ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ім. В.Н. КАРАЗІНА
КРАСНОКУТСЬКИЙ Сергій Анатолійович
УДК 577.113:541.49
Молекулярна структура мономерних фрагментів нуклеїнових кислот, ізольованих у низькотемпературних інертних матрицях
03.00.02 – біофізика
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата фізико-математичних наук
Харків - 2004
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Фізико-технічному інституті низьких температур ім. Б.І. Вєркіна Національної Академії Наук України.
Науковий керівник: доктор фізико-математичних наук, професор
Благой Юрій Павлович,
Фізико-технічний інститут низьких температур
ім. Б.І. Вєркіна НАН України, м. Харків,
головний науковий співробітник
Офіційні опоненти:
-
доктор фізико-математичних наук,
Семенов Михайло Олексійович, Інститут радіофізики та електронікі ім. А.Я.Усікова НАН України, провідний науковий співробітник (м. Харків);
-
кандидат фізико-математичних наук, доцент,
Зав'ялова Оксана Стефанiвна, Севастопольський національний технічний університет, доцент кафедри фізики (м. Севастополь);
Провідна установа
Інститут фізики НАН України, відділ фізики біологічних систем, м. Київ.
Захист відбудеться 25.06.2004р. о 15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.113 у Харківському національному університеті ім. В.Н. Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. 7-4.
З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.
Автореферат розісланий 18.05.2004 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради С.В. Гаташ
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Структурні компоненти ДНК - канонічні нуклеозиди та їх модифіковані аналоги широко досліджуються у зв'язку з перспективою регулювання генної експресії. Відомо, що неканонічні нуклеозиди мають високу спорідненість до нативних нуклеїнових кислот, завдяки чому використовуються як високоселективні лікарські препарати з антивірусною та протипухлинною активністю, а також в інших біотехнологічних напрямах.
Структура і конформації нуклеозидів, й насамперед утворюючих їх молекул азотистих основ та цукрів, широко досліджувались різноманітними методиками: рентгеноструктурним аналізом, методом нейтронної дифракції та за допомогою ЯМР-спектроскопії. Ці дослідження показали, що молекули нуклеозидів мають високу конформаційну рухомість, особливо в області цукрового залишку. Слід звернути увагу на те, що конформаційна лабільність цих молекул виявляється як в кристалевому стані, так і в розчинах, й залежить від цілого ряду параметрів: від температури, від умов росту кристалу, від природи розчинника й багатьох інших факторів. Таким чином, для адекватного розуміння механізмів та кінетики біологічно важливих реакцій, пов'язаних із зміною геометрії нуклеозидів, лише подібних експериментальних даних недостатньо. Виникає очевидна необхідність в отриманні достовірних даних про конформацію нуклеозидів у вільному стані. Це дозволить реально оцінити вплив зовнішніх факторів на конформаційні властивості того чи іншого нуклеозиду як структурної одиниці біологічної системи. Щодо теоретичних досліджень, то, згідно з сучасними літературними даними, їх результати дуже часто не співпадають, оскільки вони залежать як від метода квантово-хімічних розрахунків, так й від вибору початкових параметрів. У зв'язку з цим особливого інтересу набувають експериментальні дослідження конформації канонічних нуклеозидів та їх модифікованих аналогів в ізольованому стані, а також співставлення цих даних з результатами розрахунків на досить високому рівні квантово-хімічної теорії.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась у відділі молекулярної біофізики ФТІНТ НАН України відповідно до плану науково-дослідних робіт за темою “Вивчення впливу міжмолекулярних взаємодій на структуру та властивості комплексів нуклеїнових кислот з біологічно активними речовинами із застосуванням низькотемпературних фізичних методик” (номер держ. реєстр. № 0100U004484).
Мета і задачі дослідження. Метою дослідження було встановлення конформації нуклеозидів, а також нового нуклеозидного аналогу, що має високу антивірусну активність, сінцитолу. Для досягнення цієї мети були вирішені такі задачі:
1.
Дослідження методом Фур’є-спектроскопії матричної ізоляції молекулярної структури нуклеозидних фрагментів: азотистих основ (1-метилурацилу та 1-метилтиміну) та цукрів (рибози та 2_дезоксірибози).
2.
Квантово-хімічні розрахунки геометричних параметрів та коливальних спектрів азотистих основ та цукрів методами HF/3-21G*, МР2/3-21G*, HF/6-31G**, MP2/6-31G**.
3.
Встановлення методом Фур’є-спектроскопії матричної ізоляції молекулярної структури ізольованого стану нуклеозидів: тимідину та уридину.
4.
Квантово-хімічний аналіз конформаційної рівноваги нуклеозидів за методами HF/3-21G*, HF/6-31G**, MP2/6-31G**.
5.
Оцінка шляхом співставлення експериментальних та теоретичних результатів процентного співвідношення та термодинамічних параметрів різних конформерів для всіх молекул, що вивчалися, в ізольованому стані.
6.
Дослідження конформації нового нуклеозидного лікарського препарату з антивірусною та протипухлинною активністю – сінцитолу методом Фур’є-спектроскопії матричної ізоляції та за допомогою розрахункових методик HF/3-21G*, HF/6-31G**, MP2/6-31G**, з застосуванням отриманих результатів про конформацію канонічних нуклеозидів.
Об’єкт дослідження – нуклеозиди: тимідин, 2’-дезоксіуридин, уридин; модифікований нуклеозид з антивірусною та протипухлинною активністю – сінцитол; цукри: рибоза, 2-дезоксірибоза; азотисті основи: 1-метил-урацил, 1-метил-тимін.
