АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГІЇ ТА ТОКСИКОЛОГІЇ

КОНОНЕНКО Надія Миколаївна

УДК 615.015.4:615.273.5

ГЕМОСТАТИЧНІ ВЛАСТИВОСТІ СУКЦИФЕНАТУ

(експериментальне дослідження)

14.03.05 – фармакологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Національному фармацевтичному університеті МОЗ України, м. Харків.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки та техніки України, БЕРЕЗНЯКОВА Алла Іллівна, Національний фармацевтичний університет МОЗ України, завідувач кафедри патологічної фізіології

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор

ФРАНЦУЗОВА Стелла Борисівна, Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця МОЗ України, головний науковий співробітник лабораторії патофізіології та експериментальної фармакології Науково-дослідного лабораторного центру;

доктор медичних наук, професор

Дев’яткіна Тетяна Олексіївна, Українська медична стоматологічна академія МОЗ України, професор кафедри експериментальної та клінічної фармакології.

Провідна установа: Харківський державний медичний університет МОЗ

України, кафедра фармакології та медичної рецептури.

Захист відбудеться „19” травня 2004 р. о 1300 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01 при Інституті фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Ежена Потьє, 14.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Ежена Потьє, 14.

Автореферат розісланий „17” квітня 2004 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

Д 26.550.01, кандидат біологічних наук І.В. Данова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Гемостаз – складний динамічний процес, еволюційно сформована система, що підтримує кров у рідкому стані і зберігає її в замкнутому просторі судинного русла, припиняючи геморагії різної етіології. У виникненні кровотеч істотна роль належить порушенням у системі згортання крові – єдиній системі, до складу якої входить прокоагулянтна, антикоагулянтна та фібринолітична ланки (Н.А. Горбунова, 1991; Є.П. Іванов, 1991;
Фред Дж. Шиффман, 2001).

В останні роки зростає кількість пацієнтів, які потребують застосування гемостатичних препаратів. Це зумовлено цілою низкою причин, найбільш важливими з яких є: зростання кількості пацієнтів з гіпокоагуляційними станами, що мають потребу в хірургічних лікарських маніпуляціях, і кровотеч, які виникають за цим (Ю.М. Рєпін, 1991; М.М. Абакумов і співавт., 1998; R. Caprotti et al., 1998; А.І. Воробйов і співавт., 2001; S.R.Carr et al., 2001); зростання кількості онкологічних хворих, у яких розпад пухлини маніфестує розвитком кровотеч
(Т.Р. Харрісон, 1993; М.А. Волкова, 2001); виникнення великої кількості значних регіональних конфліктів і техногенних катастроф (В.М. Біленький, 1995; M.J. Atten, S. Ahmed, 2000; С.А. Гусєва і співавт., 2001; M. E. Beaver, C. R. Stasney, 2001; D.J. Davis, 2001; W. H. Edward et al., 2001).

Однак практична медицина відчуває дефіцит у лікарських засобах, що активно впливають на систему згортання крові (Ю.Б. Білоусов, В.С. Моісеєв, В.К. Лєпахін, 1997; Ю.Ф. Крилов, 2002). З відомих препаратів коагулотропної дії найбільш ефективними є фармакологічні засоби тваринного походження (фібриноген, концентрати факторів згортання крові). Разом з тим відомо, що технологія виготовлення гемостатичних препаратів із крові та її фракцій складна й трудомістка, і вони мають відносно високу вартість (М.Т. Гасанов, 1995). Крім того, поширення таких захворювань як синдром набутого імунодефіциту, вірусний гепатит В, С та інше обмежують застосування гемостатичних засобів, які виготовлені на основі донорської крові
(А.І. Грицюк, Є.Н. Амосова, І.А. Грицюк, 1994).

Звільнення активаторів фібринолізу відбувається при розпаді різних тканин, підвищенні проникності клітинних мембран, порушенні обмінних процесів, накопиченні гістаміну та гістаміноподібних речовин (А.М. Братчик, 1993), що зумовлює розвиток місцевого й загального патологічного фібринолітичного процесу, для корекції якого необхідні інгібітори фібринолізу, вибір яких теж обмежений. За даними літератури (Ф.П. Тринус, 1995; М.Д. Машковський, 2002) серед синтетичних антифібринолітичних засобів найбільш широко застосовується лише
-амінокапронова кислота, яка, незважаючи на низьку токсичність, має ряд побічних дій: викликає розвиток рабдоміолізу, міоглобінурії, гострої ниркової недостатності, діареї, судом, гіпотонії, шкірних висипань тощо (Ю.Ф. Крилов, 2002), що обмежує її застосування в клініці.

У зв'язку з цим пошук і розробка нових лікарських препаратів синтетичного походження для зупинки кровотеч, які поряд з високою специфічною активністю не виявляли значної токсичної дії, є актуальною проблемою сучасної фармакології (E. Haber, E. Braunwald, 1991;
І.П. Владанов, 1992; А.А. Адамян, 1994).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана в рамках науково-дослідної програми Національного фармацевтичного університету "Фармакологічні дослідження біологічно-активних речовин і лікарських засобів синтетичного та природного походження, їх застосування в медичній практиці" (№ держ. реєстр. 0103U000478). Автор був виконавцем фрагмента указаної науково-дослідної програми.

Мета і завдання дослідження. Мета дисертаційної роботи – на основі гемокоагуляційних досліджень встановити в експерименті гемостатичну активність сукцифенату нового похідного сукцинової кислоти.

У відповідності до мети були визначені такі основні завдання дослідження:

1. Визначити гостру токсичність і ефективну дозу сукцифенату.

2. Вивчити вплив препарату на тромбоцитарно-судинний гемостаз, показники коагулограми, фібринолітичну активність крові.

