АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕПІДЕМІОЛОГІЇ ТА ІНФЕКЦІЙНИХ ХВОРОБ

ім. Л. В. Громашевського

ЛЯДОВА ТЕТЯНА ІВАНІВНА

УДК: 616.36-002-036.1-022.6:578.76:575.22]-092:612.017

КЛІНІКО-ГЕНЕТИЧНІ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА РОЛЬ ЦИТОКІНОВОЇ РЕГУЛЯТОРНОЇ МЕРЕЖІ В ПАТОГЕНЕЗІ ГОСТРОГО ВІРУСНОГО ГЕПАТИТУ В

14.01.13 – інфекційні хвороби

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Харківській державній медичній академії післядипломної освіти.

Науковий керівник:

доктор медичних наук, професор Малий Василь Пантелійович, Харківська медична академія післядипломної освіти МОЗ України, завідувач кафедрою інфекційних хвороб

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Дубинська Галина Михайлівна, Українська медична стоматологічна академія МОЗ України, завідувач кафедри інфекційних хвороб з епідеміологією;

доктор медичних наук, професор Герасун Борис Абрамович, Львівський державний медичний університет ім. Данила Галицького МОЗ України;

Провідна установа:

Одеський державний медичний університет МОЗ України, кафедра інфекційних хвороб

Захист відбудеться "______"______________2005 р. о _______ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.614.01 при Інституті епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України за адресою: 01015, м. Київ, вул. Січневого повстання, 23.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України за адресою: 03038, м. Київ, вул. Миколи Амосова 5.

Автореферат розіслано "_____"__________________2004 р.

Учений секретар спеціалізованої вченої ради

кандидат медичних наук В.В. Кононенко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У структурі інфекційних захворювань проблема вірусних гепатитів є однією з найбільш актуальних (Возіанова Ж.І., 2000; Кожевнікова Г.М., 2000; Жданов К.В., 2000; Громашевська Л.Л., 2001). Згідно з розрахунковими даними ВООЗ щорічно у світі на гепатит В (ГВ) захворює близько 50 млн. чоловік, а помирають від нього до 2 млн. Вважається, що на сьогоднішній день майже третина населення Землі інфіковані вірусом ГВ, а за темпами зростання і масштабами поширення ГВ значно перевищує захворюваність СНІДом і туберкульозом (Кузін С.М., 1998; Герасун Б.А., 1999; Герасун О.Б., 2003).

Крім самостійного клінічного значення ГВ є однією з основних причин формування хронічних захворювань печінки. Не можна не брати до уваги той факт, що високий рівень захворюваності, тривалий перебіг хвороби із затяжним періодом реконвалесценції і серйозними залишковими явищами зумовлює істотні матеріальні збитки через витрати на лікування даного захворювання (Вовк А.Д., 2001; Возіанова Ж.І., 2001; Івашкін В.Г., 2003).

Суттєвою перевагою сучасної клінічної медицини є широке використання можливостей високоінформативних діагностичних технологій. Нові молекулярно-генетичні й імунологічні методи діагностики, такі як індикація специфічних антитіл до вірусу ГВ за допомогою імуноферментного аналізу (ІФА), виявлення нуклеотидних послідовностей ДНК HBV з наступним визначенням генотипу вірусу ГВ не тільки в крові, але й у різних біологічних тканинах значно розширили існуючі уявлення про етіологію і патогенез ГВ (Мукомолов С.Л., 2003; Баяндін Р.Б., 2004; Сучков С.В., 2004).

Відомо, що різні генотипи вірусу ГВ тією чи іншою мірою впливають на перебіг інфекційного процесу, його клінічні прояви, особливості імунної відповіді, ефективність противірусної терапії та наслідки захворювання (Carman W. et al., 1993; Hunt С.М., 2000; Kao J.H., 2000). На превеликий жаль, дослідження по вивченню генотипів HBV, циркулюючих на території України, та вплив їх на перебіг захворювання й особливості імунної відповіді до теперішнього часу не проводилися.

