НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

Лебединський Олександр Сергійович

УДК: 577.125:616.153.922:616.089.843:

615.361.36.013.018.1.014.413:57.085.2

ОСОБЛИВОСТІ ЛІПІДНОГО ОБМІНУ У КРОЛІВ З ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЮ ГІПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМІЄЮ ПРИ АЛОТРАНСПЛАНТАЦІЇ КРІОКОНСЕРВОВАНИХ ГЕПАТОЦИТІВ ТА КЛІТИН ПЛОДОВОЇ ПЕЧІНКИ

03.00.19 – кріобіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків – 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Петренко Олександр Юрійович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу кріобіохімії.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Гулевський Олександр Кирилович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу біохімії холодової адаптації;

доктор медичних наук, старший науковий співробітник

Кондаков Ігор Костянтинович, Інститут терапії АМН України, завідувач лабораторії експериментальної та клінічної морфології.

Провідна установа: Харківський Національний університет

ім. В. Н. Каразіна, кафедра біохімії

Захист відбудеться 22.06.2004 р. о 13-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 при Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, 61015, м. Харків-15, вул. Переяславська, 23.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці ІПКіК НАН України за адресою: 61015, м. Харків-15, вул. Переяславська, 23.

Автореферат розісланий 21.05.2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

член-кореспондент НАН України Гольцев А. М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Протягом останніх двадцяти років активно вивчається доцільність пересадки ізольованих клітин печінки при патологіях різної етіології. Доведено, що ізольовані зрілі гепатоцити при трансплантації здатні тривалий час виживати, виконувати гепатоспецифічні функції і навіть ділитися в організмі реципієнта за умови застосування адекватної імуносупресії [Gunsalus J. R., 1997; Guha С., 2002]. З огляду на низьку імуногенність, багатство на ростові фактори та надзвичайно високий проліферативний потенціал, увагу дослідників останніми роками привертають попередники паренхіматозних клітин печінки [Crombleholme T., 1993; Sell S., 2001].

Актуальність теми. Перелік захворювань, стосовно яких трансплантація гепатоцитів розглядається як потенційний і перспективний метод терапії, обумовлений спектром біосинтетичних, детоксикаційних та регуляторних функцій паренхіми печінки, і включає, в першу чергу, гостру та хронічну печінкову недостатність, а також велику кількість спадкових захворювань, пов’язаних з виконанням окремих гепатоспецифічних функцій [Репин В. С., 1998]. Центральна роль, яку відіграє печінка в обміні ліпідів і розвитку його розладів [Климов А. Н., 1999], надзвичайно поширених, зокрема і в Україні, може розглядатися як достатнє підґрунтя для експериментального вивчення можливості корекції цього спектру захворювань шляхом трансплантації клітин печінки, як зрілих, так і плодового походження. Наявність поодиноких експериментальних робіт за цією тематикою [Wiederkehr J. C., 1990; Eguchi S., 1996; Голдобина А. В., 1998] свідчить, з одного боку, про перспективність напрямку, а з іншого – про необхідність подальших досліджень ефективності підходу на різних модельних системах.

Розвиток трансплантології значною мірою залежить від успіхів сучасної кріобіології, яка забезпечує технологічну базу для тривалого зберігання тканин і клітинних суспензій в життєздатному стані. Розроблені методи кріоконсервування гепатоцитів [Petrenko A. Yu., Sukach A. N., 1991] та клітин ембріональної печінки [Тарасов А. И. и др., 2002] дозволяють значною мірою зберегти функціональну активність клітин, що суттєво розширює можливості їх клінічного застосування. Але не достатньо при цьому дослідженими залишаються питання щодо безпечних умов зберігання та транспортування кріоконсервованих клітинних суспензій. Це набуває особливого значення для забезпечення координованої роботи низькотемпературних банків і швидкого надання біоматеріалу клінічним установам та дослідницьким лабораторіям незалежно від місця їх розташування.

Аналіз даних наукової літератури, отриманих в експериментах на тваринах, засвідчує, що найкращі результати дає ортотопічна трансплантація гепатоклітинних суспензій [Onodera K., 1995], проте відзначається, що трансплантовані гепатоцити можуть спричиняти значні ураження печінкової паренхіми реципієнта. Питання про оптимізацію умов інфузії гепатоцитів при ортотопічній трансплантації розглянуто недостатньо [Rozga J., 1995; Slehria S., 2002] і потребує проведення додаткових експериментальних дослідів.

Актуальність обраного напрямку полягає у необхідності вивчення in vivo характеру дії кріоконсервованих гепатоцитів та клітин плодової печінки при алотрансплантації за умов дисліпідемії, що може стати підґрунтям для розробки нових терапевтичних підходів у лікуванні розладів обміну ліпідів. Найбільш поширеними та небезпечними з огляду на їхній зв’язок з ризиком розвитку атеросклерозу є патологічні стани, пов’язані з підвищенням вмісту холестерину (ХС) крові. Адекватною моделлю таких розладів є модель аліментарної гіперхолестеринемії кролів, розвиток якої характеризується великою кількістю паралелей зі змінами, що призводять до розвитку атеросклерозу в людському організмі.

