МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

ХАРКІВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Кащенко Світлана Аркадіївна

УДК: 611.71:611.41:611.428:611.438:612.017.1

ВЗАЄМОЗВ’ЯЗОК МОРФОГЕНЕЗУ КІСТКОВОГО СКЕЛЕТА

З ОРГАНАМИ ІМУННОЇ СИСТЕМИ ПРИ ІМУНОСТИМУЛЯЦІЇ

ТА ІМУНОСУПРЕСІЇ В ОНТОГЕНЕЗІ

(анатомо-експериментальне дослідження)

14.03.01 – нормальна анатомія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Харків – 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Луганському державному медичному університеті МОЗ України.

Науковий консультант: лауреат Державної премії України, заслужений діяч науки і техніки України, доктор медичних наук, професор Ковешніков Володимир Георгійович, Луганський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри нормальної анатомії людини.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Масловський Сергій Юрійович, Харківський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри гістології, цитології та ембріології;

заслужений діяч науки і техніки України, доктор медичних наук, професор Федонюк Ярослав Іванович, Тернопільська державна медична академія

ім. І. Горбачевського МОЗ України, завідувач кафедри анатомії людини;

доктор медичних наук, професор Волошин Микола Анатолійович, Запорізький державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри анатомії людини.

Провідна установа: Івано-Франківська державна медична академія

МОЗ України.

Захист відбудеться “_25_”_листопада 2004 р. об 11 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.600.03 при Харківському державному медичному університеті (61022, м. Харків-22, пр. Правди, 12).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Харківського державного медичного університету (61022, м. Харків, пр. Леніна,4).

Автореферат розісланий “_23_” жовтня 2004 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат медичних наук, доцент Терещенко А.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Останні роки характеризуються збільшенням питомої ваги патології опорно-рухового апарату. За даними Всесвітньої організації охорони здоров’я (ВООЗ), розміри економічного та морального збитків, що супроводжують численні захворювання опорно-рухового апарату, зростають з року в рік. На думку експертів ВООЗ, остеопороз займає третє місце після серцево-судинних захворювань та цукрового діабету в рейтингу основних медико-соціальних проблем сьогодення (Johnell O., 1997, Поворознюк В.В., 2003). З ініціативи ВООЗ, Європейської антиревматичної ліги й ініціативної групи ортопедів перша Декада третього тисячоріччя присвячена поглибленому вивченню патології кісток і суглобів (The Bone and Joint Decade, 2000 - 2010). Ідеї Декади привертають до себе увагу працівників охорони здоров'я, фахівців в області фундаментальних досліджень, морфологів і лікарів, що практикують.

За останнє десятиріччя посилився негативний вплив екологічно несприятливих факторів на функціональну активність імунної системи людей, що постійно проживають в умовах екологічно забруднених регіонів (Киреева И.С. и соавт., 1997; Фролов В.М., 1993, 2003). Погіршення екологічних умов, посилення стресорних впливів, зростання урбанізації супроводжується збільшенням кількості імунореактивних станів у населення (Арцимович Н.Г и соавт., 1994; Дранник Г.Н и соавт., 1994; Сепиашвили Р.И., 2003).

До теперішнього часу накопичений певний фактичний матеріал, що вказує на існування взаємозв'язку між кістковою та імунною системами (Гребнева О.Л. и соавт., 1997; Лаврентьева Т.П и соавт., 1997; Ивасенко І.Н., 1998; Бутенко Г.М., 1999; Ляшев Ю.Д., 2002; Kong Y., Yoshіda H., 1998; Kong Y. at all., 1999). Дослідження, що проводяться в даному напрямку, є пріоритетними й актуальними.

Кісткова система тісно пов'язана з нервовою (Маркова Е.В. и соавт., 2000), ендокринною (Корнева О.А., Шхинек Э.К., 1988; Поворознюк В.В., 2000; Дедух Н.В., Панков Е.Я., 2001) та імунною (Ковешников В.Г., Процайло М.Д., 1988; Делевский Ю.П. и соавт., 1999; Yasuda H., 1999) системами. Якщо роль нервової та ендокринної систем у функціонуванні кісткової тканини досить добре відома, то морфогенетичний вплив імунної системи на кісткову практично не вивчався. За сучасними даними тимус є органом імунологічного захисту, що забезпечує клітинний імунітет тваринних організмів і сприяє розвитку та прояву гуморального імунітету (Сапин М.Р., Этинген Л.Е., 1996; Ярилин А.А., Беляков И.М., 1996; Ярилин А.А., 2003). Разом з тим, у тимусі продукуються гормональні речовини, що не тільки стимулюють утворення Т-лімфоцитів, але і впливають на функцію багатьох органів за допомогою продукованих біологічно активних речовин.

Ряд клінічних та експериментальних досліджень попередніх років продемонстрували ефективність застосування лікарських препаратів, що впливають на імунітет, у тому числі на тимус, при лікуванні хворих із травмами або захворюваннями кісток скелета (Макарова Э.Б., 1993; Поворознюк В.В. и соавт., 1998; Зайдман А.М., Сигарева Н.А., 2000; Бутенко Г.М. и соавт., 2001; Малова Н.Г., Попов О.И., 2001; Хавинсон В.Х. и соавт., 2001). Але ці дані не внесли повної ясності в розв’язання проблеми взаємовідносин кісткової та імунної систем.

