МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

УКРАЇНСЬКА МЕДИЧНА СТОМАТОЛОГІЧНА АКАДЕМІЯ

На правах рукопису

Крутікова

Елла Іванівна

УДК 618. 146-002.446:615.37

КЛІНІКО-ПАТОГЕНЕТИЧНЕ ОБҐРУНТУВАННЯ КОМПЛЕКСНОЇ ТЕРАПІЇ ЕНДОЦЕРВІКОЗІВ,

УСКЛАДНЕНИХ ПАПІЛОМАВІРУСНОЮ ІНФЕКЦІЄЮ

14.01.01 – АКУШЕРСТВО ТА ГІНЕКОЛОГІЯ

Автореферат дисертації

НА ЗДОБУТТЯ НАУКОВОГО СТУПЕНЯ

КАНДИДАТА МЕДИЧНИХ НАУК

Київ – 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі акушерства та гінекології Української медичної стоматологічної академії МОЗ України, м. Полтава

Науковий керівник

доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України, Громова Антоніна Макарівна, завідувач кафедри акушерства і гінекології Української медичної стоматологічної академії

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор, член-кореспондент АМН і НАН України, Степанківська Галина Констятинівна Національний медичний університет ім. О. О. Богомольця МОЗ України, професор кафедри акушерства і гінекології № 1

доктор медичних наук, професор Татарчук Тетяна Феофанівна, Інститут педіатрії, акушерства та гінекології АМН України, завідувач відділення ендокринної гінекології

Провідна установа:

Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика (м. Київ)

Захист відбудеться 2 грудня 2004 р. о 1330 годині на засіданні спеціалізованої ради Д 26. 003. 03 при Національному медичному університеті ім. О. О. Богомольця (м. Київ, бул. Шевченко, 13)

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Національного медичного університету ім. О. О. Богомольця (м. Київ, Зоологічна, 3)

Автореферат розісланий 30 жовтня 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

к. мед. н., доцент Я. М. Вітовський

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність. Ендоцервікоз – найчастіше фонове захворювання шийки матки (ШМ) у молодих жінок, яке становить 25–65,6% доброякісної цервікальної патології (Василевськая Л. Н., 1987, Рудакова Е. Б., 1996). Можливість розвитку передраку на фоні ендоцервікозу остаточно не з’ясовані, а рівень діагностики диспластичного процесу залишається невисоким: близько 17% (Коханевич Е. В., 1997). Єтіопатогенетичними факторами ендоцервікозу традиційно вважаються гормональний дисбаланс, запальний процес, травми шийки матки (Степанківська Г. К., 1999, Вишнякова С. В., 2000), і недостатньо враховуються онкогенні інфекції та порушення локального імунітету, що призводять до цервікальної інтраепітеліальної неоплазії (ЦІН) (Прилепская В. Н., 1990, Zur Hausen H., 2002). Провідним інфекційним чинником ЦІН та раку шийки матки визнано вірус папіломи людини (ВПЛ) (Harmsel B., 1999. Киселев Ф. Л., 2000). Асоціація ВПЛ-інвазії із доброякісними станами шийки матки, недостатньо освітлена хоча відомо, що папіломавірус присутній у 12-65% цієї патології (Минкина Г. Н., 1998). Сьогодні потрібні нові методи ранньої діагностики фонової цервікальної патології з урахуванням всіх факторів ризику малігнізації.

На фоні ВПЛ-інфекції існує проблема розбіжності цитологічного та гістологічного діагнозів (Хмельницький О. К., 2000), тому ідентифікацію папіломавірусу запропоновано як первинний скринінг на шляху до стандартизації цитологічних даних (Воробйова Л. І., 2002). Впровадження цього заходу при ендоцервікозі доцільно поширювати. З метою ранньої діагностики неоплазій провідними лабораторіями світу досліджуються імуногістохімічні маркери цитоонкотрансформації, експресія яких залежить від ступеню патоморфологічних змін (Sano T. 1998, Klaes R., 2002), але при ендоцервікозі такі тести не проводились. Недостатньо відомостей про локальний клітинний імунітет шийки матки, як противірусний захист слизової оболонки, хоча до імунних порушень при цервікальній патології звертались численні дослідники (Poppe W. A., 1996, Лакатош В. П., 1998, Вакуленко Г. А., 2000).

До теперішнього часу не розроблені ефективні схеми лікування і профілактики вірусіндукованої малігнізації, хоча впроваджуються різні зособи імунокорекції при цервікальній патології, асоційованій із папіломавірусною інфекцією (Пинегин Б. Б., 1997, Манухин И. Б., 1998).

Таким чином, розробка нових діагностично-терапевтичних комплексів з урахуванням ролі папіламавірусу та локального імунітету при ендоцервікозі, широко розповсюдженого серед молодих жінок, сприятиме ефективній профілактиці та ранньому виявленню раку шийки матки.

Зв’язок роботи із науковими програмами, темами. Робота є фрагментом планової науково-дослідної роботи кафедри акушерства та гінекології Українсьої медичної стоматологічної академії: „Особливості гомеостазу внутрішнього середовища організму жінок із гінекологічними захворюваннями і вагітних з акушерською та екстрагенітальною патологією, вплив методів їх конструктивного і оперативного лікування на стан репродуктивного здоров’я, перебіг вагітності, пологів, післяпологового періоду, на стан плоду і новородженого” (№ державної реєстрації 0103U001311).

Мета роботи. Підвищити ефективність лікування ендоцервікозу шляхом поглиблення діагностики та удосконалення терапевтичних заходів на основі ідентифікації вірусу папіломи людини, встановлення взаємозв’язків особливостей морфологічної структури та клітинних імунних факторів слизової оболонки шийки матки.

Задачі дослідження.

1. З’ясувати частоту інфікування папіломавірусом високого онкогенного ризику (серотипи 16 і 18) жінок із ендоцервікозом.

2. Визначити морфологічні особливості ектоцервіксу при ендоцервікозі в залежності від ВПЛ-інфікування.