3. Установити антифібринолітичну активність сукцифенату при гіперфібринолізі, викликаному стрептокіназою та урокіназою (іn vіtro).

4. Визначити фармакокінетичні параметри сукцифенату.

5. Дослідити ефективність гемостатичної дії сукцифенату в умовах in vivo: на моделі паренхіматозної кровотечі у білих щурів за умов генералізованого підвищення фібринолізу, на моделях капілярних кровотеч на різаних ранах легень, нирок і апоневрозу черевних м'язів, при кровотечі з виразки шлунку.

6. Вивчити супутні фармакологічні ефекти сукцифенату (антимікробний, радіопротекторний, антирадикальний, антиокислювальний).

7. З'ясувати морфологічні зміни внутрішніх органів щурів при одноразовому та тривалому (протягом 1 міс) введенні сукцифенату.

Об'єкт дослідження – донорська кров, білі щури з моделями паренхіматозних та капілярних кровотеч.

Предмет дослідження – гемокоагуляційна активність сукцифенату.

Методи дослідження: фармакологічні, токсикологічні, біохімічні, мікробіологічні, гематологічні, гістологічні та статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше проведено поглиблене вивчення ефективності гемостатичної дії сукцифенату при кровотечах із внутрішніх органів тварин: печінки, нирок, легень, апоневрозу черевного м’яза та при кровотечі з виразки шлунка. Встановлені механізми гемостатичної та антифібринолітичної дії препарату. Сукцифенат підсилює тромбоцитопоез та агрегаційну здатність тромбоцитів, прискорює утворення тромбопластину; активує конверсію протромбіну в тромбін; прискорює перетворення фібриногену в фібрин; блокує активатори профібринолізину – стрептокіназу й урокіназу і тим самим пригнічує фібриноліз. Доведено, що сукцифенат належить до VI класу токсичності, тобто є відносно нешкідливою речовиною (LD50 при внутрішньоочеревинному введенні мишам і щурам складає 3500 мг/кг та 3166,7 мг/кг відповідно; при внутрішньошлунковому введенні щурам LD5011000 мг/кг). Поряд з гемостатичними властивостями сукцифенат виявляє антимікробну (іn vіtro по відношенню до Escherichia colі, Staphylococcus aureus, Bacіllus subtіlіs, Pseudomonas aerugіnosa, в умовах генералізованої гнійної інфекції подовжує тривалість життя дослідних тварин в 3,7 рази), радіозахисну (збільшує час життя мишей при
-випромінюванні в 1,8 рази, сприяє зменшенню накопичення цезію-137 у внутрішніх органах тварин при хронічному введенні ізотопу) та антирадикальну (уловлює гідроксильні та супероксидні радикали) активності.

Практична значимість одержаних результатів. В експерименті встановлено, що сукцифенат активує утворення тромбопластину, тромбіну, прискорює перетворення фібриногену в фібрин, має антифібринолітичні властивості, сприяє зупинці паренхіматозних і капілярних кровотеч, що свідчить про доцільність його використання в якості гемостатичного засобу. Препарат дозволений Державним фармакологічним центром МОЗ України на ІІ фазу клінічних випробувань (протокол № 5.12 – 2225/А від 17.05.02) в якості гемостатичного засобу.

Результати дисертаційної роботи впроваджено в навчальний процес на кафедрі фармакології Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова (акт впровадження від 30.12.2003 р.) і на кафедрі експериментальної та клінічної фармакології Української медичної стоматологічної академії, м. Полтава (акт впровадження від 18.12.2003 р.).

Особистий внесок здобувача. Автором особисто було здійснено патентно-інформаційний пошук, у тому числі з використанням пошукових серверів Yandex, Rambler, Alta Vista, а також медичної бази даних Medline мережі Internet, проведено аналіз даних літератури за темою дисертації, визначені мета і завдання дослідження, відпрацьовані дослідні моделі, виконані всі експериментальні дослідження, а також проведено аналіз, систематизацію та статистичну обробку отриманих результатів і оформлено їх у вигляді таблиць та рисунків, сформульовано основні положення і висновки роботи. Гістологічні дослідження проведені при консультативній допомозі завідуючої ЦНДЛ ХДМУ проф. Г.І. Губіной-Вакулік, за що дисертант їй щиро вдячний.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідались на Всеукраїнській науково-практичній конференції “Фармація ХХІ століття” (Харків, 23–24 жовтня 2002 р.); ІІ з'їзді фармакологів Росії “Фундаментальные проблемы фармакологии” (Москва, 21–25 квітня 2003 р.); спільному засіданні кафедр патологічної фізіології, фізіології з основами анатомії, фармакології, мікробіології, клінічної фармації і ЦНДЛ Національного фармацевтичного університету (Харків, 11.09.2003 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 6 наукових праць, у тому числі 4 статті у наукових фахових журналах, ліцензованих ВАК України та 2 тез у матеріалах доповідей конференцій і з'їздів.

Обсяг та структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 172 сторінках машинописного тексту і складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, 4 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків і списку використаних джерел, перелік яких містить 266 джерел, з яких 73 іноземних авторів. Робота ілюстрована 29 таблицями, 32 рисунками (з них 14 фотографій мікропрепаратів та 9 тромбоеластограм).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Експерименти виконані на 742 нелінійних статевозрілих білих щурах різної статі масою 180-220 г, 133 нелінійних статевозрілих білих мишах різної статі масою 20-22 г, 43 кролях породи Шиншилла масою 2,5-3,1 кг, вирощених у розпліднику віварію ЦНДЛ НФаУ, які утримувались на стандартному раціоні у відповідності з санітарно-гігієнічними нормами, згідно методичних рекомендацій “Доклінічні дослідження лікарських засобів” (за ред.: член-кор. АМН України О.В. Стефанова, 2001). Для проведення експериментальних досліджень використовували сукцифенат у вигляді ліофілізованого порошку по 0,1 г в ампулі 2 мл виробництва ТОВ “Фармацевтична компанія “Здоров’я” (Україна) для парентерального введення.