У розвитку гіперхолестеринемії найбільш показовими можна вважати параметри, які характеризують вміст ліпідів у сироватці крові, особливо це стосується ХС. Надзвичайно важливим з точки зору атерогенності гіперліпідемічного стану також є розподіл ХС між різними фракціями ліпопротеїнів. Характерною ознакою розвитку цієї патології також є порушення антиоксидантно-прооксидантної рівноваги в печінці та підвищення вмісту продуктів перекисного окислення ліпідів в крові [Ланкин В. З., 1989]. Дослідження in vivo щодо дії кріоконсервованих гепатоцитів і клітин плодової печінки за умов алотрансплантації при дисліпідемічних станах може стати підґрунтям для розробки нових підходів до корекції гіперхолестеринемії.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відділі кріобіохімії в рамках планових тем НДР ІПКіК НАН України: № 87 “Вивчення механізму біологічної дії кріоконсервованих препаратів ембріональної печінки та метаболізм гепатоцитів в умовах функціональної недостатності печінки”, № ГР 0202U000833; № 7 “Вивчення морфофункціональних особливостей регіональних стовбурових клітин ембріонів, їхньої кріочутливості й механізмів реалізації біологічної активності в умовах культивування і на моделях деяких патологічних станів”, № ГР 0102U002026.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи – з’ясувати характер дії кріоконсервованих гепатоцитів та клітин плодової печінки на обмін та перекисне окислення ліпідів при алотрансплантації кролям з експериментальною гіперхолестеринемією.

Для досягнення мети були поставлені такі задачі:

1. Визначити вплив циклічної зміни температури в діапазонах 77?223, 77ч173 ?а 77 ?123К на збереженість кріоконсервованих гепатоцитів для оцінки можливості їх транспортування із застосуванням сухого льоду.

2. Визначити оптимальні умови інтрапортальної інфузії алогенних кріоконсервованих гепатоцитів та клітин плодової печінки.

3. Вивчити вплив гепатоцитів та клітин плодової печінки на вміст ліпідів (загального ХС, ХС ліпопротеїнів високої густини (ЛПВГ) та триацилгліцеридів (ТАГ)) в сироватці крові при гіперхолестеринемії в моделях in vitro та in vivo.

4. Вивчити стан антиоксидантно-прооксидантної рівноваги у кролів з експериментальною гіперхолестеринемією після алотрансплантації кріоконсервованих гепатоцитів та клітин плодової печінки.

5. Оцінити морфологічний стан печінки кролів з експериментальною гіперхолестеринемією після алотрансплантації кріоконсервованих гепатоцитів та клітин плодової печінки.

Об’єкт дослідження. Обмін ліпідів, процеси перекисного окислення та морфологічний стан печінки у кролів з експериментальною гіперхолестеринемією при алотрансплантації кріоконсервованих гепатоцитів та клітин плодової печінки

Предмет дослідження. Кріоконсервовані гепатоцити та клітини плодової печінки при алотрансплантації кролям з експериментальною гіперхолестеринемією.

Методи дослідження. У роботі використано методи: програмного заморожування; спектрофотометрії для визначення активності ферментів і рівня біохімічних показників у сироватці крові й гомогенатах печінки; світлової мікроскопії для оцінки життєздатності клітинних суспензій та морфологічних особливостей печінки після дії досліджуваних факторів.

Наукова новизна отриманих результатів. Доведено, що циклічні зміни температури у твердій фазі призводять до зниження життєздатності кріоконсервованих гепатоцитів, якщо температурний діапазон циклування включає температуру склування. Показана здатність ізольованих гепатоцитів знижувати концентрацію атерогенних ліпопротеїнів в гіперхолестеринемічній сироватці крові. Показана наявність гіполіпідемічного ефекту, з’ясована його вираженість і тривалість після алотрансплантації кріоконсервованих гепатоцитів і клітин плодової печінки кролям з експериментальною гіперхолестеринемією. Показано, що трансплантація кріоконсервованих клітин плодової печінки (ККПП) кролям з експериментальною гіперхолестеринемією приводить до активації в печінці реципієнтів ферментативної системи антиоксидантного захисту. Встановлено, що через 4 тижні після трансплантації зрілих клітин печінки кролям з експериментальною гіперхолестеринемією спостерігається формування перипортальних зон відновлення печінкового епітелію, а після трансплантації плодових клітин – зменшення ознак дистрофії і, таким чином, загальне покращення стану печінкової паренхіми реципієнтів.

Практичне значення отриманих результатів. Експериментально обґрунтована можливість транспортування кріоконсервованих клітинних суспензій при температурі сухого льоду. Показана здатність ізольованих гепатоцитів знижувати концентрацію атерогенних ліпопротеїнів в гіперхолестеринемічній сироватці крові, що свідчить про можливість використання ізольованих паренхіматозних клітин печінки в екстракорпоральних апаратах “штучна печінка” в гіперхолестеринемічних ситуаціях. Отримані результати щодо впливу алотрансплантації кріоконсервованих гепатоцитів та клітин плодової печінки на обмін ліпідів у кролів з експериментальною гіперхолестеринемією можуть стати підґрунтям для розробки нових клінічних підходів до корекції розладів ліпідного обміну.

Особистий внесок здобувача. Самостійно проаналізовані й узагальнені дані наукової літератури, отримані результати експериментальних досліджень, проведено їхній первинний аналіз і статистична обробка. Спільно з науковим керівником поставлена мета роботи, сплановані експерименти, обговорені результати і зроблені остаточні висновки. Роботи, опубліковані у співавторстві з Сукачем О. М., Зінченко О. В., Черкашиною Д. В., відображають результати спільного планування, проведення експериментів та інтерпретації результатів.

Апробація результатів. Результати, викладені в дисертаційній роботі, доповідалися і обговорювалися на конференції молодих учених ІПКіК (м. Харків, 1999), республіканській науково-практичній конференції молодих учених “Досягнення та перспективи развитку терапії напередодні XXI сторіччя” (м. Харків, 2000), ІІ з’їзді трансплантологів України (Київ, 2000), міжнародній науково-практичній конференції “Проблеми клітинної та тканинної трансплантології” (м. Івано-Франківськ – м. Яремча, 2003).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 6 статей у фахових журналах.