3. Встановити діагностичну цінність кольпоскопічного та цитологічного досліджень шийки матки шляхом співставлення їх результатів з даними верифікації.

4. Встановити ризик малігнізації шийкового епітелію на тлі ендоцервікозу з використанням біохімічного маркеру цитоонкотрансформації, білка р16NK4а.

5. Охарактеризувати клітинні імунні фактори слизової оболонки ШМ при ендоцервікозі залежно від ВПЛ-інфікування та особливостей патоморфологічних змін.

6. Визначити взаємозв’язок стану локального клітинного імунітету та проявів дисплазії шийкового епітелію при ендоцервікозі.

7. Удосконалити методику лікування ендоцервікозу і дати оцінку ефективністі комплексного використання сучасних імуномодуляторів при цій патології на клінічному та морфологічному рівнях.

Об’єкт дослідження - морфологічна структура та імунологічний апарат слизової оболонки шийки матки при ендоцервікозі, асоційованому із ВПЛ-інфекцією

Предмет дослідження - розробка діагностично-лікувального комплексу з використанням імуномодуляторів, спрямованого на відновлення імунологічного апарату та морфологічної структури слизової оболонки шийки матки при ендоцервікозі на фоні ВПЛ-інфекції.

Методи дослідження – клінічні, вірусологічний, кольпоскопічний, цитологічний, гістологічний, імуногістохімічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. В дисертаційній роботі вперше проаналізовані результати вірусологічного скринінгу на папіломавірус високоонкогенної групи у жінок із ендоцервікозом.

Всебічно представлена морфологічна структура слизової оболонки ШМ із визначеннням її особливостей при ендоцервікозі на фоні ВПЛ-інфекції. Вперше у кожному п’ятому випадку ендоцервікозу підтверджена цервікальна інтраепітеліальна неоплазія високочутливим імуногістохімічним тестом на маркер цитоонкотрансформації, білок р16ІNK4а, що свідчить про високий потенціал до малігнізації ектопії шийкового епітелію. Вперше проаналізовані кількісно-якісні параметри локальних імунних клітинних факторів (CD4+, CD8+, CD19+, HLA-DR+), які корелювали із числом диспластично „ушкоджених” вірусінфікованих епітеліоцитів на користь цервікального клітинного імунодефіциту при ендоцервікозі.

Вперше запропоновано удосконалений діагностично-лікувальний алгоритм при ендоцервікозі, спрямований на регрес вірус індукованого диспластичного процесу та подолання локального імунодефіциту.

Практична цінність. Розроблено і обґрунтовано 4-х етапний діагностично-лікувальний комплекс при ендоцервікозі з урахуванням інфікованості папіломавірусом, стану місцевого клітинного імунітету ШМ та комбінованим використанням сучасних імуномодуляторів (неовіру, протефлазіду, віферону) до і після деструкції патологічного вогнища. Запропонований комплекс дозволяє своєчасно діагностувати вірусіндукований диспластичний процес на фоні ендоцервікозу, досягати максимальної співбіжності цитологічного та гістологічного діагнозів, диференійовано вибирати спосіб деструкції ШМ, а також скоротити терміни епітелізації на 10-12 діб, зменшити кількість ускладнень та рецидивів протягом року, в середньому, у 3 рази. Запропонований комплекс використовується в роботі жіночих консультацій м. Полтави та Полтавської області. Матеріали досліджень впроваджені у педагогічний процес на кафедрі акушерства та гінекології УМСА м. Полтави.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно проведені інформаційно-патентний пошук і аналіз наукової літератури за темою роботи. Автор виконувала клініко-кольпоскопічні, цитологічні обстеження шийки матки, брала участь в проведенні гістологічних, імуногістологічних, вірусологічних обстежень 232 жінок, здійснювала диспансерний нагляд за пацієнтками в період з 2001 по 2003 роки. Розроблена та обґрунтована методика комплексного лікування ендоцервікозів із використанням сучасних імуномодуляторів із оцінкою ефективності та статистичним аналізом.

Апробація. Основні положення дисертації доповідались і обговорювались на науково-практичній конференції „Сучасні принципи діагностики та лікування візуальних форм геніального раку у жінок. Якість життя” (м. Львів, 2002 р.), на науково-практичній конференції з міжнародною участю „Актуальні питання патології шийки матки” (м. Тернопіль, 2003 р.), на Вченій Раді НДІ Канцерогенезу РОНЦ ім. Н. Н. Блохіна РАМН (м. Москва, 2003), на засіданнях Полтавського товариства акушер-гінекологів (2003 р.), на засіданні апробаційної ради №1 Української медичної стоматологічної академії (27. 04. 2004).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 10 друкованих робіт, із них 4 – статті без співавторів, опубліковані у журналах, затверджених ВАК України, патент на корисну модель та інформаційний лист.

