УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ

КЕЛЕБЕРДА МИКОЛА ІВАНОВИЧ

УДК 619:615.37:616.98:578.831.1

КОРЕКЦІЯ ІМУНІТЕТУ ПОХІДНИМИ ІМІДАЗОЛУ ПРИ ВАКЦИНАЦІЇ ПТИЦІ ПРОТИ ІНФЕКЦІЙНОЇ БУРСАЛЬНОЇ ТА Н’ЮКАСЛСЬКОЇ ХВОРОБ

16.00.03 - ветеринарна мікробіологія та вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

Харків 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН.

Науковий керівник доктор ветеринарних наук, професор, академік УААН Красніков Геннадій Андрійович, Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, завідувач лабораторії патоморфології.

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор Апатенко Володимир Максимович, Харківська державна зооветеринарна академія Міністерства аграрної політики України, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології;

кандидат ветеринарних наук Пархоменко Людмила Іванівна, Луганський національний аграрний університет Міністерства аграрної політики України, доцент кафедри мікробіології, фармакології, клінічної діагностики, вірусології, клінічної біохімії та токсикології.

Провідна установа Кримський державний агротехнологічний університет Міністерства аграрної політики України, кафедра вірусології і мікробіології, м. Сімферополь

Захист відбудеться „ 2 ” березня 2004 року о 900 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.359.01 в Інституті експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

Автореферат розісланий „ 27 ” січня 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор ветеринарних наук _______________ А.Ф. Бабкін

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Розвиток основ сучасної імунології і встановлення складних кооперативних взаємодій між різними спеціалізованими клітинами імунної системи зумовили створення нових галузей цієї науки. Швидко і плідно розвивається та її частина, яка займається вивченням зниження активності органів імунітету, зокрема тих її станів, які одержали назву імуносупресій або імунодефіцитів (Р.В. Петров, 1987; М.В. Воргалик, 1986; Ю.Н. Федоров, 1999). Імунодефіцити досить поширені і у тваринництві. Проведені в минулі роки дослідження та повідомлення наукової літератури вказують на велике економічне і епізоотологічне значення факторів, що пригнічують функцію імунітету. Актуальним, у зв'язку з цим, є удосконалення методів діагностики імунодефіцитів, розробка схем і засобів корекції імунітету із застосуванням нових, порівняно дешевих імуностимуляторів, особливо при використанні вірусних вакцин, які спричиняють імуносупресивну дію.

Про ефективність використання імуностимуляторів при вакцинації птиці повідомляють багато авторів (А.М. Паланський, 1992; С.П. Фисенко, 1990; Г.А. Красніков, 1997-2000; В.М. Апатенко, 2000; М.С. Жаков, 2000; И.Н. Громов, 2000; Е.И. Большакова, 2000 та ін.), однак, як вибір самих стимуляторів, так і схем їх застосування ще не одержали достатнього наукового обґрунтування.

Недостатність імунної відповіді часто виникає при імунодефіцитах. В практиці наукових досліджень щодо діагностики імунодефіцитних станів частіше застосовують імунологічні методи, засновані на вивченні клітин і факторів крові, які з багатьох причин реалізуються лише частково і не дають повного уявлення про стан імунітету. У цьому плані великі можливості криються у комплексному застосуванні серологічних і гістоморфологічних методів досліджень. Найчастіше в діагностиці імунодефіцитних станів при вакцинаціях та імуностимуляції птиці користуються тільки одним із вищезазначених методів, що не завжди дозволяє отримати позитивний результат. У доступній літературі ми знайшли лише дані И.А. Кривутенко (1980), Г.А. Краснікова і Н.Г. Колоусової (1991) та И.Н. Громова (2000) про використання гістологічного методу для оцінки активності імуностимуляторів. Даних щодо відпрацювання схем їх ефективного застосування при вакцинації за допомогою серологічних та гістологічних досліджень у доступних нам джерелах не було виявлено. У зв'язку з цим доцільним було застосувати і перевірити розроблені в ІЕКВМ критерії оцінки стану імунітету при дії супресивних і стимулюючих факторів у курчат, зокрема, при щепленні вірус-вакциною 2 ІЕКВМ із штаму УМ-93, вакцинами із слабо-атенуйованих штамів БГ і 228 Е вірусу інфекційної бурсальної хвороби та вакцини із штаму Ла-Сота проти н’юкаслської хвороби і на їх тлі розробити схеми ефективного застосування похідних імідазолу (левамізолу і його аналога ФІАНТ-2, синтезованого в Україні).

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась згідно тематичних планів ІЕКВМ, затверджених Українською академією аграрних наук: „Вивчити механізм формування функції імунітету і розробити методи інтегральної оцінки його стану та направленої корекції” 1998-2000 рр. (№ держреєстрації 0197U000754); „Дослідити механізми формування клітинного і гуморального імунітету з метою удосконалення методів діагностики, профілактики і лікування заразних хвороб тварин” 2001-2002 рр. (№ держреєстрації 0101U001611).