Морфологічні дослідження з вивчення кісткової системи констатують лише порушення швидкості росту кісток, яка виникає при тимектомії. У роботах цитованих авторів відсутні комплексні дані про закономірності морфофункціональних змін у кістковій системі й органах імунітету при різноманітних імунореактивних станах в онтогенезі. Немає досліджень, що вивчають особливості перебігу остеогенезу при імуностимуляції та імуносупресії. Будова окістя дотепер за таких умов також практично не вивчалася (Родионова Н.В., 1980; Мажуга П.М., Домашевская О.И., 1986, 1990). У літературі відсутні дані про закономірності морфофункціональних змін кісткових структур і органів імуногенезу при різноманітних імунореактивних станах у різні вікові періоди постнатального розвитку та при різних термінах спостереження. Особливої актуальності набуває вивчення структурної перебудови лімфоїдних органів та одночасне зіставлення виявлених у них змін з морфогенезом кісток. Можливість такого зіставлення пояснюється тим, що саме морфологічна перебудова лімфоїдних органів при зміні імунного статусу повинна передувати проявам якісних і кількісних ефектів клітинного та гуморального імунітету в організмі. При такому комплексному підході створюється можливість найбільш повно оцінити не тільки зміни, що відбуваються в органах імунної системи, але й провести кореляцію між змінами в тимусі, селезінці та лімфатичних вузлах, з одного боку, і в кістковій системі, з іншого. У літературі не міститься даних про комплексне дослідження, яке було проведене в цьому напрямку.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертаційна робота виконана згідно з планом наукових досліджень Луганського державного медичного університету та є складовою частиною науково-дослідних тем кафедри нормальної анатомії людини „Особливості росту, будови та формоутворень кісток скелета під впливом деяких зовнішньосередовищних та ендогенних чинників при різних фізіологічних станах організму” № держреєстрації 0199U001811, “Особливості морфогенезу кісткової, імунної та ендокринної систем під впливом екологічних чинників” № держреєстрації 0103U006652, „Взаємозв’язок морфогенезу кісткового скелета з органами імунної системи при імуностимуляції та імуносупресії” № державної реєстрації 01040004205. Автор брала участь у виконанні перших двох тем як виконавець, в останній роботі – як відповідальний виконавець.

Мета і задачі дослідження. Метою дослідження було встановлення залежності морфогенезу кісток скелета лабораторних щурів-самців різних вікових періодів від стану реактивності органів їхньої імунної системи при імуносупресії та імуностимуляції.

Для досягнення зазначеної мети необхідно було вирішити такі задачі:

1) вивчити особливості росту, будови, формоутворення, мінерального складу, міцносних властивостей кісток скелета й ультрамікроскопічних характеристик мінерального матриксу під впливом циклоферону, тимогену, циклофосфану та тимектомії у тварин різних періодів онтогенезу;

2) вивчити зміни в окісті великогомілкової кістки тварин різних вікових груп при імуносупресії та імуностимуляції;

3) вивчити макро- та мікроскопічні особливості будови тимуса, селезінки та пахвових лімфатичних вузлів щурів при різних імунореактивних станах організму;

4) виявити електронно-мікроскопічні особливості будови тимуса тварин репродуктивного віку при введенні тимогену, циклоферону та циклофосфану;

5) провести кореляційний аналіз між морфологічними компонентами органів імуногенезу та кісткової системи щурів при імуносупресії та імуностимуляції;

6) вивчити імунологічні, біохімічні та гормональні особливості крові щурів репродуктивного віку в експерименті;

7) виявити особливості перебігу пренатального остеогенезу в потомства, отриманого від тварин, що піддавалися перед спарюванням впливу циклофосфану, тимогену, циклоферону або тимектомії.

Об'єкт дослідження. Морфогенез кісткової системи під впливом змін в органах імунної системи щурів.

Предмет дослідження. Кістки скелета, тимус, селезінка, пахвові лімфатичні вузли, кров щурів.

Методи дослідження: остеометричний – для дослідження темпів росту та формоутворення кісток скелета; органометричний – для дослідження параметрів тимуса та селезінки; гістоморфометричний – для дослідження структури епіфізів, діафізів та окістя довгих трубчастих кісток, а також для оцінки стану морфо-функціональних зон органів імуногенезу; метод рентгеноструктурного аналізу – для дослідження ультраструктури мінерального матриксу кістки та кількісної оцінки етапів мінералізації; біохімічний (ваговий, фотоколориметрія, атомно-абсорбційна спектрофотометрія) – для оцінки мінерального, макро- та мікроелементного складу кістки; біомеханічне дослідження цільної кістки – для оцінки міцності кістки; електронно-мікроскопічний – для дослідження ультраструктури тимуса та оцінки його морфологічної перебудови; імунологічне дослідження крові – для моніторингу імунного статусу тварин; біохімічне дослідження крові для оцінки регуляторно - метаболічного профілю організму; дослідження рівня вмісту кортизолу, тироксину та трийодотироніну для оцінки гормонального стану тварин.

Наукова новизна отриманих результатів. У дослідженні вирішена актуальна наукова проблема щодо вивчення морфології кісткової системи.

Уперше встановлені закономірності змін макро- та мікроархітектоніки, мінерального складу, рентгеноструктурних та міцносних характеристик кісток скелета щурів різних вікових груп у різні терміни після імуностимуляції та імуносупресії.

Уперше в експерименті, виконаному за допомогою остеометричних, органометричних, гістоморфометричних, біохімічних, біомеханічних, імунологічних методів, а також методів рентгеноструктурного аналізу та електронної мікроскопії встановлені морфофункціональні особливості реалізації взаємодії кісткової та імунної систем, показані реальні ефекти такої взаємодії.

Уперше експериментально встановлено, що введення тимогену та циклоферону позитивно впливає на біомеханічні, морфометричні та гістологічні показники кісток щурів старечого віку.

Уперше проведене дослідження будови окістя довгих трубчастих кісток щурів різного віку при імуностимуляції та імуносупресії.