Обсяг і структура дисертації. Роботу виконано на 165 сторінках машинописного тесту, ілюстровано 20 таблицями та 29 рисунками, які займають 26 сторінок. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису методів дослідження, 3 розділів власних досліджень, аналізу й узагальнення результатів дослідження, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних джерел, з них 129 кирилицею і 99 латиною.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. В основу роботи покладено матеріали дослідження шийки матки 232 жінок віком від 18 до 37 років, яких розподілено на 4 групи. Для визначення впливу ВПЛ-інфекції на слизову оболонку ШМ контрольними вважали І та ІІІ групи, до яких увійшли пацієнтки без ВПЛ-інфекції: 84 із візуально здоровою ШМ (Ігр.) та 48 із ендоцервікозом (ІІІгр.). Групи порівняння склали ВПЛ-носії: 35 із візуально здоровою ШМ (ІІгр.) та 65 із ендоцервікозом (ІVгр.). Групи рандомізовані за віком, анамнезом, клінічною характеристикою та гормональним статусом. Обсяг обстеження складався із мікробіологічного, вірусологічного, кольпоскопічного, цитологічного, патоморфолоігчного та імуногістохімічного досліджень ШМ. Для виключення дії побічних факторів, насамперед, статевих інфекцій, спочатку проводилась антибактеріальна протизапальна терапія до нормалізації мікрофлори піхвового середовища, після чого здійснювалось первинне дослідження. Визначення онкогенних 16 та 18 типів папіломавірусу та бактеріальної мікрофлори проводився методом полімеразної ланцюгової реакції. Кольпоскопічне дослідження виконувалось за допомогою кольпоскопу Kolposcop-E („Carl Zeiss, Німеччина) та оцінювався за клініко-ендоскопічною класифікацією Е.В. Коханевич і К.П. Ганіної (1997) та міжнародною термінологією кольпоскопічних термінів (Рим, 1990). Цитологічне дослідження мазків проводили за методикою Папенгейма та класифікацією Папаніколау. Для оцінки морфологічної структури цервікобіоптатів керувалися класифікацією І. А. Яковлевої і Б. Г. Кукуте (1977). Клітинні імунні фактори слизової оболонки ШМ (CD4+, CD8+, CD19+, HLA-DR+клітин) досліджували в цервікобіоптатах непрямим біоти-екстравідін пероксидазним методом з елементами власного модифікування (патент 2530 А 61 В17/42 Україна). Надана паралельна характеристика морфологічної структури ектоцервіксу та кількісно-якісних параметрів локальних CD4+, CD8+, CD19+, HLA-DR+клітин. Кількість імуноцитів з’ясовувалась морфометричним методом стандартних площ у 5 полях зору (х 60). З метою ідентифікації елементів цитоонкотрансформації в перехідній зоні епітелію при ендоцервікозі проводився імуногістохімічний тест на білок p16 INK4a у цервікобіоптатах за методикою R. Klaes at al., (Німеччина, 2001). При інтерпритації результатів виділяли 5 типів забарвлення тест-позитивних клітин: від 0 до 25%. Для вивлення етіопатогенетичних зв’язків між змінами морфологічної структури та локального клітинного імунітету ШМ проводився кореляційний аналіз рівня атипових клітин у цитограмах та імуноцитів у цервікобіоптатах.

108 пацієнткам призначалось комплексне лікування із поетапним використанням імуномодуляторів: неовіру, протефлазіду, віферона, які використовувались до та після деструкції патологічного вогнища шляхом кріо-, хіміо- та діатермоелектровпливу. Решті жінкам застосовували традиційну тактику ведення ендоцервікозу із санацією піхви та деструкцією ШМ за показаннями згідно наказу №503 МОЗ України. Для оцінки ефективності запропонованої терапії порівнювали результати обстеження до та після імуномодуляції, а також співставляли цитоморфологічні параметри ШМ, терміни епітелізації ектоцервіксу, частоту ускладнень та рецидивів протягом року, залежно від способу лікування.

Отримані кількісні результати досліджень оброблені за допомогою методів варіаційної статистики, включаючи кореляційний аналіз. Порівняння вірогідності відмінностей здійснювалось за критерієм Стьюдента. Різницю вважали достовірною при р< 0,05.

Результати досліджень та їх обговорення. Отримані дані свідчать про високу латентну та субклінічну ВПЛ-інфікованість жінок із ендоцервікозом (57,5±9,3%), яка була у 2 рази більшою ніж пацієнток із клінічно здоровою ШМ (29,4±8,4%). Епідеміологічні дослідження дозволили доповнити „традиційні” фактори ризику ВПЛ-інфікованості, які мали місце у наших пацієнток (раннє статеве життя, високий проміскуїтет, часті пологи та аборти, супутні статеві інфекції), такими як захворюваність на ендоцервікоз та екстрагенітальна патологія, пов’язана із імунодефіцитом та дисбактеріозом (часті ГРВІ та хронічні захворювання травної системи).

Аналіз кольпоскопічної семіотики показав, що ектопія циліндричного епітелію супроводжувалась кольпоскопічними ознаками дисплазії у перехідній зоні у кожному 4-му випадку, причому за умов ВПЛ-інфекції – у 4 рази частіше. Осередки ЦІН містили ацедобілий епітелій (маркер ВПЛ-інфекції) у 82,1%, що характеризує зону трансформації шийкового епітелію як імовірні „ворота” вірусної інвазії. Ацедобілий епітелій реєструвався у 5 разів частіше у ВПЛ-носіїв із ендоцервікозом, ніж із візуально нормальною ШМ, що надає ендоцервікозу статус сприятливого фону для вірусної інвазії.

Аналізучи результати цитологічного дослідження ШМ, ми відзначили перевагу „цитологічної” дисплазії (33,3%) перед „цитологічним” запаленням (19%) у 1,7 рази, що пояснювали високою частотою ВПЛ-інвазії у вивчаємій популяції. Контрастною ця перевага була у ІV групі, із ВПЛ-позитивним ендоцервікозом, при якому питома вага мазків ІІІ та ІV типів була у 6 разів більшою ніж при ВПЛ-негативному (ІІІ група) (див. рис.1).

ІІІ група

ІV група

Рис 1. Розподіл цервікоцитограм за типами по Папаніколау

Цитологічні маркери ВПЛ-інфекції визначалися у цервікоцитограмах навіть при відсутності її клінічних проявів. Абсолютна кількість атипових клітин у мазках на фоні ендоцервікозу зростала у 2,1 рази (дискаріоцитів) і у 3,7 рази (двохядерних) порівняно із таковою при незміненій ШМ.