Гостру токсичність сукцифенату вивчали на двох видах тварин: нелінійних білих мишах і нелінійних білих щурах різної статі при внутрішньоочеревинному та внутрішньошлунковому введенні і розраховували за методом Кербера (Л.М. Сернов, В.В. Гацура, 2000). Оцінку токсичності проводили за загальноприйнятою класифікацією К.К. Сидорова (1973). Ефективну дозу сукцифенату визначали в умовах експериментальної моделі паренхіматозної кровотечі на різаній рані печінки (Thіenes et al., 1957). Розрахунок ефективної дози проводили за методом
Б.М. Штабського і співавт.(1980), основаним на залежності ефекту від випробуваних доз.

При вивченні гемостатичної активності сукцифенату за препарат порівняння використовували -амінокапронову кислоту (-АКК): внутрішньовенно, 100 мг/кг маси.

Вплив сукцифенату на систему згортання крові. Вивчення тромбоцитарно-судинного гемостазу. Підрахунок тромбоцитів у периферичній крові робили в лічильній камері Горяєва із застосуванням фазово-контрастного пристрою для контрастування тромбоцитів. В якості розріднувальної та гемолізуючої рідини використовували 1% розчин оксалату амонію
(В.Є. Предтеченський, 1960).

Спонтанну агрегацію тромбоцитів вивчали за допомогою сканіруючої електронної мікроскопії (оптика Номарського) за методом З.С. Баркагана і співавт. (2001).

Ретракцію кров'яного згустку оцінювали за допомогою кількісного методу
(E.J.W. Bowie, J.H. Thompson et al., 1971).

Дослідження коагуляційного гемостазу. Тромбіновий час визначали за методом
В.П. Балуда та співавт. (1980). Кількісне визначення фібриногену у плазмі крові здійснювали за допомогою коагуляційних проб (Р.А. Рутберг, 1961). Фібринстабілізуючий фактор (фактор XІІІ) оцінювали за методом В.П. Балуда та співавт. (1980).

Дослідження внутрішнього механізму згортання. Час згортання крові визначали уніфікованим методом (В.П. Балуда та співавт., 1980). ).

Активований час рекальціфікації визначали методом Т.І. Герасименко та співавт. (2002). Активований частковий (парціальний) тромбопластиновий час вивчали за методом
В.П. Балуда та співавт. (1980). Мікрокоагуляційний тест, який відтворює динаміку утворення та інактивацію тромбіну, виконували за З.С. Баркаганом (1980).

Дослідження зовнішнього механізму згортання. Протромбіновий час визначали за методом Т.І. Герасименко і співавт. (2002).

Вивчення протизгортаючих механізмів. Гепаринорезистентність плазми визначали за методом Т.І. Герасименко та співавт. (2002).

Дослідження фібринолітичної системи крові. Фібринолітичну активність крові визначали методом Е. Бідвела (1953). Концентрацію фібриногену визначали фотоелектроколориметрично. Продукти деградації фібрину визначали неімунологічним методом (С.З. Габітов та співавт., 1982). Час лізису еуглобулінового згустку досліджували за методом Коваржика-Булука (1980).

Фармакокінетику cукцифенату вивчали методом високоефективної рідинної хроматографії, використовуючи хроматографічну систему Ultrachrom GTІ (Швеція).

Дослідження антимікробної активності сукцифенату проводили іn vіtro з використанням методу дворазових серійних розведень за допомогою набору еталонних штамів: Escherichia colі АТСС 25922, Staphylococcus aureus АТСС 25923, Bacіllus subtіlіs АТСС 6633, Pseudomonas aerugіnosa АТСС 25853 та in vіvo на експериментальній моделі генералізованої гнійної інфекції за методом Г.Н. Першина (1971).

Радіозахисну здатність сукцифенату вивчали при одноразовому опроміненні тварин високими дозами - випромінювання (загальна доза – 500 р, потужність дози – 100 р/хв); в умовах одноразового внутрішньоочеревинного введення тваринам цезію-137 з розрахунку 40 кБк на 100 г маси тварини та хронічного (протягом 24-х діб) внутрішньоочеревинного введення цезію-137 у дозі 500 Бк.

Антирадикальну активність сукцифенату визначали in vitro за його здатністю уловлювати гідроксильні () та супероксидні радикали . Ефективність перехоплення гідроксильних радикалів визначали за здатністю сукцифенату гальмувати руйнування дезоксирибози , що генеруються в системі Fe2+ – ЕДТА, Н2О2 і аскорбат за методом B. Hallіwell et al. (1987). Антирадикальну активність сукцифенату оцінювали також за його здатністю гальмувати реакцію переходу адреналіну в адренохром, що відбувається за участю супероксиданіонів при pH 10,2 (H.P. Mіsra, І. Frіdovіch, 1972).

Антиокислювальну активність сукцифенату визначали в модельній системі жовточних ліпопротеїнів за його здатністю гальмувати накопичення продуктів, що реагують з 2-тіобарбітуровою кислотою (ТБКАП) у порівнянні з іонолом за методом
Г.І. Клебанова та співавт., 1988.

