НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН І ГЕНЕТИКИ

Жук Ольга Іванівна

УДК 632.112:581.143:633.11:633.15

КІНЕТИКА РОСТОВИХ ПРОЦЕСІВ ПШЕНИЦІ І КУКУРУДЗИ В

УМОВАХ ВОДНОГО ТА ВИСОКОТЕМПЕРАТУРНОГО СТРЕСІВ

03.00.12 – фізіологія рослин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті фізіології рослин і генетики НАН України, м.Київ

Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор,

член-кореспондент НАН України

Григорюк Іван Панасович

Інститут фізіології рослин і генетики НАН України

завідувач відділу фізіології водного режиму рослин

Офіційні опоненти:- доктор біологічних наук Яворська Вікторія Казимирівна

Інститут фізіології рослин і генетики НАН України,

завідувач відділу фізіології росту і розвитку рослин

- доктор біологічних наук, професор,

член-кореспондент НАН України

Кордюм Єлизавета Львівна

Інститут ботаніки ім. М. Г. Холодного НАН України,

завідувач відділу клітинної біології та анатомії

- доктор біологічних наук, професор, академік УААН

Гудков Ігор Миколайович

Національний аграрний університет Кабінету Міністрів

України, завідувач кафедри радіобіології і радіоекології

Провідна установа: Селекційно-генетичний інститут-Національний центр

насіннєзнавства та сортовивчення УААН

Захист дисертації відбудеться “21 “ жовтня 2004 р. о 10 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 26.212.01 Інституту фізіології рослин і генетики

НАН України за адресою: 03022, Київ-22, вул. Васильківська, 31/17.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту фізіології рослин і

генетики НАН України за адресою: 03022, Київ-22, вул. Васильківська, 31/17.

Автореферат розісланий “16 ” вересня 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Мордерер Є.Ю.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Вода і температура забезпечують реалізіцію життєвого циклу рослин. Затримка росту за дії дефіциту води і високих температур призводить до втрат урожаю, тому проблема жаро-посухостійкості пшениці та кукурудзи залишається актуальною в Україні [Шматько, Григорюк, 1992, Ляшок, 1991, 2002, Григорюк, 1996, Таран, 2000]. Вона вивчається на всіх рівнях організації рослинного організму і належить до найважливіших загальнобіологічних проблем [Пустовойтова, Жолкевич, 1992, Zhu, Xiong, 2001, Eckardt, 2001, Lichtenthaler, 1996, Ситник, Мусатенко, 1998, Кордюм, Ситник, 2001, Кордюм, 2003].

Ріст є чутливим до посухи і високих температур [Генкель, 1979, Удовенко, 1979, Levitt, 1980, Trewavas, 1982, Pitman, 1986, Hampson, Simpson, 1990, Srivastava, Strasser, 1996, П’янков та ін., 2000]. Встановлено кореляційний зв’язок між масою і розмірами, активністю фотосинтетичного апарату, метаболізмом, транспортом асимілятів та продуктивністю злаків [Голик, Гуляєв, 1981, Гуляєв, 1981, Кан, 1984, Кефелі, 1978, Мілторп, 1980, Ничипорович, 1980, Курсанов, 1984, Мокроносов, 1983, Kriederman, 1986, Raven, 2001]. Однак ростові процеси на рівні поділу та розтягнення клітин частково вивчені лише для первинних коренів, листків дводольних, гіпокотилів, стеблових апексів окремих культур [Clowes, 1982, Иванов, 1987, Иванов, Максимов, 1999, Maksymowych, 1990, Schiefellein, Benfey, 1991, Granier, Tardieu, 1999].

Ріст пшениці і кукурудзи здебільшого досліджували за наростанням маси та площі асиміляційної поверхні в період формування генеративних органів [Schulze, 1986, Chasan, Walbot, 1993, Frensch, 1997]. Проте закладання головних тканин і органів рослин здійснюється на вегетативній стадії онтогенезу [Куперман, 1977, Белоусов, 1983, McKersie, Tomes, 1980, Hegarty, Ross, 1981]. Критичними тканинами цього періоду є меристеми, репопуляційні механізми відновлення яких вивчали на прикладі первинних коренів після дії на них іонізуючого опромінювання, хімічних сполук, регуляторів росту [Гродзинский, 1980, 1983, Гудков, 1985, Иванов, 1987, Троян, 1998, Яворська та ін., 1999]. Ріст клітин інтактних рослин злаків, взаємодія первинних і вторинних меристем, зон розтягнення, їх часово-просторова координація, самоорганізація під час дії й післядії посухи та високих температур майже не досліджені. Відомі фрагментарні, неоднозначні, феноменологічного характеру дані для коренів і листків дводольних, першого листка пшениці за дії незначного дефіциту води та високої температури [Murin, 1979, Мусієнко, Харламов, 1993, Ben Hai Salan, Tardieu, 1995, 1997, Brecale et al. 1997, Durand et al., 1995, Granier, Tardieu, 1998, 1999, Недуха, 2001]. Відсутність комплексних досліджень кінетики ростових процесів пшениці і кукурудзи ускладнює оцінку дії водного та високотемпературного стресів на продуктивність рослин.

