Академія медичних наук України

Інститут проблем ендокринної патології

ім. В. Я. Данилевського

Красова Наталія Сергіївна

УДК 616.379-008.64:612-09:616-08

Вплив соціально-емоційного стресування вагітних щурів

з різним ступенем інсулінової забезпеченості

на глюкозний гомеостаз та антиоксидантну систему захисту у нащадків

14.01.14 – ендокринологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків–2004

дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем ендокринної патології

ім. В.Я. Данилевського АМН України

Науковий керівник:

доктор медичних наук, професор Полторак Вікторія Віталіївна,

Інститут проблем ендокринної патології ім. В.Я. Данилевського АМН України, відділ експериментальної ендокринології, завідувач

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук Кучмеровська Тамара Муратівна,

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України

відділ коферментів, провідний науковий співробітник

кандидат медичних наук, старший науковий співробітник

Філіпова Неоніла Василівна,

Інститут охорони здоров’я дітей та підлітків АМН України,

відділення ендокринології, завідувач

Провідна установа:

Львівський національний медичний університет ім. Данила Галицького МОЗ України, кафедра ендокринології, м. Львів

Захист відбудеться “16” грудня____ 2004 р. о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.564.01 при Інституті проблем ендокринної патології ім. В.Я Данилевського АМН України за адресою: 61002, м. Харків, вул. Артема, 10.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту проблем ендокринної патології ім. В.Я. Данилевського АМН України (61002, м. Харків, вул. Артема, 10).

Автореферат розісланий “11” листопада 2004 р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат медичних наук Т.М. Тихонова

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. В останні десятиріччя в усьому світі, і в Україні зокрема, відзначено зростання кількості захворювань ендокринної системи, перше місце серед яких займає цукровий діабет (ЦД) (Тронько М.Д. та співавт., 1996; Ефимов А.С. и соавт., 1998; Zimmet Р. et al., 2001). Тяжкість цієї патології, що супроводжується частою інвалідизацією і ранньою смертністю, поєднується з високими для держави економічними витратами, все вищеозначене обґрунтовує необхідність розробки ефективних профілактичних і лікувальних заходів (Тронько М.Д. та співавт., 2002; Іпатов А.В., 2003).

Слід зазначити, що натепер значно знизився середній вік хворих на ЦД 2 типу (American Diabetes Association, 2000). З ризиком розвитку діабету у молодих пов'язаний вплив великої кількості негенетичних чинників навколишнього середовища, серед яких важливе місце посідають особливості ембріонального розвитку, стресорні впливи, прееклампсія та інше (Soltesz G., 2003), що пояснює більш пильну увагу до проблеми впливу гестаційного діабету матері на розвиток її нащадків.

гестаційний, тобто той, що виникає у період вагітності, ЦД транзиторного характеру зустрічається залежно від популяції в середньому у 2-17 % вагітних жінок (Yue D.K. et al., 1996) і являє собою досить серйозну небезпеку як для матері, так і для її дитини. Клінічні й експериментальні дані засвідчують можливість “програмування” в ембріональний період у таких дітей дисфункції органів та систем (Holemans K. et al., 1999). Так, є повідомлення про підвищену у дітей, народжених від матерів із гестаційним діабетом, частоту персистентного порушення толерантності до глюкози (Van Assche F.A. et al., 2001), збільшення ризику розвитку ЦД (Boloker J. et al., 2002), а також про зміни інсулінової секреції – гіперінсулінемію, що, як відомо, відіграє ключову роль у розвитку метаболічних і серцево-судинних порушень у зрілому віці (Holemans K. et al., 1991). В розвитку ембріопатій у нащадків матерів з діабетом важливе місце займає пренатальний оксидативний стрес, що характеризується підвищеною пероксидацією ліпідів та зменшенням активності антиоксидантних систем організму (Siman M., 1997). Однак дотепер відсутні роботи, які описують вплив вільно-радикальних процесів в пре- та постнатальний період на формування глюкозного гомеостазу у нащадків матерів з гестаційним діабетом.

Водночас відомо, що гострі стресові стани супроводжуються порушенням толерантності до глюкози як у здорових осіб, так і в хворих на ЦД (Surwit R.S. et al., 1992). Крім зрушень у глюкозному гомеостазі, стрес здатен викликати порушення у функціонуванні інших біологічних систем цілісного організму. Проте, нажаль насьогодні є лише обмежена кількість досліджень, що коректно визначають внесок емоційного стресу, його стадій і сили у розвиток ЦД. В той же час не викликає сумнівів, що сучасне зростання темпу життя та економічні негаразди здатні призводити до накопичення емоційної напруги і розвитку дистреса.

Незважаючи на досить тривале вивчення гестаційного цукрового діабету, дослідження впливу психологічного стресу на формування і подальший розвиток біологічних систем, насамперед глюкозного гомеостазу та функції панкреатичних бета-клітин у нащадків матерів з гестаційним діабетом перебуває на початковій стадії. Зокрема, не визначена роль стресу в ранній термін вагітності, коли за умов діабетичного стану спостерігається максимальна чутливість ембріону до тератогенних чинників (Siman M., 1997).

Актуальність проблеми визначається необхідністю патогенетичного обґрунтування й експериментальної розробки комплексної профілактики та ефективної терапії ендокринопатій у дітей матерів із гестаційним цукровим діабетом. Все вище зазначене стало підставою для проведення даного дослідження.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до плану науково-дослідних робіт ІПЕП ім. В.Я. Данилевського АМН України і є фрагментами тем “Дослідження впливу соціально-емоційного стресу на перебіг гестагенного діабету та формування реактивності до діабетогенних факторів у нащадків (клініко-експериментальна розробка)” (номер Державної реєстрації 0197U014642) та “Особливості формування ендокринопатій та стан адаптаційних можливостей у нащадків матерів з гестаційним діабетом; розробка заходів реабілітаційної терапії” (номер Державної реєстрації 0100U001599).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи – визначити закономірності формування та можливості фармакологічної корекції порушень глюкозного гомеостазу, функції панкреатичних бета-клітин та оксидативного стану у щурів-нащадків самиць, стресованих за умов гестаційної інсулінової недостатності.