З метою вивчення механізму антифібринолітичної дії сукцифенату викликали порушення фібринолізу іn vіtro шляхом введення стрептокінази й урокінази (непрямого і прямого активаторів фібринолізу). Результати впливу сукцифенату на ферментативно активований фібриноліз реєстрували методом тромбоеластографії. Для оцінки гемостатичної активності сукцифенату використовували його здатність зменшувати час згортання крові на різних моделях: при введенні розчину стрептокінази (активність 2000 ФО/мл у дозі 0,1 мл) на різаній рані печінки за методом Thіenes et al., (1957), що сприяло генералізованому підвищенню фібринолізу; при кровотечах з різаних ран легенів, нирок і апоневрозу черевних м'язів; при кровотечі з виразки шлунка, яку викликали введенням 20 мг/кг преднізолону та 80% етилового спирту в дозі 0,6мл/100г маси тіла (Л.В. Яковлєва та співавт., 2001).

Дані клінічних і лабораторних досліджень були зіставлені з результатами гістоморфологічного вивчення експериментального матеріалу. Одержані результати піддавали математичній обробці з обчисленням середньої X та її помилки SX. Вірогідність даних оцінювали, використовуючи критерій t Стьюдента (В.І. Сергієнко, І.Б. Бондаренко, 2000).

Результати досліджень та їх обговорення. Встановлено, що середня смертельна доза (LD50) сукцифенату при внутрішньоочеревинному введенні мишам дорівнює 3500 (3875,53124,5) мг/кг, щурам 3167 (3509,52823,9) мг/кг. При внутрішньошлунковому введенні мишам LD508000 мг/кг, щурам LD5011000 мг/кг. Ефективна доза при внутрішньоочеревинному введенні щурам в умовах моделювання різаної рани печінки за показником зменшення часу кровотечі складає 13,9 (8,619,2) мг/кг маси тіла. Встановлено, що сукцифенат перевищує в 7,2 рази -амінокапронову кислоту за ефективною дозою та у 4,6 разів за широтою терапевтичної дії (табл.1). Обидва препарати за класифікацією К.К. Сидорова (1973) з урахуванням шляху введення належать до VІ класу токсичності.

Таблиця 1

Порівняльна характеристика гемостатичної активності сукцифенату та

е-?мінокапронової кислоти при внутрішньоочеревинному введенні щурам

Досліджувана речовина | ЕД50, мг/кг | LD50, мг/кг | Терапевтич-ний індекс (LD50/ED50) | Відносний терапевтичний індекс | Сукцифенат | 13,9 | 3166,7 | 227,8 | 4,63 | -АКК | 100 | 4920 | 49,2 | 1 |

При вивченні дії сукцифенату на тромбоцитарно-судинний гемостаз було встановлено, що одноразове введення препарату в ефективній дозі не впливає на вміст тромбоцитів у периферичній крові. Тривале (протягом 20 діб) введення сукцифенату (внутрішньовенно, 13,9 мг/кг, один раз на добу) призводило до підвищення кількості тромбоцитів на 40% по відношенню до контролю (p0,05) та на 17% у порівнянні з -амінокапроновою кислотою (p0,05) (табл.2).

Таблиця 2

Кількість тромбоцитів у периферичній крові щурів при одноразовому та довготривалому введенні сукцифенату, Г/л (XSX, n=10)

Строки дослідження | Контроль | Сукцифенат | е-?КК | Вихідні дані | 531,016,7 | 543,312,6 | 540,014,9 | Одноразове введення | 542,016,4 | 551,08,4 | 549,012,8 | Багаторазове введення: | через 7 діб | 536,610,8 | 542,29,4 | 544,811,6 | через 14 діб | 548,69,9 | 562,28,8 | 560,112,1 | через 20 діб | 544,513,8 | 760,49,8*/** | 648,610,1* | Примітки:

1.*- р<0,05 у порівнянні з контролем;

2.**- р<0,05 у порівнянні з е-амінокапроновою кислотою.

Після 20-денного застосування сукцифенату поряд зі збільшенням кількості тромбоцитів у периферичній крові спостерігали підвищення агрегаційної здатності тромбоцитів у 3,8 рази, що складає 280% у порівнянні з контролем (p0,05) і це дорівнювало дії -амінокапронової кислоти (табл. 3).

Таблиця 3

Вплив сукцифенату на агрегаційну здатність тромбоцитів у щурів

(% тромбоцитів, які включені в агрегати), (XSX, n=10)

Строки дослідження | Контроль | Сукцифенат | е-?КК | Вихідні дані | 111 | 101 | 103 | Одноразове введення | 123 | 104 | 112 | Багаторазове введення: | через 7 діб | 116 | 131 | 143 | через 14 діб | 138 | 154 | 164 | через 20 діб | 106 | 384* | 305* | Примітка. *- р<0,05 в порівнянні з контролем.

Це дозволило зробити висновок про наявність активного тромбоцитарного компоненту в механізмі гемостатичної дії сукцифенату. Напевно, сукцифенат має здатність проходити через мембрану тромбоцита й активно втручатися у процес обміну, так як є похідним природного метаболіту організму – сукцинової кислоти, або взаємодіє с рецепторами зовнішньої мембрани тромбоцитів що супроводжується їх злипанням.

Встановлено, що сукцифенат помітно скорочує час рекальцифікації та активований частковий тромбопластиновий час на 28,2% і 28,4% відповідно у порівнянні з контролем (p0,05) та на 21,8% і 17% по відношенню до -АКК (p0,05) (табл. 4). Ці данні свідчать про активний вплив сукцифенату на внутрішні механізми згортання крові і можливість препарату прискорювати створення тромбопластину, викликаючи гіперкоагуляцію в стадії генерації протромбінази.