Жаро- і посухостійкість пшениці та кукурудзи вивчались в періоди формування генеративних органів й урожаю [ Жолкевич та ін., 1989, Генкель, 1978, Мусієнко та ін. 1985, Шматько, Григорюк, Шведова, 1989], а у ювенільних рослин досліджена слабо [Задонцев и др., 1968, Hsiao, 1973, Ross, Hegarty, 1979], але значимість цього періоду для забезпечення продуктивності рослин сумніву не викликає. Тому наші дослідження були сконцентровані саме на вивченні жаро- посухостійкості проростаючого насіння, проростків, а також ювенільних рослин пшениці і кукурудзи в період дії й післядії посухи та високих температур.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. В основу дисертаційної роботи покладені результати, отримані автором при виконанні розділів планів за бюджетними темами відділу фізіології водного режиму рослин Інституту фізіології рослин і генетики НАН України: “Вивчення водообміну рослин при слабких і екстремальних стресах з метою його оптимізації” (1981-1985 рр. № д.р.81015993), “Вивчення адаптивних механізмів водообміну рослин для оптимізіції продукційного процесу” (1985-1990 рр. № д.р.01.86.0006645), “Вивчення генотипної регуляції водообміну рослин при водному і температурному стресах” (1991-1995 рр. № д.р. 01.9.10 019959), “Дослідження впливу водообміну на адаптивний потенціал рослин в посушливих умовах” (1996-2000 рр., № д.р.0199U000044), “Вивчення механізмів регуляції посухостійкості рослин в нестабільному середовищі” (2001-2005 рр. № д.р.0101U000629), затверджених постановами Президії НАН України.

Мета і задачі дослідження. Головною метою даної роботи було з’ясування часово-просторової координації і самоорганізації ростових процесів на прикладі пшениці й кукурудзи на клітинному та організменному рівнях; вивчення впливу синтетичних аналогів фітогормонів і комплексних регуляторів росту на кінетику росту пшениці та кукурудзи; розробка методів оцінки стійкості пшениці до посухи і високих температур на ювенільних етапах розвитку.

Для досягнення зазначеної мети були поставлені наступні задачі:

·

·

·

·

·

·

·

·

Об’єкт досліджень - самоорганізація і часово-просторова координація ростових процесів на клітинно-організменному рівні у рослин пшениці й кукурудзи на ювенільних етапах їх розвитку за дії посухи та високих температур.

Предмет досліджень – проліферація, розтягнення, взаємодія, самоорганізація, координація і інтеграція клітин в ростовій реакції інтактних рослин пшениці й кукурудзи за дії водного та високотемпературного стресів.

Методи досліджень – системний підхід для кількісної оцінки ростових процесів рослин, методи мікрорадіоавтографії з залученням специфічного міченого попередника ДНК 3Н-тимідину, гістохімічні, цитологічні та фізіологічні методи. Використано метод Бокса-Уілсона для експериментального моделювання відносного внеску окремих складових дії водного стресу на односпрямований ріст кореня пшениці та кукурудзи.

Наукова новизна одержаних результатів. Встановлено, що в період дії і післядії водного стресу й високих температур відбувається часово-просторова координація процесів поділу, а також розтягнення клітин у інтактних рослин пшениці та кукурудзи. Вперше встановлено пороговість дії посухи на проліферацію і критичні рівні обводнення меристем для зупинки та запуску руху клітин по мітозу. Виявлено зв’язок між швидкістю відновлення проліферації клітин після припинення дії стресу і посухостійкістю сортів пшениці й гібридів кукурудзи, тривалістю та напруженістю дії факторів посухи. Експериментально доведено вищу чутливість проліферації порівняно з розтягненням клітин інтактних рослин кукурудзи і пшениці до дії водного та високотемпературного стресів на вегетативній стадії розвитку. Отримано мікрорадіоавтографи міченої ДНК ядер клітин листкових меристем кукурудзи та пшениці.

Вперше встановлено зв’язок між розміром популяцій клітин зон проліферації і розтягнення, кінетикою інтегрального росту інтактних рослин пшениці й кукурудзи та кількістю втраченої ними води під час посухи. Введено поняття потужності та фракціонування дози дії водного стресу на інтактні рослини. За допомогою методів регресійного аналізу з’ясовано, що виживання і відновлення меристеми кореня кукурудзи залежить від величини водного дефіциту тканин. Виявлено три типи ростової реакції первинного кореня на водний стрес: зупинка росту, монотонне відновлення та автоколивальне порушення рівноваги в системі. Встановлено, що в період росту листків пшениці і кукурудзи в колеоптилі проліферативні процеси лімітує обводнення меристем, а у рослин з сформованими фотосинтезуючими листками – величина водного дефіциту листкової пластинки. Показано, що водозатримна здатність меристем пагонів до виходу листків з колеоптиля корелює з фізіологічною посухостійкістю сортів пшениці.

З’ясовано характер кінетики односпрямованого лінійного росту на вегетативній стадії рослин пшениці і кукурудзи після дії синтетичних цитокінінів й ауксинів, водного та високотемпературного стресів. Доведено чутливість критерію відносного лінійного приросту для оцінки флуктуацій росту і дії водного й високотемпературного стресів на рослини кукурудзи та пшениці. Показана протекторна і коригуюча роль азотного живлення, синтетичних аналогів фітогормонів для проліферації й росту клітин, проростання насіння, підвищення стійкості озимої пшениці та кукурудзи до високої температури. Встановлено, що замочування насіння у водних розчинах синтетичних цитокінінів і ауксинів й комплексних регуляторів росту підвищує стійкість, стимулює ріст, життєздатність рослин пшениці та кукурудзи у післястресовий період.

