Мороз Олександра Мирославівна
ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН УААН
ШКАВОЛЯК АНДРІЙ ВАСИЛЬОВИЧ
УДК 612.015.31..611.37.0018.1-084
ІДЕНТИФІКАЦІЯ ТА БІОХІМІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА
Na/Li-ПРОТИТРАНСПОРТУ
В БЕТА-КЛІТИНАХ ПІДШЛУНКОВОЇ ЗАЛОЗИ ЩУРА
03.00.04 – біохімія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Львів – 2004
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана у Львівському національному медичному університеті ім. Данила Галицького МОЗ України.
Науковий керівник: | доктор медичних наук, професор,
заслужений діяч науки і техніки України,
академік АН ВШ України.
Гжегоцький Мечислав Романович,
Львівський національний медичний університет ім.Данила Галицького МОЗ України,
зав. кафедри нормальної фізіології
Офіційні опоненти: | доктор біологічних наук, професор
СТОЙКА РОСТИСЛАВ СТЕПАНОВИЧ,
Інститут біології клітин НАН України,
завідувач відділу регуляції проліферації клітин
доктор біологічних наук, доцент
КЛІЩ ІВАН МИКОЛАЙОВИЧ,
Тернопільська державна медична академія ім..І.Я.Горбачевського МОЗ України,
доцент кафедри клінічної фармації
Провідна установа: | Львівський національний університет
імені Івана Франка МОН України, кафедра біохімії
Захист відбудеться 7 вересня 2004 р. о 12.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01 в Інституті біології тварин УААН (79034, м.Львів, вул. Стуса, 38).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин УААН за адресою: 79034, м.Львів, вул. Стуса, 38.
Автореферат розісланий 2 серпня 2004 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради О.І.Віщур
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Важливість підшлункової залози в здійсненні метаболізму визначається розмаїттям властивостей панкреатичних гормонів, утворення та вивільнення яких тісно спряжені з трансмембранним перенесенням моновалентних іонів. Зокрема, в реалізації цих процесів в острівцях Лангерганса провідна роль належить іонам Na+ та К+ (Anello M. et al., 1996). Стимуляція бета-клітин нутрієнтами призводить до зниження значень рН в результаті утворення кислих метаболітів, і цей процес тісно пов’язаний з транспортом Na+ (Hattory М. et al., 1994; Shepherd R.M., Henquin J.C., 1995). Цілком ймовірно, що острівці Лангерганса володіють декількома іонними транспортерами, які попереджують накопичення протонів. В еритроцитах найбільш реальними претендентами на цю роль є механізми Na/Н- та Na/Na-протитранспорту (Орлов С.Н. и соавт., 1994; van Norren K. et al., 1997). Відомо також, що плазматична мембрана еритроцитів людини та тварин деяких видів володіє нечутливою до овабаїну транспортною системою, здатною каталізувати обмін іонів Na+ на Li+, причому остання розглядається як різновид зазначених вище транслокацій. Na/Li-протитранспорт може здійснюватись однією з ізоформ транспортера, за посередництвом якого відбувається Na/H-обмін (Canessa M. et al., 1992; Zerbini G. et al., 2003), а також бути гомологом Na/Na-протитранспорту (Escobales N., Figueros J., 1991; Hardman T.C., Land A.F., 1996). При певних патологічних станах, зокрема, за розвитку діабету, властивості механізмів Na/Li-протитранспорту в еритроцитах істотно відрізняються від таких, характерних для цих клітин у здорової людини ( Guarena C. et al., 1992), і дана обставина обгрунтовує високу ймовірність наявності в панкреатичних клітинах транспортерів, за посередництвом яких може відбуватись незалежний від натрієвої помпи обмін іонів Na+ та Li+. Однак, незважаючи на важливість виявлення транспортувальних шляхів, якими здійснюється транслокація моновалентних іонів у панкреатичних клітинах за фізіологічних та екстремальних умов, з категорії овабаїн-резистентних систем найбільш повно вивчено властивості лише Na,K,Cl-котранспорту в ацинарних (Zhao Н., Muallem М., 1995) та в бета-клітинах (Sandstrom P.I., Sehlin J., 1993) миші, Na/H-обміну – в ацинарних (Anderie I., Thevenod F., 1996) та в бета-клітинах (Shepherd R., Henquin J.C., 1995) щура. Na,K,Cl-котранспорту – в бета-клітинах щура (Бобровник A.Д., 1997). Тому однією із актуальних проблем є дослідження і інших овабаїн-нечутливих механізмів іонного обміну, зокрема, Na/Li-протитранспорту, що можуть функціонувати у підшлунковій залозі.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана згідно з планами науково-дослідних робіт “Обгрунтування методів відновлювальної фізичної терапії патологічних процесів, що супроводжуються явищами іонної мембранопатії”, № держреєстрації 0194U008107 та “Дослідження механізмів розвитку іонних мембранопатій”, № держреєстрації 0198U00877.
Мета і задачі дослідження. Мета роботи – з’ясування можливості обміну в бета-клітинах острівців Лангерганса щура внутрішньоклітинного Na+ на позаклітинний Li+ і вивчення біохімічних властивостей механізму Na/Li-протитранспорту.
Для здійснення поставленої мети вирішували наступні основні задачі:
1. Аналіз кінетичних параметрів Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах при їх інкубації в середовищах зі змінними рН, температурою та осмоляльністю.
2. Вимірювання інтенсивності Na/Li-протитранспорту в нативних бета-клітинах та в бета-клітинах зі змінним іонним складом.
3. Порівняння кінетичних параметрів Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах та в еритроцитах щура і в еритроцитах здорової людини.
4. Вивчення взаємоз’язку між концентрацією моновалентних іонів, швидкістю Na/Li-протитранспорту та інтенсивністю активного транспорту Na+ в бета-клітинах щурів, опромінених монохроматичним червоним світлом.
Об'єкт дослідження: Іон-транспортувальні системи.
Предмет дослідження: Кінетичні параметри Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах острівців Лангерганса та в еритроцитах щура, в еритроцитах людини.
