрагменті Glc6Glc4Rha у карбоксильній групі аглікону для залишків оцтової кислоти та у гідроксильній групі С-6 кінцевого залишку глюкопіранози у тетрасахаридному фрагменті Glc4Xyl3Rha2Ara для залишку кофейної кислоти.

У таблиці 2 наведено встановлені структури нативних частково ацильованих вуглеводних частин глікозидів та місця їх локалізації у агліконних частинах.

Таблиця 2

Структури ацильованих вуглеводних фрагментів

у виділених глікозидах рослин родини Araliaceae

Вуглеводний фрагмент | Атом аглікону

AcO2Ara | 3

AcO3Ara | 3

AcO4Ara | 3

CaffO6Glc4Xyl3Rha2Ara | 3

Glc6(Glc6OAc)4Rha | 28

Glc6Glc4Rha2OAc | 28

Glc6Glc4Rha3OAc | 28

Glc6Glc4Rha4OAc | 28

Glc6(Glc6OAc)4Rha2OAc | 28

Glc6(Glc6OAc)4Rha3OAc | 28

Glc6(Glc6OAc)4Rha4OAc | 28

Моноацетильовані AcO3Ara, Glc6Glc4Rha4OAc та