Міністерство охорони здоров’я України

Одеський державний медичний університет

Кравченко Ірина Анатоліївна

УДК 615.015.154

Теоретичне та експериментальне обгрунтування трансдермального введення похідних

1,4-бенздіазепіну

14.03.05 – фармакологія

АВТОРЕФЕРАТ

Дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Одеса – 2004

Дисертацією є рукопис

Дисертація виконана в Одеському національному університеті ім. І.І.Мечникова МОН України та Фізико-хімічному інституті ім. О.В.Богатського НАН України

Науковий консультант – д.х.н., професор, академік НАН України АНДРОНАТІ СЕРГІЙ АНДРІЙОВИЧ, ФХІ ім.О.В. Богатського НАН України, директор, завідувач відділом медичної хімії

Офіційні опоненти: Доктор біологічних наук, професор, член кор. УААН ЛЕВИЦЬКИЙ АНАТОЛІЙ ПАВЛОВИЧ, Інститут стоматології АМН України, заступник директора з питань науки

Доктор біологічних наук, професор ФІЛІПОВА ТЕТЯНА ОЛЕГІВНА, Одеський національний університет ім. І.І.Мечникова МОН України, професор кафедри мікробіології та вірусології

Доктор медичних наук БЕЗВЕРХА ІННА СТЕПАНІВНА, Інститут геронтології АМН України, завідувач лабораторією геріатричної фармакології

Провідна установа – Інститут фармакології та токсикології АМН України, відділ нейрофармакології (м. Київ).

Захист дисертації відбудеться “23” грудня 2004 р. о 11 00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.600.01 в Одеському державному медичному університеті МОЗ України (65026, Одеса, Валіховський пров., 2)

З дисертацією можна ознайомитися в науковій бібліотеці Одеського державного медичного університету МОЗ України (65026, Одеса, Валіхівський пров., 3)

Автореферат дисертації розіслано “22” листопаду 2004 р.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради,

к.мед.н., доцент Годован В. В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Серед актуальних проблем сучасної фармакології особлива увага приділяється розробці лікарських засобів з пролонгованою дією [Машковський М.Д, 2000]. Вона стає можливою при раціональному сполученні окремих препаратів. Іноді дія пролонгується внаслідок гальмування метаболізму вихідної сполуки, або швидкості її елімінації. Особливе значення для пролонгованої дії лікарських засобів мають процеси всмоктування (біодоступності). Поряд з таким показником як афінітет (взаємодія з біологічної мішенью) процес всмоктування є фундаментальним показником, що визначає силу дії, ефективність та терапевтичний індекс препарату [Головенко М.Я., 2004]. З огляду на збільшення числа неврологічних і психічних розладів останнім часом, а також необхідність корекції цих порушень у хворих в умовах амбулаторного лікування, актуальною є проблема створення пролонгованої форми препаратів, які за цих умов найбільш часто використовуються - похідних 1,4-бенздіазепіну. Використання цих препаратів в таблетованій та ін’єкційній формах приводить до появи таких побічних наслідків, як снотворна дія та міорелаксація. Усунення цих ефектів можливо шляхом синтезу нових похідних 1,4-бенздіазепіну [Андронаті С.А. і спів., 1992] або використання відповідних лікарських форм.

Дослідження останніх років показали, що використання трансдермальних терапевтичних систем дозволяє здійснювати повільне дозоване, чітко регульоване введення лікарських препаратів у системний кровообіг та уникнути при цьому ряду побічних ефектів з повним збереженням основної лікувальної дії [Потс Р.O., 1995; Браун Л., 1998]. Використання такого способу дозволяє проводити лікування хронічних захворювань, які вимагають тривалого контрольованого введення різних лікарських препаратів [Меркле Г., 1989]. Трансдермальний шлях введення має багато переваг порівняно з традиційними способами введення: можливість продовжити термін дії лікарських речовин, що мають короткий період напіввиведення; уникнути первинного метаболізму в печінці; зменшити коливання концентрації у крові й органах-мішенях препаратів, що мають невеликі значення терапевтичного індексу; уникнути подразнення слизової оболонки шлунка; атравматичність введення; полегшення лікування хворих у несвідомому стані та дітей [Ассмусен Б., 1991; Ранаде В.В., 1991]. Однак, незважаючи на всі переваги цього способу введення, не всі препарати можуть успішно вводитися крізь шкіру. Для цього вони повинні відповідати таким вимогам: лікарська речовина повинна мати здібність проникати крізь шкірний бар'єр і надходити до системного кровообігу; бути високоефективною у незначних дозах, тому що проникність шкіри обмежена (найбільш прийнятними будуть препарати, добова доза яких знаходиться в межах 1-2 мг), не викликати подразнення шкіряних покрить; не піддаватися значному метаболізмові у шкірі [Клигман А.М., 1984]. Усім цим вимогам відповідають препарати з групи похідних 1,4-бенздіазепіну, зокрема, вітчизняний препарат феназепам і його активний метаболіт 3-гідроксифеназепам. Незважаючи на значну кількість публікацій про розробки трансдермальних терапевтичних систем, робіт, присвячених розробці таких форм з похідними 1,4-бенздіазепіну, дуже мало [Коч Р.Л., 1987; Шварц Д.С, 1995; Васильев А.Е., 2001; Жердев В.П., 2003].

Зв'язок з науковими програмами, планами і темами. Робота виконувалася на базі навчально-науково-виробничого комплексу Одеського національного університету ім.І.І.Мечникова МОН України і Фізико-хімічного інституту НАН України в рамках тем: "Розробка фізико-хімічних основ створення трансдермальних систем доставки транквілізуючих, противірусних, антиагрегаційних засобів" (1999-2000), № держреєстрації - 0100V001143, "Синтез і структурно-функціональне вивчення лігандів рецепторів ЦНС, GP IIb/IIIa та нуклеїнових кислот" (2002-2004), № держреєстрації - 0120001465, та "Розробка та вивчення трансдермальних систем доставки похідних 1,4-бенздіазепіну" (внутрішня тема ОНУ № 160). Диссертант є співвиконавцем цих тем.