Мета і задачі дослідження. Метою наших досліджень була розробка схем корекції імунітету похідними імідазолу (левамізол і ФІАНТ-2) і визначення ефективності їх застосування при вакцинаціях проти н’юкаслської та інфекційної бурсальної хвороб з використанням методів серологічного і гістоморфологічного аналізу.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі задачі:

· Визначити ефективність застосування серологічного методу виявлення антитіл в комплексі з гістологічними дослідженнями при вивченні імунодефіцитних станів, обумовлених застосуванням вакцин із слабоатенуйованих вірусних штамів та при розробці ефективних схем імуностимуляції у птиці;

· Вивчити гістоморфологічні зміни фабрицієвої бурси при застосуванні вакцин із слабоатенуйованих штамів БГ та 228 Е вірусу інфекційної бурсальної хвороби;

· Порівняти схеми імуностимуляції левамізолом та ФІАНТ-2, застосованих окремо або з добавками аеросилу і вітаміну Е, при імунізації курчат вакциною із слабоатенуйованого штаму БГ вірусу інфекційної бурсальної хвороби;

· Провести вивчення одно- і двоциклічного методу застосування ФІАНТ-2 при щепленні курчат проти інфекційної бурсальної хвороби (шт.УМ-93) та н’юкаслської хвороби (шт. Ла-Сота);

· Дослідити стимулюючу дію ФІАНТ-2 при вакцинації проти н’юкаслської хвороби курчат 15-ти і 25-ти добового віку;

· Відпрацювати кратність і тривалість введення левамізолу курчатам при щепленні їх проти н’юкаслської хвороби (шт. Ла-Сота);

Об’єкт дослідження. Імунодефіцити у птиці та посилення післявакцинального імунітету шляхом застосування імуностимуляторів.

Предмет дослідження. Серологічні та гістологічні методи дослідженння при вивченні імунітету курчат після вакцинацій проти інфекційної бурсальної та н’юкаслської хвороб, а також відпрацювання ефективних схем застосування стимуляторів імідазолового ряду (левамізолу та ФІАНТ-2).

Методи дослідження. Робота виконана з використанням серологічних, імуногістохімічних, морфометричних, біохімічних та статистичних методів досліджень.

Наукова новизна одержаних результатів. Наукова новизна роботи полягає в отриманні нових даних щодо застосування комплексу серологічних і гістоморфологічних досліджень при вивченні імунітету після щеплень та його корекції, зокрема, при вакцинації проти інфекційної бурсальної і н’юкаслської хвороб та показана доцільність одночасного застосування гістохімічних досліджень (метод Браше) при ідентифікації різних форм імунокомпетентних клітин та оцінці імунних структур, стану їх функціональної і гермінативної активності. Встановлена імуносупресивна дія вакцин, широке застосування яких призводить до розвитку поствакцинальних імунодефіцитів, особливо після щеплення вакцинами із штамів БГ і 228 Е проти інфекційної бурсальної хвороби. Визначена імуностимулююча активність нового препарату ФІАНТ-2, який застосовували окремо або з вітаміном Е. Вперше вивчено особливості імуностимулюючої дії ФІАНТ-2 на формування імунітету у курчат різного віку після щеплення вірусними вакцинами.

Запропоновано спосіб стимуляції імунітету шляхом застосування ФІАНТ-2 з інтервалами різної тривалості (двоциклічний метод) [деклараційний патент № 46377 А Україна МКІ 7 А61К31/425. Спосіб застосування імуностимулятора для модуляції імунітету при вакцинації сільськогосподарської птиці].

Практичне значення одержаних результатів. При визначенні рівня поствакцинального імунітету птиці пропонується проводити одночасну комплексну оцінку показників серологічних досліджень з гістоморфометричним вивченням основних структур тимуса, селезінки і фабрицієвої бурси згідно рекомендованих критеріїв норми, посилення і послаблення морфофункціонального стану.

Рекомендується з метою посилення імунної відповіді після щеплення проти інфекційної бурсальної та н’юкаслської хвороб застосовувати левамізол або ФІАНТ-2 за одноциклічною та двоциклічною схемами. Для зменшення патологічних змін фабрицієвої бурси при застосуванні вакцини БГ із слабоатенуйованого вірусу інфекційної бурсальної хвороби доцільно використовувати стимулятор з вітаміном Е.

На підставі виконаних досліджень розроблено „Рекомендації щодо патоморфологічної діагностики імунодефіцитів птиці, їх корекції та стимуляції післявакцинального імунітету похідними імідазолу”.

Особистий внесок здобувача. Автор дисертації особисто приймав участь в розробці схем і напрямків експериментів, організації та проведенні науково-господарських дослідів. Самостійно виконав весь обсяг експериментальних досліджень, узагальнив первинні дані, які статистично обробив і проаналізував.

Апробація результатів дисертації. Результати були представлені, обговорені і схвалені на річних наукових конференціях ІЕКВМ УААН, звітних сесіях вченої ради ІЕКВМ УААН у 1998-2002 роках; першій міжвузівській науковій конференції молодих вчених і аспірантів „Інфекційна патологія молодняку сільськогосподарських тварин і птиці” (9-10 червня 1999 р. САУ м. Суми); конференції молодих вчених та спеціалістів ІЕКВМ ”Стан та перспективи розвитку ветеринарної науки” (6-7 жовтня 1999 р. ІЕКВМ м. Харків); Міжнародній науково-практичній конференції „Ветеринарна медицина на порозі ХХІ століття” (15-16 листопада 2000 р. ІЕКВМ м. Харків); V-му з’їзді паразитоценологів України „Проблеми зооінженерії та ветеринарної медицини” (5-6 квітня 2001р., ХЗВІ і ХДМУ м. Харків); Міжнародній науково-практичній конференції „Актуальні проблеми ветеринарної медицини в умовах сучасного ведення тваринництва” (26 травня-2 червня 2003 р., ІЕКВМ м. Феодосія).