Методи дослідження:
- біохімічні – фармакокінетичний аналіз параметрів Na-транспортувальних процесів;
- фізіологічні – виділення острівців Лангерганса, лазерне опромінення лабораторних щурів;
- морфологічні – електронна мікроскопія острівців Лангерганса;
- статистичні.
Наукова новизна одержаних результатів. Нами вперше отримано свідчення наявності в бета-клітинах острівців Лангерганса щура іон-транспортувального механізму, який може здійснювати стимульовану позаклітинним літієм транслокацію внутрішньоклітинного Na+. У використаних як експериментальні транспортні моделі бета-клітинах виявлено та кількісно оцінено основні параметри Na/Li-протитранспорту. Окреслено механізми регуляції вказаного іонного обміну, що реалізуються через модуляцію його окремих властивостей за впливу змінних фізичних (температура, осмоляльність) та хімічних (наявність транспортних інгібіторів, іонний склад внутрішньо- та позаклітинного середовищ, рН) факторів. Вперше проведено порівняння кінетичних параметрів Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах та в еритроцитах щура і в еритроцитах людини. Розширено теоретичні уявлення про механізми функціонування Na/Li-протитранспорту в нееритроїдних клітинах.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати вказують, що експериментальною моделлю для вивчення властивостей Na/Li-протитранспорту можуть служити бета-клітини острівців Лангерганса щура, позаяк останні достатньою мірою проявляють фармакологічні (чутливість до транспортних інгібіторів) та функціональні (чутливість до рН, осмоляльності, температури, іонного складу внутрішньо- та позаклітинного середовищ) характеристики.
Проведено оптимізацію умов дослідження Na/Li-протитранспорту, що дозволяє здійснювати порівняльну оцінку окремих показників цієї іонної транслокації в клітинах, що перебувають в стані, наближеному до природнього, за створення екстремальних умов та за впливу випромінювання гелій-неонового лазера. Матеріали дисертаційної праці впроваджені в навчальний процес у ЛНМУ ім. Данила Галицького в лекційні курси кафедр нормальної фізіології, патологічної фізіології, біохімії.
Особистий внесок здобувача. Збір літератури, лазерне опромінення лабораторних тварин, статистичне обчислення отриманих даних, їх опис виконано особисто дисертантом. Разом з науковим керівником сплановано комплекс біохімічних та фізіологічних методів і серії експериментальних досліджень, обговорено та узагальнено одержані результати. Виділення острівців Лангерганса та вимірювання параметрів Na-транспортувальних систем проведено спільно зі співробітниками ЦНДЛ ЛНМУ, які є співавторами публікацій. Електронно-мікроскопічне дослідження здійснено старшим науковим співробітником цієї ж лабораторії Ковалишиним В.І.
Апробація результатів дисертації. Основні результати та положення роботи були оприлюднені та винесені на обговорення на XV з’їзді фізіологів України (Львів, 1998), науково-практичній конференції “Актуальні проблеми лазерної медицини, ендоскопічної хірургії та гінекології” (Одеса, 1999), симпозіумі “Водно-сольовий обмін та його роль в гомеостатичних реакціях організму” (Львів, 1999), Міжнародній науковій конференції “С.З.Гжицький і сучасна аграрна наука” (Львів, 2000), IV та V Міжнародних медичних Конгресах студентів і молодих вчених (Тернопіль, 2000 та 2001, відповідно), Міжнародній конференції студентів і молодих вчених (Дніпропетровськ, 2001), ІІІ з’їзді Українського біофізичного товариства (Львів, 2002), VІІ з’їзді Українського лікарського товариства (Тернопіль, 2003).
Публікації. Основні результати дисертаційної роботи висвітлені у 18 публікаціях, з яких 7 опубліковано у наукових фахових виданнях, 4 – у збірниках та вісниках наукових праць, 7 – у матеріалах та тезах конференцій.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 145 сторінках машинописного тексту. Робота складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, опису отриманих результатів та їх обговорення, узагальнення, висновків, списку використаних джерел із 200 найменувань та 3 додатків (актів впровадження). Робота ілюстрована 5 таблицями, 23 рисунками та 4 світлинами, які займають 15 сторінок тексту.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи досліджень
Робота виконана на 230 лабораторних щурах-самцях. Дослідження проводили на виділених методом Lacy P.E., Kostianowsky M. (1967) бета-клітинах острівців Лангерганса, інтактність яких оцінювали за посередництвом трипанового синього (Senglen P., 1976) та електронною мікроскопією, а також на еритроцитах цих тварин і 30 здорових осіб.
На стаціонарний стан бета-клітин острівців Лангерганса впливали декількома способами: модифікацією іонного складу розчинів, які використовували для інкубації, змінами рН, осмоляльності та температури позаклітинного середовища. У вільному від Na+ або Li+ середовищі ці іони заміняли на холінхлорид. Значення осмоляльності інкубаційного середовища контролювали осмометром типу ОМКА Ц-01. Про об’єм клітин судили за вмістом внутрішньоклітинної води (Sayeed M.M., 1984).
Параметри Na/Li-протитранспорту встановлювали в нативних клітинах та в клітинах зі змінним іонним складом, що досягалось впливом пара-хлормеркурібензенсульфонату (Garrahan P., Rega A.F., 1967) або інкубацією клітин при 0,5С. Вимірювання концентрацій Na+ та К+ у клітинах здійснювали методом полум’яної фотометрії на фотометрі моделі Plapho 4, Carl Zeiss, Jena.
Про інтенсивність овабаїн-чутливого транспорту Na+ судили за збільшенням концентрацій Na+ в клітинах після їх інкубації в середовищах, що містили овабаїн (в ммоль/л): 5,0 – для бета-клітин; 1,0 – для еритроцитів щура; 0,1 – для еритроцитів людини (Cumberbatch M., Morgan B., 1978; de Mendonca M. et al., 1983). Активність Na,K-АТФази клітин обчислювали як різницю між активностями сумарної АТФази та Mg-АТФази, що їх визначали за приростом концентрацій неорганічного фосфату. Na/Li-протитранспорт був досліджений як стимульований позаклітинним літієм вихід Na+. Стандартну активність Vstd та максимальну реакційну швидкість Vmax Na/Li-протитранспорту встановлювали за різницею концентрацій Na+, виміряних в в клітинах в нульовий та завершальний час інкубації при поєднаному додаванні в середовища потоку, що містили NaCl в концентрації 140 ммоль/л або 150 ммоль/л, відповідно, двох транспортних інгібіторів – овабаїну та фуросеміду – за наявності та відсутності LiCl. Константа спорідненості Міхаеліса (Кm) до позаклітинного Na+ була визначена графічним методом.