Практичне значення одержаних результатів. Вперше проведено комплексний скринінг сортів і ліній пшениці, гібридів й ліній кукурудзи на посухо- та жаростійкість в період ювенільних етапів онтогенезу.

Запропоновано збагачення насіння пшениці і кукурудзи перед посівом синтетичними цитокінінами й ауксинами в мономерній та полімерній формах для зменшення негативної дії посухи на ювенільні рослини. Встановлено ефект стимуляції ростових процесів в пагонах та коренях рослин у післястресовий період. Для підвищення жаростійкості озимої пшениці рекомендовано додаткове підживлення рослин азотом на вегетативній стадії розвитку. Для підсилення енергії проростання, схожості насіння кукурудзи і пшениці в умовах недостатнього зволоження й високої температури середовища запропоновано допосівне замочування насіння пшениці та кукурудзи у водних розчинах ПС-К, ПС-А-6. Результати роботи обгрунтовують можливість використання регуляторів росту (Гарт, Дімекс, триман 1, етамон і гумат калію) для підвищення стійкості проростків озимої пшениці до високотемпературного стресу.

Вперше розроблено способи оцінки жаро- і посухостійкості сортів озимої пшениці, які захищено деклараційними патентами України № 42371 А від 15.10.2001, № 45097А від 15.03.2002, № 45768 А від 15.04.2002, № 45879 А від 15.04.2002 та запропоновано використовувати в селекційній роботі.

Теоретичні розробки даної проблеми використовуються при викладанні нормативного курсу “Фізіологія рослин” і спецкурсів “Стійкість рослин” та “Ріст і розвиток рослин” на біологічних факультетах вузів України.

Особистий внесок здобувача. Робота виконана автором особисто. Дисертантом самостійно здійснено інформаційний пошук та оцінку літературних даних, визначено мету, завдання та об’єкти досліджень, сплановано та виконано експерименти, проведено аналіз, інтерпретацію і узагальнення, самостійно або у співавторстві написано статті. Теоретичні та експериментальні ідеї дисертації належать автору.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертації були представлені на Всесоюзному симпозіумі ”Физиолого-биохимические механизмы ругуляции адаптивных реакций растений и фитоценозов” (Кишинев, 1984), Другій Всесоюзній нараді по фізіології кукурудзи ”Физиолого-биохимические основы продуктивности кукурузы“ (Днепропетровск, 1984), Всесоюзній конференції “Клеточный цикл растений” (Канев, 1981), Всесоюзній конференції “Регуляция клеточного цикла растений” (Чернигов, 1983), Всесоюзній конференції “Клеточный цикл и рост ратений” (Ужгород, 1989), Другому з’їзді Українського товариства фізіологів рослин (Київ, 1993), ”From molecular mechanisms to the plant. An integrated approach,” 10th FESPP Congress, (Florence, 1996), Міжнародній конференції по анатомії і морфології рослин, присвяченій 150-річчю від дня народження І.П.Бородіна (Санкт-Петербург, 1997), Міжнародній конференції “Онтогенез рослин в природному та трансформованому середовищі” (Львів, 1998), Міжнароднії науковій конференції “Регуляция роста, развития и продуктивности растений” (Минск, 1999), (European Society for New Methods in Agricultural Research) XXX1 Annual Meeting, 2001), III Міжнародній науковій конференції “Регуляция роста, развития и продуктивности растений” (Минск, 2003).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 46 наукових праць, в тому числі одна монографія, 26 статей у провідних фахових виданнях, 4 деклараційні патенти України на винаходи.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, 6 розділів, узагальнення результатів досліджень, висновків. Список цитованої літератури містить 576 джерел. Дисертація викладена на 350 сторінках, ілюстрована 66 таблицями та 126 рисунками.

МАТЕРІАЛИ, УМОВИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Об’єктами досліджень обрано рослини з односпрямованим типом росту – пшеницю і кукурудзу, для яких характерна компактна локалізіція меристем, часово-просторове розділення проліферації та розтягнення клітин. Як тест-об’єкт використовували м’яку гексаплоїдну пшеницю, озиму і яру (Triticum aestivum L.) степового та лісостепового екотипів. З сортів лісостепового екотипу в дослідах було використано Збруч, Лютесценс 7, Киянку, Поліську 90, Білоцерківську 47, Миронівську 808, Миронівську 61, Ровенську 31, Ровенську 14, Мартен-Вашері 16-85, Поліську 87 та лінії УК 4, УК 04, УК 01, УК 29. З сортів степового екотипу - Одеську 51, Одеську 66, Одеську 117, Альбатрос одеський, Вимпел одеський, Одеську напівкарликову, Лютесценс 13686. В ряді дослідів для порівняльної оцінки жаростійкості меристем слугували сорти м’якої гексаплоїдної ярої пшениці Саратовська 29, Ленінградка, Одеська 13, Далекосхідна та Діамант.

Об’єктами досліджень були також лінії кукурудзи (Zea mays L.) Піонер 346, Со 125, ЧКР 8, ВС 2923 та гібриди Колективний 95 М, Колективний 100 СВ, Київський 271, Ювілейний 60 МВ, Нептун СВ, Титан 220 СВ, Буковинський 3 ТВ, сортолінійний гібрид кукурудзи та теосинте Маїссинте 250 МВ. Для порівняльної оцінки посухо- і жаростійкості використовували далекий родич кукурудзи теосинте.