Структура дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, описання матеріалів і методів дослідження, результатів та обговорення власних досліджень, заключення, висновків і переліку використаної літератури. Загальний обсяг дисертаційної роботи складає 135 сторінки, роботу проілюстровано 32 рисунками, 4 таблицями. Список літератури містить 192 джерела і розміщений на 20 сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження

В експериментах використано 60 лабораторних білих щурів масою 150 – 300г і 45 безпородних кролів масою 0,7 – 3,5 кг. Досліди провадили згідно з правилами “Європейської конвенції захисту хребетних тварин, які використовуються з експериментальною і іншою науковою метою” [1985]. Оперативні втручання проводились під наркозом із застосуванням тіопенталу натрію (50 мг/кг маси).

Зрілі гепатоцити, а також клітини плодової печінки, отримані з плодів 20 доби гестації, виділяли неферментативним методом [Petrenko A. Yu., 1995], кріоконсервували за трьохетапною програмою заморожування під захистом 5 % ДМСО [Petrenko A. Yu., 1992] та зберігали в умовах низькотемпературного банку при 77 К. Життєздатність клітин печінки визначали за забарвленням трипановим синім [Seglen P. O., 1976], концентрацію клітин підраховували в камері Горяєва [Неменова Ю.М., 1972].

Температурне циклування суспензії кріоконсервованих гепатоцитів щурів в діапазонах температур 77?223, 77ч173 ? 77ч123 ? здійснювали на пристрої для циклування біологічних об’єктів, розробленому у відділі кріобіофізики ІПКіК НАН України [Зинченко А. В., 1997]. Моделювання транспортування кріоконсервованих клітин печінки при температурі сухого льоду здійснювали в охолодженій до 194,5 K камері програмного заморожувача протягом 2-х годин.

Для оцінки здатності ізольованих гепатоцитів впливати на рівень атерогенних ліпопротеінів гіперхолестеринемічну сироватку крові протягом 3-х годин інкубували з суспензією гепатоцитів при температурі 37?С при постійному перемішуванні, після чого в ній визначали вміст ?-ліпопротеїнів турбідиметричним методом [Ледвина М. H., 1960] та ХС – реакцією Златкіс-Зака [Кейтс М., 1975] після екстракції ліпідів за Блаєм-Дайєром [Кучеренко Н. Е., 1985].

Для оцінки ступеня пошкодження печінки реципієнтів після трансплантації гепатоцитів в сироватці крові визначали активність трансаміназ: аспартатамінотрансферази (АсАТ) (КФ 2.6.1.1.) – за методом Бергмейєра, аланінамінотрансферази (АлАТ) (КФ 2.6.1.2) – за методом Вроблевського [Bergmeyer H. U., 1972] з використанням наборів фірми Sigma (США).

Модель експериментальної гіперхолестеринемії кролів [Ловягина Т. Н., Баньковская Э. Б., 1970] формували шляхом щоденного згодовування ХС протягом 5-и місяців.

Алогенну трансплантацію кріоконсервованих гепатоцитів та клітин плодової печінки кролям з експериментальною гіперхолестеринемією здійснювали інфузією в v. porta. В обох випадках клітини вводили у вигляді суспензії в 20 мл розчину Хенкса. Контрольну групу складали тварини з експериментальною гіперхолестеринемією, яким вводили 20 мл розчину Хенкса. На 1-й, 2-й, 3-й, 5-й, 7-й, 14-й, 21-й та 28-й дні у піддослідних тварин брали кров і визначали в сироватці концентрацію загального ХС, ХС ЛПВГ та ТАГ ферментативними методами [Trinder P., 1969] із застосуванням наборів фірм Вектор-Бест та Ольвекс (Росія). На 28 добу тварин забивали та брали зразки печінки для біохімічних і гістологічних досліджень.

Визначення вмісту білка в гомогенатах печінки здійснювали біуретовим методом. Вміст відновленого глутатіону оцінювався за утворенням комплексу з алоксаном [Путилина Ф. Е., 1982]. Активність каталази (КФ 1.11.1.6) визначали спектрофотометрично за зменшенням вмісту перекису водню при 240 нм [Королюк М. А. и др., 1988], глутатіонредуктази (КФ 1.6.4.2) за зменшенням НАДФН у присутності окисленого глутатіону при 340 нм [Чернов Н. Н., 1979]. Інтенсивність Fe2+–індукованого перекисного окислення ліпідів визначалася за швидкістю накопичення ТБК-активних продуктів за 10 хвилин інкубації у прооксидантному буфері, що містив 0,25 мМ аскорбату та 12 мкМ Fe2+ [Владимиров Ю. А., 1972]. Концентрація ТБК-активних продуктів у сироватці крові визначалася, як описано [Андреева Л. Н., 1988].

Для гістологічних дослідів тканину печінки фіксували в 10%-му формаліні, заливали в парафін, гістологічні зрізи фарбували гематоксиліном й еозином [Волкова О. В., 1971]. З частини матеріалу виготовляли кріостатні зрізи товщиною 10 мкм (температура камери кріостату -20?С) та забарвлювали їх розчином судану чорного для виявлення загальних ліпідів та спиртовим розчином судан ІІІ + судан ІV для виявлення нейтральних жирів [Кононский А. И., 1976].

Статистично результати обробляли на персональному комп’ютері за допомогою спеціалізованих програм. Для визначення достовірності даних використовували параметричний метод статистичного аналізу (t-крітерій Ст’юдента) або непараметричний Манна-Уітні.

Результати досліджень та їхнє обговорення

Вплив циклічних змін температури у твердій фазі на збереженість кріоконсервованих гепатоцитів щурів. Серед факторів, що забезпечують успішність трансплантації кріоконсервованих клітинних суспензій, чи не найважливішими є життєздатність та функціональна повноцінність трансплантата. Розвиток інфраструктури низькотемпературних банків потребує швидких і надійних методів транспортування кріоконсервованих клітинних суспензій до клінічних центрів та дослідницьких лабораторій. Одним із загальноприйнятих методів доставки консервованих біоматералів є перевезення в сухому льоді, але безпечність коливань температури, що відбуваються при перенесенні зразків з рідкого азоту, дотепер не досліджувалась.