Публікації. Основний зміст дисертації викладено у 16 друкованих працях, з них 13 статей опубліковано у фахових виданнях. У співавторстві опубліковані методичні рекомендації та деклараційний патент на винахід.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 149 сторінках комп’ютерного тексту, ілюстрована 15 таблицями і 18 рисунками. Робота складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, власних досліджень, аналізу і узагальнення результатів власних досліджень, висновків і пропозицій виробництву та списку джерел літератури, який містить 301 найменування, в тому числі 103 іноземних.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Досліди проводились на базі лабораторій патоморфології, вивчення хвороб птиці і біохімії ІЕКВМ УААН та в умовах птахогосподарств Харківської області.

В Люботинському птахогосподарстві проведено серологічний аналіз проб сироваток крові курчат віком 16 - 20 діб на наявність антитіл до вірусів інфекційної бурсальної і н’юкаслської хвороб в реакції непрямої гемаглютинації (РНГА) з використанням наборів діагностикумів, виготовлених в лабораторії з вивчення хвороб птиці ІЕКВМ УААН. В серологічних реакціях досліджено 1125 проб сироваток крові від курчат різного віку під час дії супресивних і стимулюючих факторів (при консультації та підтримці завідувача лабораторії з вивчення хвороб птиці, член-кореспондента УААН Германа В.В). На підставі отриманих даних проведено аналіз динаміки серопозитивності в залежності від вибраної вакцини, імуностимулятора, схем їх застосування та віку курчат.

В ході експериментів були використані такі препарати:

1. Жива суха вірус-вакцина проти ІБХ із штаму „БГ” (ВНДІЗТ м. Владимир, Росія); 2. Вакцина проти ІБХ 228 Е Nobilis Gamboro (Голандія); 3. Культуральна вірус-вакцина 2 із штаму УМ-93 проти ІБХ (ІЕКВМ); 4. Ліофілізована жива вакцина проти н’юкаслської хвороби із штаму Ла-Сота (Сумська біофабрика). Розрахунок доз вакцин проти ІБХ і НХ проводили відповідно до тимчасових настанов щодо їх застосування.

5. Набори еритроцитарних діагностикумів для виявлення антитіл до вірусів інфекційної бурсальної та н’юкаслської хвороб в реакції непрямої гемаглютинації (РНГА) (ІЕКВМ).

6. Левамізола гідрохлорид (Харківська біофабрика „Здоров`я”) – задавали в дозі 2,5-4 мг/кг живої ваги; 7. ФІАНТ-2 - хімічно чистий хлоралгідрат двоводного 6-фенілімідазо (2.1.-6) тіазолідона (виробництво Донецького НІІУХ) - задавали в дозі 1 мг/кг живої ваги; 8. Вітамін Е - задавали в дозі 0,5 мг на 1 кг корму; 9. Аеросил (ГОСТ 14922-77)– задавали в дозі 2,5 г на 1 кг корму.

В гістоморфологічних дослідах було використано 246 голів курчат породи Род-айленд, кросів Білорусь-9 і Борки 2М, віком від однієї доби до двох місяців.

Морфофункціональний стан тимуса, фабрицієвої бурси та селезінки визначали згідно „Методических рекомендаций по гистоморфологической оценке иммунокомпетентных органов цыплят в норме и при иммунодефицитах” –Харьков, (1989) з урахуванням додаткових даних про значення ролі досліджень виявлення РНК (за Браше) при оцінці функціональної активності гістологічних структур органів імунітету.

При морфометрії імунокомпетентних органів визначали:

- у фабрицієвій бурсі: лінійні розміри фолікулів (мкм), ширину коркової речовини фолікулів (рядів клітин), потенціал фолікулів - ПТФ (отримували шляхом множення довжини фолікулів на ширину їх коркової речовини, виражене в %), площу серединного січення фабрицієвої бурси (мм2);

- у селезінці: кількість лімфоїдних фолікулів на площі серединного зрізу, кількість гермінативних фолікулів, стан ретикулярних муфт та наявність плазмацитів;

- у тимусі: ширину підкапсулярного шару часточок (за кількістю рядів піронінофільних клітин), мозково – коркове співвідношення - МКС (шляхом ділення ширини мозкової речовини на суму ширини коркової речовини з обох боків часточок), ознаки руйнування тимоцитів.

Визначення розмірів структур проводили за допомогою окулярмікрометра. Результати зважування органів та морфометрії піддавали статистичній обробці на ПК з обчисленням середнього арифметичного (М), помилки середнього геометричного (±м) і рівня вірогідності (Р).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Вивчення імуносупресивної дії живих вакцин із штамів БГ та 228 Е вірусу інфекційної бурсальної хвороби

В досліді використано 40 голів курчат, щеплених вакцинами і забитих на 7 та 14 добу після вакцинації. Дослідження показали, що за характером уражень, які розвиваються, та їх динамікою загальна картина змін фабрицієвої бурси при застосуванні обох вакцин була дуже схожа і проявлялася ознаками як імуносупресивного, так і запального некробіотичного типу. Вже на сьому добу спостерігали різке зменшення розмірів фолікулів з повною або частковою втратою коркової та делімфотизацією мозкової речовин. Характерною була наявність розрізнених або зібраних у вигляді скупчень однакових за розміром комірчинок або пухирців, що надавали тканині вигляду бджолиних стільників або піни. Подальше дослідження показало, що цими комірчинами є балоновані, сильно збільшені, з напруженими стінками ретикулярні клітини типу макрофагів з рештками лізованих внутрішніх структур. Зустрічались ділянки, що містили лімфоцити з ознаками некробіозу, пікнозу або рексизу. При дуже виражених змінах бурси комірчасті порожнини зливались, утворюючи великі кісти. Частина складок майже повністю втрачала фолікули і мала вигляд гіллястих утворень. Морфологічні дослідження свідчили, що вже через сім діб після щеплення в фабрицієвій бурсі починає розвиватись атрофія, яка значно посилювалася на 14 добу після введення вакцин і характеризувалась подальшим лімфоїдним спустошенням фолікулів, посиленням розвитку ретикулярної сполучної тканини, численними кістами та перетворенням фолікулів у залозисті структури (табл. 1).