Досліди проводили з проростаючим насінням, проростками і рослинами на вегетативній стадії росту й розвитку в умовах водної та грунтової культури. Водний стрес створювали припиненням поливу рослин, а високотемпературний - у повітряному термостаті з заданою температурою. Посуху припиняли зволоженням проростків водою або переміщенням їх на водну культуру. Вирощування рослин озимої пшениці у водній культурі з різним азотним живленням проводили на суміші Прянишникова [Гродзинский, Гродзинский, 1973]. У вегетаційних дослідах рослини вирощували в посудинах Вагнера місткістю 8 кг грунту з стандартною для культур поживною сумішшю [Доспехов, 1985]. Водний статус рослин характеризували за водним дефіцитом листків методом Штокера-Литвинова, оводненням тканин, осмотичним потенціалом, який визначали ізоосмотичним та рефрактометричним методами [Гродзинский, Гродзинский, 1973].

Проліферативну активність клітин меристем оцінювали методом мікрорадіоавтографії з використанням специфічного попередника ДНК метил-3Н-тимідину (питома активність 7,4.1011 Бк/ммоль, активність розчину 3,7.104 Бк/мл). Тривалість експозиції становила від 2 до 24 год. Рослиний матеріал фіксували у суміші Бродського. Обробку та виготовлення зрізів проводили за загальноприйнятими гістологічними методами. Ядра клітин фарбували за Фьольгеном, а оболонки - алціановим голубим. Висушені препарати покривали рідкою фотоемульсією типу “М”, експонували в темноті, проявляли, препарати знову зневоднювали та заклеювали бальзамом. За допомогою світлового мікроскопа на препаратах підраховували загальну кількість клітин, мічених ядер та мітозів. Мітотичну активність клітин меристем пагонів і коренів кукурудзи й пшениці визначали з використанням давлених гліцерин-желатинових препаратів, які готували після фіксації меристем в суміші Бродського або Кларка, лужної мацерації та фарбування ацетокарміном або ацетоорцеїном [Паушева, 1974]. Морфофізіологічну будову коренів кукурудзи після дії водного стресу вивчали на поздовжних зрізах. Препарати виготовляли за стандартними гістологічними методиками [Паушева, 1974].

Кількість клітин, які не мали центральної вакуолі, в первинних коренях кукурудзи визначали за методом Брауна [Обручева, 1964] після фіксації апексів в суміші Кларка, мацерації їх у 10% водному розчині хромової кислоти, за допомогою світлового мікроскопа та камери Фукса-Розенталя.

Відносний лінійний приріст пагонів та коренів, масу рослин, схожість насіння визначали за стандартними методами [Гродзинский, Гродзинский, 1973]. Для з’ясування дії водного стресу на ріст та кінетику клітин коренів кукурудзи використовували метод Бокса-Уілсона [Адлер, Маркова, Грановский, 1976]. Антистресову дію 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти (2,4-Д), 6-бензиламінопурину (БАП), полістимуліну К (ПС-К), полістимуліну А-6 (ПС-А-6), гумату калію, регуляторів росту гарт (похідне алкілпіридину), дімекс (похідне тетрагідротіофендиоксиду), триману 1 (аква-N-окис-2-метилпіридин-марганець-(ІІ)-хлорид) та етамону (диметил фосфорнокислий диметил-біс холін) вивчали після замочування насіння у водних розчинах та вирощування рослин у водній культурі. Дані експериментів оброблені статистично з використанням загальноприйнятих методик (Урбах, 1974, Доспехов 1985).

РЕГУЛЯЦІЯ ПРОЛІФЕРАТИВНИХ ПРОЦЕСІВ У РОСЛИНАХ ПШЕНИЦІ І КУКУРУДЗИ СИНТЕТИЧНИМИ ЦИТОКІНІНАМИ В УМОВАХ ВОДНОГО ДЕФІЦИТУ

Ріст клітин складається з процесів проліферації та розтягнення, які неоднаково чутливі до водного стресу. Отримані нами вперше експериментальні результати свідчать про вищу чутливість проліферації клітин порівняно з їх розтягненням до дефіциту води у інтактних рослин пшениці і кукурудзи [Шматько, Каблучко, 1980, 1981; Шматько, Жук, 1983, 1985, 1986, 1992, 1998]. Встановлено, що вміст води в меристемах пагонів озимої пшениці до прориву першим листком колеоптиля корелює з мітотичною активністю клітин листкових меристем. Показано, що найнижчий рівень обводнення меристематичних тканин пагонів і первинних коренів, за якого клітини здатні вступати в мітоз, становить 60%, але буває на кілька відсотків вищим [Жук, 1984, 1997, Шматько, Жук, Молошага, 1994] (рис. 1).

МА,% А 1 1 Б

2

8 2

6

4

2

0

60 70 80 90 60 70 80 вологість,%

Рис.1. Зв’язок мітотичної активності клітин і обводнення меристем пагона під час дії /А/ й післядії /Б/ посухи у озимої пшениці сортів Збруч /1/ та Одеська 117 /2/.

Після значного та тривалого зневоднення меристем проліферативні процеси в них відновлювалась протягом кількох годин зволоження рослин [Жук, 1997, Жук, Григорюк, 2002, Жук, Ярошенко, Григорюк, 2001, Жук, Григорюк, 2003] (табл.1).