Для досягнення зазначеної мети в роботі поставлено низку таких завдань:

1. Визначити вплив соціально-емоційного стресування вагітних щурів-самиць із гестаційною інсуліновою недостатністю на показники глюкозного гомеостазу, функцію бета-клітин підшлункової залози, пероксидацію ліпідів і антиоксидантну систему захисту у нащадків першого покоління на етапах онтогенезу.

2. Оцінити вплив соціально-емоційного стресування вагітних щурів з гестаційною інсуліновою недостатністю на формування у нащадків чутливості до діабетогенних чинників хімічної (стрептозотоцин) і психогенної (додатковий стрес) природи, визначеної за показниками глюкозного гомеостазу, ліпідної пероксидації та антиоксидантної системи захисту.

3. Дослідити можливість превентивної і реабілітаційної терапії нащадків стресованих матерів з експериментальним гестаційним діабетом.

Об’єкт дослідження – метаболічні порушення у щурів лінії Вістар – нащадків стресованих матерів з гестаційною інсуліновою недостатністю.

Предмет дослідження – параметри глюкозного гомеостазу, ліпідної пероксидації та антиоксидантної системи захисту у щурів-нащадків стресованих матерів з гестаційною інсуліновою недостатністю.

Методи дослідження: фізіологічні, біохімічні та радіоімунологічні.

Наукова новизна одержаних результатів. Визначено статевий диморфізм дії материнського соціально-емоційного стресу в першій третині вагітності за умов нормальної та зниженої інсулінової забезпеченості на формування порушень глюкозного гомеостазу та оксидантний статус у нащадків першого покоління. Виявлено кумулятивний ефект материнського стресу і гестаційної інсулінової недостатності на розвиток глюкозної інтолерантності, функціональну напругу бета-клітин підшлункової залози та інтенсивність ліпопероксидації у нащадків-самців протягом онтогенезу.

у самців-нащадків стресованих матерів із гестаційною інсуліновою недостатністю виявлено в період статевого дозрівання підвищення чутливості до діабетогенної дії стрептозотоцину за біохімічними маркерами глюкозного гомеостазу та антиоксидантної системи захисту. Разом з тим, стресування матерів в першому триместрі вагітності за наявності гестаційної інсулінової недостатності не виказувало аналогічного впливу на нащадків-самиць.

Доведено знижені адаптаційні можливості у самців-нащадків матерів зі стресом за умов недостатньої інсулінової забезпеченості, які визначені під час дослідження реактивності глюкозного гомеостазу та антиоксидантної системи захисту на короткочасну гіпокінезію.

Встановлено ефективність перорального застосування вітаміну Е під час перших двох третин вагітності у матерів із гестаційним стресом та експериментальним діабетом щодо попередження розвитку у нащадків порушень глюкозного гомеостазу та зниження дисбалансу антиоксидантної системи.

Визначено патогенетичну роль гестаційного оксидативного стресу в розвитку порушень глюкозної толерантності у нащадків матерів із патологічним перебігом вагітності (стрес, гестаційний діабет).

Обґрунтовано ефективність проведення у нащадків стресованих матерів із нормальною та зниженою інсуліновою забезпеченістю комбінованої пероральної антиоксидантної терапії (вітаміни Е та С) в препубертатному періоді з метою зменшення інтолерантності до глюкози і функціональної напруги бета-клітин підшлункової залози.

Практичне значення одержаних результатів. Наявність доведеного ушкоджуючого впливу материнського стресу в ранні терміни вагітності на функціонування біологічних систем у нащадків, а також визначення ролі оксидативного стресу у розвитку цих порушень обґрунтовують проведення антиоксидантної профілактичної терапії серед загалу вагітних, а саме, серед жінок із високим ризиком виникнення гестаційного діабету, з метою попередження розвитку у їх нащадків ендокринопатій, здатних привести до ранньої інвалідизації.

Результати проведеного дослідження є теоретичним обґрунтуванням коректного виділення груп ризику, своєчасної профілактики та комплексного лікування метаболічних порушень у дітей матерів із гестаційним діабетом.