Було очевидно, що обидві вакцини чинили виражену імуносупресивну дію, тому у наступних дослідженнях вивчали вплив імуностимуляторів левамізолу і ФІАНТ-2 з добавками вітаміну Е і аеросилу при застосуванні однієї з цих вакцин.

Вивчення стану імунітету після застосування імуностимуляторів птиці, щепленої вакциною із слабоатенуйованого штаму БГ вірусу інфекційної бурсальної хвороби

Дослід було проведено на 120 головах щеплених вакциною курчат, з яких було сформовано 12 груп птиці з різними модифікаціями застосування левамізолу і ФІАНТ-2 та добавок вітаміну Е і аеросилу.

Аналізуючи результати серологічних досліджень в РНГА за дві доби до щеплення була встановлена відсутність материнських антитіл до вірусу інфекційної бурсальної хвороби (рис. 1).

Після інокуляції вакцини були виявлені аглютинуючі антитіла, титр яких на 14 добу зростав до 2,2 log2. Достовірне збільшення титрів було зареєстровано в групах курчат, яким ФІАНТ-2 задавали чотири рази підряд, окремо або в суміші з вітаміном Е, а також при використанні левамізолу з вітаміном Е дворазово через добу. В цих же групах встановлені кращі показники групового імунітету. Рівень захисту в цих групах складав 60-100%.

Проведені дослідження виявили деяку різницю між групами у результатах визначення маси тіла і імунокомпетентних органів. Дані таблиці 2 свідчать про те, що збільшення маси тіла, фабрицієвої бурси та селезінки у порівнянні з контролем, де стимулятори і добавки не застосовували, спостерігалось у всіх групах. Причому найбільший ефект збільшення маси імунних органів спостерігався при застосуванні одних стимуляторів (левамізолу за схемою два рази з інтервалом одну добу та ФІАНТ-2 чотири рази підряд) без добавок.

При гістологічному вивченні стимулюючої дії препаратів та добавок і їх інтегрального впливу на всі досліджені органи була застосована трибальна система оцінки стану всього комплексу органів імунітету по дослідженій групі відповідно до кількості курчат з найбільшими, середніми і найнижчими рівнями вираженості кожного із шести досліджуваних параметрів. Стабільно високі результати при застосуванні такої системи оцінки були отримані у групах, де застосовували левамізол в дозі 4 мг/кг дворазово з інтервалом одну добу і ФІАНТ-2 чотири рази щодня в дозі 1мг/кг з наступної доби після щеплення. Добавка вітаміну Е та аеросилу на вираженість ознак стимуляції структур імунокомпетентних органів істотно не позначалась, але при їх застосуванні патологічні зміни були меншими у порівнянні з групою контролю.

Отримані в цій серії дослідів дані свідчать про доцільність використання препаратів імідазолового ряду навіть при застосуванні вакцин із вираженою залишковою патогенністю, які викликають не тільки імуносупресію, але й деструкцію імунокомпетентних органів.

Подальші дослідження були спрямовані на стимуляцію імунної відповіді при імунізації птиці менш реактогенними вакцинами проти інфекційної бурсальної та н’юкаслської хвороб. В той же час проводили опрацювання нових більш ефективних схем застосування імуностимуляторів.

Відпрацювання ефективних схем застосування імуностимулятора ФІАНТ-2 при щепленні птиці проти н’юкаслської та інфекційної бурсальної хвороб

Головною особливістю цих досліджень було те, що крім схеми короткочасного застосування імуностимулятора здебільшого протягом одної-двох діб було вирішено пролонгувати його дію за рахунок збільшення кратності введення препарату з повторною аплікацією через 7-8 діб. Таким чином, повторний цикл стимуляції співпадав з періодом піку імунної реакції, викликаної первинним введенням антигену. Дослід було проведено на 36 курчатах, яких в 16-добовому віці одночасно щеплювали проти н’юкаслської хвороби вакциною із штаму Ла-Сота та інфекційної бурсальної хвороби вірус-вакциною 2 – ІЕКВМ із штаму УМ-93. Були використані одноциклічна та двоциклічна схеми застосування імуностимулятора ФІАНТ-2. За одноциклічною схемою стимулятор у дозі 1 мг/кг живої маси випоювали після щеплення дві доби підряд або через добу. При двоциклічній схемі - два рази з інтервалом одну добу, а потім таким же чином проводили другий цикл через сім діб.

При узагальнені результатів серологічних досліджень проб крові курчат було встановлено, що титри аглютинуючих антитіл змінювались в залежності від вибраної схеми стимуляції. Тільки через 7 діб після ревакцинації та другого циклу застосування стимулятора в 3-й дослідній групі спостерігали достовірне збільшення титру антитіл на 1,3 log2 як до вірусу н’юкаслської, так і інфекційної бурсальної хвороб. В групах, де використовували одноциклічні схеми стимуляції відзначали посилення гуморальної імунної відповіді на 0,3-1 log2 в РНГА (рис. 2).

Дослідженнями встановлені чіткі ознаки стимулюючої дії препарату на масу курчат і імунокомпетентних органів. Особливо виразно вони проявлялися через 21 добу після щеплення та стимуляції за двоциклічною схемою. Так, індекс маси фабрицієвої бурси становив 7,81 проти 2,4 у контролі, а індекс маси селезінки відповідно 3,05 проти 1,6.