Із патогістологічних проявів ВПЛ-інфекції були відзначені лімфоцитарно-плазмоцитарна інфільтрація строми ШМ, парабазальна проліферація, койлоцитоз та поліморфна гістологічна картина ЦІН. Частота лімфоцитарних інфільтратів у ВПЛ-позитивних цервікобіоптатах була більшою у 4,6 рази ніж у ВПЛ-негативних. Цей феномен корелював із підвищенням кількості дендритних імуноцитів у гістологічних зразках ендоцервікозу, підкреслюючи імунологічний характер лімфоцитарної інфільтрації, яка взаємопов’язана із процесами епітеліальної трансформації та проліферації. Іншими українськими дослідниками також спостерігалось підвищення щільності лімфоцитарно-плазмоцитарного інфільтрату поверхневих та глибоких шарів строми при ендоцервікозі, поєднаному із ЦІН (Сельский П. Р. та інш., 2003), але кількісної характеристики імунокомпетентних клітин ними не наводилось. Парабазальна інфільтрація констатувалась у 1,9 рази частіше на фоні ВПЛ-інфекції, ніж за умов відсутності папіломавірусу. Койлоцитоз ми зарестрували тільки у ВПЛ-носіїв, що підкреслює специфічну природу цього явища. Із 3-х існуючих типів ендоцервікозу потенційно передпухлинним виявився епідермізуючий, бо у 52,2% зразків із епідермізуючим ендоцервікозом морфологічна структура епітелію була у „гіршому” стані, ніж у біоптатах із звичайним та проліферуючим ендоцервікозом: ускладнювалась ЦІН у 5,3 та 1,9 разів частіше, відповідно. Тропність папіломавірусу до метапластичного епітелію під час епітелізації пояснює, чому епідермізуючий ендоцервікоз дав найбільшу частоту ознак вірусіндукованої ЦІН. Це заперечує статусу ендоцервікоза, як фізіологічного процесу. Імовірно, що хронічно персистуючий папіломавірус індукує не запальний, а диспластичний процес у шийковому епітелію.

При співставленні кольпоскопічного, цитологічного та патоморфологічного діагнозів визначена розбіжність між цитологічним та гістологічним у ВПЛ-позитивній групі у 52,3%, р<0,05 (феномен цитологічної гіпердіагностики) та відсутність цієї розбіжності у ВПЛ-негативній групі. Кольпоскопічні дані співпадали із гістологічними у 96,8% (у ВПЛ-негативних) та 97,9% (у ВПЛ-носіїв), що підкреслило їх високу діагностичну цінність (рис. 2).

Рис.2. Частота ЦІН на фоні ендоцервікозу

Цитологічна „гіпердіагностика” свідчила про необхідність диференціювання атипових клітин за походженням, що не передбачає класифікації Папаніколау.

Результати молекулярно-біологічного дослідження ШМ були на користь верифікації. Білок р16INK4a (специфічний імуногістохімічний маркер цитоонкотрансформації) дав гіперекспресію у 19,1% зразків ендоцервікозу за рахунок тих цервікобіоптатів, які містили осередки дисплазії. Верифікована ЦІН підтвердилась маркером цитотрансформації у 53,3%. Забарвлення гістологічних зразків на білок р16INK4a посилювалось тільки у диспластично „пошкоджених” клітинах, прямо пропорційно ступеню атипії. Отримані результати узгоджуються із даними дослідників із Німеччини та Росії, які відзначають тенденцію до посилення експресії p16INK4a при дисплазіях, порівняно із епітелієм без диспластичних уражень (R. Klaes, 2000, Киселев Ф. Л., 2002). У ВПЛ-позитивних комбінованих біоптатах, де ЦІН поєднувалась із ендоцервікозом, глибки білка р16INK4a були знайдені нами у цитоплазмі атипових клітин, тоді як у зразках Ca in situ (взятих для порівняння із архіву) забарвлювались ядра епітеліоцитів. Цей феномен ми пояснювали тим, що ВПЛ-інфекція у наших пацієнток мала субклінічний та латентний характер і папіломавірус персистував, скоріше, в епісомальній формі, не реалізуючи свій онкогенний потенціал у повній мірі, тоді як при малігнізації ДНК вірусу інтегрує з ядром клітини-„хазяїна”.

„Утримання” вірусу в латентному стані зумовлює напруження цервікального імунітету і, навпаки, дисемінація ВПЛ-інфекції в організмі триває на тлі імунодефіциту. При дослідженні локального клітинного імунітету у цервікобіоптатах при ВПЛ-позитивному ендоцервікозі ми зареєстрували достовірне зниження рівня CD4+ та CD8+імуноцитів і розцінювали це як послаблення імунно-захисних властивостей ектоцервіксу, зумовлене колонізацією слизової оболонки ШМ папіломавірусом та несприятливим для імунокомпетентних клітин передпухлинним мікрооточенням у зонах ЦІН. Свій висновок ми підкріплювали верифікацією вірусіндукованих диспластичних змін шийкового епітелію паралельно із дефіцитом хелперних та цитотоксичних імуноцитів. Антигенпрезентуючі дендритні HLA-DR+клітини на фоні ВПЛ-інфекції мали зіркоподібно розвинені цитоплазматичні відростки (для поширення активної площі), скупчувались побіля базальної мембрани (ознака активного руху), кількісно збільшувались порівняно із ВПЛ-негативним варіантом. Локалізація цих імуноцитів відображала "ворота" вірусної інвазії та патологічної проліферації епітеліоцитів: базальний і парабазальний шари епітелію. Враховуючи властивість папіломавірусу інфікувати, насамперед, камбіальні епітеліоцити, базальні скупчення дендритних клітин ми розцінювали як адекватне залучення їх у зону вторгнення вірусу для "утримування" його в базальному шарі епітелію, як у "резервному сховищі". Про такі властивості дендритних клітин існують поодинокі повідомлення (Гантиевская Ю.А., 2001, Макаренкова В.П., 2002). Але відносний дефіцит Т-лімфоцитів та наявність дисплазії, паралельно із підвищенням рівня HLA-DR-молекул, не дозволили вважати імунний противірусний захист ектоцервіксу при ендоцервікозі достатнім. Кількість CD19+клітин (попередників В-лімфоцитів) та їх локалізація (субепітеліальна строма) не залежала від ВПЛ-інфікованості. Присутність незрілих В-лімфоцитів у цервікобіоптатах свідчила про резервні можливості імунологічного апарату ШМ для гуморального імунного захисту.