Уперше встановлені особливості перебігу остеогенезу в неонатальному та ранньому постнатальному періодах у потомства, отриманого від щурів, які перед спарюванням піддавалися впливу циклофосфану, тимогену, циклоферону та тимектомії.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані дані висвітлюють особливості морфогенезу кісток скелета тварин, а також закономірності впливу органів імунної системи на цей процес. Доповнено та розширено існуюче уявлення про зміни структури та мінерального складу кісток скелета при імуносупресії та імуностимуляції. Обґрунтовано доцільність корекції змін, що розвиваються в літньому віці у структурі кісткової тканини із застосуванням тимогену та циклоферону.

Проведене дослідження дозволило з’ясувати окремі ланки імунологічної регуляції гістогенезу кісткової тканини в онтогенезі. Отримані результати доповнили уявлення про морфологічні еквіваленти механізмів розвитку та реалізації імунної відповіді. Результати проведеного дослідження на статевонезрілих, репродуктивних та тварин старечого віку дозволяють рекомендувати застосування тимогену та циклоферону в комплексному лікуванні кісткової патології.

У зв'язку з тим, що застосування імуносупресивних впливів на організм батьків супроводжується порушеннями формування скелета плоду, пропонується з обережністю ставитися до призначення вагітним жінкам препаратів, здатних знижувати імунітет.

Отримані дані можуть бути рекомендовані в практичній роботі ортопедів-травматологів дитячої та вікової патології, імунологів, акушерів-гінекологів, гематологів, онкологів при проведенні заходів щодо лікування пацієнтів, які страждають різними формами захворювань, пов’язаними з порушенням імунологічного статусу. Результати дослідження можуть бути корисними для проведення стимуляції або пригнічення темпів росту кісткової тканини в клінічних умовах.

Пошукувачем отримано 6 деклараційних патентів України на винахід.

Теоретичні дані впроваджено в навчальний процес на кафедрах нормальної анатомії людини, оперативної хірургії та топографічної анатомії, нормальної фізіології Луганського державного медичного університету, на кафедрах анатомії людини Вінницького національного медичного університету, Буковинської та Дніпропетровської медичних академій, Кримського, Донецького, Одеського державних медичних університетів, на кафедрах оперативної хірургії та топографічної анатомії Кримського державного медичного університету та Буковинської медичної академії, на кафедрах анатомії людини, оперативної хірургії і гістології Ужгородського та Сумського державних університетів, на кафедрах гістології, цитології та ембріології Вінницького національного медичного університету та Тернопільської медичної академії.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно виконаний патентно-інформаційний пошук, визначені мета та задачі дослідження, методичні підходи, згідно з якими автором особисто виконані операційні втручання й експериментальні дослідження. Проведено статистичну обробку отриманих результатів, оформлення їх у вигляді таблиць, графіків, мікрофотографій, зроблено аналіз результатів, сформульовані основні положення та висновки роботи. Основним є участь автора в підготовці статей до друку та наукових розробок для оформлення Деклараційних патентів України в співавторстві. У тій частині актів упровадження, що стосуються наукової новизни, наводяться дані, що отримані автором у процесі виконання роботи.

Апробація результатів дослідження. Основні положення дисертаційного дослідження повідомлені на II, III, IV регіональних науково-практичних конференціях "Морфогенез та патологія кісткової системи в умовах промислового регіону" (Луганськ, 2001, 2002, 2003, 2004), на III Національному конгресі анатомів, гістологів, ембріологів та топографоанатомів України (Київ, 2002), на VI Конгресі Міжнародної асоціації морфологів (Уфа, 2002), на IX Конгресі світової федерації українських лікарських товариств (Луганськ-Київ-Чикаго 2002), на Міжнародній науково-практичній конференції “Кальцій-фосфорний гомеостаз та структурно-функціональний стан кісткової тканини в дітей та підлітків” (Євпаторія, 2001), на IV Українській науково-практичної конференції “Остеопороз: епідеміологія, клініка, діагностика, профілактика та лікування”(2001), на науково-практичній конференції “Ендокринний остеопороз: клініка, діагностика, профілактика та лікування” (Чернівці, 2002), на науково-практичній конференції “Актуальні проблеми геріатричної ортопедії” (Тернопіль, 2002), на I Міжрегіональній конференції молодих вчених: студентів, магістрантів, аспірантів, докторантів (Луганськ, 2003), на науково-практичній конференції морфологів „Роль імунної, ендокринної та нервової систем у процесах морфогенезу та регенерації” (Запоріжжя, 2003), на I Всеукраїнській науково-практичній конференції „Актуальні проблеми біомінералогії” (Луганськ, 2004), на V Міжнародному конгресі з інтегративної антропології (Вінниця, 2004), на VII Міжнародному конгресі міжнародної асоціації морфологів (Казань, 2004).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 49 наукових праць. Серед них 36 публікацій у наукових професійних виданнях, рекомендованих ВАК України, з яких 29 самостійних; 6 деклараційних патентів України на винахід; 7 тез у матеріалах конференцій, конгресів, з'їздів.

Структура та обсяг дисертації. Матеріали дисертаційної роботи викладено на 491 сторінці друкованого тексту, з яких власне тексту – 290 сторінок. Робота включає такі розділи: вступ, огляд літератури, матеріал і методи дослідження, результати дослідження, обговорення результатів дослідження та аналіз отриманих даних, висновки, перелік використаних першоджерел літератури, який містить 498 найменувань: 317 робіт вітчизняних авторів та 181 – іноземних. Дисертаційна робота ілюстрована 158 рисунками, 51 таблицею (обсяг 201 сторінка).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал та методи дослідження. Дослідження проведено на 845 білих щурах-самцях різних вікових груп, отриманих з віварію лабораторних тварин Луганського державного медичного університету. Експеримент проводився в осінньо-зимовий період року. При роботі з тваринами керувалися “Європейською конвенцією щодо захисту хребетних тварин, які використовуються з експериментальними та іншими науковими цілями” (Страсбург, 18.03.86 р.).