Предмет дослідження – конформації структурних компонентів нуклеїнових кислот в ізольованому стані та їх термодинамічні параметри.
Методи дослідження – ІК Фур’є-спектроскопія матричної ізоляції та квантово-хімічні розрахунки методами Хартрі-Фока та Мюлера-Плесета. Конформаційну рівновагу біомолекул було досліджено на підставі порівняльного аналізу експериментальних та теоретичних результатів.
Наукова новизна одержаних результатів.
1.
Вперше отримано інфрачервоні Фур’є-спектри матрично-ізольованих молекул, таких як рибоза, 2-дезоксірибоза, тимідин та уридин.
2.
На основі зіставлення з експериментальними даними про ізольований стан молекул, що досліджувались, вперше проведено їх докладне квантово-хімічне моделювання.
3.
Для всіх молекул, що вивчались, в ізольованому стані визначено процентне співвідношення різних конформерів та їх термодинамічні параметри.
4.
Вперше встановлено, що в ізольованому стані син-конформація пиримідинових нуклеозидів, що досліджувались, стабілізована внутрішньомолекулярним водневим зв’язком О5'Н…О2, а анти- конформація уридину стабілізована водневим зв’язком О2'Н…О2.
5.
Запропоновано модель антивірусної дії нового нуклеозидного аналогу –сінцитолу.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані в роботі експериментальні та теоретичні дані можуть використовуватись при розробці антивірусних лікарських препаратів на основі нуклеозидів.
Отримані кількісні спектральні характеристики та термодинамічні параметри можуть використовуватись для аналізу можливостей сучасних квантово-хімічних програм, розрахунків та моделювання процесів внутрішньо- та міжмолекулярних взаємодій.
Особистий внесок здобувача. В опублікованих із співавторами наукових працях особистий внесок здобувача полягає в наступному:
у роботах [1,3,6-13] – участь у постанові задачи, аналіз літературних та експериментальних даних; у роботах [1-3,5-13] – участь в одержанні ІК Фур’є-спектрів матрично ізольованих зразків, участь в обробці отриманих експериментальних даних; у роботах [1-4,6-14] – участь у виборі обчислювальних методів та проведення квантово-хімічних розрахунків методами Хартрі-Фока та Мюлера-Плесета з застосуванням різноманітних базисів, а також участь в обговоренні отриманих результатів; у роботах [1-3,6-14] – участь у розробці нового більш ефективного випарувального пристрою.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались і обговорювались на II Конгресі Українського біофізичного Товариства, 1998, Kharkov-Ukraine; Міжнародній конференціі “Водневий зв’язок”, 1998 Київ, Україна; XXIV European Congress on Molecular Spectroscopy Prague, Czech Republic 1998; The XIV International School-Seminar “Spectroscopy of molecules and crystals”, Odessa, Ukraine, 1999; XIIIth Conference-Workshop Horizons in Hydrogen Bond Research Swieradуw Zdrуj, Poland 1999; 8th Conference on the Spectroscopy of Biological Molecules, Netherlands 1999; "Molecules of Biological Interest in the Gas Phase" Les Houches, France 2000; Summer School on Nucleic Acids Chemistry: Oligonucleotides and Analogues - Synthesis, Structure and Properties (Kollekolle, Denmark, 1999); RECOMB 2000, Japan, “MATRIX 2001”; Szklarska Poreba, Poland 2001; XVI International School-Seminar, Sevastopol, Ukraine 2003.
Публікації. Основні результати роботи опубліковані в 14 наукових працях, у тому числі в 5 статтях у наукових журналах та в 9 тезах доповідей на національних і міжнародних конференціях та з'їздах.
Структура й обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, п'ятьох розділів, висновків та додатків. Повний обсяг дисертації складає 115 сторінок, додатки займають 15 сторінок. Робота містить 45 рисунків і 12 таблиць (на окремих сторінках немає). Список використаних джерел (173 найменувань) займає 20 сторінок.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
У вступі обґрунтовано актуальність обраної теми, сформульовано мету досліджень та задачі, що необхідно вирішити для її досягнення, визначено наукову новизну та практичну цінність отриманих результатів, наведено загальну структуру дисертаційної роботи.
У розділі 1 проведено аналіз літературних даних, що відображають сучасні уявлення про молекулярну структуру компонентів нуклеїнових кислот та методи ії дослідження. Надано номенклатурні характеристики конформаційного аналізу цих компонентів. Наведено результати конформаційного дослідження таких молекул, що знаходяться у різних експериментальних умовах: в різноманітних розчинниках або ж у кристалічному стані. Увага спрямована на те, що отримані результати дуже часто не співпадають, а іноді можуть бути діаметрально протилежними, оскільки вони залежать не тільки від температурних факторів, але ж й від природи розчинників, що вживаються, або від умов зросту кристалів. Зроблено висновок про необхідність дослідження біомолекул у ізольованому стані, що надасть можливість виявити вплив середовища на геометрію молекул та адекватно використовувати сучасні різноманітні експериментальні дані для оцінки конформації структурних одиниць нуклеїнових кислот в умовах in vivo.
Далі розглядаються та порівнюються усі сучасні методи дослідження конформації біомолекул у ізольованому стані. Підкреслюється, що дуже важко отримати ізольований стан біологічно важливих речовин, оскільки вони не розчиняються у неполярних розчинниках, а їх переведення до ізольованого стану пов’язане із випаруванням цих термонестійких молекул. Доведено, що метод матричної ізоляції є водночас найбільш простим та досить інформативним методом дослідження конформації біомолекул в ізольованому стані.