В експериментах з вивчення впливу циклічних коливань температури (100 циклів) на збереженість кріоконсервованих гепатоцитів щурів діапазони температур циклування підбиралися з урахуванням температури склування, яка для цього об’єкта становить близько 168 К. Встановлено, що циклування у температурній зоні 77?123 К практично не впливає на збереженість клітин (97,5±2,0%). Циклування в діапазоні 77?173 К, тобто приблизно до температури склування, призводить до зменшення збереженості кріоконсервованих гепатоцитів (89,0±1,5%). Якщо ж коливання температури здійснювати в температурній зоні 77?223 К, яка вища за температуру склування, то спостерігається зниження збереженості гепатоцитів до 34±3,6%. Отже, абсолютно безпечними для збереженості гепатоцитів є циклічні зміни температури в діапазонах, нижчих за температуру склування. Оскільки циклування в діапазоні склування призводить до достовірного, але незначного зменшення показника, до того ж у кожному окремому циклі пошкодження не є вирішальними для життєздатності клітин, коливання до температури сухого льоду (194,5 К), що ненабагато перевищує температуру силування, мають бути досить безпечними, що підтверджується отриманими експериментальними даними. Показано, що одно-двократне температурне циклування в діапазоні температур від 77 (рідкий азот) до 194,5 К (сухий лід) не призводить до достовірного зниження життєздатності кріоконсервованих гепатоцитів щурів. Ці результати обґрунтовують безпечність перевезення кріоконсервованих клітинних суспензій в сухому льоді.

Вплив інтрапортальної інфузії алогенних кріоконсервованих гепатоцитів і клітин плодової печінки на рівень трансаміназ у сироватці крові та морфологічний стан печінки реципієнта. Відомо, що при інфузії в портальну вену гепатоцити можуть порушувати гемодинаміку в печінці реципієнта, що призводить до значних уражень паренхіми органа. Досліди щодо пошуку шляхів оптимізації способів введення гепатоклітинних суспензій у портальну вену носять поодинокий характер. Ми припустили, що швидкість введення клітинної суспензії може значно впливати на вираженість порушень гемодинаміки у печінці реципиєнтів.

Дослідження активності трансаміназ у сироватці крові після введення суспензії кріоконсервованих гепатоцитів у концентрації 5?106 кл/мл показали (табл. 1), що у випадку інфузії зі швидкістю 4 мл/хв спостерігається значне підвищення активності обох досліджуваних ферментів. Зниження швидкості до 1 мл/хв частково запобігало значному зростанню показників, що може пояснюватися меншими порушеннями гемодинаміки у системі портального кровообігу внаслідок більш рівномірного розподілу трансплантованих клітин у печінці реципієнта. Також показано, що введення ККПП навіть у концентрації 2,5Ч107 кл/мл не призводить до достовірних змін в активності трансаміназ у сироватці крові, що, напевне, є наслідком малих розмірів цих клітин.

Вивчення гістологічних зрізів печінки, отриманих на 7-у добу після трансплантації, підтвердило дані біохімічних досліджень. Показано, що введення суспензії зрілих гепатоцитів зі швидкістю 4 мл/хв призводить до значного ураження паренхіми печінки реципієнтів у вигляді осередкової балонної дистрофії, при введенні зі швидкістю 1 мл/хв ступінь ураження значно зменшується. Після трансплантації ККПП суттєвих морфологічних змін у печінці реципієнтів не спостерігається.

Вплив гепатоцитів та клітин плодової печінки на вміст ліпідів у сироватці крові при гіперхолестеринемії в моделях in vitro та in vivo. Центральна роль печінки в обміні ліпідів крові, зокрема її відповідальність за утилізацію атерогенних фракцій ліпопротеінів [Климов А. Н., 1999], стала теоретичним обґрунтуванням для проведення серії експериментів in vitro.

Показано, що нормотермічна інкубація гіперхолестеринемічної сироватки крові з ізольованими гепатоцитами приводить до зниження в ній концентрації атерогенних ліпопротеїнів. Ступінь зниження залежить від концентрації клітин та їхньої життєздатності. Так, інкубація сироватки з гепатоцитами високої життєздатності призводить до зменшення вмісту атерогенних

Таблиця 1

Вплив алотрансплантації кріоконсервованих гепатоцитів та клітин плодової печінки на активність трансаміназ у сироватці крові (M±m, n=5)

Показник | Час після трансплантації, доби | Групи тварин | Контроль | Введення кріоконсервованих гепатоцитівВведення ККПП, швидкість 1 мл/хв

швидкість

4 мл/хв | швидкість

1 мл/хв | Активність АлАТ, од/л | 0 | 62,63±3,55 | 1 | 72,447,09 | 296,9216,8* | 130,1510,60* | 84,564,02 | 2 | 77,136,82 | 257,7814,59* | 103,636,14* | 95,844,71 | 3 | 64,273,64 | 271,2815,36* | 105,587,09* | 79,404,10 | 5 | 62,763,83 | 64,713,66 | 63,883,86 | 75,804,80 | 7 | 65,003,19 | 95,745,42* | 66,853,53 | 69,603,70 | Активність АсАТ, од/л0 | 75,002,95 | 1 | 71,253,92 | 81,516,33 | 80,006,34 | 79,654,02 | 2 | 70,753,97 | 86,00±6,12 | 84,256,36 | 84,604,71 | 3 | 70,504,35 | 94,756,57* | 87,255,98 | 85,844,10 | 5 | 72,203,80 | 123,256,14* | 101,507,46* | 84,604,80 | 7 | 75,601,63 | 158,256,46* | 125,506,12* | 86,003,70 |

* – р<0,05 порівняно з контролем.