Мета роботи – теоретичне та експериментальне обгрунтування трансдермального введення похідних 1,4-бенздіазепіну та можливостей оптимізації їх проникнення крізь неушкоджену шкіру.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні завдання:

· Розробити наукові основи трансдермального введення похідних 1,4-бенздіазепіну за допомогою матричних трансдермальних систем.

· Вивчити залежність тривалості і виразності протисудомної дії феназепаму, 3-гідроксифеназепаму, діазепаму, нітразепаму та клоназепаму від їх ліпофільності при трансдермальному введенні та можливість корекції цього ефекту шляхом спільного використання речовин із різною ліпофільністю.

· Виявити особливості фармакодинаміки і фармакокінетики феназепаму та 3-гідроксифеназепаму при трансдермальному введенні порівняно з внутрішньовенним та пероральним шляхом введення, а також в модельному експерименті іn vіvo вивчити за допомогою цих препаратів корекції абстинентного стану.

· Вивчити механізм впливу на структуру рогового шару епідермісу аліфатичних спиртів, жирних кислот і алкілпіридиніїв і на прикладі 14С-феназепаму розглянути зміну проникності рогового шару під впливом цих підсилювачів проникності іn vіtro.

· Вивчити вплив різних хімічних підсилювачів проникності, які спричиняють зворотній вплив на роговий шар епідермісу, на проникнення феназепаму, 3-гідроксифеназепаму та клоназепаму крізь шкіру іn vіvo.

· Запропонувати підходи до створення нових фізіологічно-активних речовин, які мають підвищену проникність крізь неушкоджену шкіру.

Об`єкт дослідження: Трансдермальне введення похідних 1,4-бенздіазепіну крізь неушкоджену шкіру.

Предмет дослідження: Оптимізація трансдермального введення похідних 1,4-бенздіазепіну.

Методи дослідження: Для вирішення поставлених завдань були використані сучасні методи досліджень: фармакологічні, біохімічні, радіоізотопні, фізико-хімічні, статистичні

Наукова новизна. Вперше вивчені фармакологічні властивості ефективних трансдермальних терапевтичних систем з феназепамом і 3-гідроксифеназепамом, які дозволяють пролонгувати дію цих препаратів до 48-72 годин, та які мають біодоступність до 80-90% (патент України №. 57743, Основа для трансдермальної терапевтичної системи та трансдермальна терапевтична система. Опубл. 15.07.2003).

Для вивчених 1,4-бенздіазепінів вперше виявлено зв'язок між часом настання фармакологічного ефекту та його тривалістю при трансдермальному введенні в залежності від їх ліпофільності.

Вперше запропоновано метод оптимізації фармакологічного профілю трансдермальної системи шляхом спільного використання препаратів односпрямованої дії, але з різною ліпофільністю (патент України №. 58608, Спосіб введення психотропного препарату - похідного 1,4-бенздіазепіну. Опубл. 15.08.2003).

Вперше показано, що трансдермальне введення феназепаму та 3-гідроксифеназепаму дозволяє змінювати спектр фармакологічної активності цих препаратів зі збереженням високої протисудомної та седативної активності при значному зниженні ефекту міорелаксації, а також корегувати прояви абстинентного синдрому.

Експериментально обгрунтовано вибір оптимальних підсилювачів проникності шкіри для різних похідних 1,4-бенздіазепіну. Показано, що оптимальне їх проникнення крізь шкіру залежить від використання відповідного посилювача проникності у складі трансдермальної форми. Так, для ліпофільних сполук (феназепам) оптимальними є аліфатичні спирти, жирні кислоти та алкілпіридинії, які мають вплив на розташування ліпідів, що входять до складу мембран кератиноцитів та інтерцелюлярного матриксу. Для більш гідрофільних сполук (клоназепам), доцільніше використовувати спирти, які частково екстрагують ліпіди та мають певний вплив на білки рогового шару, а для сполук з проміжною ліпофільністю (3-гідроксифеназепам) можливе використання посилювачів, що діють за всіма цими механізмами.

На основі запропонованої концепції вперше одержано нову біологічно активну речовину - 3-лауроїлокси-7-бром-5-(о-хлор)феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазе-пін-2-он (лауразепам), трансдермальне введення якої дає можливість одержати стабільний протисудомний ефект протягом 96 годин при одноразовому введенні.

Практичне значення отриманих результатів. Запропоновано підходи до оптимізації профілю протисудомної активності трансдермальної системи шляхом спільного використання препаратів односпрямованої дії з різним значенням ліпофільності.

На основі отриманих результатів вивчення фармакологічної дії та показників фармакокінетики при трансдермальному введенні похідних 1,4-бенздіазепіну з використанням різних підсилювачів проникності запропоновано оптимальний склад трансдермальної матричної системи для підвищення біодоступності до 80-90 %.

На основі використання підсилювачів біодоступності та корекції ліпофільності синтезовано нову біологічно активну речовину – лауразепам з оптимальними фармакокінетичними показниками.

Показано можливість корекції абстинентного синдрому з використанням запропонованої трансдермальної системи феназепаму, 3-гідроксифеназепаму та лауразепаму.

За матеріалами дисертації розроблено методичні рекомендації „Трансдермальні лікарські форми похідних 1,4-бенздіазепіну”.