У розділі 2 розглядається методика експерименту та квантово-хімічних розрахунків, а також надано характеристику об’єктів дослідження.
Спектри поглинання були отримані на модернізованому (Іванов О.Ю.,1995-99р.) Фур’є-спектрометрі ФС-01 (розробленому Центральним конструкторським бюро унікального приладобудування, м. Москва). Застосування Фур’є-спектрометру дозволило отримати спектри з розділенням 0,24 см-1 і прецизійністю у вимірюванні частоти – 0,02 см-1. Матричний пристрій збудовано (Іванов О.Ю.,1995-99 р.) на основі Не кріостату Р118 (ФТІНТ НАН України, м. Харків). Для ультрафіолетового опромінювання зразків було застосовано дейтерієву лампу від спектрофотометра “Хітачи”. Для контролю за молекулярними потоками вживали кварцеві мікроваги.
Для випарування термонестійких біомолекул за допомогою комп’ютерного моделювання було розроблено нову випарувальну комірку. Інтенсивність молекулярних потоків із нової комірки у 100 разів перевищувала інтенсивність із старої комірки при однакових температурах випарування. Це дозволило провести дослідження таких термонестійких молекул, як нуклеозиди та цукри, без їх терморозкладу.
Для порівняння з експериментальними даними було проведено квантово-хімічні розрахунки молекулярної структури та коливальних спектрів молекул, що досліджувались. Для розрахунків застосовували вільно поширювану програму “GAMESS“. Розрахунки проводили за методом Хартрі-Фока (HF) та за теорією Мюлера-Плесета для врахування електронної кореляції (MP2), з застосуванням базисів 3-21G* та 6-31G**.
У розділі 3 наведено результати досліджень конформаційного стану ізольованих молекул цукрів та азотистих основ нуклеїнових кислот. Шляхом порівняння спектрів, що отримані у різних матрицях, показано, що матриця не впливає на конформаційну заселеність
Рис. 1. Спектральні смуги валентних ОН коливань 2-дезоксірибози в Ar и Ne матрицях. M/S=600 для Ne и M/S=900 для Ar матриць.
Рис. 2. Вплив відпалу матриці на спектр валентних ОН коливань 2-дезоксірибози в Ar матриці (12 К). 1 – перед відпалом. 2-після відпалу при 30 К, t=5 хв.
конформерів (Рис. 1.). Відпал матриці також не вносить суттєвої зміни в спектри, простежується лише звуження спектральних смуг (Рис. 2). Це свідчить про те, що нижня межа енергетичних бар’єрів поміж конформерами становить 2,5 ккал/моль. Також ми можемо
Рис. 3. Зіставлення спектрів 2-дезоксірибози, що отримані при температурах випарування: 1 - 40°С та 2 - 85°С, 3 – різницевий спектр (2 – 1).
стверджувати, що в матриці присутні такі ж конформери, що й у газовій фазі. Велика кількість смуг у спектрі свідчить про конформаційну рухомість цих молекул. Те ж саме продемонстрували й квантово-хімічні розрахунки, які виявили понад чотирнадцять локальних мінімумів в молекулярній структурі 2-дезоксірибози. Однак, базуючись тільки на квантово-хімічних розрахунках, зробити адекватний вибір конформерів неможливо, оскільки їх енергії можуть дуже різнитися від одного метода до іншого. Тому для порівняння з експериментом були розраховані інфрачервоні коливальні спектри. Базуючись на порівнянні розрахованих та експериментальних спектрів, було знайдено, що для фуранозних структур найбільшу кількість у матриці мають три конформери 1 2, 3. Також було встановлено, що найбільш сильним внутрішньомолекулярним водневим зв’язком є O1H…O5 у конформері 1 та O5H…O1 у 2. Шляхом застосування різних температур випарування ми намагались зсунути конформаційну рівновагу (Рис. 3.).
Рис. 4. Спектральні смуги валентних NН, коливань 1-метил-урацилу: 1 - Ar матриця 12K, концентрація –1:700. 2 – спектр після відпалу матриці при 25 К. 3 – різницевий спектр 2 - 1 у маштабі (х2), 4 -спектр 1-метил-тиміну.
Але з підвищенням температури випарування простежувалось підвищення інтенсивності двох смуг: вузької смуги 3573 см-1 та широкої - 3517 см-1. Ці смуги були віднесені до дімеру та тримеру води, відповідно. Таким чином, зміна температури випарування не приводить до зсуву конформаційної рівноваги. Зсунення конформаційної рівноваги також не було зафіксовано після ультрафіолетового опромінювання молекул. Це свідчить про те, що основні конформери, які присутні в матриці, мають близькі значення енергії.