ліпопротеїнів на 58%, у випадку клітин з низькою життєздатністю (підданих дії швидкого заморожування-відігрівання) – до достовірно (р<0,05) менш вираженого зменшення показника (лише на 24%). Наведені дані свідчать про перспективність використання ізольованих клітин печінки для зменшення гіперхолестеринемії, зокрема при застосуванні в екстракорпоральних апаратах “штучна печінка”, та вказують на доцільність подальших досліджень in vivo.

Для досліджень in vivo було обрано традиційну модель гіперхолестеринемії кролів. Розвиток моделі відстежували за зміною вмісту загального ХС у сироватці крові, який у інтактних тварин складав 0,31±0,17 ммоль/л. Через місяць згодовування екзогенного холестерину цей параметр збільшувався до 1,98±0,85 ммоль/л і надалі не змінювався. Через 5 місяців холестеринової дієти кролям першої дослідної групи трансплантували кріоконсервовані алогенні зрілі гепатоцити, другій – кріоконсервовані клітини плодової печінки кролів, а третій – контрольній – вводили розчин Хенкса. Доза клітин для трансплантації у випадку зрілих гепатоцитів складала 108 клітин на тварину, як запропоновано у роботах [Eguchi S., 1996; Gunsalus J. R., 1997]; у випадку плодових клітин одному реципієнту трансплантували суспензію клітин, отриману з цілої печінки одного плода, що складало приблизно 5?108 клітин на тварину.

Свіжовиділені гепатоцити мали життєздатність 79-86%. Їхнє кріоконсервування за трьохетапною програмою заморожування під захистом 5% диметилсульфоксиду призводило до зменшення життєздатності на 20-25%. Життєздатність свіжовиділених клітин плодової печінки становила 88-96%. Їхнє кріоконсервування аналогічним методом призводило до зменшення життєздатності на 10-15%, що свідчить про більшу стійкість клітин плодового походження до дії низьких температур порівняно з дорослими гепатоцитами.

Як видно з рис. 1, у групі контрольних тварин у відповідь на оперативне втручання протягом першого тижня відбувалося значне зростання в сироватці крові концентрації загального ХС з максимумом на 7-у добу (4-кратне збільшення показника). Надалі концентрація ХС поступово зменшувалася і на 28 добу поверталася до доопераційного рівня, який значно перевищує рівень інтактних тварин. Трансплантація зрілих гепатоцитів гальмувала підвищення концентрації загального ХС у сироватці крові в період з 5-ї до 7-ї доби. Після трансплантації плодових клітин значний гіпохолестеринемічний ефект відзначався у два проміжки часу – на перший тиждень (3-7 поопераційні доби) та у віддалені строки спостереження (між 21-ю та 28-ю добами). При цьому на 28-у добу у тварин, яким було трансплантовано ККПП, вміст загального ХС був у 25 разів нижчим, аніж у контрольній групі, та в 13 разів нижчим за доопераційний, сягаючи рівня норми.

Рис. 1. Концентрація загального ХС у сироватці крові кролів з експериментальною гіперхолестеринемією після алотрансплантації кріоконсервованих гепатоцитів та клітин плодової печінки.

* – р<0,05 порівняно з контролем.

Вміст ХС ЛПВГ в сироватці крові тварин контрольної групи зростав протягом 5 – 28-ої поопераційних діб. Після алотрансплантації кріоконсервованих гепатоцитів достовірних відмінностей порівняно з контролем не було виявлено протягом всього періоду спостереження. У групі тварин, яким було трансплантовано клітини плодової печінки, рівень ХС ЛПВГ на 14-28 дні після операції був достовірно нижчий від контрольного (р<0,05), на сягаючи 28 добу рівня інтактних тварин. Оскільки в ці самі строки зменшувався також і вміст загального ХС у цій групі, то для оцінки перерозподілу ХС між атерогенними (ЛП низької густини та дуже низької густини) та антиатерогенними (ЛПВГ) фракціями було вираховано коефіцієнт атерогенності [Климов А. Н., 1977]. Виявилося, що на 21 та 28 доби він був нижчим від контрольного відповідно в 1,6 та 2,8 разів. Тобто після трансплантації кріоконсервованих клітин плодової печінки спостерігалося не лише значне зниження концентрації загального ХС у сироватці крові, але й його перерозподіл на користь антиатерогенних ліпопротеїнів.

Концентрація ТАГ у сироватці крові тварин контрольної групи достовірно не відрізнялася від доопераційного рівня впродовж всього періоду спостереження (рис. 2) і незначно перевищувала рівень норми (0,77±0,12 ммоль/л). Після трансплантації кріоконсервованих гепатоцитів цей параметр був достовірно нижчим на 1, 2, 3 та 7-у доби, тобто майже протягом всього першого тижня. Достовірне зниження вмісту ТАГ у сироватці крові після введення ККПП спостерігалося лише на 7-у добу спостереження. У віддалені строки спостереження в обох експериментальних групах достовірних відмінностей від значень показника в контрольній групі не спостерігалося.

Таким чином, отримані експериментальні дані дозволяють зробити висновок, що кріоконсервовані гепатоцити реалізують свою біологічну дію щодо ліпідів сироватки крові протягом першого тижня після трансплантації, знижуючи рівень загального ХС і ТАГ. Відносна короткочасність ефекту може бути пов’язана з припиненням функціонування трансплантата. Подовжити термін виживання пересаджених клітин, ймовірно, можна за умов застосування імуносупресії.

Рис. 2. Концентрація ТАГ у сироватці крові кролів з експериментальною гіперхолестеринемією після алотрансплантації кріоконсервованих гепатоцитів та клітин плодової печінки.