При опроміненні піддослідних тварин розфокусований потік монохроматичного червоного світла (МЧС), генерований гелій-неоновим лазером типу ЛГ-75, скеровували на депільовану епігастральну область. Густина потужності випромінювання становила 0,5 мВт см-2. Дозування проведено шляхом змін кількості сеансів та їх тривалості.
Статистичний аналіз одержаних результатів здійснювали на персональному комп’ютері Celeron-400 з використанням програми Excel пакету Microsoft Office. Для оцінки рівня вірогідності використовували критерій Стьюдента. Зміни показників вважали вірогідними при р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Вплив змін рН інкубаційного середовища на стимульований позаклітинним літієм вихід натрію з бета-клітин щура. Завдання даного фрагменту праці – встановлення величин стандартної активності (Vstd) та максимальної швидкості (Vmax) Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах острівців Лангерганса щура в процесі їх інкубації в середовищах з низьким (6,4), фізіологічним (7,4) і високим (8,4) рНо та аналіз зв’язку можливих модуляцій вказаного іон-транспортувального механізму з активністю Na,K-АТФази цих же клітин.
При з’ясуванні залежності стандартної активності та максимальної швидкості Na/Li-протитранспорту від іонів Н+, концентрація яких зумовлювала реакцію інкубаційного середовища, в бета-клітинах острівців Лангерганса щура не зареєстровано достатньо тісного зв’язку між обидвома аналізованими параметрами. В тому випадку, коли рНо був на рівні 7,4, Vstd іонного обміну становила 0,49 0,02 ммоль Na+ 1 кг клітин-1 1 год-1, а Vmax сягала 0,70 0,01 ммоль Na+ 1 кг клітин-1 1 год_. При інкубації бета-клітин в середовищі з рН 8,4 активність Vstd збільшувалась на 26%, а швидкість Vmax – на 33%. Закиснення інкубаційного середовища, в якому впродовж 1 год витримували бета-клітини, до рН 6,4 проявлялось пригніченням Vstd – на 30%.
Обчисленням даних, отриманих у результаті вимірювання Vstd та Vmax Na/Li-протитранспорту, не виявлено залежності між цими показниками в бета-клітинах, що були інкубовані в середовищах при рНо 7,4 та 8,4. При їх витримуванні в закисненому середовищі аналізований коефіцієнт кореляції становив +0,24.
З’ясовано також, що активність Na,K-АТФази бета-клітин при їх інкубації в середовищі, рН якого сягало 7,4, становить 1,22 0,34 мкмоль Рі 1 мг білка-1 1 год-1. Різновекторні зміни рН інкубаційного середовища не позначались на процесах екструзії Na+, про що свідчила висока стабільність цього ферменту. Отримані результати вказують на можливість здійснення в бета-клітинах острівців Лангерганса щура Na/Li-протитранспорту, який за застосованих експериментальних умов не проявляє модулюючого впливу на натрієву помпу.
Температурна залежність інтенсивності Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах щура. Відомою є ймовірність розвитку змін іонної проникності плазматичної мембрани внаслідок витримування клітин в інкубаційному середовищі при температурі 0,5С, що призводить до зменшення в них концентрації К+ та збільшення - Na+, і в результаті подальшого їх переміщення в середовище при температурі 37С, коли внутрішньоклітинні рівні вказаних іонів можуть повернутись до базальних значень (Sayeed, 1984).
Метою даного фрагменту праці було встановити в бета-клітинах острівців Лангерганса щура залежність інтенсивності Na/Li-протитранспорту від температури середовища, в якому здійснюється їх інкубація.
Результати досліджень засвідчили, що бета-клітини щура містять Na+ в концентрації 15,60 ,44 ммоль · 1 кг клітин-1 та К+ в концентрації 96,28 1,74 ммоль · 1 кг клітин-1. Витримування цих клітин в ізоосмоляльному середовищі, температура якого була знижена до 0,5С, на 90 хв проявляється втратою біля 60% внутрішньоклітинного К+ та майже 4-кратним накопиченням Na+. Функціонування механізму Na/Li-протитранспорту за таких умов не зареєстровано.За часткового відновлення в результаті “теплової” (370С) інкубації концентрацій внутрішньоклітинного Na+ (до 38,78 0,94 ммоль · 1 кг клітин-1) та К+ (до 70,95 0,87 ммоль · 1 кг клітин-1) стандартна активність Na/Li-протитранспорту становила 0,22 0,01 ммоль Na+ · 1 кг клітин-1 · 1 год-1.
Друга мета досліджень даної серії зводилась до вcтановлення залежності Vstd та Vmax Na/Li-протитранспорту від поєднаного впливу на бета-клітини двох факторів – температури та осмоляльності інкубаційного середовища.
Інкубація бета-клітин у середовищах вибраного температурного режиму за фізіологічної осмоляльності не відбивається на параметрах Na/Li-протитранспорту (табл.1). Інкубація цих клітин в гіперосмоляльному середовищі призводить до збільшення Vstd – на 58%, V max – на 34% відносно величин, встановлених при застосуванні ізоосмоляльного середовища. Підвищення температури гіперосмоляльного середовища до 40°С проявлялось зростанням Vstd – на 20%, а Vmax – на 40% стосовно базального рівня (37С). Однак коли температура гіперосмоляльного середовища сягала 43С, значення Vstd та Vmax Na/Li-протитранспорту істотно зменшувались, повертаючись в діапазон контрольних значень.