Для порівняння з нуклеозидами були отримані матричні спектри метилованих основ: 1-метил-урацил, 1-метил-тимін. Оскільки ці молекули являють собою моделі нуклеозидів, то на цей час існує багато робіт щодо їх молекулярної структури. Але ми змогли отримати спектри цих молекул з більш високою якістю, що надало нам можливості ідентифікувати нові спектральні смуги. На рисунку 4 показано спектри 1-метил-урацилу та 1-метил-тиміну в області поглинання NН. Слід відзначити, що особливістю валентного коливання N3Н 1-метил-урацилу є присутність двох близьких смуг поглинання. Природу слабкої високочастотної смуги поглинання 3462 см-1 досі не було встановлено. Відпал матриці показав, що інтенсивність слабкої смуги змінюється
Співвідношення
інтенсивностей | Експеримент
Ar матриця | HF/3-21G* | MP2/ 3-21G** | HF/6-31G** | MP2/6-31G**
I(NH)/ I(CH) | 16,5 | 16,7 | 8,2 | 15,1 | 9,17
I(NH)/I(Me) | 3,9 | 1,7 | 1,1 | 1,4 | 1,82
I(C6H)/I(C5H) | 1,3 | 2 | 9,2 | 6,1 | 8,6
синхронно з такою ж для смуг коливань N3Н, С2Н та С4Н. Було показано, що смуга 3462 см-1 відноситься до другого обертону коливання С2О, інтенсивність якого підвищена через Фермі-резонанс з коливанням N3Н. Таким чином, реальна інтенсивність коливання N3Н є сумою смуг 3428,6 см-1 та 3462 см-1. Для області коливань С5Н, С6Н молекули 1-метил-урацилу також можна спостерігати Фермі резонанс (Рис. 5). Оскільки інтенсивність смуг в цій області дуже мала,
Рис. 5. Спектральні смуги коливань C5Н, C6Н 1-метил-урацилу: 1 - Ar матриця 12K, концентрація –1:700. 2–різниця спектрів після відпалу матриці при 25 К і перед ним.
вплив смуг, що відносяться до коливань полімерних структур, може бути суттєвим. З метою виявлення смуг, які відносяться до полімерів, був проведений відпал матриці. Різниця спектрів показує, що смуги полімерів знаходяться у більш червоній області спектру, та їхня інтенсивність дуже мала у першому спектрі. Завдяки цьому можна отримати інтенсивності коливань С5Н та С6Н, що дорівнюють сумі інтенсивностей розщеплених смуг. Те ж саме спостерігається для коливань метильної групи: ми маємо п’ять смуг у спектрі замість трьох, що передбачені розрахунками. Квантово-хімічні розрахунки завищують частоти та інтенсивності коливання. Тому для отримання їх реальних значень було проведено шкалювання. Порівняння різних методів розрахунків (Таб.1), що були проведені для цієї молекули, визначили, що найкращий збіг з експериментом за співвідношеннями інтенсивностей коливань дає метод HF з базисом 3-21G*. Отримані дані дозволили перейти до вивчення більш складних молекул, таких як нуклеозиди.
У розділі 4 наведені дані про дослідження конформації канонічних нуклеозидів тимидину, 2’- дезоксіуридину та уридину.
Рис. 6. Спектральні смуги валентних коливань nNН, nOH: 1) 2’-дезоксіуридину (Іванов А.Ю., та ін. 2002), 2) тимідину, 3) 1-метил-урацилу, 4) 1-метил-тиміну, співвідношення М/O > 800/1.
Було встановлено, що найбільш інформативною областю для виявлення внутрішньо-молекулярних водневих зв’язків є область ОН, NH коливань (Рис. 6). Коливання NH у цій області практично не змінює частоти, тому його легко ідентифікувати у спектрах нуклеозидів. Усі інші смуги поглинання належать гідроксильним групам цукрового кільця. Для тимідину та 2’_дезоксіуридину ми маємо дві ОН групи та чотири смуги у спектрі. Підвищення кількості смуг пояснюється наявністю різних молекулярних структур. Ми розрахували шість основних конформаційних типів цих молекул (Рис. 7). Ці структури були стабільними для всіх методів та базисів розрахунку. Вибір цих конформацій був обумовлений можливостями утворення тих або інших внутрішньомолекулярних водневих зв’язків, оскільки цей зв’язок ми можемо визначати в експерименті. Також враховано лише основні конформації цукру у нуклеозиді: C3'-ендо та C2'-ендо. Експерименти із зміною матриці показали, що отримані спектральні характеристики не залежать від типу застосованої матриці. Таким чином, було виявлено, що матриця не впливає на конформацію нуклеозідів. Для адекватного віднесення смуг у інфрачервоному спектрі було проведено теоретичне моделювання коливального спектру. Завищення частот у квантово-хімічних розрахунках було враховано завдяки застосуванню єдиного коефіцієнту для NH, OH області k=O5'Hексп./O5'Hрозр.=0,8757. Було також показано, що метод HF/3-21G* дає малі значення довжини внутрішньомолекулярного водневого зв’язку і тим самим дуже завищує його силу. Більш точні методи HF/6-31G** та MP2/6-31G** дають більш реальні значення для параметрів водневого зв’язку. Однак відношення інтенсивностей коливань для методу HF/3-21G* більш узгоджуються з
Рис. 7. Конформаційні структури 2'-дезоксіуридину та тимідину. Скорочення R=H - для 2'-дезоксіуридину, R=CH3 - для тимідину. Внутрішньомолекулярні водневі зв’язки надані пунктиром.
експериментом. Базуючись на порівнянні експериментального та теоретичного спектрів, встановлено, що заселеність конформації Х_s1 дуже низька. Також було показано, що анти конформери домінують у матриці. Однак конформери Х_a0, Х_a1 не відрізняються в області ОН коливань. Тому розглянуто область СН коливань (Рис. 8), де ці конформери повинні мати відмінності. Базуючись на порівнянні спектрів різних молекул, ми віднесли смугу 3102 см-1 до С5Н коливання у молекулах тимідину та 2'-дезоксіуридину. Розрахунки свідчать про те, що коливання nC6H у конформері X_a1 має інтенсивність у десять разів більшу, ніж інтенсивність коливання С5Н. У експериментальному спектрі ми спостерігаємо протилежну картину: інтенсивність коливання С5Н перевищує інтенсивність коливання С6Н. Однак підвищення
Рис. 8. Спектральні смуги валентних коливань nC5H, C6H (3140-3040 cм-1) 2’-дезоксіуридину (Іванов О.Ю., та ін. 2002), 2) тимідину, 3) 1-метил-урацилу, ізольованих у аргоновій матриці (T=12K, M/О=700).