Проведено сім серій дослідів. Перші чотири серії присвячені дослідженню впливу тимектомії, впливу введення тимогену, циклофосфану та циклоферону на морфогенез кісток скелета та будову органів імунної системи тварин різних вікових груп. П’ята серія була присвячена вивченню впливу тимектомії, введенню циклофосфану, циклоферону та тимогену на внутрішньоутробний остеогенез у потомства. Шосту серію склали самки та самці, від яких отримували потомство для вивчення особливостей перебігу внутрішньоутробного остеогенезу та остеогенезу в ранньому постнатальному періоді. У сьомій серії проведено електронно-мікроскопічне дослідження тимуса статевозрілих щурів при різних умовах експерименту.

У кожній серії тварини були розподілені на групи залежно від тривалості спостереження. Контролем для тимектомованих тварин були самці з несправжньою тимектомією. Повноту видалення тимуса оцінювали візуально та гістологічним методом. Контролем для інших груп тварин були щури, яким вводили фізіологічний розчин в еквівалентних об’ємах.

Кров для імунологічного аналізу отримували в асептичних умовах з хвостової вени тварин, сироватку виготовляли шляхом центрифугування. Для оцінки імунологічної реактивності тварин визначали Т- та В- лімфоцити (Jondal M. at all., 1972; Zola H., 1977), ТФР-РОК і ТФЧ-РОК клітини (Limantibul F. at.all., I978). Підрахування “активних” розеткоутворюючих клітин: Е-РОК, Еакт-РОК, З-РОК, ауто-РОК проводили за методом Florey M., Peetom F. (1976).

У сироватці тварин визначали кількість кальцію, фосфору, натрію, хлору, калію, активність лужної фосфатази, кортизолу, трийодотироніну, тироксину (Горячковский А.М., 1998; Камышников В.C., 2000; Назаренко Г.И., Кишкун А.А., 2000). Усі біохімічні реакції виконані на біохімічному напівавтоматичному аналізаторі “Cormay Multi” №801260337. В експерименті були використані реактиви та контрольні сироватки HUMAN.

Імуносупресивний стан у тварин моделювали шляхом введення циклофосфану та видалення тимуса. Розрахунок дозування лікарських препаратів проводили з урахуванням рекомендацій Ю.Р. та Р.С. Риболовлєвих (1979). Формула розрахунку має такий вигляд:

,

де r - коефіцієнт видової витривалості для щура =3,62, R - для людини =0,57.

Циклофосфан інгібує розмноження та ріст клітин, пригнічує проліферацію лімфоцитарних клонів, у дозах до 5 мг/кг на добу препарат є цитотоксичним для В-лімфоцитів. Циклофосфан вводили тваринам щодня внутрішньоочеревинно в дозуванні 1 мг/кг маси протягом десяти днів.

Тимектомію робили щурам усіх вікових груп хірургічним способом. Під час операції користувалися спеціальним пінцетом з підсвітлюванням для локального освітлення операційного поля („Пінцет з підсвітлюванням” Деклараційний патент № 60696А). Обидві частки залози видаляли за допомогою пінцета для тимектомії у дрібних лабораторних тварин („Пінцет для тимектомії” Деклараційний патент 64156А). Усі оперативні втручання на тваринах виконані автором особисто.

Стимуляцію імунної системи проводили за допомогою тимогену та циклоферону. Тимоген вводили тваринам внутрішньоочеревинно в дозі 1мкг/кг маси тіла протягом десяти днів. Циклоферон вводили 1 раз на день в/м по 6мг/кг маси тіла за схемою (на 1,2,4,6,8,11,14,17,20,23 добу) (Метод.реком.МЗО Украины, 2000).

Після закінчення терміну спостереження тварин виводили з експерименту методом декапітації під ефірним наркозом. З огляду на наявність циркадних ритмів в лімфоїдних органах забій щурів проводився в той же самий час доби (Суслов А.П., Рябов Т.П., 1981; Баркова Э.Н. и соавт., 1992). Відразу після забою виділяли лімфоїдні органи (тимус, селезінку, пахвові лімфатичні вузли) за допомогою спеціального пінцета („Пінцет для екстракції щитоподібної залози у дрібних лабораторних тварин” Деклараційний патент 61509А), зважували на торзійних вагах, вимірювали і фіксували в 10% розчині нейтрального формаліну або в рідині Буена. При заборі, фіксації та подальшій обробці імунних органів користувалися положеннями, викладеними в Методичних рекомендаціях (Сапин М.Р. и соавт., 1990; Судзиловский Ф.В. и соавт., 1995). Парафінові зрізи товщиною 3-5 мкм забарвлювали гематоксилін-еозином, деталі гістологічної будови лімфоїдних органів вивчали за допомогою мікроскопа Olympus BX 41.