Таблиця 1
Вплив температури середовищ інкубації різної осмоляльності
на стандартну активність (Vstd) та максимальну швидкість (Vmax)
Na/Li-протитранспорту (в ммоль Na+ 1 кг клітин-1 1 год-1)
в бета-клітинах острівців Лангерганса щура
Температура | Vstd, n = 6 | Vmax, n = 6
300 мОсмоль/кг | 400мОсмоль/кг | 300 мОсмоль/кг | 400мОсмоль/кг
37єC | 0,49 0,02 | 0,78 0,02 | 0,70 0,01 | 0,94 0,04
40С | 0,49 0,02 | 0,94 0,02* | 0,69 0,02 | 1,34 0,04*
43С | 0,47 0,01 | 0,74 0,02 | 0,73 0,02 | 0,89 0,02
Примітка. * - вірогідність p<0,05 стосовно базального рівня (37С)
Одержані дані вказують на можливість об’ємної регуляції панкреатичних бета-клітин щура механізмом Na/Li-протитранспорту, позаяк відповідними змінами температури інкубаційного середовища можна пригнітити процеси його активації, зумовлені осмотичним зморщуванням.
Вплив осмотичного стресу на інтенсивність Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах щура. Динамічна регуляція об’єму клітин визначається змінами властивостей іонних транспортерів, які відносяться до об’єм-збільшувальних або об’єм-зменшувальних систем. Хоча більшість з них є ідентифікованими та добре вивченими в еритроцитах, відомості щодо їх характеристик у клітинах органів травного тракту залишаються вкрай обмеженими.
Метою даного фрагменту роботи було – з’ясувати можливість регуляції об’єму бета-клітин острівців Лангерганса щура за участю механізму Na/Li-протитранспорту.
Перед висвітленням одержаних результатів доцільно навести дані щодо коливань кількості внутрішньоклітинної води при інкубації бета-клітин в середовищах змінної (200; 300; 400 мОсмолькг) осмоляльності (Бобровник А.Д. та співавт., 2001). Їх витримування в гіперосмоляльному середовищі за відсутності транспортних інгібіторів проявлялось зменшенням кількості внутрішньоклітинної води на 12% (р > 0,05) відносно значень, зареєстрованих при застосуванні ізоосмоляльного середовища. При внесенні в гіперосмоляльне середовище овабаїну (5,0 ммоль/л) об’єм бета-клітин залишався незмінним, а при їх інкубації в ізоосмоляльному середовищі за наявності овабаїну кількість внутрішньоклітинної води була на 19,6% (р < 0,05) більшою, ніж за відсутності цього ж інгібітора.
Є важливим, що хоча на 60-ій хв інкубації бета-клітин у гіпоосмоляльному середовищі вміст внутрішньоклітинної води істотно – на 79,5% (р < 0,05) - збільшувався, тим не менше вплив овабаїну на ефект гіпотонічного шоку як за наявності, так і за відсутності фуросеміду проявлявся нормалізацією клітинного об’єму.
Витримування бета-клітин острівців Лангерганса в гіперосмоляльному середовищі проявляється вірогідним зростанням інтенсивності Na/Li-протитранспорту (табл.1). Ймовірно, за умов пригнічення швидкості екструзії Na+ Na/Li-протитранспорт виконує компенсаторну роль в підтриманні натрієвого градієнту. При інкубації названих клітин у гіпоосмоляльному середовищі інтенсивність Na/Li-протитранспорту не відрізнялась від такої, встановленої за їх витримування в ізоосмоляльному середовищі.
В даному дослідженні отримано свідчення наявності в бета-клітинах острівців Лангерганса щура тісної кореляційної залежності співвідношень Vstd та Vmax Na/Li-протитранспорту від значень осмоляльності позаклітинної рідини. Так, за підтримання базальних умов інкубації (300 мОсмоль/кг; 37°С) коефіцієнт кореляції r становив +0,70, а за перебування клітин в гіперосмоляльному середовищі цей показник змінювався до –0,51. Отже, поєднане визначення вказаних параметрів може бути корисним для біохімічної характеристики даного іон-транспортувального механізму.
Залежність параметрів інтенсивності Na/Li-протитранспорту від концентрації позаклітинного Na+. Раніше аналізом швидкості однієї з компонент овабаїн-резистентного транспорту іонів – Na,K,Cl-котранспорту – як функції концентрацій позаклітинного Na+ було показано, що в бета-клітинах щура цей процес підпорядковується кінетиці насичення (Бобровник А.Д., 1997). Мета даної праці – встановлення особливостей впливу позаклітинного Na+o на інтенсивність іншого овабаїн-резистентного механізму іонної транслокації - Na/Li-протитранспорту.
У нашому дослідженні вихід Na+ з інкубованих бета-клітин острівців Лангерганса щура в сольове середовище, що містило Li+, виявився значно інтенсивнішим, ніж у середовище з холінхлоридом (0,49 ,01 ммоль Na+ 1 кг клітин-1 год-1 проти 0,12 ,01 ммоль Na+ 1 кг клітин-1 год-1, відповідно; Р<0,05). Цей факт додатково свідчить про можливість функціонування механізму Na/Li-протитранспорту.
На рис.1 наведено криву активації позаклітинним Na+ скерованого назовні транспорту цього іону, що здійснюється в обмін на субстратний Li+. Нами отримано дані, що в бета-клітинах острівців Лангерганса щура цей процес є функцією концентрацій позаклітинного Na+.
У таблиці 2 узагальнено значення окремих параметрів Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах острівців Лангерганса щура і, для порівняння, їх величини в еритроцитах цієї ж піддослідної тварини. Подібне дослідження виконано при двох концентраціях позаклітинного Na+ - 140 ммоль/л та 150 ммоль/л. Як свідчать наведені результати, у щура величини Vstd та Vmax Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах острівців Лангерганса виявились на 51% і 40%, відповідно, вищими, ніж такі в еритроцитах. |
Особливо великі відмінності кінетичних параметрів Na/Li-протитранспорту зареєстровано зі сторони величин Кm для Na+о, які в бета-клітинах острівців Лангерган-са були вдвічі нижчими порівняно з такими в еритроцитах, та співвідношення Vmax /Km, позаяк його значення в бета-клітинах виявились втричі вищими, ніж в еритроцитах. На основі отриманих нами даних можна припустити, що вказані відмінності певною мірою зумовлені різними значеннями спорідненості іонного транспортеру до позаклітинного Na+.