Наукові результати дослідження впроваджено до навчального процесу кафедр: експериментальної та клінічної фармакології Української медичної стоматологічної академії (м. Полтава), психіатрії Одеського державного медичного університету, фармакології Вінницького національного медичного університету, фармакології Луганського державного медичного університету, фармацевтичної хімії Одеського національного університету ім. І.І. Мечникова, а також ці результати використовувалися при виконанні НДР у Фізико-хімічному інституті ім. О.В. Богатського НАН України та Українському науково-дослідному протичумному інституті ім. І. І. Мечникова (акти впровадження від 25.03.2004., 14.04.2004, 25.05.2004, 29.03.2004, 6.04.2004, 22.04.2004, 07.09.2004).

Прикладні результати дослідження впроваджено при розробці лікарських форм на Борщагівському ХФЗ при розробці трансдермальних форм з естрадіолом та прогестероном та ЗАТ “Фармацевтична фірма “Дарниця” при розробці гелей кетопрофену та індометацину (акти впровадження від 15.03.2004., 15.04.2004).

Особистий внесок дисертанта. Автором особисто був визначений науковий напрямок, сформульовані завдання, методичні підходи та програма дослідження, проведений патентно-інформаційний пошук. Самостійно виконані всі експериментальні дослідження за винятком синтезу похідних 1,4-бенздіазепіну, вони були отримані у відділі медичної хімії Фізико-хімічного інституту ім. О.В.Богатського НАН України (с.н.с., к.х.н. Павловський В.І.). Проведено аналіз і узагальнення результатів дослідження, оформлені таблиці і графіки, проведена статистична обробка, сформульовані висновки та основні положення дисертації, здійснено впровадження у практику результатів дисертації.

Апробація матеріалів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися: на V Національному з'їзді фармацевтів України (Харків, 1999), 59th Іnternatіonal Congress of FІР (Barcelona, 1999), 6th European Congress of Pharmaceutіcal Scіences, EUFEPS 2000 (Budapest, 2000), 60th Іnternatіonal Congress of FІР (Vіenna, 2000), Mіllennіal World Congress of Pharmaceutіcal Scіences (San-Francіsco, 2000), XVth World Congress of Pharmacology (San-Francіsco, 2002), Scіentіfіc Meetіng of the Research Socіety on Alcoholіsm and the 11th Congress of the Іnternatіonal Socіety for Bіomedіcal Research on Alcoholіsm (San-Francіsco, 2002), Міжнародної науково-практичної конференції "Нові технології одержання і застосування біологічно активних речовин" (Алушта, 2002), ІІІ Міжнародної науково-практичної конференції "Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія" (Харків, 2003), Всеукраїнської науково-практичної конференції "Сучасні технології органічного синтезу і медичної хімії" (Харків, 2003), 9th Congress of the European Socіety for Bіomedіcal Research on Alcoholіsm (Prague, 2003), Neuroscіence 2003 (New Orleans, 2003)

Публікації. Результати дисертації опубліковані в 40 наукових роботах (3 монографії, 22 наукові статті – у фахових журналах, методичні рекомендації, 2 патенти на винахід, решта робіт в матеріалах і тезах конференцій та симпозіумів).

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 261 сторінках машинописного тексту і складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, аналізу та узагальнення результатів, висновків, списку використаних джерел (27 робота вітчизняних і 240 зарубіжних авторів). Текст ілюстрований 89 рисунками та 63 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Експериментальні дослідження проведені на 4667 безпородних мишах, вагою 18-22 г та 200 безпородних щурах-самцях, масою 160-180 г, які утримувалися в стандартних умовах віварію. В роботі використовувалися похідні 1,4-бенздіазепіну: феназепам, 3-гідроксифеназепам, діазепам, нітразепам, клоназепам, які були синтезовані в Фізико-хімічному інституті ім О.В.Богатського НАН України у відділі медичної хімії. Для проведення фармакокінетичних досліджень були синтезовані радіоактивні препарати – 14С-феназепам, 14С-3-гідроксифеназепам, 14С-лауразепам. Радіохроматографічна чистота вивчалась методом тонкошарової хроматографії на пластинках “Silufol UV-254”, ідентифікували за відомими значенням Rf. Трансдермальні терапевтичні системи (ТТС) виготовлялися методом полив-сушіння, містили полівініловий спирт та 1,2-пропіленгліколь у співвідношенні: 1:2,8 та похідні 1,4-бенздіазепіну в концентрації – 0,086-1 мг/см2. Одним з показників фармакологічної активності транквілізаторів є їх здібність усувати прояви судомної дії коразолу - блокатора ГАМК-рецепторів. Моделлю судом була обрана внутрішньовенна інфузія судомного агенту коразолу [Андронати і спів., 1992]. Групам тварин (5-6 голів) за певні проміжки часу (15, 30 хв, 1, 3, 6, 8, 12, 24, 48, 72, 96 годин) до введення коразолу вводили похідні 1,4-бенздіазепіну (внутрішньовенно, інтрагастрально або шляхом аплікації ТТС). Протисудомну активність похідних 1,4-бенздіазепіну оцінювали по збільшенню мінімальних ефективних доз коразолу (МЕД), який при внутрішньовенному введенні (у хвостову вену, у вигляді 1% розчину зі швидкістю 0,01 см3/с), викликає у дослідних тварин розвиток клоніко-тонічних судом (ДКТС) та тонічну екстензію (ДТЕ) у порівнянні з контролем (ДКТСк і ДТЕк). Ефекти, які викликаються, є швидкозворотніми та концентраційно залежними.