Таблиця 4

Показники згортання та фібринолітичної активності крові при одноразовому внутрішньовенному введенні сукцифенату в дозі 13,9 мг/кг (XSX)

Показники | Об’єкт дос-лідження та кількість тварин | Контроль | Сукцифенат | -АКК

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | Коагуляційний гемостаз | Тромбіновий час, с | щури, n=10 | 33,70,42 | 28,90,6*/** | 32,30,3* | XIII фактор, с | щури, n=10 | 60,00,9 | 78,00,8*/** | 72,21,0* | Фібриноген, г/л | щури, n=10 | 3,50,05 | 3,60,03 | 3,60,02 | Тромбіновий час із протамінсульфатом, с | щури, n=10 | 24,00,21 | 24,90,7 | 24,70,21 | Продовження табл. 4

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | Гематокріт, % | кролі, n=5 | 50,62,5 | 59,01,5* | 56,21,9 | Ретракція кров’яного згустку, % | кролі, n=5 | 38,40,52 | 72,74,6* | 62,23* | Внутрішній механізм згортання | Активований час рекальцифікації, с | щури, n=10 | 24,50,34 | 17,60,3*/** | 22,50,34* | Активований частковий тромбопластиновий час, с | щури, n=10 | 22,50,34 | 16,10,4*/** | 19,40,65* | Зовнішній механізм згортання | Протромбіновий індекс, % | щури, n=10 | 78,160,35 | 91,10,2*/** | 82,50,3* | Фібринолітична активність | Фібринолітична активність, % | щури, n=10 | 21,90,7 | 11,20,2*/** | 14,10,3* | Продукти деградації фібрину | щури, n=10 | 0 | 0 | 0 | Час лізису еуглобулінового згустку, хв | кролі, n=5 | 64,2±4,9 | 170,6±4,0* | 158,4±5,4* | Примітки:

1. *-p0,05 по відношенню до контролю;

2. **- p0,05 по відношенню до -АКК.

При аналізі мікрокоагуляційного тесту встановлено, що під впливом сукцифенату скорочується час активації протромбіну та перехід його в тромбін, що підтверджується підвищенням згортання нативної плазми тварин дослідної групи при додаванні гемолізат-кальцієвої суміші на 5 хвилині інкубації на 31,5% по відношенню до контролю (p0,05) й на 18,3% у порівнянні з -АКК (p>0,05), а на 10 хвилині інкубації згортання плазми підвищувалось на 31,3% і 17% відповідно (p0,05). Крім того, під впливом сукцифенату збільшувався час інактивації тромбіну на 30 хвилині інкубації гемолізат-кальцієвої суміші на 25,3% у порівнянні з контрольною групою тварин і на 15% стосовно рефренс-препарату (p0,05); на 50 хвилині інкубації – на 35,7% та 21% відповідно (p0,05). Встановлено, що при введенні сукцифенату підвищувався протромбіновий індекс на 16,6% по відношенню до контролю та на 10% у порівнянні з -амінокапроновою кислотою (p0,05), що свідчить про вплив сукцифенату на ІІ фазу гемокоагуляції, тобто – прискорення конверсії протромбіну в тромбін (З.С. Баркаган, 2001). Препарат потенціював перехід фібриногену у фібрин під впливом тромбіну на 14,2%, що свідчить про вплив сукцифенату на ІІІ стадію коагуляційного гемостазу. Введення сукцифенату підвищувало активність фібринстабілізуючого фактора (фактор XІІІ - фібриназа) на 30% у порівнянні з контролем (p0,05) і на 8% по відношенню до -АКК (p0,05). Загальновідомо, що фібриназа бере участь у третьому етапі перетворення фібриногену у фібрин та сприяє утворенню стабілізованого, нерозчинного фібрину (Фред Дж. Шиффман, 2001). При цьому кількість фібриногену та тромбіновий час із протамінсульфатом вірогідно не відрізнялися від показників контрольної групи тварин, тоді як ці величини виявляють порушення фібриноутворення через кількісне та якісне порушення фібриногену й наявність інгібіторів тромбіну (В.П. Балуда, 1995). Cукцифенат підсилює ретракцію кров’яного згустку на 89% у порівнянні з контролем (р<0,05) і за цим показником дорівнює препарату порівняння (див. табл. 4). Найбільш виражені зміни були відзначені з боку фібринолітичної системи крові: отримані результати свідчать про те, що сукцифенат виявляє виражений гальмуючий вплив на фібринолітичну активність крові в щурів, пригнічуючи фібриноліз у 2 рази порівняно з контрольною групою (p0,05) та в 1,3 рази перевершуючи за даним ефектом -амінокапронову кислоту. Про фібринолітичну активність крові можна судити також за наявністю в ній продуктів деградації фібриногену-фібрину (ПДФ) (В.В. Меньшиков, 1987). Підвищення рівня ПДФ розглядається як ознака гіперфібринолізу. Після введення сукцифенату проба на виявлення продуктів деградації фібрину дала негативний результат (див. табл. 4).Оскільки сукцифенат виявив виразну антифібринолітичну дію на систему крові щурів, був вивчений вплив препарату на процес природного лізису фібринового згустку в дослідах на кролях. Під дією сукцифенату лізис еуглобулінового згустку сповільнювався в 2,7 рази порівняно з контролем (p0,05) і дорівнював антифібринолітичної дії -АКК (див. табл.4).