Результати гістологічних досліджень свідчили, що матеріальною основою збільшення маси імунокомпетентних органів було зростання площі функціональної паренхіми, кількості лімфоїдних клітин та розміру фолікулів. При застосуванні двоциклічної схеми стимуляції ФІАНТ-2 за рядом гістологічних показників були отримані максимальні результати, зокрема морфофункціональний потенціал фолікулів збільшувався на 35-37 % порівняно з групами одноциклічного застосування ФІАНТ-2, а ширина кори фолікулів на 30-40 %, відповідно (табл. 3). Отже при застосуванні ФІАНТ-2 за двоциклічною схемою за даними серологічних та морфометричних досліджень відмічались максимальні прояви імуностимуляції.

Вивчення імуностимулюючої дії ФІАНТ-2 в залежності від віку вакцинованих курчат

В досліді було використано 32 голови курчат, з яких половина була щеплена у 15- добовому віці, друга половина на 25 добу проти н’юкаслської хвороби вакциною із шт. Ла-Сота. Стимуляцію ФІАНТ-2 проводили з наступної доби чотири рази підряд. Забій курчат проводили на 7 та 14 добу після щеплення.

Необхідно відмітити, що при чотириразовому застосуванні ФІАНТ-2 реєстрували виражену стимуляцію гуморального і клітинного імунітету у птиці обох вікових груп. При дослідженні проб крові курчат молодшої вікової групи перед щепленням були зареєстровані материнські антитіла у низьких титрах 0,5 log2, але вже на 14 добу після щеплення і стимуляції титр аглютинуючих антитіл зростав в 6 разів до 3,2 log2 порівняно з вихідним і на 0,5 log2 в порівнянні з групою контролю. Рівень сероконверсії в цей період при дослідженні проб сироваток в дослідній групі становив 100проти 80 % у птиці контрольної групи, якій не застосовували імуностимулятор. При стимуляції ФІАНТ-2 птиці старшого віку, щепленої проти н’юкаслської хвороби, титр антитіл зростав до 4,6 log2 в порівнянні з 4,0 log2 у контрольній групі. Показник групового імунітету в обох групах становив 100%.

Стимулююча дія ФІАНТ-2 була підтверджена при визначенні маси імунокомпетентних органів і морфометрією. Вже через 7 діб у птиці молодшого віку маса фабрицієвої бурси зростала на 25,8 %, а через 14 діб на 35,7%. В цей період посилювалася проти контролю величина ПТФ на 30 %, що свідчило про зростання розмірів фолікулів і ширини кори. Помітно збільшувалися показники активності тимусу.

Проте значно вищий стимулюючий ефект було відмічено при застосуванні стимулятора птиці старшого віку. При цьому жива маса тіла, маса селезінки, фабрицієвої бурси і тимуса зростала відносно контролю, площа фабрицієвої бурси значно збільшувалася. Розміри її фолікулів становили 627,6±15,6 мкм, а ширина кори 9,1±0,7 рядів клітин при контролі 4,8±0,57. Збільшувався потенціал фолікулів. У селезінці реєструвалися лімфоїдні та гермінативні фолікули.

Таким чином було встановлено, що ФІАНТ-2 зумовлює виражену імуностимулюючу дію при застосуванні його курчатам старшого віку. Оптимальною є схема, при якій ФІАНТ-2 використовували впродовж чотирьох діб.

Вивчення стимулюючої дії левамізолу при застосуванні його вакцинованим курчатам за різними схемами

Дослід було проведено на 40 курчатах 15- добового віку, щеплених проти н’юкаслської хвороби вакциною із штаму Ла-Сота, з яких було сформовано п’ять груп. Левамізол застосовували у дозі 2,5 мг/кг живої маси. Препарат задавали випоюванням за двоциклічними схемами (чотири доби підряд з перервою між циклами сім діб і дворазово через 1 добу з перервою між циклами вісім діб), а також одноциклічно (чотири рази щодоби і два рази з перервою одна доба). Курчат групи контролю щеплювали без стимуляції. Забій проводили на 10 та 20 добу після щеплення.

За результатами серологічних досліджень в РНГА встановлено перевагу двоциклічної схеми імуностимуляції з чотириразовим щодобовим випоюванням левамізолу над іншими схемами. Титр аглютинуючих антитіл до вірусу н’юкаслської хвороби на 20 добу після щеплення у цій групі був на 0,8 log2 вище порівняно з групою контролю. Серед груп з одноциклічними схемами імуностимуляції кращі показники були у групі, яка отримувала левамізол чотири доби підряд починаючи з наступної доби після щеплення. В цій групі спостерігали збільшення титру антитіл на 0,6 log2 в порівнянні з контролем. Отже результати серологічних досліджень свідчили про те, що застосування левамізолу сприяло підвищенню титру поствакцинальних антитіл і рівня групового імунітету в усіх дослідних групах курчат, який на 20 добу після щеплення становив 80-100 %.

При гістологічному дослідженні курчат контрольної групи були встановлені ознаки імунодефіциту, що проявлявся головним чином частковою делімфотизацією фолікулів, звуженням їх коркового шару та присутністю у фолікулах світлих, дрібних порожнин (дірочок) на місці зруйнованих клітин, що найчастіше виникають на ранніх стадіях дії сильних антигенних факторів.