Важливим результатом проведеної роботи було виявлення сильних та значимих кореляційних зв’язків (p<0,05) між числом імуноцитів у біоптатах і кількістю атипових клітин у мазках-відбитках із ектоцервіксу.

При ВПЛ-негативному ендоцервікозі був зареєстрований зворотній корелятивний взаємозв’язок між цитологічними маркерами ЦІН та лімфоцитами CD4+, CD8+, CD19+ (таблиця 1). Це означає, що зменшення рівня імуноцитів у тканині ШМ супроводжується збільшенням атипових епітеліоцитів у цервікоцитограмах, притаманних ЦІН.

При ВПЛ-позитивному ендоцервікозі вище зазначені кореляційні зв’язки також мали місце(таблиця 2). Цитологічні маркери ВПЛ-інфекції (койлоцити, двохядерні клітини) були у достовірно зворотній кореляційній взаємозалежністі (р<0,05) з CD4+ імуноцитами („хелперами”) та CD8+імуноцитами (цитотоксичними). Така кореляція вказувала на вибіркову участь локального клітинного Т-імунітету у противірусному захисті, дефіцит якого сприяє ВПЛ-інфікованості шийки матки.

Спільною для обох груп, незалежно від ВПЛ-ніфікованості, виявився характер зв’язку дендритних та атипових клітин. Кількість дендритних HLA-DR+імуноцитів корелятивно підвищувалась разом із числом диспластично „ушкоджених” клітин, що свідчить про відносну напругу антиген-презентуючої ланки місцевого імунітету при ендоцервікозі у відповідь на з’явлення передпухлинної трансформації епітеліоцитів.

Таким чином, виявлені кореляційні зв’язки свідчили про єдиний патогенетичний механізм імунопатичних та патоморфологічних змін в епітелії шийки матки при ендоцервікозі та про подвійний вплив папіломавірусної інфекції як на імунологічний апарат, так і морфологічну структуру ектоцервіксу. Виявлена кореляція ще раз підкреслює необхідність діагностики стану клітинно-опосередкованого локального імунітету в цервікобіоптах із перехідної зони ектоцервіксу для визначення ступеню патоморфологічних змін і відповідного лікування.

Таблиця 1.

Кореляційні зв’язки імуноцитів з атиповими епітеліоцитами при ВПЛ-негативному ендоцервікозі n=24 |

Дискаріоцити

Дискаріоцити |

2-х ядерні

2-х ядерні |

r =0,95+0,01 Тут і далі r–коефіцієнт кореляції

(p<0,001) | СД4+

СД4+клітини– |

0,90+0,06

(p<0,001)– | 0,81+0,10

(p<0,001) | СД8+

СД8+клітини– |

0,99+0,006

(p<0,001)– | 0,95+0,04

(p<0,001) | 0,81+0,10

(p<0,001) | СД19+

СД19+клітини– |

0,90+0,06

(p<0,001)– | 0,94+0,05

(p<0,001)– | 0,74+0,18

(p<0,001) | 0,95+0,01

(p<0,001) | HLA-DR+

HLA-DR+
клітини |

0,92+0,05

(p<0,001) | 0,86+0,09

(p<0,001)– | 0,89+0,06

(p<0,001)– | 0,89+0,06

(p<0,001)– | 0,84+0,11

(p<0,001)

Таблиця 2.

Кореляційні зв’язки імуноцитів з атиповими епітеліоцитами при ВПЛ-позитивному ендоцервікозі n=32 |

Койлоцити

Койлоцити |

Дискаріоцити

Дискаріоцити

r=0,91+0,02*

(p<0,001) | 2 ЯДК

2-х ядерні |

0,92+0,07

(p<0,001) | 0,91+0,02

(p<0,001) | СД4+

СД4+клітини– |

0,65+0,14

(p<0,01)– | 0,65+0,14

(p<0,01)– | 0,75+0,12

(p<0,01) | СД8+

СД8+клітини– |

0,49+0,09

(p<0,05)– | 0,43+0,21

(p<0,5)– | 0,60+0,16

(p<0,05) | 0,88+0,05

(p<0,0001) | СД19+

СД19+клітини– |

0,48+0,19

(p<0,5)– | 0,59+0,17

(p<0,05)– | 0,49+0,19

(p<0,5) | 0,62+0,15

(p<0,01) | 0,39+0,21

(p<0,5)

HLA-DR+
клітини |

0,65+0,14

(p<0,01) | 0,60+0,16

(p<0,05) | 0,70+0,13

(p<0,01)– | 0,89+0,05

(p<0,001)– | 0,87+0,05

(p<0,001)– | 0,52+0,18

(p<0,5)

* – тут і далі r – коефіцієнт кореляції

Запропонований нами поетапний імуномодулюючий терапевтичний комплекс з використанням неовиру, протефлазіду, віферону сприяв елімінації папіломавірусу майже у кожної третьої із пролікованих жінок (33,8%), що у 3 рази частіше, ніж при використанні традиційного противірусного засобу, ацикловір (p<0,05). Стосовно морфологічної структури ШМ – цервікальна інтраепітеліальна неоплазія на тлі ендоцервікозу виявилась нестійкою під впливом імуномодуляторів: зникли ознаки дисплазії як у ВПЛ-негативних так і у ВПЛ-позитивних хворих: кольпоскопічно у 100% і 70,6% пролікованих, цитологічно – у 100% та 77,5%, гістологічно – у 100% та 75%, відповідно. Відбувся переросподіл цервікоцитограм за Папаніколау (рис.3).

ІІІ група

ІVгрупа

Рис. 3. Цитологічний контроль після І етапу імуномодуляції

Результати цитологічного дослідження при ВПЛ-негативному (ІІІ група) та при ВПЛ-позитивному ендоцервікозі (ІV група) вказують на позитивну динаміку цитоморфологічної стуктури ШМ на фоні імуномодулюючої терапії (порівняно з рис.1). Після імунокорекції досягнуто співбіжність цитологічного та гістологічного діагнозів у 94,5%, що сприяло підвищенню діагностичної цінності цитологічного дослідження.