Морфометричне дослідження об’єктів проводили на комп’ютерному комплексі, до складу якого входять: мікроскоп Olympus BX-41, цифровий фотоапарат Olympus C 5050Z з п’ятимегапіксельною матрицею, персональний комп’ютер Athlon XP 2200+ Mh, DDR RAM 512 m, HDD 128 Gb, video: GeForce FX5200 128Mb, обладнаний платою відеозахоплення, з’єднаний з цифровою камерою за допомогою USB інтерфейсу та відеокабелю. Мікрофотографії отримували в декількох режимах збільшення: при об’єктиві Plan 4х 8/-, Plan 10х х/0.25 та Plan 40х х/0.65 ?/0.17.; використовували наближення об’єктива фотоапарата – Zoom 162. Для переведення піксельної системи координат у реальну використовували калібрувальний файл, за допомогою якого комп’ютерна програма видає розміри об’єктів у реальних величинах (мкм). Для отримання параметрів об’єктів одержані цифрові зображення завантажували в оригінальну комп’ютерну програму „Morpholog” (Овчаренко В.В., Маврич В.В., 2004). Отримані дані морфометричного дослідження експортувалися в програму Excel для статистичної обробки та збереження.

У тимусі визначали площу коркової та мозкової речовини (%). У селезінці, на фронтальних зрізах, зроблених на рівні її воріт, визначали розміри лімфатичних вузликів, діаметри їхніх гермінативних центрів, ширину крайової зони, площі білої та червоної пульпи (%). На подовжніх зрізах, що проходять крізь ворота пахвових лімфатичних вузлів, вимірювали максимальний і мінімальний діаметри лімфатичних вузликів, їхніх гермінативних центрів, ширину крайової зони, площу коркової речовини (%). Підрахунок проводився на всій площі препарату, аналізувалися шість зрізів з кожного об’єкта.

Для електронно-мікроскопічних досліджень шматочки тимуса розміром 1 мм3 занурювали в глутаральдегідний фіксатор за Карновським на 24 год., потім поміщали в 1% тетраксид осмію за Палладе на 1 год. Після дегідратації в етанолі зростаючої концентрації та абсолютному ацетоні матеріал заливали сумішшю епоксидних смол (епон-аралдіт). Полімеризацію проводили протягом 36 год. при 60єС. Ультратонкі зрізи виготовляли на ультрамікротомі УМТП–4 Сумського ВО “Електрон”, контрастували в розчині уранілацетату та цитрату свинцю за Рейнольдсом та переглядали в електронному мікроскопі ЕМ-125.

Тушки тварин I-IV серій експерименту скелетували з виділенням стегнових, великогомілкових, плечових, тім’яних, тазових кісток і III поперекового хребця. Кістки зважували на торзійних вагах з точністю до 1мг та вимірювали за методикою В.Г.Ковешнікова (2003) з точністю до 0,01мм. Для проведення наступного гістологічного дослідження проводили декальцинацію кісток у 5% розчині азотної кислоти. Потім виготовляли парафінові зрізи проксимального епіфіза та середини діафіза великогомілкових кісток товщиною 8-10 мкм. Зрізи забарвлювали гематоксилін-еозином, морфометричний аналіз препаратів діафіза, окістя та епіфізарного хряща проводили за допомогою вищеописаної комп’ютерної програми. При морфометрії епіфізарного хряща керувалися класифікацією В.Г.Ковешнікова (1980), визначали загальну ширину епіфізарного хряща та ширину його зон. Вираховували показники процентного співвідношення площ клітинних елементів і міжклітинної речовини в проліферативній зоні епіфізарного хряща, визначали процентну частку первинної спонгіози. За допомогою комп’ютерної системи проводили морфометричний аналіз хондроцитів проліферативної зони. У зоні первинного остеогенезу визначали щільність розташування остеобластів та остеокластів на площі 1мм2 та їхні розміри. При морфометрії діафіза вимірювали площу поперечного перетину кістковомозкової порожнини та компактної речовини, ширину зон зовнішніх і внутрішніх генеральних пластинок, ширину остеонного шару, діаметри остеонів та їхніх каналів, щільність розташування остеоцитів на площі 1мм2 в остеонному шарі.

Морфометричне дослідження окістя включало вимір його загальної товщини на рівні проксимального метафіза та середини діафіза великогомілкової кістки. Проводилося визначення товщини камбіального і волокнистого шарів окістя, обчислення середньої площі остеокластів, їхніх периметрів, максимального та мінімального радіусів клітин, щільність розташування остеобластів у камбіальному шарі.

Міцносні характеристики кісток оцінювались біомеханічним методом (Слесаренко Н.А. и соавт., 1998). Програма дослідження включала визначення міцносних властивостей плечової кістки при вигині на універсальній навантажувальній машині Р-0,5 з контрольованою швидкістю навантаження 0,25 мм/хв до руйнування (Ступаков Г.П., Воложин А.И., 1989; Ковешников В.Г., Лузин В.И., 2003). Розраховували межу міцності, модуль пружності, питому вагу прогину, роботу руйнування та руйнівного моменту.

Після звільнення кісток від параосальних тканин робили визначення вмісту води, органічних та мінеральних речовин ваговим методом (Воложин А.И., 1976). Досліджені кістки висушували до постійної ваги (t 105°С) та озоляли в муфельній печі (t 450-500°С) протягом 12 годин (Новиков Ю.В. и соавт., 1969; Егоров В.В. и соавт., 1993). Визначення макро- та мікроелементного складу кісткового порошку проводилося на атомно-абсорбційному спектрофотометрі C-115, досліджувався вміст Са, Мn, Mg, Zn, Cu, Fe. Визначення Na і K проводилося на полум’яному фотометрі типу ПФМ-4.2.У. Вимір вмісту P вивчався на фотоелектрокалориметрі ФЕК-56М.