Особистий внесок здобувача. Увесь фактичний матеріал, приведений у роботі, отримано дисертантом самостійно. Аналіз одержаних даних, розрахунок функціональних індексів, систематизацію, статистичну обробку і визначення кореляційних взаємозв'язків, обґрунтування наукових положень та висновків, а також написання дисертаційної роботи автор виконав самостійно. Дизайн дисертаційного дослідження розроблено під керівництвом д. мед. н., проф. В. В. Полторак. Моделювання гестаційного стрептозотоцинового діабету та материнського соціально-емоційного стресування, а також визначення рівня інсуліну в сироватці крові проведено разом із к. мед. н. А. І. Гладких та Ж. А. Лещенко.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації подані на 34-му конгресі Європейської асоціації з вивчення цукрового діабету (Барселона, Іспанія, 1998), науково-практичній конференції, яка присвячена 80-річчю Українського НДІ фармакотерапії ендокринних захворювань (Харків, 1999), 35-му конгресі Європейської асоціації з вивчення цукрового діабету (Брюссель, Бельгія, 1999), 36-му конгресі Європейської асоціації з вивчення цукрового діабету (Єрусалим, Ізраїль, 2000), науково-практичній конференції, яка присвячена 100-річчю з дня народження І. Н. Буланкина (Харків, 2001), 37-му конгресі Європейської асоціації з вивчення цукрового діабету (Глазго, Великобританія, 2001), 6-му з'їзді ендокринологів України (Київ, 2001), 5-му Європейському конгресі ендокринологів (Турін, Італія, 2001), Першій науково-практичній конференції молодих вчених, яка присвячена 95-річчю з дня народження акад. В. П. Комісаренка (Київ, 2002), 38-му конгресі Європейської асоціації з вивчення цукрового діабету (Будапешт, Угорщина, 2002), науково-практичній конференції, яка присвячена 180-річчю з дня народження В.Я. Данилевського (Харків, 2002),
8-му Українському біохімічному з'їзді (Чернівці, 2002), 3-х Данилевських читаннях (Харків, 2004), 4-му Національному конгресі патофізіологів України (Чернівці, 2004), 40-му конгресі Європейської асоціації з вивчення цукрового діабету (Мюнхен, Німеччина, 2004).

Публікації. Автором за темою дисертації опубліковано 34 наукових праці (6 статей у спеціалізованих наукових виданнях, у тому числі 5 у рекомендованих ВАК України, з яких 2 одноосібних та решта у співавторстві, 28 тез в матеріалах вітчизняних та зарубіжних з'їздів, конгресів та конференцій).

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 170 сторінках друкованого тексту. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, трьох розділів власних досліджень, обговорення отриманих результатів, висновків. Роботу ілюстровано 36 таблицями, 24 рисунками. Список використаних джерел містить 230 посилань та займає 25 сторінок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. У роботі використовували самців і самиць щурів лінії Wistar півтора- і трьохмісячного віку загальною кількістю 1138 голів, вагою 75-110 та 180-250 г, відповідно, яких утримували в стандартних умовах віварію Інституту проблем ендокринної патології ім. В.Я. Данилевського при нормальному освітленні і годуванні ad libitum. Дослідження проводилися відповідно до національних "Загальних етичних принципів експериментів на тваринах" (Україна, 2001), які узгоджуються з положеннями „Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей” (Страсбург, 1985). В якості матеріалу дослідження використо-вували гомогенат печінки, кров і сироватку крові щурів.

З метою моделювання умов, характерних для гестаційного цукрового діабету, а саме – порушення толерантності до вуглеводів під час вагітності без істотного підвищення базальної глікемії, самицям на другу добу вагітності проводили одноразову внутришньочеревну ін'єкцію стрептозотоцину в субдіабетогенній дозі („Sigma”, 45 мг/кг маси тіла, на 0,1 М цитратному буфері, рН 4,5) (Holemans K. et al., 1991). Стрептозотоцин (streptozotocin – STZ) – антибіотик (2-дезокси-2-метил-нітрозаміно-карбонил-аміно-D-глюкопираноза), здійснює вибірковий вплив на панкреатичні бета-клітини (Rakieten N. et al., 1963). Слідові кількості STZ, а також продукти його розпаду, потрапляють до печінки і нирок, звідки виводяться протягом доби, що забезпечує захист ембріона, який формується, від токсичного впливу (Elsner M. et al., 2000).

модель материнського “соціально-емоційного” стресу була відтворена шляхом щоденної зміни угрупування щурів (n=25), в якому самиця перебувала протягом 6-годинного світлового періоду з другої по восьму добу вагітності. На ніч вагітну самицю відсаджували до окремої клітки (Pratt N.C. et al., 1989).

У подальших дослідженнях брали участь нащадки вищезазначених тварин, розподілені за впливом на матір на групи „Стрес”, „ГСД” (гестаційний стрептозотоциновий діабет), „ГСД+стрес” та інтактний контроль.

При дослідженні чутливості до діабетогенної дії STZ нащадків, отриманих від матерів із гестаційною інсуліновою недостатністю та/або стресом під час вагітності, тваринам проводилася одноразова внутришньочеревна ін'єкція субдіабетогенної дози STZ (35 мг/кг маси тіла) у період пубертату або в статевозрілому віці.

При дослідженні адаптивності тварин-нащадків, останніх піддавали короткочасному впливу гіпокінезії. Під час моделювання гіпокінезії тварина протягом однієї години утримувалась у пеналі для імобілізації (Аршавский И.А., 1982).

Для оцінки можливості превентивного та реабілітаційного терапевтичного впливу на порушення в роботі систем глюкозного гомеостазу та антиоксидантного захисту, які розвиваються у нащадків стресованих діабетичних матерів, застосовували дві моделі антиоксидантної терапії (АОТ), що знижують вплив оксидативного стресу на різних етапах онтогенезу - у пренатальному (формування біологічних систем) і препубертатному (інтенсивний ріст) періодах. У першому випадку матері експериментальних тварин одержували розчин вітаміну Е (solutio ?-tocoferoli acetatis 10 % oleosa) з 2 по 15 добу вагітності перорально в терапевтичній для тварин дозі – 50 мг/кг маси тіла (Siman C.M. et al., 1995). В другому випадку нащадки стресованих діабетичних матерів одержували перорально вітамін Е в дозі 50 мг/кг маси тіла і вітамін С (кислота аскорбінова) в дозі 200 мг/кг маси тіла (Siman C.M. et al., 1997) з 21 по 35 добу життя. Комбінація вітамінів та їх дози були відібрані таким чином, щоб виказувати максимальний синергічний ефект (Simanet al., 1997).