інтенсивності смуги С5Н у спектрі може пояснюватись перекриттям смуг коливань різних конформерів, тому заселеністю конформеру X_a1 ми не можемо нехтувати. Для коливань груп СН та СН2 цукрового кільця ми спостерігаємо Фермі-резонанс та перекриття смуг коливань різних конформерів. Те ж саме спостерігається і для області деформаційних коливань. Таким чином, ці області не можна використовувати для конформаційного аналізу, але вони становлять певний інтерес для спектроскопії. Розрахунки вказують на домінування син конформера
Тип конформеру
Метод розрахунку | a0 | а1 | a2 | a3 | S1 | s2
HF/3-21G(p)A | 5,0 | 2,0 | 2,4 | 4,4 | 3,1 | 0
HF/3-21G(p)B | 5,4 | 2,4 | 2,7 | 5,7 | 3,3 | 0
HF/6-31G(d,p)A | 2,7 | 1,3 | 1,4 | 3,1 | 1,5 | 0
HF/6-31G(d,p)B | 2,9 | 1,6 | 1,8 | 5,0 | 1,6 | 0
MP2/6-31G(d,p)A | 5,6 | 2,8 | 3,6 | 4,8 | 2,7 | 0
G (298K)A
MP2/6-31G(d,p) | 3,4 | 1,7 | 2,4 | 3,8 | 1,9 | 0
G (420K)A
MP2/6-31G(d,p) | 2,8 | 1,4 | 2,1 | 3,4 | 1,6 | 0
G (420K)B
HF/6-31G(d,p) | 0 | 0,1 | 0,3 | 4,3 | 0,6 | 0
G (420K)A
Експеримент | 0 | - | 1,8 | 2,2 | - | 1,1
G (420K)B
Експеримент | - | 0 | 1,3 | - | - | 1,2
X_s1, але з підвищенням температури коливальний внесок значно зменшує різницю в енергіях поміж конформерами. Різницю енергій Гібса ми розраховували за формулою:
,
де КАВ - константа рівноваги конформерів, яка встановлюється у
Рис. 9. Порівнювання спектрів тимідину (1) та уридину (2) в NH и OH області, Ar матриця.
Рис. 10. Спектральні смуги коливань nC5H, C6H. 1) 2-дезоксіуридин (Іванов О.Ю., та ін. 2002), 2) тимідин, 3) уридин, ізольований у аргоновій матриці.
експерименті як співвідношення заселеностей конформерів А та В. Для зсуву конформаційної рівноваги використовувалося ультрафіолетове опромінювання. Результати цього експерименту (а саме співвідношення коефіцієнтів молярної екстінкції смуг поглинання) добре корелюють з результатами, що були отримані із застосуванням інших методик. Енергії конформерів, а також різниця у вільних енергіях Гібсу, за даними експерименту та розрахунків, наведені у таблиці 2. Для дослідження конфірмаційної поведінки нуклеозиду уридину були використані методи, які виявили найбільшу інформативність на попередніх молекулах. Були проаналізовані області NH, OH (Рис. 9) та область СН коливань (Рис.10). Нуклеозид уридин продемонстрував більшу конформаційну рухомість, тому що наявність додаткової ОН групи надає можливості для утворення двох нових внутрішньомолекулярних зв’язків О2’Н…О3’Н та О2’H…O2H. Прояв цих внутрішньомолекулярних водневих зв’язків ми спостерігаємо у спектрі. У порівнянні із спектром 2’-дезоксіуридину у спектрі уридину з’являються дві нові смуги 3456 та 3680 см-1. Ускладнюється спектр і у СН області: в ній присутня нова інтенсивна смуга, що зсунута у короткохвильову область спектру. Природа цієї смуги може бути пов’язана із Фермі-резонансом, хоча найбільш імовірним, на наш погляд, є зсунення смуги завдяки стеричній взаємодії з 2’ОН групою у анти конформації нуклеозида. Для цієї молекули ми провели квантово-
Частотасм-1) експеримент | Експеримент (I) | Розрахунок (I) | Коливання
3427,2 | 1 | 1 | NH усіх конформерів
3456,3 | 0,81 | 1,08 | О2Н: А1, А2
3491,7 | 0,98 | 0,94 | О5Н: S1, S2
3558,2 | 0,67 | 1,01 | О2Н S1, A3,A4
О3Н А1, А2, S2
О5Н А3, А4
3641,4 | 0,1 | 0,15 | О3Н А2
О5Н А1
3664,9 | 0,37 | 0,43 | О2Н S2
О3Н А3, S1
О5Н А1
хімічні розрахунки структури за методами HF/6-31G**, MP2/6-31G**. Для отримання заселеності конформерів у матриці ми порівняли інтенсивності смуг у експериментальному спектрі та спектрі, розрахованому за методом HF/3-21G*, що показав найкращий збіг з експериментом для попередніх молекул. Порівняння спектрів надано у Таблиці 2. Базуючись на цьому порівнянні, ми встановили концентрацію конформерів у матриці. Таким чином, концентрація син конформерів S1, S2, що стабілізовані внутрішньомолекулярним водневим зв’язком О5’Н…О2, становить 35%, а анти конформерів А1, А2 зі зв’язком О2’H…О2 - 25%. Концентрація анти конформерів з вільними або суто акцепторними ОН групами становить 35%. Мінорна кількість молекул знаходиться у конформаціях, в яких усі ОН групи утворюють водневий зв’язок з іншими групами цукрового кільця, наприклад у конформаціях, аналогічних до конформацій Ха2, Ха3 тимідину та 2’-дезоксіуридину.