Рис.1. Вплив позаклітинного Na+ на
Vstd Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах острівців Лангeрганса щура (n=6; 300 мОсмоль/ кг; 37С)
Роль внутрішньоклітинного Na+ як модулятора Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах щура. Кінетичний аналіз параметрів Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах включав встановлення залежності швидкості вказаної іонної транслокації від концентрації внутрішньоклітинного Na+. З цією метою застосовано техніку обробки клітин шляхом їх витримування в розчині, що містив пара-хлормеркурібензенсульфонат.
Таблиця 2
Порівняння активності та кінетики Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах острівців Лангерганса і в еритроцитах щура |
Бета-клітини, n=6 | Еритроцити, n=6
Стандартна активність Vstd (ммоль Na+ 1 кг клітин-1 1 год-1) | 0,49 0,02 | 0,32 ,04
Константа Міхаеліса Km (Na+о) (ммоль/л) | 31,48 ,50 | 66,83 ,85
Максимальна швидкість Vmax (ммоль Na+ 1 кг клітин-1 1 год-1) | 0,70 ,02 | 0,50 ,06
Співвідношення Vmax/Km·10-3 | 22,45 0,43 | 7,42 ,27
Na-навантаження здійснювали при 5-ти концентраціях субстратного Na+ - від 8 до 70 ммоль/л. Частину вимірювань параметрів Na/Li-протитранспорту проведено за відсутності в середовищах потоку пара-хлормеркурібензенсульфонату, за умови 5-кратного промивання бета-клітин MgCl2-сахарозним розчином.
Після застосування методичних прийомів, що сприяли Na-навантаженню клітин, збільшення внутрішньоклітинних концентрацій цього іону, при яких значення стандартної активності Na/Li-протитранспорту були максимальними, становило в середньому 150 відсотків (табл.3).
Таблиця 3
Концентрація Na+ та К+ (ммоль 1 кг клітин-1) та
кінетичні параметри (ммоль Na+ · 1 кг клітин-1 · 1 год-1)
Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах острівців Лангерганса щура |
Промиті клітини | Навантажені натрієм клітини
Натрій | 17,00 ,84 | 41,65 ,75*
Калій | 88,65 ,87 | 63,21 ,67
Стандартна активність Vstd | 0,53 ,05 | 0,70 ,07*
Максимальна швидкість Vmax | 0,69 ,07 | 0,94 ,09*
Примітка. * - вірогідність р<0,05 стосовно величин в промитих клітинах
При вивченні кінетики Na/Li-протитранспорту отримано дані, які вказують на те, що цей обмін у певних межах є функцією концентрацій внутрішньоклітинного Na+. Так, його стандартна активність виразно пригнічується за різко зменшеної концентрації Na+і (10 ммоль 1 кг клітин-1), зростаючи в міру збільшення цього параметру. Проте за умови перевершення концентрації Na+і рівня понад 40 ммоль 1 кг клітин-1 гальмування вказаного процесу відновлюється, і швидкість останнього прямує до нуля, коли концентрації Na+ обабіч плазматичної мембрани наближаються до вирівнювання.
Порівняльний аналіз деяких біохімічних характеристик Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах та в еритроцитах щура і в еритроцитах людини.
Застосовуючи однакові методи аналізу, в даному дослідженні отримано результати, які засвідчують можливість обміну внутрішньоклітинного Na+ на позаклітинний Li+ не лише в бета-клітинах, але й в еритроцитах щура, хоча в останньому випадку цей процес здійснюється значно повільніше - Vstd Na/Li-протитранспорту становила (в ммоль Na+ 1 кг клітин_ 1 год-1): 0,32 ,04 проти 0,49 ,02, відповідно (p<0,05). Очевидно, біологічна доцільність високої іонної проникності плазматичної мембрани для Na+ полягає в тому, що клітини залозисто-епітеліальних тканин спеціалізовані на перенесенні більшої кількості іонів та молекул води впродовж здійснення процесів секреції (Saier H.M., 2000).
Vstd Na/Li-протитранспорту в еритроцитах 30-ти здорових осіб, об’єднаних у групу порівняння, сягала 0,24 ,01 ммоль Na+ 1 кг клітин-1 1 год-1. Отримані середні значення цього параметру не відрізняються від таких, встановлених дослідниками, які процес даної іонної транслокації вивчали як Na-стимульований Li-вихід (Canessa M., 1989; Dowd A. et al., 1994). Однак, в еритроцитах 9-ти осіб з обстежених 30-ти величини Vstd цього обміну перевершували 0,30 ммоль Na+ 1 кг клітин-1 1 год-1, а у 10-ти осіб з тієї ж загальної кількості були нижчими від 0,20 ммоль Na+ 1 кг клітин_ 1 год-1. Коли ж отримані значення Vstd згуртувати на основі статі осіб, які знаходились під спостереженням в даному дослідженні, то можна дійти висновку про більш високу інтенсивність Na/Li-протитранспорту в еритроцитах жінок, ніж в еритроцитах чоловіків, позаяк зареєстровані середні дані становили (в ммоль Na+ 1 кг клітин-1 1 год-1): 0,29 ,01 проти 0,18 ,02, відповідно; p<0,05.
Транспорт Na+ в бета-клітинах підшлункової залози щура за впливу випромінювання гелій-неонового лазера. Метою дослідження було вивчити взаємозв’язок між концентрацією внутрішньоклітинного Na+, інтенсивністю активного транспорту вказаного іону та максимальною швидкістю Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах острівців Лангерганса щурів, опромінених генерованим гелій-неоновим лазером монохроматичним червоним світлом.