Для дослідження ультраструктури мінерального компонента кістки використовували метод рентгеноструктурного аналізу (Подрушняк Е.П., Новохатский А.И., 1983). Аналіз кісткового порошку робили на рентгенівському дифрактометрі ДРОН-3 з гоніометричною приставкою ГУР-5. Використовували K випромінювання міді з довжиною хвилі 0,15433 нм, напруга складала 30 кВ, сила анодного струму – 20 мА. Дифраговані рентгенівські промені реєстрували в кутовому діапазоні від 2° до 37° зі швидкістю запису 1° за 1 хвилину. По кутовому положенню дифракційних піків розраховували параметри елементарної комірки гідроксіапатиту з урахуванням гексагональної сингонії кристалів (Горелик С.С. и соавт., 1970). Розміри кристалітів визначали за методом Селякова-Шерера.

Особливість перебігу пренатального остеогенезу вивчалася в потомства, одержаного від самок і самців щурів, що піддавалися перед спарюванням впливу циклофосфану, тимогену, циклоферону та тимектомії. Усього було вивчено 60 плодів (16, 21 доба) і 90 щурів (1, 7 доба постнатального періоду). Плоди витягали з матки, вимірювали розмір від тімені до куприка, фіксували в 96? спирті і 10% формаліні. Об’єкти, фіксовані в спирті, забарвлювали за методикою W.Dawson (1926). Об’єкти, фіксовані у формаліні, використовували для виготовлення гістотопограм.

Скелети плодів вивчали під стереомікроскопом МБС-1 при збільшенні х16. Реєстрували терміни появи, топографію та розміри точок скостеніння за методикою І.М.Акімової (1968).

Статистичну обробку даних досліджень проводили за допомогою пакета прикладних статистичних програм “Statistika 6.0 for Windows”. Вірогідність відмінностей середніх величин визначали за критерієм Стьюдента.

Результати дослідження та їх аналіз. Перша серія дослідження була присвячена вивченню основних закономірностей росту, будови, формоутворення, хімічного та мінерального складу, рентгеноструктурних характеристик, а також міцносних властивостей кісток у тимектомованих щурів трьох вікових груп. У тих же тварин вивчалися органометричні та морфометричні характеристики селезінки та пахвових лімфатичних вузлів. Як контроль використовувалися несправжньотимектомовані щури.

Отримані дані для несправжньооперованих тварин (контроль до тимектомії) і щурів, яким вводили фізіологічний розчин (контроль до введення тваринам циклофосфану, тимогену та циклоферону), практично цілком збігаються з даними літератури, що стосуються інтактних тварин: зі збільшенням віку щурів поступово сповільнюються темпи як подовжнього, так і поперечного росту їхніх кісток (Ковешников В.Г., 1989, 1993, 1994, 1998, 2000; Сокольников А.А. и соавт., 1992; Григорьев А.И. и соавт., 1994; Ковешников В.Г., Лузин В.И., 2000). При зміні темпів росту в кістках зменшується вміст води та органічних речовин, а також зростає частка мінерального компонента, у якому знижується концентрація натрію та калію і збільшується вміст кальцію, фосфору, магнію. Міцносні характеристики кісток зі збільшенням віку тварин також підсилюються (Шматков А.Е. и соавт., 2000; Ковешников В.Г., Лузин В.И., 2003). Зміни біомеханічних параметрів плечової кістки пов’язані зі збільшенням мінеральної насиченості кісткового матриксу.

Дані про будову та ультраструктурні параметри кристалів кісткового мінералу інтактних щурів у літературі зустрічаються в обмеженій кількості робіт (Лузин В.И., 1999). Використання методу рентгеноструктурного аналізу дозволило встановити, що зі збільшенням терміну спостереження розміри елементарного вмісту гідроксіапатиту зростають як уздовж осі С (від 6,874*

10-10М до 6,886*10-10М), так і вздовж осі А (від 9,419*10-10М до 9,440*10-10М). Співвідношення розмірів С/А у контрольних щурів змінюється в межах від 6,874 до 6,886. Розміри блоків когерентного розсіювання гідроксіапатиту у статевозрілих тварин варіюють від 24,802 нм (7доба) до 26,318 нм (180 доба). У зазначені вікові періоди динаміка кісткоутворення та резорбції, а також структурні зміни кісткової тканини перебігають з різною інтенсивністю.

Досліджені морфологічні параметри органів імунної системи контрольних тварин показують, що їх параметри надзвичайно лабільні та залежать від віку та застосованих впливів (Волошин Н.А., Григорьева Е.А., 2000). Структурні зміни тимуса, селезінки та лімфатичних вузлів є основним маркером порушень імунного статусу організму (Березина Е.А., 1981; Бородин Ю.И. и соавт., 1992). За нашими даними у щурів контрольної групи найбільшу площу перетину коркова речовина тимуса займає у тварин статевонезрілого віку - до 77%, у статевозрілих щурів – 71% – 74%, у тварин старечого віку – знижується до 58%. Максимальну абсолютну масу та лінійні розміри тимус має по досягненні щурами віку 4–5 місяців (457,01±6,47мг, 18,590,61мм – довжина, 8,550,08 мм – ширина, 3,540,04 мм – товщина частки), максимальну відносну масу - у віці 4–5 тижнів (2,15±0,07). Інволютивні процеси в тимусі мають прогресуючий характер, але цей орган не зникає навіть по досягненні тваринами періоду виражених старечих змін (Ярилин А.А., 2003; Consolini R., Legitimo A., 2000). Анатомічні особливості будови тимуса білих щурів досить близькі до описаних у літературі даних, що стосуються щурів Wistar, але відрізняються від параметрів для щурів Oxys (Маркова Е.В. и соавт., 2003). Селезінка білих щурів має індивідуальні морфометричні особливості функціонально активних зон, а також характерні морфологічні параметри. У статевонезрілих щурів контрольної групи (вік 4–5 тижнів) показник абсолютної маси органа має мінімальне значення (126,83±4,14 мг), а відносної маси – максимальне (4,34±0,14). Найбільша маса органа визначається по досягненні тваринами віку 12-18 місяців до 1000,33±23,24 мг, при цьому показник відносної маси знижується до 2,61±0,16. Площа перетину білої пульпи селезінки максимальна у статевонезрілих щурів (26,45±1,43%), потім вона знижується і складає у тварин старечого віку 12,86±0,93% від загальної площі зрізу. У лімфатичних фолікулах визначається тенденція до збільшення діаметрів від 348,21±2,32 мкм у статевонезрілих щурів до 421,55±10,86 мкм у щурів у віці 4-5 місяців.