* – р<0,05 порівняно з контролем

Біологічні ефекти від введення кріоконсервованих клітин плодової печінки мають двохфазний характер. Спочатку спостерігається гіполіпідемічна дія трансплантата в межах першого тижня після трансплантації, а потім – на третьому-четвертому тижнях. Слід зазначити, що віддалені ефекти характеризуються значно більшою вираженістю. Ці дані дають змогу припустити, що за ефекти, які спостерігалися протягом першого тижня після трансплантації, вірогідно, відповідають біологічно активні речовини, що входять до складу та продукуються клітинами плодової печінки, такі як ?-фетопротеін [Рябчиков О. П. и др., 1998], hepatic stimulatorу substance [Kale V. P. et al., 1999] тощо. Щодо механізмів реалізації віддалених гіполіпідемічних ефектів клітин плодової печінки, то їх реалізація може обумовлюватися як безпосередньою репопуляцією печінки реципієнта донорськими клітинами, так і дією біологічно активних речовин, які можуть сінтезуватися трансплантованим матеріалом та ініціювати відновні процеси в органі-мішені.

Морфологічний стан печінки кролів з експериментальною гіперхолестеринемією після алотрансплантації кріоконсервованих гепатоцитів та клітин плодової печінки. Дослідження морфологічного стану печінки кролів контрольної групи виявило, що проведення хірургічної операції, введення розчину Хенкса на фоні сформованої гіперхолестеринемії та ведення поопераційного періоду при подальшому аліментарному надходженні екзогенного холестерину призводять до формування синдрому регенераторно-пластичної недостатності печінкової паренхіми.

Негативні структурні зміни, які відбуваються в печінці тварин контрольної групи, можуть бути частково компенсовані, якщо виконана алогенна трансплантація кріоконсервованих гепатоцитів навіть на фоні продовження аліментарної гіперхолестеринемії: гістологічно виявляються чіткі перипортальні зони відновлення печінкового епітелію з нормальними морфологічними ознаками.

На гістологічних препаратах печінки кролів, яким на фоні експериментальної гіперхолестеринемії трансплантували ККПП, виявлено значно меншу вираженість ознак дистрофії гепатоцитів відносно контроля, однак це покращення стану клітинних елементів печінкової паренхіми не має чіткої структурної локалізації.

Стан антиоксидантно-прооксидантної рівноваги при алотрансплантації кріоконсервованих гепатоцитів та клітин плодової печінки. Зважаючи на особливу, а з точки зору багатьох авторів [Okabe H. et al., 1981; Зенков Н. К., Меньшикова Е. Б., 1996; Ланкин В. З., 1989] і вирішальну, роль процесів перекисного окислення ліпідів у розвиткові гіперхолестеринемії та ініціації атеросклерозу, доцільність вивчення стану прооксидантно-антиоксидантної рівноваги при цій експериментальній моделі не викликає сумнівів.

Отримані результати показали (табл. 2), що у відповідь на оперативне втручання у кролів контрольної групи відбувалося значне збільшення вмісту ТБК-активних продуктів у сироватці крові з максимумом на 3-ю добу, після чого значення показника поступово знижувалося до доопераційного рівня.

Достовірна відмінність від контролю в групі, якій було трансплантовано кріоконсервовані гепатоцити, спостерігалася лише на 21-у добу. Відзначене підвищення концентрації МДА в сироватці крові може пояснюватися двома факторами: з одного боку, описаними вище пошкодженнями печінкової паренхіми після трансплантації, а з іншого – дією самого трансплантата. Зважаючи на нетривалість гіполіпідемічних ефектів після введення кріоконсервованих гепатоцитів та їх відсутність у ці строки, другий варіант є більш імовірним. Після трансплантації клітин плодової печінки кролям з експериментальною гіперхолестеринемією рівень ТБК-активних продуктів достовірно зростав порівняно з контролем на 5, 21 та 28-у доби після введення клітинної суспензії. Слід зазначити, що у ці самі терміни також спостерігається й гіполіпідемічна дія ККПП, що може свідчити про взаємозв’язок цих явищ.

Таблиця 2

Концентрація ТБК-активних продуктів (мкмоль/л) у сироватці крові кролів з експериментальною гіперхолестеринемією після алотрансплантації кріоконсервованих гепатоцитів та клітин плодової печінки (M±m, n=5)

Час після трансплантації, доба | Контроль | Трансплантація кріоконсервованих гепатоцитів | Трансплантація кріоконсервованих клітин плодової печінки | Доопераційний рівень | 15,92±0,36 | 1 | 22,78±1,75 | 19,93±1,53 | 27,87±2,18 | 2 | 21,46±1,45 | 25,13±2,56 | 22,36±0,65 | 3 | 25,89±0,80 | 22,11±1,24 | 23,76±0,39 | 5 | 24,43±0,36 | 20,19±3,31 | 27,24±0,86* | 7 | 23,61±0,72 | 24,05±1,94 | 23,32±0,62 | 14 | 21,69±0,23 | 24,09±0,63* | 23,19±0,55 | 21 | 19,32±0,71 | 18,86±0,91 | 24,16±0,71* | 28 | 16,73±0,41 | 14,73±0,89 | 19,52±0,66* | норма | 5,22±1,03 |

* – р<0,05 порівняно з контролем.