Таблиця 1.

Мітотична активність в меристемах пагона сортів озимої пшениці після дії посухи

Сорт Контроль Відновлення, год

3 5 7 8

Лютесценс 7 6,90,2 0 0,60,1 3,70,1 5,90,2

Збруч 7,20,1 0 1,20,2 4,20,2 2,90,3

Киянка 5,90,2 0 2,80,2 3,90,1 2,90,2

Поліська 90 7,10,1 0 1,80,1 3,40,3 4,90,1

Ровенська 31 7,30,3 0 0,90,1 3,00,3 1,60,2

Миронівська 61 6,40,1 0 1,80,3 1,70,2 5,50,1

Одеська 51 8,10,2 3,70,2 0 2,60,2 4,70,1

Одеська 66 7,30,3 2,60,4 0 2,70,1 6,10,2

Одеська 117 5,50,1 0 0,50,1 1,40,3 1,60,1

Альбатрос одеський 3,30,3 1,90,2 2,60,1 4,30,1 2,70,1

Визначено, що мітотична активність клітин меристем посухостійких сортів озимої пшениці відновлювалась швидше порівняно з слабостійкими, що співпадало з їх вищою водозатримною здатністю. Кінетика мітотичної активності клітин меристем пагонів відзначалась специфічністю для сортів і ліній пшениці або гібридів та ліній кукурудзи також в період дії водного стресу. Так, у посухостійкого сорту озимої пшениці степового екотипу Одеська 117 і гібриду кукурудзи Маїссинте 250 МВ під час водного стресу мітози припинялись раніше порівняно з слабостійким сортом озимої пшениці лісостепового екотипу Збруч та слабостійким гібридом кукурудзи Колективний 95 М. Отримані результати свідчать про включення метаболічних систем захисту клітин від несприятливих умов посухи шляхом переведення їх в стабільний і менш чутливий до стресу стан та зупинку проліферації (рис.2). Одним з регуляторів проліферативних процесів в стресових умовах виступає АБК, що швидко накопичується під час посухи [Жук, Григорюк, Гродзінський, 1999].

МА,% а 1 б

10 14

8 2 1

6 3 10 3

4

2 4 6

4

0 5 10 15 20 25 год

2 2

2 4 6 8 10 12 год

Рис.2. Мітотична активність клітин меристем пагонів сортів озимої пшениці (а): 1- Збруч, контроль, 2- Одеська 117, контроль, 3 – Збруч, посуха, 4 - Одеська 117, посуха; гібридів кукурудзи (б): 1 – Маїссинте 250 МВ, контроль, 2 –Маїссинте 250 МВ, посуха, 3 – Колективний 95 М, контроль, 4 – Колективний 95М, посуха.

Для пшениці встановлено тісний зв’язок між водозатримною здатністю меристем пагона та життєздатністю рослин пшениці після 6 діб посухи (табл.2).

Таблиця 2.

Вміст води і кількість живих рослин сортів озимої пшениці степового і лісостепвого екотипів після дії посухи

Вміст води в тканинах Кількість живих рослин

Сорт ( % до сирої маси) ( % до проросших зернівок )

пагона ендосперму

Поліська 90 13,10,2 9,30,1 98,10,3

Збруч 23,40,3 9,20,2 96,40,5

Ровенська 31 15,60,2 9,10,2 96,20,6

Миронівська 61 12,40,3 8,80,5 94,80,6

Киянка 17,80,2 9,10,4 89,80,3

Лютесценс 7 21,90,4 8,70,2 93,90,8

Одеська 51 24,70,2 8,80,8 100,30,2

Одеська 117 21,70,8 9,50,4 91,70,8

Одеська 66 21,90,4 9,30,3 97,60,1

Альбатрос одеський 20,20,5 9,40,3 97,80,8

Збільшення тривалості посухи для проростаючого насіння пшениці до 90 і більше діб не суттєво впливало на його життєздатність після відновлення зволоження [Григорюк, Жук, 2002]. У кукурудзи виживання проростаючого насіння після посухи не залежало від збереження пулів води меристемами.

Після виходу першого листка пшениці з колеоптиля здатність пагона витримувати значне зневоднення втрачалась. Для етіольованих інтактних проростків пшениці і кукурудзи, які отримували асиміляти з зернівки, критичним для вступу клітин інтеркалярних меристем листків до мітозу виявився вміст води в цих меристемах, але у рослин, які перейшли до автотрофного типу живлення та отримували асиміляти з зелених частин листків проліферативні процеси лімітувала величина водного дефіциту листкових пластинок - донорів фотоасимілятів [Шматько, Жук, 1998] (рис.3).

ВД, % 2

40 4

1

3

МА,% 5 6 7 8 9 10 11 12 доба посухи

15,0

3

1

10,0

5,0 4

2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 доба посухи

Рис. 3. Водний дефіцит і мітотична активність клітин меристем фотосинтезуючих листків гібридів кукурудзи та теосинте під час посухи: 1 – Маїссинте 250 МВ, контроль, 2 – Маїссинте 250 МВ, посуха, 3 – теосинте, контроль, 4 – теосинте, посуха.