Глюкозний гомеостаз оцінювали за рівнем глікемії (базальної та під час внутрішньочеревного тесту толерантності до глюкози, ВЧТТГ). Кров для аналізу брали з хвостової вени після попереднього 4-годинного голодування, а також через 30, 60 і 120 хв після введення глюкози (3 г/кг маси тіла). Рівень глюкози в крові визначали глюкозооксидазним методом із застосуванням ферментативного аналізатора глюкози “Ексан-Г” (Литва). Розраховували показник інтегральної глікемії під час навантажувального тесту. Площу під глікемічними кривими (ПГК/2год) при проведенні ВЧТТГ розраховували за допомогою комп’ютерної програми “Mathlab”. Рівень імунореактивного інсуліну (ІРІ) в сироватці крові визначали за допомогою стандартних наборів “рио-ИНС-ПГ-125І” (Бєларусь) методом радіоімунологічного аналізу “in vitro”. Індекс функції бета-клітин (ФБК), що ґрунтується на одночасному визначенні індивідуальних рівней ІРІ та глюкози в сироватці крові натще, розраховували за допомогою алгоритму НОМА (Homeоstasis Model Assessment) (Matthews D.R. et al., 1985). Оцінку інтенсивності нефермен-тативного глікозилювання проводили за визначенням концентрації фруктозаміну (ФА) в сироватці крові, яку вимірювали з використанням нитросинього тетразолію (Johnson R.N. et al., 1982).

Після декапітації анестезованої хлоралозо-уретановим наркозом тварини збирали кров для отримування сироватки, а печінку перфузували холодним середовищем виділення та гомогенізували у гомогенізаторі Поттера на льоду (Мэдди Э., 1979).

Оксидативний стан в гомогенаті печінки та сироватці крові характеризували за показниками перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) та антиоксидантного захисту (АОЗ). Вміст дієнових, оксидієнових та триєнових кон’югатів (ДК, ОДК, ТК) оцінювали в гептан/ізопропанольних екстрактах (Плацер З. и соавт., 1970; Волчегорский И.Ф. и соавт., 1989), визначали також вміст малонового діальдегіду (МДА) в реакціях з тіобарбітуровою кислотою (Стальная И.Д. и соавт., 1977). в гомогенаті печінки визначали кількість відновленого глутатіону (ГSH) у кольоровій реакції з реактивом Елмана (Beutler E. et al., 1963) та активність каталази за допомогою молібдата амонію (Королюк А. и соавт., 1988). Загальну антиоксидантну активність (ЗАА) сироватки крові досліджували на моделі окислювання жовточних ліпопротеїнів (Клебанов Г.И. и соавт., 1988). Рівень ?-токоферолу в сироватці крові визначали кольоровою реакцією з двовалентним залізом (індикатор ?,б1-біпіридил) та внесенням поправки на присутність холестеролу (Кибардин С.А., 1951). Концентрацію церулоплазміну (ЦП) в сироватці крові характеризували за реакцією з солянокислим р-фенилендіаміном (Колб Г.И. и соавт., 1982).

Статистичний аналіз отриманих результатів здійснено параметричними та непараметричними методами. Вірогідну статистичну відмінність ознак, що характеризуються нормальним розподілом та близькими дисперсіями, визначали за критерієм Стьюдента (t). В ряді випадків використовували Х-критерій Ван-дер-Вардена (Лакин Г.Ф., 1990). Розходження вважали вірогідними при р<0,05. Проведено кореляційний аналіз лінійного зв’язку кількісних ознак, що характеризуються нормальним розподілом (r, коефіцієнт кореляції Пірсона) (Гланц С., 1999).

Результати досліджень та їх обговорення. Отримані результати дозволяють констатувати, що материнський соціально-емоційний стрес протягом першої третини вагітності являє собою діабетогенний чинник для нащадків першої генерації обох статей. Так, при ізольованому моделюванні він призводив до виникнення порушень глюкозної толерантності, яка була зафіксована за допомогою ВЧТТГ у самців з періоду пубертата (рис.), а у самиць – в молодому репродуктивному віці (табл. 1). Хімічно індукований гестаційний діабет матері також викликав глюкозну інтолерантність у нащадків обох статей, зафіксовану в наших дослідженнях з періоду пубертата, що співпадає з літературними даними (Pribylova H. et al., 1996).

Виявлено, що комбінація материнського стресу з гестаційною інсуліновою недостатністю формувала у самців (але не у самиць) більше порушення толерантності до глюкози, ніж окремий вплив змодельованих чинників. Можливо, розвиток глюкозної інтолерантності обумовлено резистентністю периферичних тканин до гіпоглікемізуючого впливу інсуліну, тому що гіперглікемія супроводжувалася функціональною напругою панкреатичних бета-клітин (див. табл. ). Привертає увагу статевий диморфізм активації інсулінпродукуючого апарату нащадків стресованих за умов ГСД щурів: індекс ФБК у статевозрілих нащадків-самців на 51вище, ніж у самиць (р<0,01).

Рис. Динаміка глікемії протягом ВЧТТГ (3 г/кг маси тіла) у 1,5-місячних самців-нащадків, отриманих від матерів зі стресом та/або гестаційною інсуліновою недостатністю під час вагітності;

(X±Sx), n=6

*- р0,05 по відношенню до контролю

Наявність самостійного ушкоджуючого ефекту стресування матері та його потенціюючий вплив на порушення глюкозного гомеостазу, що обумовлені гестаційною інсуліновою недостатністю, у самців-нащадків можна пояснити декількома факторами. По-перше, це підвищений рівень у крові гормонів із контрінсуліновою дією – глюкокортикоїдів, який було зафіксовано у нащадків-самців з аналогічною моделлю материнського стресу, починаючи з неонатального періоду (Sergienko L. et al., 2001). У зв’язку з цим слід відзначити вірогідно нижчу чутливість глюкозного гомеостазу самиць до діабетогенної дії глюкокортикоїдів, а саме, загальновідому неможливість відтворення моделі дексаметазонового діабету у молодих самиць щурів Вістар. По-друге, пошкоджуючий вплив материнського стресу, можливо, пояснюється інфантилізацією самців (Brizgalova G. et al., 1997; Brizgalova G. et al., 1998; Weinstock M., 2001) при одночасно низькому рівні печінкових ? - рецепторів до естрогену, що викликає посилення периферичної інсулінорезистентності (Khan A. et al., 2003).