Високі морфометричні показники імунокомпетентних органів були також отримані у групі курчат, яким застосовували двоциклічну схему стимуляції левамізолом. Значний рівень стимуляції встановлено при випоюванні левамізолу за одноциклічною схемою чотири рази поспіль. Проте цей ефект був не тривалим і не виявлявся при дослідженні матеріалів через 20 діб після щеплення. Це спостереження підкреслює доцільність використання двоциклічної схеми стимуляції імунної системи курчат.

Висновки

1. Вивчена імуносупресивна дія живих вакцин із штамів БГ та 228 Е вірусу інфекційної бурсальної хвороби. Запропоновані схеми корекції імунітету похідними імідазолу (левамізол і ФІАНТ-2) при вакцинаціях птиці проти н’юкаслської та інфекційної бурсальної хвороб. Розроблено комплекс серологічних, морфометричних та імуногістохімічних досліджень, що дозволяє оцінювати гуморальний і клітинний стан імунітету птиці при застосуванні вакцин з імуносупресивною дією і контролювати ефективність корегуючої дії імуностимуляторів.

2. Однією із головних причин послаблення функції імунокомпетентних органів є їх ураження імуносупресивними вірусами та вакцинами, виготовленими на їх основі. Після щеплення курей вакцинами БГ та 228 Е із слабоатенуйованих вірусів інфекційної бурсальної хвороби в фабрицієвій бурсі розвиваються зміни характерні для цього захворювання, які приводять до руйнування фолікулів та атрофії органу, що зумовлює тяжкий імунодефіцитний стан.

3. Левамізол в дозі 4 мг/кг живої ваги та ФІАНТ-2 - 1 мг/кг живої ваги, при застосуванні їх за рекомендованими схемами, стимулюють стан гуморального імунітету курчат після щеплення проти інфекційної бурсальної хвороби вакциною із штаму БГ. Застосування цих препаратів чотири рази підряд самостійно, або в комплексі з вітаміном Е сприяє підвищенню титру антитіл на 0,6-0,8 log2 порівняно з групою контролю.

4. За даними серологічних та гістологічних досліджень препарат ФІАНТ-2, похідний імідазолу, в дозі 1 мг/кг живої маси проявляє виражену імуностимулюючу дію і не поступається за ефективністю левамізолу, застосованому в дозі 2,5-4 мг/кг.

5. Застосування вітаміну Е та аеросилу разом з імуностимуляторами (левамізолом і ФІАНТ-2) не посилює морфофункціональну активність імунокомпетентних органів після щеплення вакциною БГ, але зменшує ступінь вираженості патологічних змін, зумовлених дією вакцини.

6. Ефект імуностимулюючої дії при щепленні птиці проти н’юкаслської хвороби (вакциною із штаму Ла-Сота) та інфекційної бурсальної хвороби (вірус-вакциною 2 ІЕКВМ із штаму УМ-93) досягається при дворазовому призначенні ФІАНТ-2 з наступної доби після щеплення. Прояви імуностимуляції розвиваються швидше при введенні препарату один раз на добу протягом чотирьох діб. Більш стійкий і тривалий ефект забезпечує застосування двоциклічної схеми, яка передбачає дво- або чотириразове введення імуностимулятора підряд кожну добу, з перервою сім-вісім діб.

7. Чіткі прояви імуностимулюючої дії препарату зумовлює застосування ФІАНТ-2 за двоциклічною схемою при одночасній вакцинації птиці проти інфекційної бурсальної та н’юкаслської хвороби. Найбільше імуностимуляція проявляється на 21 добу після щеплення. Титр специфічних антитіл при цьому зростає на 1,3 log2 як при вакцинації проти н’юкаслської хвороби, так і інфекційної бурсальної хвороби у порівнянні з групою, якій не задають імуностимулятор. Одноциклічні схеми імуностимуляції ФІАНТ-2 сприяють збільшенню титрів антитіл на 0,3-1 log2.

8. Ефективність дії імуностимуляторів при щепленні проти н’юкаслської хвороби залежить від віку курчат. Кращий ефект імуностимуляції дає застосування ФІАНТ-2 курчатам старшого віку після щеплення в 25-ти добовому віці, коли імунні органи досягають більш вираженої морфологічної завершеності в порівнянні з курчатами, яким вводять вакцини і використовують імуностимулятор у 15-ти добовому віці. Рівень групового імунітету на 14 добу після щеплення проти н’юкаслської хвороби складає 100 % у птиці обох вікових груп, але титр антитіл вище у птиці, яку щеплюють в віці 25 діб.

9. Двоциклічна схема імуностимуляції ефективна як при застосуванні левамізолу, так і ФІАНТ-2. Найвищий ефект приросту маси та стимуляції морфометричних показників імунокомпетентних органів дає ця схема при щепленні проти н’юкаслської хвороби.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Вивчення патогенної дії вакцин БГ та 228 Е проти інфекційної бурсальної хвороби на фабрицiєву бурсу / Г. Краснiков, В. Герман, М. Келеберда, О.Дубров // Вет. медицина України. - N 9.-1999.- с.12-13. Дисертант провів досліди, виготовив гістологічні препарати і зробив морфометрію та статистичну обробку матеріалів.

2. Келеберда М.I. Гістологічна оцінка iмуностимулюючої дії левамізолу, ФIАНТ та комбінованих препаратів при вакцинації проти інфекційної бурсальної хвороби// Вiсн. Сумського ДАУ: наук.-метод. журн.- 1999.- Вип.4.- С.99-101.

3. Келеберда М.I., Романько М.Е., Долгая М.М. Імуномоделюючий вплив тимомiметичних препаратів на реакцію імунокомпетентних органів при вакцинації проти хвороби Гамборо у птахів// Вет. медицина: Мiжвiд. темат. наук. зб.- Х., 1999.- Вып.76.- С.107-112. Дисертант провів дослід і приймав участь в серологічних, гістологічних та біохімічних дослідженнях, здійснив статистичну обробку даних та інтерпретацію результатів.