Будову лімфатичних вузлів вивчено на мишах (Бородин Ю.И. и соавт., 1990), собаках (Кривский И.Л. и соавт., 1988; Щербакова Э.Г. и соавт., 1988; Головацкий А.С., 1990), лінійних щурах (Выренков Ю.Е. и соавт., 1995). Статті, у яких висвітлювалися б особливості будови лімфатичних вузлів у білих щурів, нечисленні (Долгова М.А., Надьярная Т.Н., 1991; Пристяжнюк И.Е., Горчаков В.Н., 1997; Морозова Е.В., 1998; Камышный А.М., 2000). У статевонезрілих щурів контрольної групи на частку коркової речовини припадає до 56,94±2,14% від загальної площі лімфатичного вузла. Зі збільшенням віку тварини частка коркової речовини зменшується до 37,14±3,93% у тварин у віці 12-18 місяців. Діаметри лімфатичних фолікулів, навпаки, поступово зростають від 259,46±2,77 мкм у статевонезрілому періоді тварин до 375,532,85 мкм – у статевозрілому. У старечому віці цей параметр знову зменшується до 258,68±3,65 мкм. Наявність великих центрів розмноження характерна для молодих тварин (189,81±1,98мкм), у статевозрілих і старих щурів цей параметр знижується майже у два рази. У більшій частині лімфатичних вузликів лімфатичного вузла тварин старечого віку гермінативні центри відсутні.

Відомо, що видалення тимуса в експерименті на тваринах супроводжується істотним ослабленням ростових ефектів СТГ, збільшенням вмісту ТТГ (Старкова Н.Т., 1996). Тимектомія також викликає ріст маси наднирників, що є ознакою підвищення секреторної активності коркової частини та супроводжується підвищеним виділенням глюкокортикоїдних гормонів (Хмельницкий О.К., Брежнева В.А., 1991). Найбільш істотним наслідком тимектомії в аспекті розглянутого питання є пригнічення росту кісток, що висвітлене в наукових публікаціях ряду авторів (Аверченко В.И., 1969; Ковешников В.Г., Процайло М.Д., 1988). Однак існуючої в них інформації не завжди достатньо для співставлення результатів різних досліджень між собою. Дані не всіх експериментів, проведених у цьому напрямку, подібні. Так, O. Kirkeby (1991) співставив результати визначення механічних властивостей, кровопостачання та рівня мінералізації кісток у тимектомованих та інтактних щурів Льюіс. Істотних розходжень між порівнюваними групами не виявлено. На підставі цього автором зроблено висновок про відсутність впливу тимектомії на будову, функцію та регенерацію кісток.

За остеометричними даними видалення тимуса у щурів викликає зниження ростової активності кісток скелета через 30 діб після операції у статевонезрілих та статевозрілих тварин. За допомогою морфометричного дослідження виявлено зменшення приросту подовжніх (на 4,46%-6,82%) та поперечних розмірів (на 3,58%-4,76%) досліджених кісток. Через 90 і 180 діб остеометричні параметри в піддослідних тварин, як і раніше, продовжують відставати в прирості від розмірів кісток щурів контрольних груп. У тварин старечого віку відмінності в остеометричних показниках у піддослідних та контрольних щурів протягом усього періоду спостереження не мають достовірного значення.

При описі будови епіфізарного хряща була використана класифікація його зональної будови, запропонована В.Г. Ковешніковим (1980). Морфометричний аналіз цієї ділянки кісток статевонезрілих і статевозрілих тимектомованих щурів показує, що ширина епіфізарного хряща в порівнянні з контролем має менші параметри, що багато в чому визначається зміною ширини зони проліферації. У свою чергу, зміна параметрів цієї зони пов’язана зі зменшенням щільності розташування хондроцитів до 4,02% (7 діб) на одиниці площі препарату з одного боку, з іншого боку це пояснюється деяким зменшенням розмірів клітин. Дана тенденція простежується у статевонезрілих та статевозрілих тварин протягом трьох місяців після операції. Остання обставина пояснюється тим, що в молодому віці організму процеси, пов’язані зі становленням Т-ланки імунної системи, практично цілком зосереджені в тимусі (Беляева И.В. и соавт., 1976).

Дослідження діафізів великогомілкових кісток показує, що після тимектомії відбувається відставання процесів перебудови грубоволокнистої кісткової тканини в пластинчасту як у статевонезрілих, так і в статевозрілих щурів. Площа поперечного перетину компактної речовини великогомілкової кістки щурів менша, ніж у групі контрольних тварин, від 4,34% до 15,79% у різні терміни спостереження. Знижена й щільність розташування остеоцитів в остеонному шарі діафіза на 6,66%–8,80%. У статевозрілих тварин у динаміці спостереження відхилення морфометричних параметрів мають подібну спрямованість, але трохи менший ступінь виразності. У щурів старечого віку істотних морфометричних відмінностей між групами контрольних і піддослідних щурів за даними остеометрії не встановлено.

Додатковими аргументами про негативний вплив тимектомії на ріст кісток у товщину є результати морфометричних змін окістя, що свідчать про зменшення її загальної товщини, щільності розташування остеобластів та їх попередників.