При вивченні механізму антифібринолітичної дії сукцифенату ми виходили з даних літератури про різноспрямовані дії інгібіторів фібринолізу, які можна поділити на антиактиватори, що перешкоджають процесу активації плазміногену, тобто утворенню активного протеолітичного ферменту, та антиплазміни, які блокують протеолітичну дію плазміну відносно фібриногену та інших білків (Фред Дж. Шиффман, 2001). Тому ми моделювали порушення фібринолізу введенням прямого і непрямого активаторів плазміногену - урокінази та стрептокінази - іn vіtro. В дослідах, проведених без додавання активаторів фібринолізу сукцифенат у 3,1 рази підвищував активність початкових фаз гемокоагуляції в порівнянні з контрольною пробою (р<0,05). При додаванні до цитратної суміші стрептокінази та сукцифенату відбувалося повне гальмування процесу стрептокіназної активації фібринолізу, про що свідчить індекс інгібіції, який дорівнює 10, утворення повноцінного фібринового згустку і збереження динамічних властивостей фібринових ниток, які формуються, що підтверджується збільшенням максимальної амплітуди тромбоеластограми (характеризує щільність, еластичність та величину фібринового згустку) в 2,9 рази в порівнянні зі стрептокіназним контролем (р<0,05). Експерименти з урокіназною активацією фібринолізу свідчать про менш виражене гальмування сукцифенатом фібринолітичної системи крові, що визначається збільшенням максимальної амплітуди тромбоеластограми в 2,1 рази щодо урокіназного контролю (р<0,05). Таким чином, механізм антифібринолітичної дії сукцифенату зумовлений гальмуванням непрямих активаторів фібринолізу, тобто речовин, які шляхом перетворення неактивного проактиватора в активатор впливають на процес переходу плазміногену в плазмін. Менше сукцифенат впливає на прямі активатори, що безпосередньо активують перехід профібринолізину в фібринолізин.

При вивченні ефективності гемостатичної дії сукцифенату при паренхіматозній кровотечі на різаній рані печінки щурів, встановлено, що препарат зменшує час кровотечі у 2,2 рази порівняно з показниками контрольних тварин (p0,05). При введенні сукцифенату тваринам зі стрептокіназною активацією фібринолізу тривалість кровотечі наближається до контрольних даних, що дозволяє говорити про повну інактивацію дії стрептокінази та ефективність застосування препарату при паренхіматозних кровотечах, обумовлених генералізованим підвищенням фібринолізу.

При дослідженні гемостатичної активності сукцифенату при кровотечах з внутрішніх органів було встановлено, що при кровотечі з апоневрозу черевного м'яза сукцифенат зменшував час згортання крові в 3 рази порівняно з контролем (p0,05) і в 1,6 рази по відношенню до -АКК (p0,05); час кровотечі з різаних ран легень менший в 2,6 рази порівняно з контролем (p0,05) і в 1,5 рази стосовно рефренс-препарату; при кровотечі з різаних ран нирок - в 2,6 та 1,3 рази відповідно (p0,05).

За даними літератури виразки шлунка є причиною близько 50% випадків кровотеч з верхніх відділів шлунково-кишкового тракту (Т.Р. Харрісон, 1996). Встановлено, що слизова оболонка шлунка має високу фібринолітичну активність (Дж. М. Хендерсон, 1999). Таким чином, в зоні виразкової кровотечі можливе використання препаратів, що володіють антифібринолітичною активністю. Теоретичні передумови дозволили нам вивчити гемостатичну активність сукцифенату при виразковій кровотечі в експерименті на щурах. Отримані результати показали, що вже після одноразового внутрішньошлункового введення сукцифенату в ефективній дозі спостерігається припинення кровотечі з виразки: аналіз калу на приховану кров на другу добу експерименту дав негативний результат. Крім того, спостерігалось зниження вмісту азоту сечовини в сироватці крові на другу добу на 50% порівняно з першою добою, на 52% по відношенню до контрольної групи і на 41,4% стосовно тварин, які отримували -АКК (p0,05). Як відомо, підвищення вмісту азоту сечовини в крові є маркером кровотечі з верхніх відділів шлунково-кишкового тракту. Така азотемія пояснюється абсорбцією крові та гіповолємією, яка розвивається на фоні кровотечі (Дж. М. Хендерсон, 1999). При внутрішньошлунковому введенні -амінокапронової кислоти в ефективній дозі кровотеча з виразки шлунку припинилась тільки на третю добу дослідження, тобто після дворазового застосування препарату. При вивченні патоморфологічного матеріалу в контрольній групі тварин відзначено наявність свіжих геморагічних ерозій і виразок з явищами дистрофії в ділянках слизової оболонки, які складають їх дно і вкритих еозинофільними безструктурними масами (некротичні маси), у яких виявляються буро-чорні кристали солянокислого гематину. Покривний епітелій в ділянках, які збереглися, ущільнений, має невелике, темне ядро. Власна пластинки слизової оболонки збагачена макрофагами і, особливо помітно, еозинофілами. Судини мікроциркуляторного русла в верхніх відділах слизової оболонки розширені та повнокровні, місцями з явищами діапедезних крововиливів. У частини тварин було наповнення шлунку кров’ю. У щурів, яким вводили -амінокапронову кислоту, зерна солянокислого гематину спостерігались рідше, ніж у контрольних тварин. Місцями верхні відділи власної пластинки слизової оболонки набряклі, насичені морфофункціонально активними фібробластами, тоді як в нижніх відділах – багато еозинофілів, макрофагів, лімфоцитів. Покривний епітелій слизової оболонки місцями дистрофічний. У щурів, які отримували сукцифенат, спостерігається більш збережений покривний епітелій: ерозії відсутні, ознаки дистрофізації епітеліоцитів поодинокі. На між’ямочному валику розташовані декілька великих, молодих епітеліоцитів без явищ дистрофії та апоптозу. У просвіті окремих венул сформовані фібринові тромби. Набряк поверхневого шару власної пластинки слизової оболонки невиражений. Таким чином, можна зробити висновок про те, що сукцифенат сприяє міцному тромбуванню ушкодженої виразковим процесом судини завдяки нейтралізації фібринолітичної активності слизової оболонки шлунка.