Седативна дія була вивчена за тестом "відкритого поля" [Андронати і спів., 1985]. Міорелаксантну дію ТТС визначали по тесту "обертового стрижня" (Luisa de Angelis, 1979). У якості моделі абстинентного синдрому обрано модель, що була запропонована Головенко М.Я. і спів. (1997). LD50 визначалася за методом Личтфилда та Уилкоксона (1982). Тест максимальних електрошокових судом визначався за методом Томан Дж. (1946). У фармакокінетичних дослідженнях об’ектами були плазма крові, головний мозок, печінка, нирки, шкіра, сеча, кал. Для визначення загальної радіоактивності в органах та тканинах частини органів гідролізували концентрованою мурашиною кислотою та визначали радіоактивність приладом TRІ-CARB 2700 (Canberra PACKARD, США). Для вивчення екскреції мишам, вагою 20,0±2,0 г, на попередньо виголену ділянку спини між лопатками була аплікована ТТС, яка містить 14С-феназепам (0,7 Ки/моль) та 14С-3-гідроксифеназепам (0,3 Ки/моль). Тварин поміщали в метаболічні клітки і відбирали проби сечі та калу кожні 24 години. При внутрішньовенному введенні проби сечі та калу відбирали через кожні 12 годин. Вміст радіоактивних продуктів метаболізму в сечі і калі встановлювали методом рідинної сцинтіляційної фотометрії [Зиньковский В.Г., 1994]. Дані були оброблені статистично. Для визначення повної картини екскреції препаратів при одноразовій аплікації ТТС, аналіз екскрементів проводився протягом 15 доби з моменту аплікації. Ліпофільність похідних 1,4-бенздіазепіну визначали шляхом обчислювання коефіцієнту розподілу їх у системі октанол-вода [Смульский С.П., 1981]. Для проведення дослідів in vitro на ізольованому роговому шарі були одержані зразки рогового шару пацюків. При проведенні досліджень in vitro були використані двокамерні Franz cell. Донорне середовище являло собою гідрогель, що складався з полівінілового спирту та 1,2-пропіленглі-колю (1:1), яке містило 14С-феназепам (0,01 Ки/моль) і 10% підсилювача проникності. Ступінь екстракції ліпідів рогового шару визначали методом гравіметрії за різницею зразків рогового шару, що оброблений розчином підсилювачів проникністі (10 %) у 1,2-пропіленгліколі [Колб В.Г., 1982]. Вміст екстрагованого холестерину в загальній кількості ліпідів визначали за реакцією Лібермана – Бурхарда [Колб В.Г., 1982]. Для дегідратації рогового шару зразки рогового шару сушили над пентаоксидом фосфору. Для гідратації зважений роговий шар поміщали в 27% розчин броміду натрію на 24 години при кімнатній температурі. Для експериментів по дифузії похідних 1,4-бенздіазепіну через роговий шар in vitro його обробляли розчином підсилювача проникності (тільки з боку анатомічної поверхні) протягом 24 годин при 32°С. Для ІЧ спектроскопії зразки рогового шару попередньо вимочували в розчині підсилювача проникності у 1,2-пропіленгліколі протягом 24 годин. ІЧ спектри кожного зразка рогового шару були зняті двічі: до та після обробки підсилювачами проникності шкіри на приладі FTІ-8300 (Shіmadzu). Спектри були оброблені за допомогою програми Shіmadzu Hyper ІR.

Одержані протягом експерименту цифрові дані статистично обробляли загальноприйнятими методами з використанням значень середньої арифметичної величини (М), середнього відхилення середньої арифметичної (m), критерія Стюденту та коефіцієнту достовірності Р на ЕОМ Pentium-3 за допомогою пакету програм Microsoft Excel.

Результати дослідження та їх обговорення

Вивченню нових трансдермальних лікарських форм іn vіvo повинно передувати дослідження іn vіtro, що дає змогу оцінити можливість трансдермального введення активної речовини крізь роговий шар епідермісу, а також цілеспрямованого вивчення факторів, що мають вплив на проникнення речовини за ретельно контрольованих умов. Одним з головних об'єктів при дослідженні трансдермального введення лікарських препаратів є шкіра, а саме, роговий шар епідермісу. Проведеними дослідженнями було доведено можливість трансдермального введення феназепаму крізь ізольований роговий шар, що сприяє подальшому розвитку цього дослідження. Подальшими дослідженнями було показано взаємозв'язок між ліпофільністю похідних 1,4-бенздіазепіну та швидкістю їх трансдермального введення (рис. 1 (а-г)).. Було показано, що коефіцієнт розподілу октанол-вода корелює зі швидкістю досягнення терапевтичного ефекту при трансдермальному введенні похідних 1,4-бенздіазепіну.

Нашим завданням було вивчити зв'язок між ліпофільністю похідних 1,4-бенздіазепіну та ступенем проникнення їх через неушкоджене шкіряне покриття, шляхом реєстрації динаміки їх протисудомної дії (рис. 1 (а-г)).

Як випливає з наведених даних, ліпофільність має значний вплив на швидкість і тривалість фармакологічного ефекту цих речовин. Так, для феназепаму та діазепаму стаціонарний період дії наступає через 6-8 годин після аплікації, яка продовжується протягом 48 годин, у той час як для 3-гідроксифеназепаму та нітразепаму характерний швидкий розвиток протисудомної дії, який знижується на другу добу аплікації.

На основі проведених досліджень нами була запропонована комбінована трансдермальна система, до складу якої входять два похідних 1,4-бенздіазепіну, які мають різні значення ліпофільності та односпрямовану дію. Такими системами можуть бути системи: феназепам - 3-гідроксифеназепам і діазепам-нітразепам (рис. 2). Спільне використання таких препаратів дає можливість одержати швидкий та стабільний у часі протисудомний ефект. Його дія визначається вже через 0,5-1,0 годину після аплікації ТТС і продовжується протягом 48 годин.