Зростання водного дефіциту листкових пластинок рослин кукурудзи до 50% зупиняло фотосинтез і транспорт фотоасимілятів до меристем, що спричиняло пригнічення мітотичної активності клітин. При цьому вміст води в меристемі досягав 80%, який перевищував необхідний для поділу клітин рівень. Аналогічні результати отримані також для кількох ліній кукурудзи, які свідчать про пряму залежність проліферативних процесів від забезпечення меристем фотоасимілятами. Водночас розтягнення клітин не припинялось, що засвідчують величини відносних лінійних приростів листків, а проліферативні процеси були чутливішими до посухи порівняно з ростом клітин розтягненням. Отже, пряма залежність проліферативних процесів від водного статусу меристем відзначена лише для етіольованих проростків.

Обробка насіння БАП і ПС-К до посіву зменшувала негативну дію дефіциту води на проліферативні процеси у кукурудзи та пшениці [Жук, Ярошенко, Григорюк, 2000, Жук, Григорюк, Роїк, 2001, Григорюк, Жук, 2002]. Ефективність екзогенних цитокінінів обумовлювалась специфікою генотипу. Так у кукурудзи гібридів Титан 220 СВ та Нептун СВ БАП сприяв підтриманню мітотичної активності клітин листкових меристем в період тривалої грунтової посухи (рис. 4).

МА, 10,0

% а б

1 3

3 2

1

5,0 2

6 5

4 4

5

6

2 4 6 8 2 4 6 8 доба посухи

Рис. 4. Вплив синтетичних цитокінінів на мітотичну активність клітин меристеми листків кукурудзи гібридів Титан 220 СВ (а); Нептун СВ (б): 1- контроль; 2- БАП; 3 –ПС- К; 4- посуха; 5- посуха+БАП; 6- посуха+ПС- К.

Встановлена аналогічна дія цитокінінів (БАП та ПС-К) і ауксинів (2,4-Д та ПС-А-6) на проростання насіння й ріст рослин озимої м’якої пшениці за дефіциту води та після припинення посухи [Жук, Григорюк, Роїк, 2001, Григорюк, Жук , 2002].

Таким чином, проліферативна активність клітин рослин пшениці і кукурудзи обумовлюється водним статусом меристем та донорних частин листкових пластинок. Водозатримна здатність меристем пагона пшениці визначала виживання рослин після дії посухи. Екзогенні аналоги фітогормонів інтенсифікували поділ клітин листкових меристем під час посухи та стабілізували проліферативні процеси, зменшували негативну дію дефіциту води на функціонування репродуктивних тканин.

ВПЛИВ ПОСУХИ НА РОЗТЯГНЕННЯ КЛІТИН

Дію посухи на розтягнення клітин оцінювали за кінетикою переходу меристематичних клітин до розтягнення. Цей підхід для оцінки відносного внеску процесів розтягнення в інтегральну реакцію рослин на водний стрес нами використано вперше. На моделі первинного кореня кукурудзи експериментально показано блокування водним стресом розтягнення клітин (рис.5) [Жук, 1993]. За допомогою методу Бокса-Уілсона встановлено, що значимою для переходу клітин до розтягнення була лише кількість води, яку втратила меристема.

Кількість клітин

х 103 шт. 180

150

130 4

2

3

100 1

1 2 доба після посухи

Рис. 5. Кінетика клітин без центральної вакуолі у первинному корені кукурудзи гібриду Буковинський 3 ТВ після: 1 - критичного (втрата 22% води); 2 – середнього (втрата 12% води); 3 – слабкого ( втрата 6% води) водного стресу; 4 - контроль.

Найзначніше накопичення клітин, які не перейшли до розтягнення, відзначено у першу добу після критичного рівня зневоднення кореня. Після середнього зневоднення їх кількість була вдвічі меншою, а після слабкого - зростала лише на короткий проміжок часу. Після критичного зневоднення наступало спустошення меристеми, після середнього – її монотонне відновлення, а слабкий стрес лише виводив систему з рівноваги на деякий проміжок часу. Використання цієї ж моделі для оцінки лінійного росту кореня кукурудзи у післястресовий період показало, що критичний рівень зневоднення апекса призводить до повної зупинки лінійного росту протягом доби (рис.6).

ВЛП 1,2 3

1,0 2

0,8

0,4

0,2 1

1 2 3 4 5 6 7 8 доба після посухи

Рис. 6. Відносний лінійний приріст коренів кукурудзи гібриду Буковинський 3 ТВ після дії: 1 – критичного (втрата 22% води); 2 – середнього (втрата 12% води); 3 – слабкого (втрата 6% води) водного стресу.

Середній рівень водного дефіциту значно зменшував приріст кореня в першу добу після посухи, після чого відбувалось його поступове збільшення до рівнів контролю. Слабкий стрес викликав незначні коливання приростів, які затухали через чотири доби [Жук, 1993]. Для коренів, що не сформували зону розтягнення, критичні рівні водного дефіциту були вищими. Нами виділено три типи ростової реакції на водний стрес, які характеризують пошкодження системи: повне блокування за критичного рівня водного стресу, монотонне відновлення за среднього рівня, виведення системи з рівноваги за слабкого стресу.

Цитокініни і ауксини (БАП, ПС-К, 2,4-Д, ПС-А-6) посилювали лінійний ріст пшениці та кукурудзи після водного стресу. Найзначніше стимулювали ріст після посухи цитокініни. Замочування насіння озимої пшениці і кукурудзи перед пророщуванням у водних розчинах цитокінінів стимулювало наростання маси пагонів та коренів [Жук, Григорюк, Роїк, 2001, Жук, Ярошенко, Григорюк, 2000, Григорюк, Жук, 2002].