Наступним етапом нашої роботи з'явилося вивчення фармакокінетики препарату на кролях. Для аналізу отриманих даних доцільно навести дані літератури про гемодинаміку в кролів. Так, загальний хвилинний кровоток складає 0,6 л/хв чи 0,2 л/хв/кг (при середній масі тварин 3 кг). Кровоток через печінку дорівнює 0,2 л/хв (0,067 л/хв/кг), через нирки - 0,07 л/хв (0,03 л/хв/кг). У той же час загальний кліренс речовини дорівнював 0,04 л/хв/кг по плазмі. Якщо прийняти, що гематокріт близький до 30 %, цю величину варто збільшити в 1,5 рази для одержання оцінки загального кліренсу по крові - 0,06 л/хв/кг. Таким чином, загальний кліренс досліджуваної речовини близький до 30% від загального хвилинного кровотоку й до 60% від сумарного кровотоку через головні органи, що елімінують. Отже, дана речовина належить до швидкоелімінуючих речовин у кролів. У той же час стаціонарний об’єм розподілу невеликий і складає лише 1,7 л/кг, що може свідчити або про низьку спорідненість сукцифенату до тканин, або про високий ступінь зв'язування білками плазми крові. Сукупність високого загального кліренсу і низького стаціонарного об’єму розподілу зумовлює дуже короткий середній час утримання речовини в організмі, що не перевищує 24 хвилин. Також невеликий і період напівзникнення речовини з плазми - 27 хвилин. Цікаво відзначити, що початковий об’єм розподілу сукцифенату близький до стаціонарного - близько 1,3 л/кг. Останнє свідчить про те, що для даної речовини нехарактерне прагнення до розподілу в периферичні тканини. Імовірно, розподіл сукцифенату відбувається, головним чином, в інтенсивно перфузованих органах. Швидке завершення процесу розподілу відбивається і на формі кривої "концентрація - час", що лише на початковій ділянці відхиляється від моноекспоненціального ходу, характерного для речовин, що розподіляються практично миттєво.

Встановлена наявність високої і різнобічної біологічної активності сукцинової кислоти та її похідних (В.П. Черних, 1985). Тому вивчення супутніх видів фармакологічної дії сукцифенату було доцільним і стало наступним етапом нашої роботи.

Як відомо, крововтрата знижує резистентність організму та призводить до пригнічення його імунобіологічних механізмів захисту, тим самим створюючи сприятливі умови для активного розмноження бактеріальної флори, тому ми вивчили антимікробну активність сукцифенату. Встановлено, що сукцифенат іn vіtro виявляє бактеріостатичну активність на
S. aureus в дозі 125 мкг/мл, перевищуючи в 2 рази активність диметилсульфоксиду (p0,05). Стосовно E. colі та Bac. subtіlіs сукцифенат проявив бактеріостатичну активність в дозі 62,5 мкг/мл, вірогідно перевищуючи рефренс-препарат також у 2 рази. В умовах іn vіvo генералізовану гнійну інфекцію отримували внутрішньоочеревинним введенням Staphylococcus aureus, інфікуюча доза якого складала 10109 мікробних тіл у суміші з “голодним” агаром із розрахунку 15. Сукцифенат в дозі 13,9 мг/кг і препарат порівняння – бензилпеніциліна натрієву сіль (2000 ОД на одну мишу) вводили внутрішньоочеревинно одночасно з зараженням. У контрольній групі тварин тривалість життя становила 14%, при введенні сукцифенату цей показник складав 52%, тобто сукцифенат подовжував в 3,7 рази тривалість життя дослідних тварин. Після закінчення експерименту органи тварин були піддані патоморфологічному вивченню. В контрольній групі мишей реєстрували розвиток гнійно-некротичних фокусів у легенях, нирках, селезінці, печінці та перитоніту. У тварин, яким вводили препарат, також відзначений розвиток перитоніту, однак, одночасно формування поодиноких гнійно-некротичних фокусів відзначене лише в одному з внутрішніх органів. Таким чином, ми прийшли до висновку, що одноразове введення сукцифенату не попереджає формування генералізованої гнійної інфекції, однак сприяє більш доброякісному її перебігу.

Згідно даним літератури (В.А. Барабой, Д.А. Сутковой, 1997) під впливом іонізуючого випромінювання відбувається пригнічення процесів згортання крові, що проявляється геморагічним синдромом. Останнє свідчить про перспективність використання при цій патології кровоспинних засобів, в тому числі й сукцифенату. Крім того можна припустити, що сукцифенат буде проявляти радіопротекторні властивості, оскільки він є продуктом ацелювання
4-амінофенону янтарною кислотою, а 4-амінофенони та їх похідні виявляють позитивний вплив на перебіг патологічного процесу, викликаного іонізуючим випромінюванням. Наші експерименти показали, що в умовах -випромінювання сукцифенат подовжував життя білих мишей в 1,8 рази по відношенню до контролю (p0,05). При введенні цезію-137 (внутрішньоочеревинно, одноразово із розрахунку 40 кБк на 100 г маси) сукцифенат (внутрішньоочеревинно, 13,9 мг/кг, протягом 7 діб) сприяв зниженню вмісту цезію-137 у м'язах на 25%, у головному мозку на 50%, печінці на 63% і кістках на 77% порівняно з контрольними тваринами (p0,05). Застосування сукцифенату (внутрішньоочеревинно, 13,9 мг/кг, протягом 24 діб) в умовах хронічного введення цезію-137 (внутрішньоочеревинно, 500 Бк протягом 24 діб) сприяло зниженню загальної радіоактивності щурів і зменшенню випромінювання м'язів і печінки тварин на 34% і 36% відповідно стосовно контролю (p0,05) та підвищенню рівня радіонукліду у кишечнику на 40%. Таким чином, ці експерименти довели, що сукцифенат прискорює виведення цезію-137 переважно через кишечник і свідчать про наявність у нього радіозахисних властивостей.