Як засвідчують результати, наведені в таблиці 4, вплив на лабораторних щурів лазерної енергії в дозах 2,86 та 5,72 Дж см-2, розподілених на 10 15-хвилинних сеансів та 10 30-хвилинних сеансів, відповідно, не призводить до змін параметрів активного транспорту Na+. Однак, в бета-клітинах острівців Лангерганса щурів, опромінених МЧС у дозі 0,28 Дж см-2 (5 3-хвилинних сеансів) концентрація К+ виявилась вірогідно підвищеною. Як наслідок, індекс К+іNa+і був збільшеним на третину. Виникнення подібної метаболічної ситуації можна розглядати як вказівку на посилення процесів активного транспорту Na+ в клітинах, що їх досліджували. Вірогідність подібного припущення підтверджується напрямком змін і інших параметрів овабаїн-чутливої екструзії Na+.
Таблиця 4
Показники іон-транспортувальних процесів в бета-клітинах
острівців Лангерганса опромінених МЧС щурів:
концентрація Na+ та К+, співвідношення K+i /Na+i,
активність Na,K-АТФази (мкмоль Рі мг білка-1 1год_),
інтенсивність екструзії MNa+i,коефіцієнт екструзії KNa+i, V max Na/Li-протитранспорту
(ммоль Na+ 1 кг клітин-1 год-1) |
Контроль | 0,28 Дж/см2 | 2,86 Дж/см2 | 5,72 Дж/см2
Na+(ммоль 1 кг клітин-1) | 15,11 0,59 | 15,15 0,36 | 14,23 0,52 | 13,40 0,48
K+(ммоль 1 кг клітин-1) | 91,13 2,00 | 119,64 1,25* | 91,11 1,60 | 95,01 4,46
K+i /Na+i (од.) | 6,09 0,21 | 7,92 0,25* | 6,46 0,24 | 7,21 0,53
Na,K-АТФаза | 1,21 0,34 | 1,36 0,02 | 1,34 0,04 | 1,40 0,03
MNa+I(ммоль Na+ кг клітин_ год-1) | 4,05 0,08 | 6,11 0,07* | 4,62 0,21 | 4,95 0,12
KNa+I (1 год-1) | 0,27 0,01 | 0,40 0,07* | 0,32 0,02 | 0,37 0,04
Na/Li-протитранспорт | 0,71 0,06 | 0,41 0,02* | 0,48 0,03* | 0,69 0,02
Примітка. * - вірогідність p<0,05 стосовно контролю
Отримані дані служать доказом участі механізмів екструзії Na+ в підтриманні Na-градієнту в бета-клітинах острівців Лангерганса за впливу на організм лабораторних щурів випромінювання гелій-неонового лазера в низьких дозах і дозволяють узагальнити, що модуляція іонної проникності плазматичної мембрани є однією з найбільш ранніх дій вказаного фізичного чинника. Цей висновок узгоджується з одержаними в даному дослідженні результатами вимірювання максимальної швидкості Na/Li-протитранспорту.
ВИСНОВКИ
У дисертації відповідно до поставленої мети та задач дослідження обстежено як експериментальні транспортні моделі бета-клітини острівців Лангерганса щура і виявлено свідчення функціонування в них Na/Li-протитранспорту, інтенсивність здійснення якого визначається іонними, осмотичними та температурними факторами, що дозволило провести розв"язання нового наукового завдання - вивчення властивостей одного з овабаїн-резистентних механізмів транслокації моновалентних іонів в ендокринних клітинах підшлункової залози.
1. Вихід Na+ з бета-клітин, інкубованих у середовищі за наявності LiCl, відбувається в 2,5 рази інтенсивніше, ніж в середовищі, яке містить холінхлорид, що вказує на можливість здійснення стимульованої позаклітинним літієм транслокації внутрішньоклітинного Na+.
2. Вплив на бета-клітини залужненого інкубаційного середовища призводить до збільшення на третину стандартної активності та максимальної швидкості Na/Li-протитранспорту. Закиснення інкубаційного середовища такою ж мірою пригнічує стандартну активність вказаного іонного переміщення.
3. Функціонування механізму Na/Li-протитранспорту в процесі “холодової” інкубації (0,5?С) бета-клітин, внаслідок чого останні втрачають приблизно 60% К+ та накопичують 4-кратну кількість Na+, не проявляється. За часткового відновлення впродовж “теплової” інкубації (37?С) вихідних концентрацій цих іонів стандартна активність Na/Li-протитранспорту є вдвічі нижчою за таку, встановлену перед початком “холодової” інкубації.
4. Витримування бета-клітин в гіперосмоляльному середовищі (400 мОсмоль · 1 кг-1) призводить до зростання інтенсивності Na/Li-протитранспорту: Vstd - наполовину, Vmax - на третину. При їх інкубації в гіпоосмоляльному середовищі (200 мОсмоль · 1 кг-1) параметри вказаного іонного переміщення не змінюються. Одержані результати не заперечують, що механізм Na/Li-протитранспорту може приймати участь в регуляції об’єму бета-клітин.
5. Інкубація бета-клітин в ізоосмоляльному середовищі при температурі 40?С та 43?С не відбивається на базальній інтенсивності Na/Li-протитранспорту. Вплив на ці клітини гіперосмоляльного середовища за температури 40?С призводить до посилення названого обміну іонів (Vstd - на 20 %, Vmax - на 40 %). У процесі їх перебування в середовищі зазначеної осмоляльності при температурі 43?С параметри Na/Li-протитранспорту повертаються в межі значень, встановлених при температурі 37°С.
6. Активність скерованого з бета-клітин транспорту Na+, стимульованого літієм, має концентраційну (0...120 ммоль · 1 л-1) залежність від позаклітинного Na+. Цей іонний обмін в певних межах (10...40 ммоль · кг-1) є функцією концентрацій внутрішньоклітинного Na+, і його швидкість прямує до нуля, коли концентрації Na+ з обидвох сторін плазматичної мембрани наближаються до вирівнювання. Ці результати підтверджують можливість функціонування механізму Na/Li-протитранспорту при прогресивній зміні концентрацій Na+.
7. Стандартна активність Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах щура наполовину перевершує таку в його еритроцитах і є вдвічі вищою, ніж в еритроцитах людини. Вища швидкість вказаного іонного обміну в бета-клітинах щура узгоджується зі зменшеною вдвічі константою спорідненості Кm (Na+o).