Доцільність такого комплексу підтверджена на імуногістохімічному рівні. Таблиця 3 відображає кількісний рівень локальних імуноцитів, з’ясований морфометричним методом стандартних площ у 5 полях зору (х 60).

Таблиця 3.

Імуногістохімічне дослідження шийки матки

Клітинні імунні фактори | ВПЛ-негативні, N=24 | ВПЛ-позитивні, N=32

До

лікування | Після

імунокорекції | До лікування | Після

імунокорекції

CD4+ | число | 5,5±0,3 | 7,9±0,2* | 2,6±0,2** | 6,1±0,3* | CD8+ | число | 17,4±0,3 | 40,6±0,9* | 10,7±0,5** | 30,2±1,2* | HLA-

DR+ | число | 17,7±0,5 | 11,6±0,7* | 24,7±0,7** | 16,3±0,3* | відростки | хаотично | біполярно | хаотично | біполярно | * – порівняно із даними до лікування, ** – порівняно із ВПЛ-негативними (р<0,05)

Після імуномодуляції відмічались достовірне підвищення рівня CD4+, CD8+, CD19+клітин, та зниження кількості HLA-DR+імуноцитів у цервікобіоптатах. Зміни числа імуноцитів одночасно із зникненням морфологічних ознак ВПЛ-індукованої дисплазії та початком спонтанної епітелізації вогнища ектопії розцінювались як ознака послаблення антигенної "навантаженості" ШМ та регресу патологічного процесу.

Клінічна оцінка ефективності імуномодулюючої комплексної терапії ендоцервікозу графічно представлена на рис.4.

Рис. 4. Частота ускладнень і рецидивів ендоцервікозу (%) після традиційного лікування (контроль) та комплексної терапії (порівняння). Примітка. * – порівняно із контролем, (p<0,05).

Клінічні результати запропонованого нами лікування свідчать про скорочення термінів епітелізації вогнища ендоцервікозу на 10-12 діб, зменшення частоти ускладнень після деструкції ШМ (затримок епітелізації, кровотечі із ділянки некрозу, загострень хронічного аднекситу, болісних менструацій та овуляції) у 2,8 рази серед ВПЛ-негативних пацієнток та у 2,5 рази серед ВПЛ-носіїв, зниження рівня рецидивів протягом року у 2,8 та 3,2 рази, відповідно.

ВИСНОВКИ

В результаті проведеної роботи запропоновано нове рішення щодо діагностично-лікувального алгоритму при ендоцервікозі, спрямованого на усунення локального імунодефіциту та епітеліальної дисплазії, на основі виявлених етіопатогенетичних зв’язків між ступенем патоморфологічних змін шийкового епітелію, станом імунологічного апарату ШМ та ВПЛ-інфікованостю.

1. Папіломавірусна інфекція у жінок репродуктивного віку із ендоцервікозом виявляється у 57,6% і перебуває переважно у субклінічній формі, що вдвічі частіше ніж із візуально здоровою ШМ (29,4%) та характеризує ендоцервікоз як сприятливий фон для вірусної інвазії.

2. ВПЛ-позитивний ендоцервікоз ускладнюється цервікальною інтраепітеліальною неоплазією частіше у 4,6 разів ніж ВПЛ-негативний, що свідчить про вірусіндукований характер дисплазії. Найбільша частота ЦІН реєструється на фоні епідермізуючого ендоцервікозу порівняно із проліферуючим та звичайним.

3. Кольпоскопічні та гістологічні діагнози співпадають у 97,4%, незалежно від інфікування папіломавірусом. На фоні ВПЛ-інфекції розбіжність результатів цитологічного дослідження із верифікацією зустрічається у 52,3% ендоцервікозу, полягає у цитологічній гіпердіагностиці ЦІН і усувається після комплексної імуномодуляції, тоді як на тлі ВПЛ-негативного ендоцервікозу така розбіжність – не достовірна.

4. Наявність епітеліоцитів у передраковому стані при ендоцервікозі підтвержується на біохімічному рівні у 19,1% цервікобіоптатів, де реєструється гіперекспресія імуногістохімічного маркеру онкоцитотрансформації, білка р16ІNK4, при цьому локалізація тест-позитивних клітин співпадає із зонами ЦІН, а інтенсивність забарвлення прямопропорційна ступеню ЦІН.

5. При ВПЛ-позитивному ендоцервікозі, порівняно із ВПЛ-негативним, спостерігається підвищення кількості антигенпрезентуючих (HLA-DR+) та пониження рівня регуляторно-ефекторних (CD4+, CD8+) імуноцитів у цервікобіоптатах. Зона локалізації імунокомпетентних клітин знаходиться у базальному, парабазальному шарах епітелію ШМ, і є одночасно „епіцентром” дисплазії та „воротами” вірусної інвазії. Це дозволяє вважати локальний цитоімунний дисбаланс етіопатогенетичним фактором розвитку передраку на тлі ендоцервікозу.

6. Має місце пряма кореляційна взаємозалежність між кількістю атипових клітин у цервікоцитограмах та числом HLA-DR+імуноцитів у цервікобіоптатах, а також сильний зворотній кореляційний зв’язок між числом дискаріоцитів, койлоцитів та CD4+, CD8+клітин, що свідчить про єдиний механізм патологічних змін в імунологічному апараті та морфологічній структурі ШМ, незалежно від ВПЛ-інфікованості.

7. При комплексному використанні сучасних імуномодуляторів (протефлазіду, неовіру, віферону) досягається ерадикація папіломавірусу у 33,8%, співбіжність цитологічного та гістологічного діагнозів у 94,5%, кількісно-якісні зміни локальних імуноцитів ШМ, регрес 75% епітеліальних дисплазій. Після комплексної терапії при ВПЛ-негативному ендоцервікозі реєструється спостерігається скорочення термінів "загоювання", в середньому, на 10-12 діб порівняно із традиційними термінами, зменшення частоти ускладнень у 2,8 рази, рецидивів протягом 1-року – у 2,8 рази, а при ВПЛ-позитивному – у 2,5 та у 3,2 рази, відповідно.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Діагностику ендоцервікозу необхідно проводити поетапно, поглиблено і комплексно, з використанням сучасних методів дослідження (полімеразної ланцюгової реакції, імуногістохімічних тестів) з метою ідентифікації папіломавірусу, стану морфологічної структури, клітинного імунітету ШМ та уникнення гіпердіагностичних заключень.