З метою вивчення механізму радіозахисної дії сукцифенату досліджували його здатність уловлювати гідроксильні та супероксидні радикали. Експерименти показали, що препарат за умов перекісного окислення ліпідів, індукованого іонами Fe2, обмежував приріст ТБКАП на 50% в концентрації 0,6 мкг/мл реакційного середовища. За ефективністю уловлювати гідроксильні радикали сукцифенат дорівнював рефренс-препарату манніту та дещо поступався етанолу.

При вивченні спроможності сукцифенату уловлювати супероксидні радикали встановлено, що сукцифенат в концентрації 5 мкг/мл реакційного середовища гальмує перехід адреналіну в адренохром на 56% і в цьому відношенні не поступається відновленому глутатіону (пригнічуюча дія дорівнює 52%).

Сукцифенат у концентрації 0,8 мкг/мл виявляє антиокислювальні властивості, про що свідчить зниження продуктів, які реагують з 2-тіобарбітуровою кислотою на 66% і в цьому плані практично не поступається іонолу.

Таким чином, радіозахисна активність сукцифенату в значній мірі обумовлена спроможністю вловлювати гідроксильні та супероксидні радикали, які виступають каталізаторами процесу перекісного окислювання ліпідів та забезпечують його аутокаталітичний характер. Зниження рівня цих радикалів запобігає виникненню та розвитку окислювальних неферментативних реакцій.

Встановлено, що одноразове введення сукцифенату в дозах, які в 2, 5, 10 і 20 разів перевищують ефективну (ED50=13,9 мг/кг), не викликає змін морфологічної структури внутрішніх органів тварин. При тривалому введенні (30 діб) препарату в ефективній дозі реєструються розлади кровообігу у вигляді кровонаповнення судин, діапедезі еритроцитів і діапедезних крововиливів. Найбільш виражений характер ці зміни мали в міокарді, нирках, легенях. У поодиноких тварин (у 1,8 % випадках) були виявлені зміни з боку селезінки, що виражаються в заповненні еритроцитами і макрофагами синусоїдів капілярів червоної пульпи селезінки. Патоморфологічні дослідження свідчать, що при довготривалому введенні сукцифенату у тварин розвивається гіпокоагуляційний синдром, що необхідно брати до уваги при його практичному використанні в клінічних умовах.

Таким чином, гемокоагуляційні дослідження показали, що сукцифенат прискорює утворення тромбопластину (І фаза гемокоагуляції), активує конверсію протромбіну в тромбін (ІІ фаза згортання крові), прискорює перетворення фібриногену в фібрин, підвищує активність фібринази (ІІІ фаза коагуляційного гемостазу) та пригнічує фібринолітичну активність крові за рахунок блокування активаторів плазміногену (ІІ післяфаза), тобто препарат має універсальні прокоагулянтні властивості. При експериментальній патології сукцифенат сприяє зменшенню часу кровотечі з внутрішніх органів тварин. Наведені вище дані експериментально обґрунтовують доцільність використання сукцифенату в якості гемостатичного препарату.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведене теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що визначається експериментальним обґрунтуванням доцільності використання сукцифенату в якості гемостатичного препарату при паренхіматозних і капілярних кровотечах.

1. Середньосмертельна доза сукцифенату при внутрішньоочеревинному введенні білим мишам і щурам складає 3500 (3875,53124,5) мг/кг та 3166,7 (3509,52823,9) мг/кг, відповідно; при внутрішньошлунковому введенні мишам LD508000 мг/кг, щурам – LD5011000 мг/кг (VI клас токсичності за класифікацією К.К. Сидорова, тобто відносно нешкідливі речовини). Ефективна доза сукцифенату (ED50) при внутрішньоочеревинному введенні щурам за умов моделювання різаної рани печінки за показником зменшення часу кровотечі дорівнює 13,9 (8,619,2) мг/кг маси тіла. За широтою терапевтичної дії сукцифенат перевершує -амінокапронову кислоту в 4,6 рази.

2. Сукцифенат (внутрішньовенно, 13,9 мг/кг щоденно протягом 20 діб) підвищує кількість тромбоцитів у периферичній крові щурів та їх агрегаційну здатність (20-та доба дослідження) на 40% і 280%, відповідно (р<0,05 по відношенню до контролю).

3. Введення сукцифенату (13,9 мг/кг маси, внутрішньовенно, одноразово за 10 хв до забору крові) білим щурам вірогідно скорочує активований час рекальцифікації та активований частковий тромбопластиновий час на 28,2% і 28,4%, відповідно, у порівнянні з контролем; збільшує протромбіновий індекс на 16,6%; прискорює перетворення фібриногену у фібрин на 14,2% та підвищує активність фібринстабілізуючого фактора на 30%, а також підсилює ретракцію кров’яного згустку на 89% у порівнянні з контрольною групою тварин.

4. Застосування сукцифенату (13,9 мг/кг внутрішньовенно, одноразово за 10 хв до забору крові) гальмує фібринолітичну активність крові кролів, що підтверджується подовженням часу лізису еуглобулінового згустку в 2,7 разів у порівнянні з контролем (р<0,05).

5. Сукцифенат проявляє виражену гемостатичну активність на моделі різаної рани печінки як при профілактичному одноразовому внутрішньовенному введенні в дозі 13,9 мг/кг (час кровотечі зменшився в 2,2 рази в порівнянні з контролем, р<0,05), так і при введенні препарату