Враховуючи різницю в значеннях ліпофільности цих препаратів, а також той факт, що в організмі тварин і людини феназепам перетерплює перетворення в 3-гідроксипохідне, можна пояснити одержання стабільного терапевтичного ефекту, який швидко развивається, при використанні комбінованих ТТС, що містять диазепам і нітразепам, а також феназепам і 3-гідроксифеназепам.

Таким чином, проведеними дослідженнями, на прикладі ряду похідних 1,4-бенздіазепіну, було показано, що при розробці трансдермальних систем для оптимізації фармакодинамічного профілю, необхідно враховувати ліпофільність препарату і, при необхідності, можна корегувати швидкість досягнення стабільного фармакологічного ефекту і його тривалість за рахунок спільного використання у складі ТТС препаратів з різним значенням Log P.

З огляду на те, що введення транквілізаторів ряду 1,4-бенздіазепіну до складу ТТС дає можливість цілеспрямовано модифікувати профіль їх фармакологічної активності, були вивчені особливості фармакологічних властивостей трансдермальної терапевтичної системи, що містить феназепам та 3-гідроксифеназепам.

Зільшення тривалості часу введення препарату, відсутність різких змін концентрації препарату в крові і головному мозку експериментальних тварин приводить до зниження виразності побічних ефектів, характерних для інших способів уведення цих препаратів. У ході дослідження було показано, що трансдермальне введення феназепаму та 3-гідроксифеназепаму спричиняє деяку гнітючу дію на рухову активність тварин у період 6-24 год., причому для 3-гідроксифеназепаму ці показники менше виражені.

Дослідження міорелаксації та протисудомної дії за тестом максимального електрошоку показали, що незначна міорелаксація спостерігається у часи найбільшого проникнення феназепаму та 3-гідроксифеназепаму, що становить для феназепаму проміжок часу – 24-30 год. після аплікації, а для 3-гідроксифеназепаму – 6 год. В проміжок від 3 до 24 год. спостерігається найбільший захист від великих судомних припадків при використанні феназепаму, та практично повний захист від цих судом протягом часу аплікації трансдермальної системи з 3-гідроксифеназепамом.

Таким чином, вивчення фармакологічних властивостей трансдермальної терапевтичної системи показало, що зміна способу введення препарату дає можливість модифікувати профіль фармакологічної активності і, при високому ступені попередження великих судомних припадків, практично уникнути проявів ефекту міорелаксації, який є побічним для цих препаратів.

Далі нами була показана можливість зміни параметрів трансдермальних систем - концентрації активної речовини та зміни площі. Показано, що збільшення концентрації феназепаму на одиницю площі приводить до подовження часу дії ТТС (рис. 3) та нелінійного зростання протисудомної активності (рис. 3,4), а зміна площі приводить до зміни швидкості введення лікарської речовини.

Вивчення залежності доза-протисудомний ефект для 3-гідроксифеназепаму, нітразепаму та діазепаму показало аналогічний профіль збільшення мінімальних ефективних доз коразолу для клоніко-тонічних судом та тонічної екстензії, що реєструються при збільшенні дози препарату у складі ТТС. Як і для феназепаму, він має нелінійний характер при збільшенні концентрації речовини на одиницю площі (рис. 4 (а,б)).

Характер залежності зміни протисудомної дії феназепаму при зміні площі аплікації ТТС у діапазоні від 1 см2 до 6 см2 при концентрації 0,1 мг/см2, свідчить про достовірне збільшення фармакологічного ефекту при збільшенні площі аплікації, хоч це збільшення носить нелінійний характер. Так, за 3 год. аплікації при збільшенні площі аплікації у 3 рази посилення ефекту по ДКТС складає 1,3 рази, а по ДТЕ - 1,21 рази. При збільшенні площі у 6 разів, посилення ефекту по ДКТС складає 1,54 рази, а по ДТЕ - 1,4 раза. За 24 год. аплікації при збільшенні площі аплікації в 3 рази посилення ефекту по ДКТС складає 1,3 раза, а по ДТЕ - 1,18 раза. При збільшенні площі в 6 разів, посилення ефекту по ДКТС складає 1,4 раза, а по ДТЕ - 1,25 раза.

Нами було проведено порівняльне вивчення трансдермального, внутрішньовенного та перорального введення феназепаму та його активного метаболіту - 3-гідроксифеназепаму. Фармакокінетичні параметри визначалися, виходячи з двочастинної моделі розподілу препаратів і шляхом позамодельної оцінки. Аналіз приведених даних дозволяє оцінити фармакокінетику трансдермального ведення феназепаму в організмі експериментальних тварин. Біодоступність при трансдермальному введенні становить 20 % для головного мозку і 37 % для плазми крові. Зміна способу введення приводить до збільшення часу утримання препарату (MRT) в організмі з 16 годин у головному мозку при внутрішньовенному введенні до 38,5 годин при трансдермальному, і з 5,5 годин у плазмі крові до 19,3 години при трансдермальному. Таке збільшення MRT дає можливість збільшити час дії препарату при однократній аплікації ТТС, що приводить до пролонгованої дії, що спостерігається (табл.1). Аналогічно було проведене вивчення 3-гідроксифеназепаму (табл.2).

Для 3-гідроксифеназепаму спостерігається збільшення часу утримання препарату в організмі, що складає для головного мозку 55 год., у порівнянні з 6,7 при внутрішньовенному введенні та 46,6 год., проти 6,0 год. для крові. Час утримання при трансдермальному введенні, практично в 3-4 рази перевищує таке при внутрішньовенному введенні. Біодоступність трансдермальної форми 3-гідроксифеназепаму складає для крові та головного мозку – 28 % та 26 %, відповідно.