2. На першому етапі рекомендується обстежувати жінок кольпоскопічно, цитологічно, бактеріологічно, вірусологічно.

На другому етапі – потрібне протизапальне, антибактеріальне лікування з урахуванням чутливості мікрофлори та послідуючою імуномодуляцією. Імуномодулятори (неовір, протефлазід) доцільно застосовувати комбіновано: загально та вагінально. Неовір – по 2 мл 12,5% розчин в/м через 2 доби (6-8 ін’єкцій) одночасно протефлазід – вагінальні тампони з 3 мл ротефлазіду і 20 мл фізрозчину 2 рази на добу, протягом 20 діб. По завершенню другого етапу – бажаний кольпоскопічний та цитологічний контроль із послідуючим гістологічним дослідженням цервікобіоптатів.

На третьому етапі - доцільна деструкція патологічного вогнища ШМ із урахуванням верифікації (хіміо- кріодеструкція, діатермокоагуляція, діатермоексцизія). У ВПЛ-носіїв доцільно використовувати електродеструкцію, на фоні якої зменшується число рецидивів у 3,6 та 6,5 разів порівняно із рівнем рецидивів після кріо- та хіміодеструкції, відповідно.

На четвертому етапі – доцільно продовжити підтримуючу імунокорекцію протягом 1 – 1,5 місяця протефлазідом per os 3 рази на добу по 8 крапель з одночасним використанням вагінальних супозіторіїв „віферон” по 2 рази на добу 20 діб.

Такий підхід дозволяє скоротити тривалість епітелізації на 10-12 діб та зменшити кількість ускладнень та рецидивів, в середньому, у 3 рази.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Громова А.М., Крутікова Е.І. Частота захворювань шийки матки в Полтавській області. –// Вісник проблем біології і медицини. – 2002, №1. – С.5–9. (Автором зібрано фактичний матеріал та здіснено його статистичний аналіз)

2. Крутикова Е.І. Клініка та діагностика фонових і передракових захворювань шийки матки в залежності від факторів ризику їх розвитку. // Вісник Української медичної стоматологічної академії. 2002. – Т.2, вип.1. – С.78–80.

3. Громова А.М., Крутікова Е.І., Білаш А.В. Патоморфологічна характеристика фонових і передракових захворювань шийки матки, асоційованих з папіломавірусною інфекцією // ПАГ. – 2002. – № 6. – С.86–91. (Автором особисто проводилась більшість досліджень та статистична обробка результатів)

4. Крутікова Е.І. Білок pl6INK4a як маркер диспластичних змін у клітинах епітелію шийки матки при ендоцервікозах // Шпитальна хірургія. – 2003. – №4.– С. 56-59.

5. Крутикова Е.І. Клітинні фактори локального імунітету шийки матки при фонових та передракових захворюваннях, асоційованих із папіломавірусною інфекцією //ПАГ. – 2003. – №4. – С.100–104.

6. Крутікова Е.І. Патогенетичне обгрунтування імуномодулюючої терапії ендоцервікозу //Ліки України. – 2004. – №2. – С.19-22.

7. Імуногістохімічне дослідження слизових оболонок / І.П.Кайдашев, В.І.Шинкевич, В.В.Рябенко та інш. // Лабораторна діагностика. –2003. – №3. – С.15–20. (Автор приймала участь у проведенні досліджень та аналізі отриманих результатів)

8. Патент 2530 А 61 В17/42 Україна Спосіб оцінки функціонального стану слизової оболонки шийки макти / І.П.Кайдашев, А.М.Громова, Е.І.Крутикова, В. І. Шинкевич. – МПК 20021210055; Заявл. 13. 12. 2002; Опубл. 06. 04, Бюл. №6.

9. Громова А.М., Крутикова Е.І. Метод комплексного етіопатогеничного лікування фонових та передракових захворювань шийки матки: Інформаційний лист, Випуск 4 з проблем „Акушерство та гінекологія” Протокол № 3, від 24. 04. 2003 р.

10. Крутікова Е.І. Комплексне етіотропне лікування ендоцервікозів: „Сучасні принципи діагностики та лікування візуальних форм геніального раку у жінок. Якість життя”: Збірка науков. робіт // Матеріали наук.-практичної конференції – Львів, 2002.– С. 80-81.

АНОТАЦІЯ

Крутікова Е. І. Клініко-патогенетичне обґрунтування комплексної терапії ендоцервікозів, ускладнених папіломавірусною інфекцією. –Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14. 01. 01 – акушерство і гінекологія. – Національний медичний університет ім.. О. О. Богомольця МОЗ України, Київ, 2004.

Дисертація присвячена розробці комплексу поетапних заходів, спрямованих на підвищення ефективності діагностики та лікування ендоцервікозу. Діагностика включала традиційні клініко-морфолоігчні дослідження шийки матки, і, додатково, ідентифікацію онкогенних типів вірусу папіломи людини та імуногістохімічне дослідження цервікобіоптатів для визначення маркерів цитоонкотрансформації та локального клітинного імунітету. Для комплексного лікування використовувались сучасні імуномодулятори: неовір, протефлазід, віферон. На глибокому структурному рівні доведено, що ектопія призматичного епітелію являється сприятливим фоном для папіломавірусної інфекції, на тлі якої ендоцервікоз варто розцінювати як передраковий стан шийки матки із цервікальною інтраепітеліальною неоплазією та місцевим клітинним імунодефіцитом. Комплексна імуномодуляція запобігає уникненню діагностичних помилок, відновленню морфологічної структури шийкового епітелію, особливо в осередках дисплазії, скороченню термінів епітелізації після деструкції патологічного вогнища на 10-12 діб, зниженню рівня ускладнень та рецидивів, в середньому, у 3 рази.