4. Красников Г.А., Келеберда Н.И. Некоторые особенности строения фабрициевой бурсы у кур// Наук. вiсн. НАУ.- 1999.- №16.- С.104-107. Дисертант провів гістологічні дослідження фабрицієвих бурс, морфометрію та статистичну обробку матеріалу.

5. Красников Г.А., Келеберда Н.И. Некоторые особенности гистоморфологии селезенки у кур// Наук. вiсн. НАУ.- 1999.- N 16.- С.109-111. Дисертант провів гістологічні дослідження селезінок, морфометрію та статистичну обробку матеріалу.

6. Красников Г.А., Келеберда Н.И. О возрастных особенностях фабрициевой бурсы у кур// Наук. вiсн. НАУ.- 1999.- N 16.- С.107-108. Дисертант провів гістологічні дослідження фабрицієвих бурс, морфометрію та статистичну обробку матеріалу.

7. Краснiков Г.А., Келеберда М.I. Експериментальнi обґрунтування схем застосування iмуностимуляторiв при вакцинації птиці// Вiсн. аграр. науки.- 2000.- N 11.- С.36-39. Дисертант приймав участь у постановці дослідів з відбором і підготовкою імунокомпетентних органів для гістологічних досліджень, проб крові курчат для серологічних і біохімічних досліджень, провів аналіз та узагальнення даних.

8. Красников Г.А., Герман В.В., Келеберда Н.И. Испытание различных схем применения производного имидазола - ФИАНТ-2 для стимуляции поствакцинального иммунитета у цыплят// Вет. медицина: Мiжвiд. темат. наук. зб.- Х., 2000.- Вип.77.- С.185-194. Дисертант провів досліди і вивчив особливості поствакцинального імунітету курчат при застосуванні різних схем ФІАНТ-2 за допомогою серологічних і гістологічних досліджень.

9. Красников Г.А., Герман В.В., Келеберда М.I. Опрацювання схем стимуляції імунітету після щеплення птиці за гiстоморфометричними критеріями // Вет. медицина: Мiжвiд. темат. наук. зб.- Х., 2000.- Т.1, Вип.78. - С.181-189. Дисертант провів досліди, узагальнив і проаналізував дані.

10. Красников Г.А., Келеберда Н.И. Некоторые морфофункциональные зависимости и гистоструктура центральных органов иммунитета у кур// Вет. медицина: Мiжвiд. темат. наук. зб. -   Х., 2000.- Вип.77.-С.199-206. Дисертант виконав дослідження та узагальнив експериментальні дані.

11. Красников Г.А., Келеберда Н.И., Маценко Е.В. Морфофункциональные проявления иммунодефицитов при вирусных болезнях птиц// Пробл. зооiнженерiї та вет. медицини: Зб. наук. праць ХЗВI.- Х., 2001.- С.186-187. Дисертант узагальнив експериментальні матеріали і проаналізував дані літератури.

12. Красников Г.А., Маценко Е.В., Келеберда Н.И. Вирус-вирусные, вирус-бактериальные и вирус-протозойные сообщности у животных, обусловленные иммунодефицитами// Пробл. зооiнженерiї та вет. медицини: Зб. наук. праць ХЗВI.- Х., 2001.- С.110-111. Дисертант узагальнив експериментальні матеріали і проаналізував дані літератури.

13. Красников Г.А., Маценко Е.В., Келеберда Н.И. Некоторые морфометрические подходы к оценке статуса органов иммунитета у кур// Пробл. зооiнженерiї та вет. медицини: Зб. наук. праць ХЗВI.- Х., 2001.- С.189-191. Дисертант проводив гістологічні та морфометричні дослідження, узагальнив отримані дані.

14. Красников Г.А., Маценко Е.В., Келеберда Н.И. О морфофункциональной зависимости между фабрициевой бурсой и селезенкой у цыплят// Пробл. зооiнженерiї та вет. медицини: Зб. наук. праць ХЗВI.- Х., 2001.- Ч.2, Вып.8(32).- С.141-143. Дисертант провів досліди та узагальнив їх результати.

15. Применение иммуностимуляторов для коррекции иммунодефицитных состояний, обусловленных действием микотоксинов и вирусов / Г.А. Красников, Н.Г. Колоусова, Е.В. Маценко, Н.И. Келеберда// Пробл. зооiнженерiї та вет. медицини: Зб. наук. праць/ ХЗВI.- Х., 2001.- С.188-189. Дисертант узагальнив та проаналізував результати досліджень.

16. Патент № 46377 А Україна МКІ 7 А61К31/425. Спосіб застосування імуностимулятора для модуляції імунітету при вакцинації сільськогосподарської птиці / Красніков Г.А., Стегній Б.Т., Герман В.В., Келеберда М.І., Попов А.Ф., Спіцин М.В. № 2001074651; заявлено 04.07.2001; опубл. 15.05.2002, бюл. № 5.

Келеберда М.І. Корекція імунітету похідними імідазолу при вакцинації птиці проти інфекційної бурсальної та н’юкаслської хвороб. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук 16.00.03 – ветеринарна мікробіологія та вірусологія

В дисертації наведені результати вивчення впливу похідних імідазолового ряду: левамізолу і ФІАНТ-2 на стан імунітету курчат при щепленні їх вакцинами, що чинять імуносупресивну дію. В дослідах із застосуванням комплексу серологічних, гістоморфометричних та біохімічних досліджень розроблені та обґрунтовані нові схеми стимуляції імунітету при вакцинації курей проти інфекційної бурсальної хвороби (вакцинами різного ступеня атенуації) та н’юкаслської хвороби.