Таким чином, визначення фармакокінетичних даних для феназепаму та 3-гідрокси-феназепаму показало, що цей спосіб уведення за досить значною біодоступністю препаратів забезпечує пролонговану дію та високий рівень вмісту речовини у плазмі крові і головному мозку піддослідних тварин.

Порівняльний аналіз параметрів виділення феназепаму, 3-гідроксифеназепаму та їх метаболітів з організму мишей із сечею і калом після трансдермального і внутрішньовенного введень виявив деякі особливості їх екскреції. Визначення швидкості елімінації показало, що при внутрішньовенному введенні найбільша швидкість елімінації для феназепаму спостерігається у першу добу досліду, причому швидкість елімінації феназепаму і його метаболітів була значно вищою із сечею, ніж з калом. При одноразовому трансдермальному введенні швидкість елімінації радіоактивних продуктів у перші три доби досліду була незначною, потім спостерігалося її збільшення, і протягом 7-8 доби швидкість елімінації була практично постійна, потім, до 10-11 доби знову відмічалося зниження швидкості елімінації, що можна пояснити припиненням подачі його з ТТС і вичерпанням препарату в депо шкіри. Аналогічна картина спостерігається при вивченні елімінації 3-гідроксифеназепаму та його метаболітів. При внутрішньовенному введенні у першу добу спостерігається дуже висока швидкість елімінації, яка у 10 разів перевищує швидкість елімінації при трансдермальному введенні. Очевидно, що стадією, яка лімітує швидкість виведення, є швидкість проникнення активного препарату через шкірний бар'єр.

За даними кумулятивної екскреції були також визначені величини констант елімінації та максимальної кількості виведених радіоактивних продуктів (ліпофільних і гідрофільних метаболітів) при трансдермальному введенні. При цьому встановлено (табл.3-4), що їх значення практично у 10 разів менше відповідних констант, визначених при внутрішньовенному введенні.

Цей факт можна пояснити явищем обертання констант, тобто найменша з двох констант (константа елімінації або константа надходження) обумовлює швидкість виведення препарату.

При виведенні феназепаму і, особливо, 3-гідроксифеназепаму після трансдермального введення було також було показано значне зменшення утворення глюкуронових кон`югатів, порівняно з внутрішньовенним. Для 3-гідроксифеназепаму при трансдермальному введенні з сечею їх виводиться 45% проти 77% при внутрішньовенному, а з калом 12% проти 38,5%, відповідно (Р<0,01). Це можливо пояснити тривалим надходженням цих речовин до організму, що дає змогу повільному утворенню глюкуронових кон`югатів феназепаму та 3-гідроксифеназепаму та виведенню їх з організму.

Таким чином, у результаті порівняльного вивчення кінетики екскреції метаболітів феназепаму та 3-гідроксифеназепаму при його трансдермальному і внутрішньовенному введенні було показано, що використання трансдермального способу для введення феназепаму та 3-гідроксифеназепаму приводить до подовження часу виведення цих препаратів і їх метаболітів, при цьому швидкість виведення феназепаму та 3-гідроксифеназепаму при внутрішньовенному введенні у 10 разів перевершує швидкість при трансдермальному введенні цих препаратів. Зміна способу введення 3-гідроксифеназепаму приводить до перерозподілу кількості виведених радіоактивних продуктів із сечею і калом, значно підвищується кількість виведених з сечею ліпофільних продуктів.

Подальшою метою було вивчення можливості підсилення проникності шкіри для похідних 1,4-бенздіазепіну за допомогою хімічних підсилювачів проникності, які мають зворотній вплив на роговий шар епідермісу. На прикладі феназепаму було вивчено вплив іn vіtro аліфатичних кислот та спиртів а також похідних алкілпіридинію хлориду на проникність рогового шару епідермісу і встановлення переважного механізму їх дії. Збільшення проникності рогового шару може бути досягнуто шляхом посилення дифузії молекул лікарської речовини через бішарові ліпідні мембрани кліток, а також збільшенням його розчинності у міжклітинному матриксі або шляхом зменшення взаємодії з білками рогового шару. Збільшення дифузії молекул препарату через бішарові мембрани відмічається при порушенні розташування алкільних ланцюгів ліпідів, унаслідок чого збільшується локальна плинність плазматичних мембран. Подібний ефект може бути досягнутий, зокрема, введенням до складу ліпідів, що формують мембрани, сполук, які містять довгі алкільні радикали, таких речовин, як аліфатичні кислоти або спирти.

З огляду на те, що феназепам є ліпофільною сполукою, найбільш імовірним шляхом проникнення через роговий шар є дифузія його молекул крізь ліпофільні регіони ліпідів мембран і інтерцелюлярного матриксу. Таким чином, використання підсилювачів проникності, які впливають на структуру ліпідних бішарів, для збільшення трансдермального потоку феназепаму є найбільш прийнятним.

У зв'язку з великим внеском ліпідів рогового шару у підтримку бар'єрних функцій важливо було вивчити ступінь екстракції різних ліпідів під впливом підсилювачів проникності. Ступінь екстракції ліпідів рогового шару визначали шляхом гравіметрії зразків рогового шару, оброблених розчином підсилювачів проникності (10 %) у 1,2-пропіленгліколі. Кількісну оцінку зміни проникності рогового шару під дією підсилювачів оцінювали щодо зміни швидкості проникнення 14С-феназепаму крізь роговий шар (табл. 5).

Як видно з представлених даних, при використанні аліфатичних кислот і спиртів для посилення проникності відбувається значне збільшення швидкості проникнення 14С-феназепаму крізь роговий шар. У випадку аліфатичних кислот зміна величини швидкості проникнення дзвоноподібно залежить від кількості атомів вуглецю в алкільному ланцюгу, при цьому найбільшу посилюючу дію надає лауринова кислота (C10) (табл.5).