У розділі 5 розглядається молекулярна структура модифікованого нуклеозида, сінцитолу та механізми його лікарської дії. Сінцитол є модифікованим аналогом цитидину (Землічка та ін. 1998р. ) Методи дослідження конформації сінцитолу ті ж самі, за допомогою яких було вивчено молекулярну структуру канонічних нуклеозидів. З метою отримання даних про заселеність конформерів було порівняно експериментальні та розраховані спектри. Показано, що син конформація сінцитолу присутня лише у малих кількостях, <10%. Знайдено, що розрахунки за методами MP2/6-31G**, HF/6-31G** та HF/3-21G* дають неадекватні значення енергії, виявляючи домінування син конформації. Встановлено дві анти конформації Za1, Za2 (Рис. 11), що домінують в ізольованому стані. В цілому молекулярна структура сінцитолу дуже схожа на структуру інших канонічних нуклеозидів, що досліджувались. Ця конформаційна схожість виявляється й у тому, що сінцитол бере участь у багатьох біосинтетичних реакціях, в котрих звичайно бере участь цитидин. Основними конформаційними відмінами
Рис. 11. Найбільш енергетично вигідні конформації сінцитолу.
сінцитолу від канонічних нуклеозидів є практична відсутність син конформерів, а також паралельність площі кільця основи та площі, в котрій лежать атоми, що заміщують цукрове кільце. В літературі існувала гіпотеза про те, що лікувальна дія модифікованих нуклеозідів полягає у вбудовуванні цих молекул у біополімер та зміні його конформації, завдяки чому відбувається часткова або повна інактивація цієї молекули. Ми провели моделювання вбудовування сінцитолу до полімерної ДНК послідовності. Розрахунки свідчать, що конформація полімерного ланцюга при цьому не змінюється. Таким чином, антивірусна активність сінцитолу є подібною до дії інших модифікованих нуклеозидів, які не мають аналогу О3’ групи. Спочатку сінцитол фосфорується за 5’ положенням клітинною (або вірусною) кіназою, після чого вбудовується до послідовності вірусної ДНК при її реплікації в ядрі клітини подібно до звичайного цитидину. Вбудовування сінцитолу до ланцюга ДНК за 3’ кінцем блокує процес ії реплікації. Особливого інтересу при цьому методі лікарської дії препарату набуває питання про її селективність. Селективність дії таких препаратів досягається завдяки різниці в їх афінності до віральних та звичайних, тобто клітинних, ензимів. Ця афінність обумовлена насамперед конформацією молекули того чи іншого лікарського препарату. Оскільки за даними цитотоксичного аналізу сінцитол виявив себе як нетоксичний препарат з високою антивірусною та протипухлинною активністю (Землічка та ін. 1998 р.), то надзвичайної актуальності набувають розробка та цитологічні дослідження інших модифікованих нуклеозидів, що матимуть подібну до сінцитолу молекулярну структуру в ізольованому стані.
ВИСНОВКИ
1.
Розроблено методику та спеціальний пристрій, що надають можливість вбудовувати такі термонестабільні молекули, як цукри та нуклеозиди, до матриць інертного газу.
2.
Показано, що в ізольованому стані молекули 2-дезоксірибози та рибози знаходяться в кільцевій формі й мають велику конформаційну рухомість. Проведені квантово-хімічні розрахунки продемонстрували стабільність двадцяти одного конформаційного ізомера 2-дезоксірибози, що стабілізовані внутрішньомолекулярними водневими зв’язками. Встановлено, що в матричних зразках відсутні конформери рибози, що мають вільні, або суто акцепторні OH групи.
3.
Вперше отримано ІК Фур’є-спектри уридину та тимідину в ізольованому стані. Вивчено їх конформаційну рівновагу та структуру внутрішньомолекулярних водневих зв’язків.
4.
Показано, що анти-конформери досліджених нуклеозидів є домінантними в ізольованому стані. Кільце рибози головних анти конформерів a1, a0 знаходиться в С2'-ендо конформації. Син-конформація нуклеозидів, що досліджувались, стабілізована внутрішньомолекулярним водневим зв’язком О5'Н…О2, а анти- конформація уридину стабілізована водневим зв’язком О2'Н…О2.
5.
Вперше досліджено молекулярну структуру нового нуклеозидного аналогу, сінцитолу. Пропонується розробка та подальше дослідження антивірусних лікарських препаратів на основі нуклеозидних аналогів, чия геометрія схожа до сінцитолу.
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1.
Krasnokutski S.A., Ivanov A.Yu., Izvekov V., Sheina G.G., Blagoi Yu.P. FTIR matrix isolation study of uridine, thymidine, ribose, and glucose. // Journal of Molecular Structure.-1998.-Vol.482, №1.-Р.249-252.
2.
Краснокутский С.А., Иванов А.Ю., Шеина Г.Г., Благой Ю.П. Конформационная изомерия молекул рибозы и 2-дезоксирибозы, изолированных в низкотемпературных матрицах // Вісн. Харк. ун-ту №488, Біофізичний вісник.-2000.-вип.6(1).-C.49-55.
3.
Иванов А.Ю., Краснокутский С.А., Шеина Г.Г., Благой Ю.П. Конформационная изомерия пиримидиновых нуклеозидов, изолированных в низкотемпературных инертных матрицах // Вісн. Харк. ун-ту №560, Біофізичний вісник.-2002.-вип.1(10).-C.42-49.