Відомо, що розвиток експериментальної гіперхолестеринемії супроводжується пригніченням у печінці активності ферментів системи антиоксидантного захисту [Tsai A. C. et al., 1977; Ланкин В. З., 1981], що в свою чергу призводить до секреції гепатоцитами модифікованих ліпопротеінів [Ланкин В. З. и др., 1976]. З огляду на це оцінка стану системи антиоксидантного захисту в печінці під час розвитку експериментальної гіперхолестеринемії має принципове значення. Визначення активності ферментів системи антиоксидантного захисту, а саме каталази та глутатіонредуктази, а також вмісту відновленого глутатіону, в гомогенатах печінки кролів контрольної групи на 28 добу після проведення операції виявило значне зменшення всіх показників (табл. 3). В інтенсивності індукованого перекисного окислення ліпідів достовірної відмінності, проте, не спостерігалося. У групі тварин, яким було трансплантовано кріоконсервовані гепатоцити, досліджувані показники залишалися на рівні контролю. Після трансплантації клітин плодової печінки зафіксовано достовірне зростання активності каталази до рівня інтактних тварин (у 3 рази порівняно з контролем). Глутатіонредуктазна активність та вміст відновленого глутатіону також значно збільшувалися – вдвічі у порівнянні з контролем. Достовірних змін в інтенсивності індукованого ПОЛ не спостерігалося. Ці дані свідчать про те, що алотрансплантація кріоконсервованих клітин плодової печінки в печінці реципієнтів стимулює ферментативну систему антиоксидантного захисту.

Таблиця 3

Стан антиоксидантно-прооксидантної рівноваги в гомогенатах печінки кролів з експериментальною гіперхолестеринемією після алотрансплантації кріоконсервованих гепатоцитів та клітин плодової печінки (M±m, n=5)

Досліджувані параметри | Норма | Контроль | Транспл. кріоконс. гепатоцитів | Транспл. клітин плодової печінки | Активність каталази, мкмоль Н2О2/мг білка/хв | 118,95±2,71 | 30,19±4,19* | 49,66±16,76* | 94,30±11,76# | Активність глутатіонредуктази, нмоль НАДФН/мг білка/хв | 21,38±3,55 | 5,47±0,43* | 7,22±2,37* | 11,44±0,89*# | Відновленний глутатион,

мкмоль/г білка | 40,15±0,38 | 15,20±1,32* | 15,05±3,28* | 32,18±0,94*# | Индуковане ПОЛ, пмоль МДА/мг білка/хв | 1,42±0,01 | 1,60±0,29 | 1,66±0,26 | 2,46±0,46* |

Примітки: * – р<0,05 порівняно з нормою;

# – р<0,05 порівняно з контролем.

Отже, встановлена гіполіпідемічна дія як кріоконсервованих гепатоцитів, так і кріоконсервованих клітин плодової печінки, після алогенної трансплантації кролям з експериментальною гіперхолестеринемією. В обох випадках ефекти спостерігаються протягом першого тижня після операції. Крім того, у випадку плодових клітин на третьому-четвертому тижнях також спостерігаються віддалені більш виражені ефекти. Дія кріоконсервованих клітин плодової печінки не обмежується гіполіпідемічними ефектами. Через 4 тижні після трансплантації спостерігається також значна стимуляція ферментативної системи антиоксидантного захисту в печінці реципієнтів.

ВИСНОВКИ

Актуальною проблемою сучасної кріобіології є вивчення біологічної дії кріоконсервованих клітинних суспензій за умов трансплантації. У дисертації наведене теоретичне узагальнення та нове вирішення наукової проблеми щодо можливості застосування кріоконсервованих гепатоцитів і клітин плодової печінки для корекції гіперхолестеринемії.

1. Одно-дворазове перенесення кріоконсервованих гепатоцитів з рідкого азоту (77 К) в сухий льод (194,5 К) не призводить до зниження їх збереженості, в той час як 100-разові циклічні зміни температури в діапазонах, що включають температуру склування (168 К), спричиняють значну руйнуючу дію. Ці результати можуть служити обґрунтуванням можливості транспортування кріоконсервованих клітинних суспензій у сухому льодові.

2. У системі in vitro показана здатність ізольованих гепатоцитів знижувати концентрацію атерогенних ліпопротеїнів у гіперхолестеринемічній сироватці крові.

3. Інтрапортальна трансплантація кріоконсервованих зрілих гепатоцитів призводить до пошкодження печінки реципієнтів, оціненого морфологічно та за рівнем трансаміназ у сироватці крові. Зниження швидкості інфузії суспензії зрілих гепатоцитів з 4 мл/хв до 1 мл/хв значно зменшує ступінь ураження. Трансплантація кріоконсервованих клітин плодової печінки зі швидкістю 1 мл/хв не спричиняє пошкоджуючої дії на печінкову паренхіму реципієнта.

4. Алотрансплантація кріоконсервованих гепатоцитів кролям з експериментальною гіперхолестеринемією знижує концентрацію ХС і ТАГ у сироватці крові в перший тиждень після трансплантації.

5. Після алотрансплантації кріоконсервованих клітин плодової печінки кролям з експериментальною гіперхолестеринемією спостерігається значний гіполіпідемічний ефект у два інтервали часу: протягом 5-14 діб після трансплантації – зниження вмісту загального ХС, з 21 до 28-ї доби – загального ХС, ХС ЛПВГ і ТАГ у сироватці крові.

6. У віддалені строки після трансплантації кріоконсервованих клітин плодової печінки спостерігається активація ферментативної системи антиоксидантного захисту: підвищення вмісту відновленого глутатіону, активності глутатіонредуктази та каталази.

7. Введення кріоконсервованих зрілих гепатоцитів тваринам з експериментальною гіперхолестеринемією приводить до формування перипортальних зон відновлення печінкового епітелію. Трансплантація ККПП забезпечує зменшення ознак дистрофії і, таким чином, загальне покращення стану печінкової паренхіми кролів з експериментальною гіперхолестеринемією .

ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ

1. Сукач А. Н., Лебединский А. С. Влияние изолированных гепатоцитов на концентрацию атерогенных липопротеинов в сыворотке крови человека// Биологический вестник. – 1999. – Т. 3, № 1-2. – С. 33-35. (Дисертантом самостійно проведено експерименти щодо вивчення впливу інкубації гіперхолестеринемічної сироватки крові з суспензією ізольованих гепатоцитів на вміст в ній холестерину та атерогенних ліпопротеїнів).