В той же час у самиць пренатальний стрес зумовлював розвиток порушень глюкозного гомеостазу пізніше - у репродуктивному віці, що узгоджується з уявленнями про більшу адаптивність жіночого організму (Zhu M. et al., 1998; Schoenle E.J. et al., 2002; Peshev L.P. et al., 2003) та строками дозрівання інсулінпродукуючого апарату підшлункової залози у щурів (Абрамов А.В. и соавт., 2004).

Таблиця 1

Показники глюкозного гомеостазу у щурів, нащадків матерів зі стресом та/або гестаційною інсуліновою недостатністю під час вагітності, (хSx), n=6

Група | ПГК/2год, ммоль/лЧхв-1 | Коефіцієнт ФБК

у 1,5-місячному віці | у 3-місячному віці | у 1,5-місячному віці | у 3-місячному віці

Самці

Контроль | 772,5438,82 | 525,9028,45 | 362,6649,58 | 698,2267,93

Стрес | 874,8144,65 | 927,4544,71

р10,01 | 290,1045,84 | 915,9182,01

ГСД | 1034,4082,72

р10,02 | 856,3537,23

р10,001 | 618,8857,55

р10,01 | 1318,88101,86

р10,001

ГСД+стрес | 1310,4095,32

р10,001

р20,05 | 1176,7564,42

р10,001

р20,01 | 909,7775,33

р10,001

р20,01 | 1480,72151,20

р10,001

Самиці

Контроль | 786,2236,20 | 668,2529,16 | 241,0851,82 | 541,7165,33

Стрес | 729,3330,74 | 1005,7546,93

р10,001 | 166,9214,25

р30,05 | 794,6573,79

р10,05

ГСД | 1006,8374,94

р10,05 | 1014,3052,32

р10,001

Р3<0,05 | 479,9243,83

р10,05 | 1251,48130,88

р10,001

ГСД+стрес | 961,2063,61

р10,05 | 899,5540,65

р10,05 | 364,4151,13

р30,001 | 975,2393,23

р10,01

р30,01

Примітки:

1. р1- вірогідність різниці у порівнянні до контролю;

2. р2- вірогідність різниці у порівнянні до групи “ГСД”;

3. р3 - вірогідність різниці у порівнянні до аналогічної групи самців.

Визначено, що материнський соціально-емоційний стрес в першому тримес-трі вагітності не призводив до істотного підвищення інтенсивності ПОЛ в печінці щурів-нащадків першого покоління за умов ізольованого моделювання, але надавав потенціюючого впливу на підвищення активності ліпопероксидації в печінці, обумовлене материнською гестаційною інсуліновою недостатністю, більшою мірою у самців. Так, вміст ДК в гомогенатах печінки у півторамісячних тварин в групах “ГСД+стрес” було підвищено на 36у самців та 68– у самиць (р0,01). Вміст МДА було значно підвищено (р0,01) в групах “ГСД+стрес” нащадків обох статей. У трьохмісячних експериментальних тварин рівень продуктів ПОЛ був достовірно нижчим порівняно з статевонезрілими, що співпадає з літературними даними (Яковлева Л.В. и соавт., 2001; Peshev L.P. et al., 2003) та свідчить про зниження інтенсивності синтетичних процесів, пов’язаних з ростом та диференціацією тканин протягом онтогенезу. Однак відносно контролю вміст первинних продуктів ПОЛ у нащадків матерів з діабетом (групи “ГСД” та “ГСД+стрес” як самців, так і самиць) та рівень МДА в групі “ГСД+стрес” самців були вірогідно збільшеними (р0,01). В групі самиць “ГСД+стрес” спостерігалось статистично значуще підвищення вмісту тільки ДК в печінці, але не МДА, що може опосередковано свідчити про більшу активність системи АОЗ та кращу адаптивність самиць. Кореляційний аналіз досліджених метаболічних показників у нащадків виявив прямий (r=0,854, р<0,05) зв’язок між ступенем виразності глюкозної інтолерантності, визначеної за показником ПГК/2год, та інтенсивністю ПОЛ (за вмістом МДА) у нащадків-самців. У самиць аналогічної кореляції не зафіксовано, що може бути пов’язано з наявністю додаткових до глюкозної інтолерантності патогенетичних механізмів підвищення ліпопероксидації у нащадків стресованих матерів з гестаційним діабетом.

Під час дослідження стійкості біологічних систем нащадків до дестабілізуючого впливу діабетогенних чинників, нами виявлено підвищену чутливість до діабетогенної дії стрептозотоцину у статевонезрілих самців-нащадків, отриманих від стресованих матерів з ГСД. А саме, показник інтегральної глікемії під час ВЧТТГ після ін’єкції субдіабетогенної дози STZ в групі самців “ГСД+стрес” на 17вище, ніж в групі “ГСД” (р<0,05), в той час, як у трьохмісячних тварин STZ нівелював розбіжності ступеню глюкозної інтолерантності між вищевказаними групами. Можливо, це пов’язано зі зниженням репаративних резервів підшлункової залози у самців даного віку (Абрамов А.В. и соавт., 2004).