Встановлено, що левамізол (у дозі 2,5-4 мг/кг) та ФІАНТ-2 (у дозі 1 мг/кг) при щепленні проти інфекційної бурсальної та н’юкаслської хвороб чинить імуностимулюючу дію на стан гуморального імунітету (збільшення титру антитіл) і посилює продукцію лімфоїдних клітин бластів і плазмацитів в імунокомпетентних органах, що проявляється активізацією морфофункціонального стану відповідних гермінативних зон та збільшенням розмірів лімфоїдних структур.

Показано, що для досягнення вираженої імуностимулюючої дії можна використовувати одноциклічні і двоциклічні схеми застосування

імуностимуляторів. Експериментально доведена доцільність застосування імуностимуляторів з введенням їх через проміжки часу різної тривалості (двоциклічна схема).

Ключові слова: імунодефіцит, вакцинація, імуносупресія, інфекційна бурсальна хвороба, н’юкаслська хвороба, імуностимуляція, ФІАНТ-2, левамізол, вітамін Е, аеросил.

Келеберда Н.И. Коррекция иммунитета производными имидазола при вакцинации птицы против инфекционной бурсальной и ньюкаслской болезней. - Рукопись.

Диссертация на получение научной степени кандидата ветеринарных наук

16.00.03 - ветеринарная микробиология и вирусология

В диссертации приведены результаты изучения влияния производных имидазола: левамизола и ФИАНТ-2 на состояние иммунитета у цыплят при вакцинации их вакцинами, которые оказывают иммуносупрессивное действие. В исследованиях с применением комплекса серологических, гистоморфометрических и биохимических исследований разработаны и обоснованы новые схемы стимуляции иммунитета при вакцинации кур против инфекционной бурсальної болезни (вакцинами различной степени аттенуации) и ньюкаслской болезни.

Установлено, что левамизол (в дозе 2,5-4 мг/кг) и ФИАНТ-2 (в дозе 1 мг/кг) при вакцинации против инфекционной бурсальной и ньюкаслской болезни оказывают иммуностимулирующее действие на состояние гуморального иммунитета (увеличение титра антител) и усиливает продукцию лимфоидных клеток, бластов и плазмацитов в иммунокомпетентных органах, которая проявляется активизацией морфофункционального состояния соответствующих герминативных зон и увеличением размеров лимфоидных структур. Применение витамина Е и аэросила вместе с иммуностимуляторами (левамизолом и ФИАНТ-2) не усиливает морфофункциональную активность иммунокомпетентних органов после применения вакцины из слабоаттенуированого штамма БГ вируса инфекционной бурсальной болезни, но уменьшает степень проявления патологических изменений, обусловленных действием вакцины.

Показано, что для достижения выраженного иммуностимулирующего действия можно использовать одноцикличные и двухцикличные схемы применения иммуностимуляторов. Экспериментально доказана целесообразность применения иммуностимуляторов с введением их через промежутки времени разной продолжительности (двухцикличная схема). При использовании такой схемы титр специфических антител был выше на 1,3 log2 как при вакцинации против ньюкаслской, так и инфекционной бурсальной болезней в сравнении с группой контроля. Одноцикличные схемы способствовали увеличению титров антител на 0,3-1 log2.

Установлено, что эффективность действия иммуностимуляторов при вакцинации против ньюкаслськой болезни зависит от возраста цыплят. Лучший эффект иммуностимуляции получен при использовании ФИАНТ-2 цыплятам старшего возраста, иммунокомпетентные органы которых достигали большего морфологического развития после вакцинации в 25-суточном возрасте, в сравнении с цыплятами, которых вакцинировали и стимулировали в возрасте 15 суток.

Ключевые слова: иммунодефицит, вакцинация, иммуносупрессия, инфекционная бурсальная болезнь, ньюкаслская болезнь, иммуностимуляция, ФИАНТ-2, левaмизол.

Keleberda N.I. Correction of immunity in the same time of vaccination poultry by influence imidazole products from Gamboro disease and New- Castle disease. -The manuscript.

Dissertation for scientific Candidate degree in Veterinary Science  

16.00.03 - veterinary microbiology and virology.

There are results studying of imidazole products influence presented in the dissertation: influence of levamisole and FIANT-2, on immunity organs of chickens in the same time of immunization by vaccines that have immunosuppressive effect on the organs. In experiments with use of complex serological, histomorphometrical and biochemical researches have been worked out and new schemes of immunity stimulation by vaccination in chickens against Gamboro disease (by vaccines with different extents of virus attenuation) and New - Castle disease have been proved.

It has been determined that levamisole (in dose 0,25-0,4 mg/kg) and FIANT (in dose 1 mg/kg) by vaccinate against Gamboro and New-Castle diseases exerts immunostimulating effect on humoral immunity state (amplification of antibody titers) and also he increases production of lymphoid cells, blastems and plasmacytis in immunocompetent organs, that become apparent in a m20,1orphofunctional status activation corresponding germinant zones and increase of lymphoid structures size.

It has been shown that for the reaching of the above simulation effect immunostimulators could be used in single circle and doubling circle schemes. Experimentally, grounding on the histology and morphometric criterions, expediency of immunostimulators usage in doubling circle scheme with the second inoculation in different time intervals has been determined.

Key words: immunodeficiency, vaccination, immunosuppression, Gamboro disease, New-Castle disease, immunostimulation, FIANT-2, levamisole