Дані рентгеноструктурного аналізу дозволили з’ясувати, що після тимектомії реєструється зміна кристалографічних показників гідроксіапатиту. Розміри елементарної комірки вздовж осей А та С у кістковому мінералі піддослідних тварин перевищують аналогічні параметри в контролі на 2,12 10-3-3,7 10-2% (по осі А) і 1,4 10-3%-8,7 10-3% (по осі С). Незважаючи на зміну лінійних розмірів елементарної комірки, коефіцієнт С/А змінюється незначно, що вказує на стабільність стану кристалів і характеризує ступінь симетрії елементарних комірок (Подрушняк Е.П., 1997). Розрахунки обсягів елементарних комірок і розмірів блоків когерентного розсіювання показують перевищення значень над аналогічними параметрами в контролі на 0,08%-0,86%, 5,62%-6,69% відповідно. За допомогою двофакторного аналізу встановлений значимий вплив фактора часу на розміри блоків когерентного розсіювання після тимектомії. Можна думати, що виявлені структурні зміни гідроксіапатиту сприяють зниженню активності метаболічних процесів, що, у свою чергу, відбивається на темпах росту кісток тварин.

Висока активність мінерального обміну та участь його в підтримці іонної рівноваги організму стала вагомим аргументом для дослідження хімічного складу кісток з аналізом вмісту основних макро- та мікроелементів (Скоблин А.П., Белоус А.М., 1968; Скальний А.В., 1999). При імуносупресії, яка викликана тимектомією, з поверхні кристалічних ґраток кісткового мінералу виводяться іони Ca, P і Mg. Це призводить до зниження мінеральної насиченості кісток у тимектомованих тварин у статевонезрілому та статевозрілому віці. У статевонезрілих щурів демінералізація на 180-у добу спостереження складає 5,61%, у статевозрілих–8,74%. Втрата Ca і P у тварин репродуктивного віку досягає 3,84% і 5,83%. До цього ж терміну спостереження у тварин даного віку відзначається надлишкове накопичення Na і K на 6,21% і 12,84% відповідно, а також дефіцит Mg на 6,49%. Цинк не тільки виявляє остеотропні властивості, а також є одним з важливих складових елементів, що впливають на активність імунної системи (Григорьев А.И. и соавт., 1994; Сергеев П.В. и соавт., 2000; Скальный А.В., Кудрин А.В., 2000). Вплив цинку на Т–лімфоцити відомий тим, що він входить до складу одного з гормонів тимуса – тимуліну, з яким пов’язують дозрівання та диференціацію Т-клітин (Prasad A. at all., 1988). Вміст Zn знижується від 17,98% до 26,75% у пізні терміни після видалення тимуса. Негативний баланс відзначений і у вмісті міді (7,65%–9,94%). При цьому у тварин старечого віку процес дегідратації і втрати неорганічних елементів відбувається в порівняно уповільненому темпі з молодими щурами.

Серед тестів, що дозволяють об’єктизувати рівень метаболічних реакцій в організмі тварин, особливе місце займає сироваткова лужна фосфатаза, що відбиває функціональний стан остеобластів (Ляшенко А.А., Уваров В.Ю., 2001). Істотне значення має також рівень вмісту гормонів щитоподібної залози та коркової речовини наднирків. Після тимектомії активність лужної фосфатази тривалий час (90 діб) залишається підвищеною (від 9,51% до 30,45%), що свідчить про деструктивні процеси в кістковій системі (Камышников В.С., 2000). Вміст кортизолу в тимектомованих щурів перевищує контрольні значення від 7-ої до 90-ої доби спостереження, що є свідченням антагоністичних відносин тимуса та наднирників (Чеснокова В.М. и соавт., 1983; Хмельницький О.К. и соавт., 1991). Відомо, що підвищення рівня глюкокортикоїдних гормонів забезпечує специфічність імунної відповіді, тому що вони пригнічують малодиференційовані лімфоцити, що мають низьку афінність до антигену (Оськина И.Н. и соавт., 2003). У той же час рівень йодовмісних гормонів, навпаки, знижується, що підтверджує узгодженість зміни в ступені активності тимуса та щитоподібної залози (Старкова Н.Т., 1996). Про розвиток деструктивних процесів у кістковій тканині, викликаних дисбалансом імунної системи, свідчить підвищення в сироватці крові рівня кальцію (на 9,35%) і фосфору (на 8,08%).

У тимектомованих тварин біомеханічні властивості трубчастих кісток знижені. Зокрема, показник межі міцності відрізняється від контрольного найбільш істотно у статевонезрілих щурів (6,53%–27,88%), трохи менше виражені відмінності у статевозрілих тварин (5,89%–9,09%) і, нарешті, у старих щурів – відхилення не перевищує 5,51%.

Після видалення тимуса периферичні органи імунної системи стають основною базою для забезпечення адекватного імунного захисту організму. З літератури відомо, що тимектомія в дорослих тварин призводить до накопичення неспецифічних Т-супресорів у перші 4 - 5 тижнів за рахунок відсутності тимічного гуморального фактора та порушення диференціації Т-лімфоцитів (Ковальчук Л.В. и соавт., 1995). У тимектомованих статевонезрілих тварин маса селезінки вірогідно збільшується (7–90 добу). Розміри лімфатичних вузликів білої пульпи перевищують контрольні показники на 52,10%–60,61% переважно в початкові терміни спостереження. Незважаючи на це, площа перетину білої пульпи селезінки зменшена. Подібна динаміка морфометричних параметрів селезінки відображає дефіцит надходження лімфоцитів і тимічних гормонів