Зі збільшенням і зменшенням кількості атомів вуглецю в алкільному ланцюзі відмічається зменшення посилюючої дії аліфатичних кислот. Аналогічна залежність спостерігається і при використанні вищих аліфатичних спиртів, що мають подібний механізм дії (табл.5).

При використанні нижчих аліфатичних спиртів, очевидно, переважним механізмом дії є часткова екстракція ліпідів рогового шару і заміщення їх молекулами спирту у міжклітинному матриксі, унаслідок чого розчинність проникаючої речовини в ньому збільшується і стає можливою дифузія препарату крізь інтерцелюлярний простір (табл.6).

Екстракція частини ліпідів з рогового шару під дією розчинника та одночасне надходження його молекул у ліпідні мембрани приводить до збільшення локальної плинності гідрофобних регіонів, і, отже, до зменшення дифузійного опору рогового шару. Це дає можливість ліпофільним препаратам проникати не тільки крізь гідрофобні області ліпідних мембран, але і шляхом дифузії крізь інтерцелюлярний простір.

Нами встановлено, що, поряд зі ступенем екстракції ліпідів, вміст холестерину в роговому шарі і ступінь його екстракції при обробці шкіри підсилювачами проникності також є важливим показником дифузії феназепама крізь шкіру (табл. 6). Через 24 години експозиції пропіленгліколем з рогового шару екстрагується ~ 50 % холестерину, який знаходиться в ньому. У присутності спиртів кількість екстрагованого холестерину зростає на 10-20 %, при незмінній загальній кількості екстрагованих ліпідів. Імовірно, збільшення проникності рогового шару під дією нижчих спиртів пояснюється екстракцією холестерину з мембран, збільшенням розчинності проникаючої речовини у міжклітинному матриксі та нагромадженням молекул аліфатичного спирту в гідрофобних регіонах ліпідних мембран. Стан інтерцелюлярних ліпідів контролювався за допомогою ІЧ спектроскопії. Аналіз ІЧ спектрів рогового шару до та після обробки різними підсилювачами свідчить про наявність описаних вище механізмів дії.

Таким чином, дослідженнями іn vіtro було показано, що обробка рогового шару шкіри такими підсилювачами проникності як 1,2-пропіленгліколь, а також аліфатичні спирти та кислоти, приводить до порушень у конформації ліпідів і білків, а також значно гідратує

роговий шар епідермісу, що було доведено методом ІЧ спектроскопії. Для посилення трансдермального проникнення феназепаму поряд з 1,2-пропіленгліколем, доцільно використовувати жирні кислоти та спирти з довжиною алкільного ланцюга - С11-С13, а з нижчих спиртів - пентанол.

Подальше вивчення впливу посилювачів проникності на зміну трансдермального введення похідних 1,4-бенздіазепіну було проведено in vivo та показало залежність фармакологічного ефекту сполук, які відрізняються значеннями ліпофільності - феназепаму, 3-гідроксифеназепаму та клоназепаму у складі трансдермальних терапевтичних систем, які містять посилювачі проникності. Нами було показано, що використання таких сполук, як аліфатичні спирти, кислоти та алкілпіридиній хлориди приводить до порушення бар`єрних властивостей рогового шару, та, як наслідок, до підвищення швидкості проникнення лікарських препаратів крізь роговой шар. Маючи на увазі попередньо одержані дані, було проведено порівняльне вивчення in vivo похідних 1,4-бенздіазепіну з реєстрацією протисудомного ефекту. Слід зазначити, що для проникнення речовин з різною ліпофільністю, мабуть, використовуються різні шляхи, про що свідчить аналіз наведених даних. При використанні феназепаму та 3-гідроксифеназепаму Log P, яких становить 3,6 і 3,0, відповідно, ми спостерігаємо чітку залежність між кількістю атомів вуглецю в алкільному ланцюгу жирної кислоти і виразністю протисудомного ефекту, прояви якого досягають 400-500 % від контрольних значень і до 200 % від дії у складі ТТС, які не утримують підсилювачів проникності (рис.5).

При використанні клоназепаму (Log P = 1.61), ліпофільність якого виражена значно меншою мірою, ми не спостерігаємо такого ефекту. У цьому випадку найбільший посилюючий ефект має капронова кислота, переважним об'єктом впливу якої, мабуть, є білки рогового шару, а також посилення гідратації рогового шару, що приводить до менш вираженого посилюючого ефекту. Він досягає на максимумі свого прояву 200 % від контрольних значень і незначно відрізняється від використання ТТС без підсилювачівВивчення підсилювачів проникненості, що належать до класу спиртів також має свої особливості при використанні активних речовин, які мають різну ліпофільність. Необхідно враховувати, що якщо вищі жирні спирти переважно мають вплив на ліпідні бішари мембран, то нижчі спирти, в основному, мають вплив на ліпіди інтерцеллюлярного матриксу, частково екстрагуючи їх, а також підвищують розчинність активної речовини, тим самим сприяючи кращому її розподілу в роговому шарі.

У цьому випадку на проникність шкіри також істотно впливає кількість атомів вуглецю в алкільному ланцюгу аліфатичного спирту. Так, для феназепаму ми спостерігали значне посилення протисудомного ефекту при використанні лауринового спирту, що узгоджується з даними по посилюючій дії аліфатичних кислот (рис. 6).

Іншими словами, механізм дії аліфатичного спирту (С11Н23ОН) збігається з механізмом дії аліфатичної кислоти (С11Н23СООН). При використанні лауринового спирту фармакологічний ефект досягає 400-500% стосовно контролю і практично в 2,5 рази перевищує ефект, який спостерігається при використанні ТТС без підсилювачів проникності.