Таким чином, у інтактних рослин проліферативні процеси відзначаються більшою чутливістю до зміни водного статусу порівняно з процесами розтягнення, що вперше доведено нами експериментально. Три типи ростової реакції рослин на водний стрес характеризують ступінь проліферативної інактивації клітин меристем. Вперше використані нами кінетичні характеристики росту рослин за дефіциту води дозволили з’ясувати головні причини і наслідки дії стресу на клітинно-організменому рівні, розробити способи оцінки посухостійкості рослин озимої пшениці на початкових стадіях росту.

ДІЯ ВИСОКОЇ ТЕМПЕРАТУРИ НА ПРОЛІФЕРАЦІЮ КЛІТИН МЕРИСТЕМ

ПШЕНИЦІ І КУКУРУДЗИ

Проліферативні процеси надзвичайно чутливі до зміни температури середовища [Гриф, 1981, Жук, Шматько, Григорюк, 1993, Мусиенко, Харламов, 1995, Шматько. Жук, Григорюк, 1988, Шматько, Жук, 1998, Иванов, 1987, Doerner, 1994, Nigg, 1995]. Високотемпературний стрес порушував проліферацію, що було ідентифіковано за інтенсивністю включення міченого специфічного попередника ДНК 3Н-тимідину в клітини інтеркалярних меристем листків пшениці та кукурудзи [Жук, Шматько, Григорюк, 1993, Шматько, Жук, 1998, Григорюк, Жук, 1998] (рис.7).

Рис. 7. Мікрорадіоавтограф включення специфічного міченого попередника ДНК метил-3Н-тимідину в ядра клітин меристем листкових примордіїв проростків озимої пшениці сорту Одеська 51 під час реплікативної фази мітотичного циклу.

Кількість клітин, які включили мітку в період реплікації ДНК, після прогріву рослин збільшилась, що означає зміну швидкості розмноження клітин, інтенсифікацію репаративних процесів для ліквідації пошкоджень ДНК. Одночасно відзначено зменшення кількості мітозів і їх зникнення в частині меристеми, яка знаходиться на межі зон поділу й диференціації клітин, що є наслідком блокування проліферації та передчасного припинення діяльності інтеркалярної меристеми (табл.3).

Таблиця 3. Вплив високої температури на величину індексу мітки та мітотичну активність клітин листкової меристеми озимої пшениці сорту Одеська 51

Варіант Відстань від основи листка, мм

1 1-3 вище 3

ІМ МА ІМ МА ІМ МА

Контроль, 26,13,8 10,60,3 25,53,2 10,60,4 19,94,6 5,40,3

3Н-тимідин, 4 год r =0,25 r=0,15 r=0,42

Дослід, 2 год+40С, 34,95,4 6,70,3 37,46,4 9,40,8 22,33,5 4,50,7

3Н-тимідин, 4 год r=0,40 r=0,73 r=0,77

Контроль, 97,71,9 9,90,8 95,05,9 7,50,9 87,84,8 5,00,2

3Н-тимідин, 24 год r=0,18 r=0,35 r=0,33

Дослід, 2 год+40С, 96,50,8 6,10,4 95,11,2 2,30,6 94,90,6 0

3Н-тимідин, 24 год r=0,35 r=0,52 r=0,0

В умовах наших дослідів кореляційна залежність ( r ) між індексом мітки та мітотичною активністю не завжди була тісною і суттєво коливалась, що обумовлено гетерогенністю популяції клітин за чутливістю до високотемпературного стресу.

Нами встановлено, що високотемпературний стрес зменшував кількість мічених клітин та мітозів в листкових меристемах кукурудзи лінії Піонер 346 [Жук, Шматько, Григорюк, 1993, Шматько, Жук, 1998]. Після прогріву проростків кукурудзи за температури +45С протягом 2 год кількість мічених ядер найсуттєвіше зменшувалась в апікальній частині листкових пластинок, де клітини переходять до розтягнення (табл.4). Значне зменшення кількості мічених ядер відзначено і в інших частинах інтеркалярної меристеми, що обумовлено порушенням реплікативного процесу або підготовки до нього. Стає очевидним, що деструктивні процеси, утворення значної кількості вільних радикалів та дезорганізація релікації ДНК є визначальними чинниками пригнічення клітинного росту в інтеркалярних меристемах злаків після дії високої температури.

Таблиця 4.

Вплив високої температури (+45С, 2 год) на величину індексу мітки клітин листкових меристем кукурудзи лінії Піонер 346

Введення 1-й листок 2-й листок

3Н-тимідину,

год 1 мм 1-3 мм вище 3 мм 1 мм 1-3 мм вище 3 мм

контроль

1 16,62,2 20,41,8 17,72,0 20,12,5 20,21,9 18,02,1

4 25,82,5 44,52,3 42,21,9 27,81,5 25,52,1 36,31,9

після прогріву

1 10,53,5 10,52,7 11,33,0 13,84,2 9,82,7 6,93,5

4 14,63,0 20,62,8 7,54,0 13,54,0 19,63,5 14,93,4

Рослини здатні адаптуватись до росту за високих, але не екстремальних температур, що виявлено нами на прикладі озимої пшениці, яку витримували за дії температури +35С протягом 15 год (рис.8). Протягом 4 год кількість мітозів в

МА,% 1

3

2

10,0

4

5,0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 год прогріву

Рис. 8. Вплив високої температури на мітотичну активність клітин меристем озимої пшениці сорту Одеська 51: 1 – контроль, пагони; 2 – прогрів, пагони; 3, 4 – те ж саме, корені.