4.
Иванов А.Ю., Краснокутский С.А., Шеина Г.Г., Благой Ю.П. Особенности колебательного спектра 1-метил-урацила, изолированного в инертных матрицах // Вісн. Харк. ун-ту №568, Біофізичний вісник.-2002.-вип.2(11).-C.14-19.
5.
Huisken F., Werhahn O., Ivanov A.Yu., Krasnokutski S.A.The O–H stretching vibrations of glycine trapped in rare gas matrices and helium clusters, J. Chem. Phys.-1999.-Vol.111, №7.-Р.2978-2984.
6.
Krasnokutski S.A., Ivanov A.Yu., Sheina G.G., Blagoi Yu.P. FTIR matrix isolation study of monomeric uridine, ribose and glucose // II Congress of Ukrainian Biophysical Society.- Kharkov (Ukraine),1998.- P.58.
7.
Krasnokutski S.A., Ivanov A.Yu., Izvekov V., Sheina G.G., Blagoi Yu.P. FTIR matrix isolation study of uridine, ribose and glucose // XXIV European Congress on Molecular Spectroscopy Prague (Czech Republic), 1998.-P.470.
8.
Krasnokutski S.A., Ivanov A.Yu., Sheina G.G., Blagoi Yu.P. FTIR spectra of monomeric adenosine isolated in the low temperature Ar matrices // The XIV International School-Seminar “Spectroscopy of molecules and crystals”.- Odessa (Ukraine), 1999.-P.153.
9.
Krasnokutski S.A., Ivanov A.Yu., Sheina G.G., Blagoi Yu.P. FTIR spectra of monomeric uridine, thymidine and adenosine isolated in the low temperature Ar matrices // XIIIth Conference-Workshop Horizons in Hydrogen Bond Research.- Swieradуw Zdrуj (Poland), -1999, P.36.
10.
Krasnokutski S.A., Ivanov A.Yu., Sheina G.G. and Blagoi Yu. P. The conformational behavior of structural component of DNA in the "frozen gas phase" - low temperature matrices Ar and Ne. FTIR spectroscopic study // Molecules of Biological Interest in the Gas Phase.-Les Houches (France), 2000.-P.81.
11.
Krasnokutski S.A., Ivanov A.Yu., Sheina G.G., Blagoi Yu.P. FTIR spectra of monomeric adenosine isolated in the low temperature Ar matrices // 8th Conference on the Spectroscopy of Biological Molecules, Enschede (The Netherlands),1999.- P.263.
12.
Krasnokutski S.A., Ivanov A.Yu., Sheina G.G. and Blagoi Yu.P. Investigation of nucleosides molecular structure // RECOMB 2000.-Tokyo (Japan), 2000.-P.238-239.
13.
Krasnokutski S.A., Ivanov A.Yu., Sheina G.G., Blagoi Yu.P. FTIR matrix isolation spectroscopy of some pyrimidine and purine nucleosides, euroconference // MATRIX 2001.-Szklarska Poreba (Poland), 2001.- P.1.18.
14.
Ivanov A.Yu., Krasnokutski S.A., Zemlicka J., Sheina G.G. Conformational behavior of syncytol in isolated state. FTIR matrix isolation spectroscopy // XVI International School-Seminar “Spectroscopy of molecules and crystals”.- Sevastopol (Ukraine), 2003.- P.311.
АНОТАЦІЯ
Краснокутський С.А. Молекулярна структура мономерних фрагментів нуклеїнових кислот, ізольованих у низькотемпературних інертних матрицях. -Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02-біофізика.-Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, Харків, 2004.
Методом ІК-Фур’є спектроскопії матричної ізоляції, а також за допомогою квантово-хімічних ab-initio розрахунків, вивчено конформацію структурних компонентів ДНК и РНК. Для проведення досліджень за методом спектроскопії матричної ізоляції таких термонестійких молекул, як цукри та нуклеозиди, було створено спеціальну комірку. Виявлено три основних фуранозних конформери 2-дезоксірибози, що стабілізовані внутрішньомолекулярними водневими зв’язками. Для 2`-дезоксіуридину та тимідину в ізольованому стані домінують анти конформери, їх заселеність - 80%. Домінуюча конформація цукроваго кільця – С2`-ендо, й лише 20% конформерів мають С3`-ендо конформацію. Син-конформації нуклеозидів стабілізовані зв’язком O5'H…O2. В уридині, в анти конформації, було знайдено новий тип внутрішньомолекулярного водневого зв’язку O2'H…O2. Кількість син-конформерів уридину з водневим зв’язком O5'H…O2 становить близько 35%. Вивчено конформаційну поведінку модифікованого нуклеозиду, сінцитолу, що продемонстрував сильну антивірусну активність. Виявлено, що конформація цієї молекули подібна до такої ж інших канонічних нуклеозидів, що досліджувались. Запропоновано механізм антивірусної дії сінцитолу.
КЛЮЧОВІ СЛОВА: Спектроскопія матричної ізоляції, квантово-хімічні розрахунки, конформація, нуклеозиди, модифіковані нуклеозиди, цукри.
АННОТАЦИЯ
Краснокутский С.А. Молекулярная структура мономерных фрагментов нуклеиновых кислот, изолированных в низкотемпературных инертных матрицах. -Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук по специальности 03.00.02-биофизика.-Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина, Харьков, 2004.