2. Сукач О. М., Лебединський О. С. Ізольовані гепатоцити як засіб зниження концентрації атерогенних ліпопротеїнів у сироватці крові людини // Трансплантологія. – 2000. – Т. 1, № 1. – С. 281-283. (Дисертантом самостійно проведено експерименти щодо вивчення впливу інкубації гіперхолестеринемічної сироватки крові з суспензією ізольованих гепатоцитів на вміст у ній холестерину та атерогенних ліпопротеїнів).

3. Лебединский А. С., Зинченко А. В., Петренко А. Ю. Влияние циклического изменения температуры в твердой фазе на сохранность криоконсервированных гепатоцитов крыс // Проблемы криобиологии. – 2002. – № 3. – С. 48-51. (Дисертантом самостійно проведено експерименти щодо вивчення впливу циклічних змін температури у твердій фазі на життєздатність кріоконсервованих гепатоцитів).

4. Лебединский А. С., Петренко А. Ю. Особенности выделения, криоконсервирования и аллогенной трансплантации гепатоцитов кроликов. // Проблемы криобиологии. – 2003. – № 1. – С. 51-58. (Дисертантом самостійно виділені та кріоконсервовані гепатоцити, трансплантовано отриманий матеріал та здійснено біохімічне визначення активності трансаміназ у сироватці крові кролів-реципієнтів).

5. Лебединський О. С., Черкашина Д. В., Петренко О. Ю. Про можливість корекції гіперхолестеринемії трансплантацією клітин плодової печінки // Трансплантологія. – 2003. – Т. 4, № 1. – С. 92-93. (Дисертантом сформовано модель експериментальної гіперхолестеринемії, отримані та трансплантовані гепатоцити і клітини плодової печінки, а також виконано експерименти щодо визначення біохімічних показників крові та морфологічного стану печінки).

6. Лебединский А. С., Петренко А. Ю., Сукач А. Н. Течение экспериментальной гиперхолестеринемии после аллотрансплантации криоконсервированных гепатоцитов // Проблемы криобиологии. – 2003. – № 3. – С. 54-61 (Дисертантом сформована модель експериментальної гіперхолестеринемії, отримані та трансплантовані гепатоцити і клітини плодової печінки, а також виконані експерименти щодо визначення біохімічних показників крові та морфологічного стану печінки).

АНОТАЦІЇ

Лебединський О. С. Особливості ліпідного обміну у кролів з експериментальною гіперхолестеринемією при алотрансплантації кріоконсервованих гепатоцитів та клітин плодової печінки. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 – кріобіологія. Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2004.

Дисертація присвячена вивченню впливу кріоконсервованих гепатоцитів і клітин плодової печінки на перекисне окислення та обмін ліпідів за умов алогенної трансплантації кролям з експериментальною гіперхолестеринемією.

Показано, що одно-двократне температурне циклування в діапазоні температур від 77 (рідкий азот) до 194,5 К (сухий лід) не призводить до достовірного зниження життєздатності кріоконсервованих гепатоцитів, що свідчить про можливість їх транспортування з використанням сухого льоду.

Встановлена гіполіпідемічна дія як кріоконсервованих гепатоцитів, так і кріоконсервованих клітин плодової печінки, протягом першого тижня після алогенної трансплантації кролям з експериментальною гіперхолестеринемією. Крім того, у випадку плодових клітин на третьому-четвертому тижнях також спостерігаються віддалені більш виражені ефекти. Дія кріоконсервованих клітин плодової печінки не обмежується гіполіпідемічними ефектами. Через 4 тижні після трансплантації спостерігається також значна стимуляція ферментативної системи антиоксидантного захисту в печінці реципієнтів.

Ключові слова: кріоконсервовані гепатоцити, кріоконсервовані клітини плодової печінки, ліпідний обмін, перекисне окислення ліпідів, експериментальна гіперхолестеринемія, алогенна трансплантація.

Лебединский А. С. Особенности липидного обмена у кроликов с экспериментальной гиперхолестеринемией при аллотрансплантации криоконсервированных гепатоцитов и клеток плодовой печени. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 – криобиология. Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2004.

Диссертационная работа посвящена изучению влияния трансплантации криоконсервированных гепатоцитов и клеток плодовой печени на перекисное окисление и обмен липидов у кроликов с экспериментальной гиперхолестеринемией.

Показано, что многократные циклические изменения температуры в образцах криоконсервированных суспензий гепатоцитов могут приводить к снижению жизнеспособности клеток если диапазон циклирования захватывает температуру стеклования. При этом одно-двукратное температурное циклирование в диапазоне температур от 77 (жидкий азот) до 194,5 К (сухой лед) не приводит к достоверному снижению жизнеспособности криоконсервированных гепатоцитов.

Установлено, что изолированные гепатоциты способны снижать концентрацию атерогенных липопротеинов в гиперхолестеринемической сыворотке крови при нормотермической инкубации in vitro, причем степень снижения зависит от концентрации клеток и их жизнеспособности.

Показано, что интрапортальное введение суспензии криоконсервированных гепатоцитов со скоростью 1 мл/мин приводит к значительно меньшим повреждениям паренхимы печени реципиента, чем введение со скоростью 4 мл/мин, а введение клеток плодовой печени не приводит к существенным повреждениям органа.

Аллогенное интрапортальное введение криоконсервированных гепатоцитов кроликам с экспериментальной гиперхолестеринемией приводит к снижению содержания холестерина (ХС) и триацилглицеридов (ТАГ) в сыворотке крови в пределах первой недели после трансплантации. Криоконсервированные клетки плодовой печени при введении кроликам с экспериментальной гиперхолестеринемией оказывают значительное гиполипидемическое