Визначено, що стрес за умов ГСД знижував у самців-нащадків в півторамісячному віці адаптивність системи АОЗ по відношенню до STZ. Це ілюструється недостатньою активністю складових АОЗ (падіння вмісту ГSH та пригнічення активності каталази в печінці, р<0,05), які не забезпечують підтримання фізіологічного рівня ліпопероксидації (вміст ДК підвищено на 34а МДА – на 48по відношенню до контролю, р<0,01). У самиць-нащадків діабетичних щурів материнський стрес протягом першої третини вагітності не надавав аналогічного впливу. Можливо, це частково пов’язано з більш активною індукцією відновлення зниженої після STZ-ін’єкції маси бета-клітин підшлункової залози у самиць під впливом естрогенів (Zhu M. et al., 1998).

Проведення короткочасної гіпокінезії підтвердило наявність статевого димор-фізму в формуванні реактивності системи глюкозного гомеостазу у нащадків стресованих щурів з діабетом, а саме, наявність потенціюючого ефекту стресування матерів на розвиток у нащадків-самців глюкозної інтолерантності, обумовленої гес-таційною інсуліновою недостатністю: показник інтегральної глікемії як у півтора-, так і трьохмісячних тварин групи “ГСД+стрес” вище, ніж в групі “ГСД” (на 15,7 та 11,8відповідно, р<0,05). Водночас, у статевозрілих самців-нащадків матерів зі стресом за умов ГСД впродовж реакції на короткочасну гіпокінезію зафіксовано знижені адаптаційні можливості системи АОЗ (вміст МДА в гомогенаті печінки у тварин групи “ГСД+стрес” на 31,6вище, ніж у групі “ГСД”, р<0,02, а активність каталази збільшено на 36,2у порівнянні до контролю, р<0,02). стресування матерів не чинило суттєвого впливу на адаптивність до гіпокінезії самиць-нащадків щурів з діабетом.

Нами виявлено, що пероральне вживання терапевтичних доз вітаміну Е протягом перших двох триместрів вагітності стресованими матерями як з нормаль-ною, так і зі зниженою інсуліновою забезпеченістю, а також нестресованими матерями з гестаційним стрептозотоциновим діабетом попереджало розвиток глюкозної інтолерантності та функціональну напругу бета-клітин підшлункової залози у нащадків першої генерації обох статей протягом онтогенезу. Так, показник ПГК/2год у півторамісячних самців-нащадків АОТ-групи “ГСД+стрес” склав (731,8522,81) проти (1073,3849,02) ммоль/л.Чхв-1 в аналогічній плацебо-групі (р<0,001) у порівнянні до (691,2317,25) ммоль/л.Чхв-1 в АОТ-контролі (р>0,05). У статевозрілих щурів спостерігалася подібна до вищевказаної картина. Індекс ФБК також не зазнав вірогідних змін як у півтора-, так і трьохмісячних тварин. Поряд з цим слід зазначити неповну захисну дію превентивної терапії вітаміном Е на формування системи АОЗ у статевозрілих самиць-нащадків групи “ГСД” та самців групи “ГСД+стрес”. Рівні первинних та кінцевих продуктів ПОЛ в гомогенаті печінки у самиць-нащадків матерів з гестаційним діабетом були підвищеними. Однак ці зміни були значно меншими, ніж в плацебо-групі самиць “ГСД” (р0,01), що свідчить про наявність терапевтичного ефекту вживання вітаміну Е. У самців групи “ГСД+стрес” відмічено підвищений у півтора раза вміст ДК в гомогенатах печінки (р0,05), однак відсутність достовірних змін рівня кінцевого продукту ПОЛ – МДА, поряд з нормальним вмістом ГSH та активністю каталази у гомогенатах печінки, не дозволяє зробити певного висновку про порушення регуляції інтенсивності ліпопероксидації в цих тварин.

Отримані після використання превентивної АОТ-терапії результати свідчать про суттєву роль вільних радикалів в програмуванні метаболічних порушень у плода за умов вагітності, обтяженої діабетом, та не суперечать літературним даним, які описують механізм тератогенного впливу гіперглікемії (Siman M., 1997). Верифікований у нашому дослідженні сприятливий ефект АОТ-терапії в матерів під час вагітності на оксидантний статус нащадків, як і нормальна толерантність до вуглеводів у останніх, дозволяє зробити висновок про доцільність вживання вітаміну Е вагітними з гестаційним діабетом, особливо за умов стресуючого впливу навколишнього середовища, в якості ефективного засобу попередження розвитку глюкозної інтолерантності і зниження дисбалансу АОЗ у нащадків.

При дослідженні можливості реабілітуючого впливу антиоксидантних препаратів на метаболізм нащадків матерів з експериментальним гестаційним діабетом та/або стресом під час вагітності було визначено, що вживання комбінованої антиоксидантної терапії (?-токоферолу ацетат та аскорбінова кислота) протягом препубертату знижує виразність інтолерантності до глюкози у піддослідних тварин обох статей. Так, показник ПГК/2год під час навантажувального тесту достовірно знижено в експериментальних групах, що отримували вітамінотерапію, по відношенню до плацебо (р0,05), однак спостерігалися статистично значущі розбіжності у порівнянні до контролю в групах “ГСД” і “ГСД+стрес”, але не в групі “Стрес”. Крім того, використання антиоксидантів нівелювало потенціюючий вплив материнського стресування за умов експериментального гестаційного діабету на розвиток глюкозної інтолерантності у статевонезрілих нащадків-самців. Ефективність роботи систем, що контролюють глюкозний гомеостаз, оцінена за показником ПГК/2год, підтверджувалась також динамікою індексу ФБК. вживання комбінованої АОТ гальмувало функціональну напругу панкреатичних бета-клітин у півторамісячних нащадків матерів з діабетом (групи “ГСД” та “ГСД+стрес”), разом з тим, необхідно відзначити, що в групі самців “ГСД+стрес” індекс ФБК перевищував аналогічний показник у відповідних контрольних тварин (р0,01). Можливо, це пов'язано з глибокими змінами в регуляції процесів поглинання й утилізації глюкози, тобто, із розвитком резистентності до інсуліну в периферичних тканинах самців-нащадків стресованих матерів із гестаційним діабетом.