Інша картина спостерігається при використанні 3-гідроксифеназепаму та, особливо, клоназепаму (рис. 7). У випадку клоназепаму ми спостерігаємо чітке посилення протисудом-ного ефекту при використанні нижчих спиртів. Найбільш виражений ефект ми спостерігаємо при використанні ізопропанолу (рис. 7 (б)).

Очевидно, що ізопропанол сприяє поліпшенню розподілу клоназепаму у шкірі, одночасно маючи вплив на ліпіди інтерцелюлярного матриксу, частково їх екстрагуючи і замінюючи своїми молекулами. Все це сприяє поліпшенню проникнення активної речовини у внутрішнє середовище організму. Саме тому, що внаслідок низької ліпофільності, клоназепам використовує саме ці шляхи проникнення, то використання вищих спиртів не приводить до помітного збільшення фармакологічного ефекту (рис. 7 (б)).

Використання речовин, які мають взаємодію з мембранами клітин, зокрема, поверхнево-активні речовини (ПАР), являє значний інтерес при трансдермальному введенні. Нами був досліджений ряд катіонних ПАР (солі алкілпіридинія), що містять алкільні замісники від С10 до С16. Аналіз одержаних результатів показав, що кількість атомів вуглецю в алкільному ланцюгу алкілпіридиній хлоридів надає незначний вплив на проникність шкіри для феназепаму та 3-гід-роксифеназепаму, тоді як для клоназепаму збільшення довжини радикалу приводить до значного зменшення посилюючої дії відповідного алкілпіридинія, хоч за абсолютним значенням ці речовини надають більш посилюючий ефект на проникність феназепаму та 3-гідроксифеназепаму, ніж клоназепаму (рис. 8).

Визначення вмісту феназепаму в органах та тканинах дослідних тварин, а також константи абсорбції показало, що результати фармакодинамічного аналізу протисудомного ефекту повністю корелюють з фармакокінетичними даними.

Аналіз одержаних даних дозволяє дійти до висновку, що використання аліфатичних кислот, зокрема, лауринової кислоти, найбільшою мірою змінює бар`єрні властивості шкіри, приводячи до збільшення її проникності для феназепаму. Нами була вивчена динаміка протисудомної дії феназепаму у присутності лауринової кислоти (рис. 9) та визначені параметри фармакокінетики (табл.7). Використання лауринової кислоти дозволяє реєструвати достовірний протисудомний ефект уже через 15 хвилин після аплікації. При використанні стандартної ТТС, достовірний ефект реєструвався через 2-3 години після аплікації. Також ми спостерігаємо посилення самого протисудомного ефекту, що досягає 3-х разового збільшення, порівняно з контрольними значеннями. При використанні феназепаму в складі стандартної ТТС цей показник не перевищує 200%. Спостерігається також пролонгованість дії препарату до 72 годин без помітного зниження ефекту.

Використання лауринової кислоти як підсилювача проникності для феназепаму призводить до збільшення середнього часу утримання препарату в крові з 19,3 ± 0,6 до 32,7 ± 11,7 годин, а його біодоступність збільшується з 38 % до 92 % за вмістом у крові і з 20 % до 83 % за вмістом у головному мозку. Збільшення біодоступності та середнього часу утримання феназепаму свідчить про достовірне збільшення його проникнення крізь шкіру з аплікованої матриці.

Таким чином, використання різних підсилювачів проникності, що викликають оборотне порушення структури рогового шару, і підібраних залежно від ліпофільності похідних 1,4-бенздіазепіну, призводить до збільшення їх надходження у внутрішнє середовище організму та пролонгації їх дії.

На основі проведених досліджень нами була запропонована нова біологічно-активна сполука на основі хімічної модифікації молекули 3-гідроксифеназепаму, шляхом уведення до складу молекули залишку лауринової кислоти. З цією метою у відділі медичної хімії Фізико-хімічного інституту ім. О.В.Богатського був синтезований лауразепам (3-лауроїлокси-7-бром-5-(о-хлор)феніл-1,2-дигидро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-он) (рис. 10).

Визначення LD50 і ED50 показало, що ці показники складають: LD50 = 800 мг/кг, ED50 = 0,56 мг/кг.

Вивчення динаміки дії лауразепаму при одноразовому внутрішньовенному введенні в дозі 10 мг/кг показало, що цей препарат, на відміну від інших похідних 1,4-бенздіазепіну, має тривалу протисудомну дію по антагонізму з коразолом (рис. 11 (а)).

Достовірний протисудомний ефект відмічався в діапазоні 0,5-96 годин, на відміну від інших похідних 1,4-бенздіазепіну, після одноразового внутрішньовенного застосування яких ефект відмічається протягом 12-15 годин, як було показано вище. Високу протисудомну дію лауразепаму було відмічено в діапазоні доз 0,125-20 мг/кг. Використання трансдермального способу введення лауразепаму дозволяє одержати тривалий, стабільний, високий протисудомний ефект, який за своїми абсолютними значеннями практично не відрізняється від ефекту ТТС, що містить 3-гідроксифеназепам, однак максимальний прояв фармакологічної дії спостерігається через 24 години після аплікації, що, мабуть, обумовлено поступовим гідролізом лауразепаму, який повільно надходить до організму (рис. 11(б)).

Практично постійний рівень вмісту 3-гідроксифеназепаму та лауразепаму в крові і головному мозку мишей після трансдермального введення лауразепаму забезпечує його тривалий протисудомний ефект (рис. 12).

Аналіз фармакокінетичних показників свідчить, що при трансдермальному введенні відбувається збільшення часу утримання активних речовин в організмі, а також заслуговує уваги той факт, що константа елімінації (kel) для загального радіоактивного