меристемах пагонів і коренів пшениці зростала та стабілізувалась на новому, дещо нижчому рівні, ніж в контролі. Збільшення температури до +45С виявилось критичним, оскільки мітози в клітинах пшениці зупинялись протягом 2-3 год після початку прогріву і відновлювались лише після припинення дії стресу [Шматько, Григорюк, Жук, 1988].

Додаткове забезпечення рослин пшениці мінеральним азотом посилювало мітотичну активність клітин листкових меристем під час дії високої температури (Шматько, Жук, Іванова, 1993) (рис.9). Додавання азоту до поживної суміші

МА,%

10,0 1

2

5,0

3 4

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 год прогріву

Рис. 9. Вплив високої температури та мінерального азоту на мітотичну активність клітин листкової меристеми проростків пшениці сорту Поліська 87: 1 – контроль, без азоту, 2 – контроль+азот, 3 - +40С, без азоту, 4 –+40С+азот.

Гельрігеля, на якій вирощували рослини, збільшувало кількість мітозів, які відзначались на 2 год довше. Аналогічне явище відзначено і для кореневої меристеми тих же рослин, але тривалість періоду, протягом якого спостерігались мітози за дії високої температури, була меншою [Шматько, Жук, Иванова, 1993]. Подібні результати отримано також для пшениці сорту Одеська 117. Висока чутливість кореневої меристеми до високої температури порівняно з листковою меристемою виявлена для всіх вивчених сортів пшениці.

Після припинення дії високої температури відбувалось відновлення лінійного росту листків і коренів, що свідчить про збереження здатності до проліферації клітин меристем пагона та кореня. Кінетичні характеристики відносного лінійного росту рослин пшениці у післястресовий період обумовлювались не лише температурою, але і тривалістю експозиції (рис.10).

ВЛП

2,0

1,5

1

2

0,5

3

1 2 3 4 5 6 7 8, доба

Рис. 10. Відносний лінійний приріст пагонів сорту озимої пшениці Одеська 51 після дії високої температури: 1 - +45С, 2 год, 2 -+45С, 6 год, 3 -+45С, 8 год.

Після експозиції рослин за дії температур +45С (2-4 год) відбувалось монотонне відновлення приростів. Збільшення експозиції до 6 год спричиняло пригнічення росту на 80-85% і незначне його зростання протягом чотирьох діб з різким посиленням на 5-7 добу. Однак після 8 год прогріву ріст рослин практично не відновлювався. Очевидно, протягом коротких експозицій рослин пшениці за екстремально високих температур не відбувалась проліферативна інактивація більшості клітин меристем. Пригнічення росту листків внаслідок тривалої дії високої температури з поступовим його затуханням свідчить про спустошення меристеми і втрату її клітинами проліферативної функції. Кінетика лінійного росту рослин пшениці і кукурудзи після дії високої температури вивчена на прикладі 20 сортів й ліній пшениці, 10 гібридів та ліній кукурудзи, а також далекого родича кукурудзи - теосинте. Встановлено відмінність у відносній чутливості до високотемпературного стресу меристем пагонів і коренів одних й тих же інтактних рослин пшениці та кукурудзи [Григорюк, Жук, 1998, Шматько, Жук, 1998, Жук, Ярошенко, Григорюк, 2000]. Додаткове забезпечення рослин озимої пшениці мінеральним азотом сприяло активізаціїї проліферативних процесів, підтримувало їх на вищому рівні та протягом тривалішого періоду порівняно з рослинами, що не отримували азот. Компенсаційна активність меристем після припинення дії стресу спричиняла різке прискорення росту листків і коренів пшениці та кукурудзи у довжину.

РЕГУЛЯЦІЯ РОСТОВИХ ПРОЦЕСІВ У КУКУРУДЗИ І ПШЕНИЦІ ПІСЛЯ

ДІЇ ВИСОКОТЕМПЕРАТУРНОГО СТРЕСУ

Для зменшення негативної дії високих температур на проростаюче насіння і рослини пшениці й кукурудзи використано синтетичні цитокініни та ауксини (мономерна та полімерна форми) [Григорюк, Жук, 1998, Жук. та ін., 2000]. Насіння протягом доби замочували у водних розчинах БАП, ПС-К, 2,4-Д, ПС-А-6 в концентраціях 10-4 та 10-5М за діючою речовиною. Цитокініни посилювали ріст листкових пластинок озимої пшениці після дії високотемпературного стресу (рис.11).

ВЛП 1,5

3

1,0

4 5

2

0,5 1

1 2 3 4 5 доба після прогріву

Рис. 11. Вплив високої температури, БАП та ПС-К на відносний лінійний приріст пагонів озимої пшениці сорту Одеська 51: 1 – БАП, 2 – БАП + 45С, 4 год, 3 – ПС-К, 4 – ПС-К + 45С, 4 год , 5 – вода + 45С, 4 год.

Антистресову дію БАП та ПС-К вивчено у відновний період за кінетикою відносного лінійного росту