8. Хронічний вплив на щурів енергії гелій-неонового лазера в сумарних дозах 0,28 Дж · см_ та 2,86 Дж · см-2 пригнічує на 42% та 32%, відповідно, максимальну швидкість Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах за відсутності змін концентрації внутрішньоклітинного Na+.
Список основних опублікованих за темою дисертації робіт
1. Шкаволяк А.В. Кінетичний аналіз Na/Li-протитранспорту при дослідженні проникності еритроцитарної мембрани для іонів Na+ //Експерим. клін. фізіологія і біохімія. – 1999. - №1. – С.7-11.
2. Шкаволяк А.В. Активність Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах підшлункової залози щура за впливу випромінювання гелій-неонового лазера //Бібліотека Одеського медичного журналу. – 1999. – Додаток 5 (55). – С.149-153.
3. Шкаволяк А.В. Вплив змін позаклітинного рН на швидкість Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах підшлункової залози щура //Матеріали ІV Міжнародного конгресу студентів і молодих вчених. – Тернопіль, 2000. – С.368-369.
4. Бобровник А.Д., Шкаволяк А.В., Гринчишин Н.М. Механізми транспорту моновалентних іонів в бета-клітинах підшлункової залози щура за впливу випромінювання гелій-неонового лазера //Актуальні проблеми медицини, біології, ветеринарії та сільського господарства. – Львів, 1998. – С.147-149. – Здобувачем проведено лазерне опромінення щурів, аналіз та інтерпретацію отриманих даних.
5. Na/Li-протитранспорт у хворих на хронічний алкоголізм / А.Р.Панас, А.В.Шкаволяк, О.А.Бурий, Н.М.Гринчишин // Вісник проблем біології та медицини. – 1998. – Вип.23. – С.128-132. – Здобувачем встановлено швидкість Na/Li-обміну в еритроцитах здорових осіб і здійснено статистичне обчислення отриманих даних.
6. Шкаволяк А.В., Галібей І.Б. Властивості систем Na,K,Cl-котранспорту та Na/Li-протитранспорту в еритроцитах людини //Збірник наукових праць співробітників КМАПО ім.П.І.Шупика. – Київ, 1999. – Вип.8, Кн.1. – С.294-296. – Здобувачем отримано та інтерпретовано матеріали стосовно Na/Li-протитранспорту і здійснено загальне редагування статті.
7. Шкаволяк А.В., Бобровник А.Д., Гринчишин Н.М. Температурна залежність швидкостей Na,K,Cl-котранспорту та Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах підшлункової залози щура //Наук. вісник Львів. держ. акад. ветер. мед. ім.С.З.Гжицького. – 2000. – Т.2, №2, Ч. 3. – С.264-266. – Здобувачем проведено аналіз даних щодо Na/Li-протитранспорту.
8. Гжегоцький М.Р., Шкаволяк А.В., Бобровник А.Д. Швидкість Na,K,Cl-котранспорту та Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах підшлункової залози щура. Вплив концентрації позаклітинного Na+ // Наук. вісник Львів. держ. акад. ветер. мед. ім. С.З.Гжицького. – 2000. – Т.2, №3-4. – С.19-23. – Здобувачем проведено дослідження Na/Li-протитранспорту, статистичне обчислення отриманих даних.
9. Шкаволяк А.В., Гринчишин Н.М. Дослідження Na-транспортуючих систем в діагностиці іонних мембранопатій // Експерим. клін. фізіологія і біохімія. – 2000. - №4. – С.63-66. – Здобувачем проведено пошук та систематизацію даних літератури.
10. Вплив осмотичного стресу на активність Na,K,Cl-котранспорту та Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах підшлункової залози щура / А.Д.Бобровник, А.В.Шкаволяк, Н.М.Гринчишин, А.В.Манченко // Мед. хімія. – 2001. – Т.3, №1. – С.24-27. – Здобувачем опрацьовано фрагмент роботи стосовно вивчення властивостей Na/Li-протитранспорту.
11. Бобровник А.Д., Гринчишин Н.М., Шкаволяк А.В. Кінетичні механізми Na,K,Cl-котранспорту та Na/Li-протитранспорту в ізольованих бета-клітинах щура //Фізіол. журнал. – 1998. – Т.44, №3. – С.153. – Здобувачем проведено дослідження Na/Li-протитранспорту, статистичне обчислення отриманих даних.
12. Шкаволяк А.В., Бобровник А.Д., Ковальський П.П. Дослідження Na/Li-протитранспорту в діагностиці іонних мембранопатій // Тези ХІV з’їзду терапевтів України. – Київ, 1998. – С.22. – Здобувачем виміряно швидкість Na/Li-протитранспорту в здорових осіб і проведено статистичне обчислення отриманих даних.
13. Shkavoliak A., Bajsa I. Comparison of Na/Li countertransport process of human and rat erythrocytes //2nd Internacional studente and 9th EMSA International Scientifice Symposium. – Lublin, 2000. – P.135. – Здобувачем проведено дослідження Na/Li-протитранспорту в еритроцитах людини та щура.
14. Шкаволяк А.В., Байса І.Ю., Ленишин Г.М. Визначення активності та кінетичних характеристик Na/Li-протитранспорту в еритроцитах людини //Матеріали Міжнародної медичної конференції студентів і молодих вчених “Сучасні проблеми клінічної та теоретичної медицини”. – Дніпропетровськ, 2001. – С.181-182. – Здобувачем проведено дослідження Na/Li-протитранспорту в еритроцитах практично здорових осіб та підготовка тез до друку.
15. Шкаволяк А.В., Байса І.Ю. Розмаїття механізмів транслокації літію через плазматичну мембрану. Видова та органна специфічність Na/Li-протитранспорту //Матеріали V Міжнародного конгресу студентів та молодих вчених. – Тернопіль, 2001. – С.170. – Здобувачем порівняно інтенсивність Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах і еритроцитах щура та еритроцитах людини.