Методом ИК-Фурье спектроскопии матричной изоляции, а также с помощью квантово-химических ab-initio расчетов, изучена конформация структурных компонентов ДНК и РНК. Для проведения исследований методом спектроскопии матричной изоляции таких термонестабильных молекул, как сахара и нуклеозиды, была создана специальная ячейка. Определены три основных фуранозных конформера 2-дезоксирибозы, стабилизированные внутримолекулярными водородными связями. Для 2`-дезоксиуридина и тимидина в изолированном состоянии доминируют анти-конформеры, их заселенность - 80%. Доминирующая конформация сахарного кольца – С2`-эндо, и лишь 20% конформеров имеют С3`-эндо конформацию. Син-конформации нуклеозидов стабилизированы связью O5'H…O2. В уридине, в анти-конформации, был обнаружен новый тип внутримолекулярной водородной связи O2'H…O2. Количество син-конформеров уридина с водородной связью O5'H…O2 составляет около 35%. Изучено конформационное поведение модифицированного нуклеозида синцитола, демонстрирующего сильную антивирусную активность. Обнаружено, что конформация этой молекулы сходна с таковой других исследованных канонических нуклеозидов. Предложен механизм антивирусного действия синцитола.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Спектроскопия матричной изоляции, квантово-химические расчеты, конформация, нуклеозиды, модифицированные нуклеозиды, сахара.
SUMMARY
Krasnokutskiy S.A Molecular structure of nucleic acid monomeric fragments isolated in the low temperature inert matrix. Manuscript.
Thesis for candidate’s degree by speciality 03.00.02-Biophysics.-V.N. Karazin Kharkiv National University, Kharkiv, 2004.
Conformational structure of biologically important molecules in isolated state is very important for understanding of their behaviour as in the different environment and inside of the cell. The knowledge of the conformation of modified nucleoside drugs can be a key for understanding of the mechanism of their antiviral and antitumour actions. Conformational structure of DNA, RNA components was investigated by bought infrared (IR) matrix isolation spectroscopy and quantum-chemical ab-initio calculation. For the investigation of thermounstable molecules by the method of matrix isolation spectroscopy the special oven was created. At the same temperatures the intensity of molecular beam from this oven is two times higher than that from the old one. This gives a possibility to evaporate such thermounstable biomolecules as sugars and nucleosides without their thermodecomposition. Furie-Transform IR spectra of investigated molecules in different matrixes were recorded in the range from 400 cm-1 and up to 4300 cm-1. In quantum chemical calculation global minimums were found by comparison with our experimental data. It was shown that sugars in the isolated state are very conformational flexible molecules, and exist in the closed ring forms. Intramolecular hydrogen bonds play a key role in the stabilising of the conformer structure. Quantum chemical calculations show more than twenty local minimums. It was shown that all OH groups of ribose are involved in the net of intramolecular hydrogen bonding. For the structures with five- carbon ring, three main conformers of 2-deoxyribose were identified. Energy barrier between these conformations was found to be at minimum 2,5 kcal/mol. For 2`-deoxyuridine and thymidine quantum chemical calculation show existing of six conformers with dominant conformation of the sugar ring C2’-endo and C3’-endo. In the isolated state anti conformers are dominant and their occupancy estimated to be about 80%. The dominant conformation for sugar ring is C2’-endo, and only small amount of conformers (about 20%) have the C3’-endo conformation of the sugar. Sin conformations of nucleosides are stabilised by intramolecular hydrogen bonding O5'H…O2 and their occupancy is about 19%. Same structures which differ only in orientation of one hydroxyl group, which prevent intramolecular hydrogen bonding, loose in energy about 4 kcal/mol. The next investigated molecule was uridine. In comparison with previously studied molecules it has one extra hydroxyl group, this lead to the higher conformational flexibility and increasing in the amount of possible intramolecular hydrogen bonds. For the first time, existing of new type of intramolecular hydrogen bond O2'H…O2 in anti conformation of uridine was shown. Amount of conformers with such intramolecular hydrogen bond is about 25%. Occupancy of uridine sin conformer with intramolecular hydrogen bond O5'H…O2 is about 35%, and that of conformers which have at least one free OH group is 60%. Conformational behaviour of modified nucleoside, syncytol, which shows strong antiviral activity against DNA viruses, was studied. It is found that conformational structure of this molecule is very similar to the one of the other investigated canonical nucleosides. The main difference is that sin conformation of sincytol is very low occupied < 10%. These conformational similarities are such that syncytol is accepted into many biosynthetic pathways that normally incorporate citidine. The most likely, syncytol is phosphorilated by kinase into the active 5`-triphosphate form, and then incorporated to viral DNA sequence. Being incorporated at 3` end of the DNA, syncytol stop the replication process, due to the absence of the 3` group analogue in the molecular structure of this drug. The idea that structural difference between syncytol and citidin may also change conformation of DNA biopolymers was not proofed. It was shown that most likely, conformational structure of syncytol is responsible for the selectivity of its therapeutic action, due to higher affinity of the molecular structure of syncytol to the viral enzyme in comparison with that to the cellular enzyme.
KEY WORDS: Matrix isolation spectroscopy, quantum chemical calculation, conformation, nucleosides, modified nucleosides, sugar.
Наукове видання
КРАСНОКУТСЬКИЙ Сергій Анатолійович
“Молекулярна структура мономерних фрагментів нуклеїнових кислот, ізольованих у низькотемпературних інертних матрицях”
Підписано до друку 07.04.2004 р. Формат 60x90 1/16.
Друк офсетний. Ум. Друк. арк. 0,9.
Тираж 100 прим. Замовлення № 208 __________________________________________________________
Надруковано в мінідрукарні ТОВ “Рейтинг”
М. Харків, вул Сумська, 37, т. 14-34-26, 700-53-51