Протягом онтогенезу спостерігалася поступова втрата сприятливого ефекту на глюкозний гомеостаз комбінованої АОТ, проведеної у нащадків в період препубертату. Так, вживання вітамінів достовірно (р0,05) знижувало ступінь глюкозної інтолерантності у статевозрілих тварин обох статей групи “ГСД”, однак поряд з цим не встановлена гальмуюча дія АОТ на порушення глюкозного гомеостазу в щурів-нащадків стресованих матерів (групи “Стрес” та “ГСД+стрес”) (табл. 2). Аналіз показника ПГК/2год свідчить про потенціюючий вплив материнського стресування протягом ранньої вагітності на розвиток глюкозної інтолерантності, обумовленої гестаційним діабетом, у статевозрілих самців як у відсутності, так і за наявності АОТ.

Використання антиоксидантів попереджало розвиток функціональної напруги панкреатичних бета-клітин у статевозрілих тварин групи “Стрес” та зменшувало індекс ФБК у нащадків матерів з діабетом (групи “ГСД” та “ГСД+стрес”) (див. табл. 2). Слід наголосити відсутність статистично вірогідного потенціюючого впливу материнського стресу за умов експериментального гестаційного діабету на вищевказаний показник глюкозного гомеостазу у самців, які отримували комбіновану АОТ.

Таблиця 2

Показники глюкозного гомеостазу у трьохмісячних щурів, нащадків матерів зі стресом та/або гестаційною інсуліновою недостатністю під час вагітності, за наявності та відсутності антиоксидантної терапії, (хSx), n=6

Група | ПГК/2год, ммоль/лЧхв-1 | Коефіцієнт ФБК

плацебо | АОТ | плацебо | АОТ

Самці

Контроль | 636,38±16,66 | 643,55±7,98 | 538,3938,36 | 584,8630,07

Стрес | 870,76±32,82

р10,01 | 779,68±25,78

р10,05 | 833,9078,78

р10,001 | 610,8257,76

ГСД | 1021,15±18,09

р10,001

р20,01 | 867,20±28,83

р10,05

р20,05

р40,01 | 1192,8475,44

р10,001

р20,01 | 858,6671,60

р10,001

р40,001

ГСД+стрес | 1107,0±47,20

р10,01

р20,01 | 1015,88±39,16

р10,02

р20,01

р30,001 | 1538,42171,99

р10,001

р20,001

р30,01 | 1064,83148,63

р10,01

р40,001

Самиці

Контроль | 671,05±16,23 | 688,53±16,58 | 580,8225,94 | 596,5454,81

Стрес | 754,30±13,29

р10,05 | 740,73±15,59

р10,05 | 762,4633,79

р10,01 | 586,3865,91

ГСД | 975,95±20,73

р10,001

р20,01 | 881,15±19,58

р10,0001

р20,001

р40,05 | 1336,3682,96

р10,001

р20,01 | 880,9433,74

р10,001

р40,001

ГСД+стрес | 968,88±24,10

р10,001

р20,01 | 920,65±6,51

р10,001

р20,01 | 1206,8797,96

р10,001

р20,01

р50,001 | 722,7768,38

р10,01

р40,001

р50,05

Примітки:

1. р1- вірогідність різниці у порівнянні до контролю;

2. р2- вірогідність різниці у порівнянні до групи “стрес”;

3. р3- вірогідність різниці у порівнянні до групи “ГСД”;

4. р4- вірогідність різниці у порівнянні до плацебо;

5. р5- вірогідність різниці у порівнянні до аналогічної групи самців.

Наявні у нащадків матерів з гестаційним діабетом порушення вуглеводного обміну призводили до посилення процесів неферментативного глікозилювання як у півтора-, так і трьохмісячному віці. А саме, концентрація ФА у сироватці крові щурів в групах “ГСД” та “ГСД+стрес” перевищувала контрольний рівень у півтора-два раза (р0,01). Максимальні порушення спостерігалися у самців-нащадків стресованих матерів з ГСД. Комбінована АОТ вірогідно знижувала (р0,05), але не відновлювала до норми, концентрацію ФА у самців групи “ГСД+стрес” протягом онтогенезу.

Під час дослідження інтенсивності ліпопероксидації у крові експери-ментальних тварин було встановлено, що стресування матерів за умов нормальної інсулінової забезпеченості протягом вагітності призводило до підвищення рівня ПОЛ в сироватці крові, яке було зафіксовано у самців з періоду пубертату, а у самиць – в статевозрілому віці. Слід відмітити пряму кореляцію інтенсивності ПОЛ (за показником МДА) зі ступенем виразності глюкозної інтолерантності у даних тварин (r=0,41, р<0,01; r=0,82, р<0,05, відповідно, у півторамісячних самців та трьохмісячних самиць групи “Стрес”). У нащадків матерів з ГСД пренатальне стресування не призводило протягом онтогенезу до вірогідного додаткового підвищення активності ПОЛ в сироватці крові.