Ключові слова: ендоцервікоз, папіломавірусна інфекція, цервікальна інтраепітеліальна неоплазія, імуномодуляція, імуногістохімічне дослідження.

Annotation

Krutikova E. I. Clinico-pathogenetic grounding of complex therapy of endocervicosis complicated by papillomaviral infection. – Manuscript.

A thesis in search for the degree of Candidate of medical sciences on the specialty 14. 01. 01. – Obstetrics and Gynecology. National Medical University named after A. A. Bogomolets, Public Health Ministry of Ukraine, Kyiv, 2004.

The thesis is dedicated to the working out the complex of staged measures directed on increasing of efficiency of diagnosis and treatment of endocervicosis. The diagnosis included traditional clinic morphological investigations of cervix uteri and additionally, identification oncogenic types of the human papillomavirus and immunohistochemical investigation cervicobioptats for determining the markers of cytooncotransformation and local cellular immunity. For complex treatment there were used modern immunomodulators: Neovir, Proteflazid, Viferon. On the deep structural level it was proved that ectopia prismatic epithelium is a favorable backrground for papillomaviral infection on background of which endocervicosis needs to be evaluated as precancerous condition of cervix of uteri with cervical intraepithelial neoplasia and local cellular immunodeficiency. Complex immunomodulation prevents diagnostic mistakes, renovation morphological structure of epithelium of cervix uteri especially in concentration of dysplasia, shortening the terms of epithelization after destruction of pathogenical focus on 10-12 days, lowering of the level of complications and recurrences in 3 times on average.

Key words: endocervicosis, papillomaviral infection, cervical intraepithelial neoplasia, immunomodulation, immunohistochemical investigation.

АННОТАЦИЯ

Крутикова Э.И. Клинико-патогенетическое обоснование комплексной терапии ендоцервикозов, осложнённых папилломавирусной інфекцієй.–Рукопись.

Диссертация на соискание научной ступени кандидата медицинских наук по спеціальністи 14. 01. 01 – акушерство и гинекология. – Национальний медицинский университет ім. А. А. Богомольця МОЗ Украины, Киев, 2004.

Диссертация посвящена проблеме повышения эффективности диагностики и лечения эндоцервикоза. Поставленные задачи решались путём углублённой диагностики, направленой на идентификацию вируса папилломы человека (ВПЧ) и детальное изучение морфологической структуры шейки матки: кольпоскопической семиотики, клеточного состава цервикоцитограм, патоморфологической картины, маркера цитоонкотрансформации, белка р16INK4a, и локальных клеточных иммунных факторов (CD4+, CD8+, CD19+, HLA-DR+) в цервикобиоптатах. Предложен 4-х-этапный диагностично-терапевтический комплекс при ендоцервикозах с использованием указаной диагностики, современных иммуномодуляторов (неовира, протефлазида, виферона) и деструкции шейки матки согласно верификации. Обсследовано и пролечено 232 женщины: 119 с визуально здоровой шейкой матки и 113 с ендоцервикозом, из которых было сформировано 4 группы, разнящихся по наличию ВПЧ-инфекции и состоянию шейки матки, а также 2 погруппы, различных по методу лечению.

Эндоцервикоз охарактеризован как благоприятный фон для онкогенной папилломавирусной инфекции, осложнённый цервикальной интраепителиальной неоплазией в 38,5%, рецидивирующий при несвоевременной монодеструкции шейки матки. Дисплазия шеечного епителия в зоне трансформации сопровождает ендоцервикоз на фоне ВПЧ-инфекции чаще, чем при отсутствии вирусной инвазии в 4,6 раза. При этом отмечаеться несовпадение цитологических и гистологических диагнозов в 52,3%. На глубоком структурно-молекулярном уровне показано, что у каждой пятой пациентки с ендоцервикозом епителий шейки матки несёт высокий потенциал к малигнизации, о чём свидетельствует положительный тест на маркер цитоонкотрансформации, белок р16INK4a, в 19,1% цервикобиоптатов. В основном, тест-позитивные образцы были получены от ВПЧ-носителей, у которих имел место цервикальный клеточноиммунный дисбаланс, проявившийся достоверным снижением числа CD4+ и CD8+ иммуноцитов (аференто-эффекторного звена) и повышением уровня HLA-DR+иммуноцитов (антигенпрезентирующего звена). Выявлены корреляционные связи между уровнями атипических клеток в цервикоцитограмах и иммуноцитов в цервикобиоптатах, что свидетельствует об едином механизме нарушений морфологической структуры и иммунологического аппарата шейки матки.

Используя комплекс иммуномодуляторов удалось достичь совпадения результатов цитологической и гистологической диагностики в 94,5%, эрадикации папилломавируса в 33,8%, регресс епителиальной дисплазии в 75%, достоверных изменений количества локальных имуноцитов в сочетании с нормализацией морфологической структуры епителия шейки матки. Клинически на фоне комплексной терапии зарегистрировано снижение частоты осложнений после деструкции в 2,8 раза у ВПЧ-негативных пациенток и в 2,5 раза у ВПЧ-носителей, а также снижение частоти рецидивов в течение года – в 2,8 раза, 3,2 раза, соответственно.

Таким образом, показана роль папилломавирусной инфекции и цервикального иммунодефицита как осложняющих факторов ендоцервикоза, что обусловливает необходимость их своевременной диагностики и целесообразность комплексного лечения с использованием иммуномодуляторов.

Ключевые слова: эндоцервикоз, папилломавирусная инфекция, цервикальная интраэпителиальная неоплазия, иммуномодуляция, иммуногистохимическое исследование.

ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ

ВПЛ – вірус папіломи людини

ШМ – шийка матки

ЦІН – цервікальна інтраепітеліальна неоплазія