16. Шкаволяк А.В., Павлюст Л.П., Манченко А.В. Внутрішньоклітинний Na+ як модулятор Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах щура // Тези доповідей ІІІ з’їзду Українського біофізичного товариства – Львів, 2002. – С.136. – Здобувачем проведено аналіз параметрів Na/Li-протитранспорту, статистичне обчислення та інтерпретацію отриманих даних.
17.Стандартна активність Na/Li-протитранспорту в еритроцитах жінок та чоловіків / І.Й.Влох, А.В.Шкаволяк, Л.П.Павлюст, Н.М.Гринчишин, І.Ю.Байса // Укр. медичні вісті. – 2003. – Т.5, №1 (63). – С.157. – Здобувачем виміряно інтенсивність Na/Li-протитранспорту і здійснено статистичне обчислення отриманих даних.
18. Шкаволяк А.В., Павлюст Л.П., Гринчишин Н.М. Гіперосмотична регуляція Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах підшлункової залози щура //Буковинський медичний вісник. – 2003. - №1-2. – С.172-173.– Здобувачем проведено вивчення особливостей обміну іонів за базальних та гіперосмотичних умов.
Анотація
Шкаволяк А.В. Ідентифікація та біохімічна характеристика Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах підшлункової залози щура. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Інститут біології тварин УААН, Львів, 2004.
Ця праця досліджує гіпотезу можливого здійснення в острівцях Лангерганса лабораторного щура Na/Li-протитранспорту як мембранної функції, що забезпечує обмін внутрішньоклітинного Na+ на позаклітинний Li+. Застосовуючи стандартну фармакокінетичну техніку аналізу, в бета-клітинах острівців Лангерганса, ізольованих ензиматичним розщепленням, визначено концентрацію К+ та Na+, стандартну активність та максимальну швидкість цього обміну, константу спорідненості до позаклітинного Na+ (Km), індекс Vmax /Km . 10-3. Проведено вивчення впливу рН, температури та осмоляльності позаклітинного середовища, концентрацій внутрішньоклітинного та позаклітинного Na+ на ці кінетичні параметри іонного обміну. Крім того, дане дослідження, виконане зі застосуванням однакових методів аналізу, було спрямоване на вирішення наступних завдань: 1) порівняння, які властивості Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах та в еритроцитах щура і в еритроцитах людини є подібними; 2) обстеження окремих показників активного транспорту Na+ та Na/Li-протитранспорту як індикаторів чутливості до випромінювання низькоенергетичного гелій-неонового лазера.
Результати даного дослідження засвідчують можливість функціонування в бета-клітинах острівців Лангерганса лабораторного щура механізму, який здійснює Na/Li-протитранспорт. Іонні, осмотичні та температурні зміни і різновекторні коливання рН в позаклітинному середовищі мають відношення до виникнення аномалій в бета-клітинах, які маніфестуються модуляцією властивостей Na/Li-протитранспорту. Інтенсивність цього обміну в бета-клітинах щура є вищою, ніж в його еритроцитах і в еритроцитах здорової людини. Хронічний вплив на щурів випромінювання гелій-неонового лазера в дозах 0,28 Дж см-2 та 2,86 Дж см-2 проявляється в бета-клітинах пригніченням максимальної швидкості Na/Li-протитранспорту.
Ключові слова: Na/Li-протитранспорт, активний транспорт Na+, бета-клітини острівців Лангерганса, еритроцити, фармакокінетичний аналіз, лабораторні щурі, гелій-неоновий лазер.
Аннотация
Шкаволяк А.В. Идентификация и биохимическая характеристика Na/Li-противотранспорта в бета-клетках поджелудочной железы крысы. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. – Институт биологии животных УААН, Львов, 2004.
В работе на основании данных литературы о модуляции в эритроцитах больных диабетом свойств ион-транспортирующих механизмов, посредством которых осуществляется обмен Na+ на Li+, сформулирована гипотеза о возможности функционирования в эндокринных клетках поджелудочной железы системы, принимающей участие в двухнаправленной транслокации названных ионов. Эта гипотеза проэкзаменирована автором на примере бета-клеток островков Лангерганса лабораторной крысы путем изучения Na/Li-противотранспорта как мембранной функции, обменивающей внутриклеточный Na+ на внеклеточный Li+.
Выделение островков Лангерганса проведено седиментационным методом с использованием коллагеназы для энзиматического расщепления тканей эндокринной части поджелудочной железы. Сохранение структурной интактности бета-клеток, подтвержденное результатами окрашивания трипановым синим и електронно-микроскопически, послужило обоснованием для их использования в качестве экспериментальных транспортных моделей.
В бета-клетках методом пламенной фотометрии определены концентрации ионов K+ (96,28 +/- 1,74 ммоль .1 кг клеток -1) и Na+ (15,60 +/- 0,44 ммоль . 1 кг клеток -1), методом фармакокинетического анализа - стандартная активность Na/Li-противотранспорта (0,49 0,02 ммоль Na+ 1 кг клеток-1 1 час-1) и максимальная скорость этого обмена (0,70 0,01 ммоль Na+ . 1 кг клеток-1 1 час-1), константа сродства (Km) к внеклеточному Na+ (31,48 1,50 ммоль 1 л), индекс Vmax/Km . 10-3 (22,45 0,43). Показано, что стандартная активность этого обмена в интактных бета-клетках превышает на 50% таковую в эритроцитах крысы и на 100% - в эритроцитах здорового человека. Кроме того, настоящее исследование направлено на решение следующих задач: 1) сравнение, какие свойства Na/Li-противотранспорта проявляют идентичность в бета-клетках и эритроцитах крысы и эритроцитах человека; 2) изучение отдельных показателей активного транспорта Na+ и Na/Li-противотранспорта как индикаторов чувствительности к излучению низкоэнергетического гелий-неонового лазера.
Показано, что для выявления в бета-клетках Na/Li-противотранспорта и определения его биохимического базиса правомерно использование тех ж методов анализа, которые разработаны для его изучения в эритроцитах человека.
Основной вывод проведенного исследования состоит в том, что в бета-клетках изолированных островков Лангерганса лабораторной крысы может