У тварин, що отримували плацебо, відмічено дисбаланс складових АОЗ. Наприклад, як у півтора-, так і у трьохмісячних щурів знижено загальну антиоксидантну активність сироватки крові (р<0,01) в групах “Стрес”, “ГСД” та “ГСД+стрес”, рівень ?-токоферолу – у нащадків матерів з діабетом (р<0,01, групи “ГСД” та “ГСД+стрес”, за винятком статевозрілих самиць групи з комбінованим впливом), а також падіння вмісту ГSH та зміни активності каталази у статевозрілих нащадків діабетичних груп.

Вживання антиоксидантної вітамінотерапії під час препубертату виказувало у нащадків щурів з гестаційною інсуліновою недостатністю та/або стресуванням протягом вагітності деякий гальмуючий ефект на інтенсивність ліпопероксидації в обидва вікових періоди. Разом з тим, рівень як початкових (ДК, ТК, ОДК), так і кінцевих (МДА) продуктів ПОЛ у вищезазначених тварин був достовірно збільшеним, ніж у відповідному контролі (р<0,01 – р<0,001). Спостерігався сприятливий вплив терапії й на параметри АОЗ, більшою мірою у статевонезрілих тварин (відновлення ЗАА, ?-токоферолу, активності каталази). Слід наголосити, що ЗАА сироватки крові у статевозрілих нащадків, що отримували АОТ протягом препубертату, вірогідно вища, ніж у плацебо-груп (р<0,05) (за винятком групи самців “ГСД+стрес”), що свідчить про віддалені наслідки ранньої вітамінотерапії. Окрім цього, АОТ частково відновлювала інші показники антиоксидантного захисту у трьохмісячних щурів (?-токоферол у групі самців “Стрес” – до норми, активність каталази у самців груп “Стрес” та “ГСД+стрес” на 12 (р<0,02) та 21(р<0,01) відповідно, відносно плацебо, та ін.). Таким чином, комбінована антиок-сидантна терапія під час препубертату, що була проведена у нащадків стресованих матерів з нормальною або зниженою інсуліновою забезпеченістю, віддаляла строки виникнення та знижувала ступінь прояву глюкозної інтолерантності, функціональ-ної напруги панкреатичних бета-клітин, активації ліпопероксидації та дисбаланс системи антиоксидантного захисту у даних тварин, хоча і не виключала розвитку вищевказаних метаболічних порушень протягом онтогенезу.

Узагальнення результатів, отриманих під час оцінки різних режимів терапії, дозволяє констатувати, що превентивна антиоксидантна терапія протягом вагітності більш ефективно відвертає розвиток дисбалансу глюкозного гомеостазу та оксидативний стрес у нащадків (в порівнянні до комбінованої антиоксидантної вітамінотерапії протягом препубертату), тому що діє на момент закладки та формування цих метаболічних порушень.

висновки

1. У дисертації експериментально доведено наявність статевого диморфізму ефекту соціально-емоційного стресування щурів у ранній термін вагітності на індукований гестаційним діабетом метаболічний дисбаланс (глюкозна інтолерантність, оксидативний стрес) та напругу інсулінпродукуючого апарату у їх нащадків першого покоління.

2. соціально-емоційне стресування матерів у ранній період вагітності є діабетогенним чинником для нащадків першого покоління обох статей, оскільки призводить до глюкозної інтолерантності та активації ліпопероксидації в сироватці крові у самців з періоду пубертата, а у самиць - у молодому репродуктивному віці. материнський стрес за умов гестаційної інсулінової недостатності викликав більш виразне порушення глюкозної толерантності та зростання функціональної напруги бета-клітин підшлункової залози у нащадків-самців, порівняно до роздільного впливу модельних чинників.

3. соціально-емоційне стресування матерів у першому триместрі вагітності не спричиняло істотного підвищення інтенсивності перекисного окислювання ліпідів у печінці щурів-нащадків першого покоління при ізольованому моделюванні, але надавало потенцюючого впливу на підвищення активності ліпопероксидації в печінці, обумовлене гестаційною інсуліновою недостатністю, переважно у самців.

4. Моделювання в експериментальних тварин функціональної напруги систем, що забезпечують глюкозний гомеостаз та оксидативний стан організму (субдіабетогенна доза стрептозотоцину, стрес гіпокінезії) дозволили виявити знижені адаптаційні можливості у самців-нащадків стресованих матерів із гестаційною інсуліновою недостатністю. Разом з тим, стресування матері у першому триместрі вагітності за умов експериментального гестаційного діабету не виказувало аналогічного впливу на нащадків-самиць.

5. Застосування вітаміну Е (50 мг/кг маси тіла, per os) протягом перших двох триместрів вагітності у стресованих матерів із нормальною та зниженою інсуліновою забезпеченістю відвертало розвиток глюкозної інтолерантності, функціональну напругу бета-клітин підшлункової залози, підвищення ліпопе-роксидації та дисбаланс антиоксидантної системи захисту у нащадків першої генерації обох статей.

6. Комбінована антиоксидантна терапія в період препубертату, проведена у нащадків стресованих матерів із нормальною та зниженою інсуліновою забезпе-ченістю, віддаляла терміни виникнення і зменшувала ступінь виразності інтоле-рантності до глюкози, а також функціональну напругу бета-клітин підшлункової залози, хоча і не виключала розвитку вищеозначених метаболічних порушень протягом онтогенезу.

7. антиоксидантна терапія, проведена в період препубертату у нащадків матерів із гестаційною інсуліновою недостатністю, незалежно від наявності чи відсутності стресу в період вагітності, знижувала інтенсивність ліпопероксидації і частково відновлювала показники антиоксидантної системи захисту.

СПИСОК опублікованих ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.

2.

3.

4.

5.

6.