Попри успіхи, досягнуті в удосконаленні діагностики ГВ, значна кількість питань і дотепер залишаються невирішеними. Зокрема, незважаючи на дослідження, які присвячені вивченню етіології, патогенезу, особливостей імунітету при ГВ, фактори, що зумовлюють запуск каскаду імунологічних реакцій, які призводять до повноцінної санації організму від гепатотропних вірусів, залишаються недостатньо вивченими. Крім того, не до кінця встановлені істинні механізми цитолізу гепатоцитів (Івашкін В.Г., 2000; Павлова Л.Є., 2000; Жданов К.В., 2000).

Провідну роль в ініціації реакцій клітинної і гуморальної ланок імунітету, як відомо, відіграє викид активованими макрофагами регуляторних цитокінів – фактора некрозу пухлини-? (ФНП-?) та інтерлейкіну-1? (ІЛ-1?). ІЛ-1? належить роль в активації Т-лімфоцитів, які можуть запускати клітинну і гуморальну імунну відповідь. Від збалансованості цих двох основних компонентів залежить перебіг і результат інфекційного процесу (Івашкін В.Г., 1997; Кетлінський С.А., 2002).

Відомо, що завершення імунної відповіді при вірусних інфекціях також залежить від формування в остаточному результаті повноцінної антитільної відповіді, яка визначається диференціюванням В-лімфоцитів, прямо активованих ІЛ-6. Незважаючи на те, що більшість патогенетичних механізмів дії ІЛ-1?, ІЛ-6, ФНП-?, ІЛ-2 та ІЛ-4 добре вивчені, роль цих прозапальних та протизапальних цитокінів при гострому вірусному ГВ (ГВГВ) вивчена недостатньо. Зокрема, не дослідженою залишається продукція цитокінів залежно від генотипів вірусу ГВ. Крім того, у патогенезі даного захворювання недостатньо вивченою є роль білків гострої фази запалення, зокрема С-реактивного білка (СРБ), який індукується ІЛ-6, та роль оксиду азоту (NO), що стимулюється у відповідь на дію ФНП-? і ІЛ-1? (Полєвщиков О.В., 1999; Павлова Л.Є., 2000; Ратнікова Л.І., 2003).

У зв'язку з вищезазначеним, є доцільним проведення генотипування вірусу ГВ, який циркулює на території України, і вивчення ролі прозапальних і протизапальних цитокінів: ІЛ-1?, ІЛ-6, ФНП-?, ІЛ-2, ІЛ-4 та індукованих ними гострофазових показників запалення: СРБ і NO на тяжкість і наслідки ГВГВ.

Зв?язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана згідно з планом науково-дослідної роботи Харківської медичної академії післядипломної освіти "Роль цитокінової регуляторної мережі у хворих на гострий вірусний гепатит В" № державної реєстрації 0103 U 004141.

Мета дослідження: прогнозування клінічного перебігу, тяжкості та наслідків ГВГВ на підставі генодіагностичних досліджень і динаміки цитокінової регуляторної мережі.

Основні завдання дослідження:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

Об'єкт дослідження: хворі на ГВГВ.

Предмет дослідження: комплекс клініко-біохімічних, серологічних, вірусологічних та імунологічних параметрів у динаміці захворювання у хворих на ГВГВ.

Методи дослідження: клінічні, біохімічні, серологічні, молекулярно-біологічні, імунологічні й інструментальні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в Україні проведено генотипування вірусу ГВ: виявлена циркуляція в популяції двох генотипів – D і А. Встановлено, що домінантним є генотип D, який зареєстровано в 90,8% випадків.

Виявлено два геноваріанти генотипу D вірусу ГВ, які впливають на клінічні прояви хвороби.

Комплексно схарактеризовано участь регуляторних цитокінів (ІЛ-1?, ІЛ-6, ФНП-?, ІЛ-2 та ІЛ-4) у хворих на ГВГВ залежно від генотипу HBV та геноваріантів.

При ГВГВ уже на початковому етапі інфекційного процесу у хворих із легким і середньотяжким перебігом виявлено три типи імунного реагування, обумовлені характером відповіді основних регуляторних цитокінів (ІЛ-1?, ІЛ-6, ФНП-?, ІЛ-2 та ІЛ-4).

Встановлено кореляційні залежності між рівнем прозапальних цитокінів (ІЛ-1?, ФНП-?) і показниками цитолізу гепатоцитів. Визначено прямі залежності між досліджуваними показниками прозапальних і протизапальних цитокінів (ІЛ-4, ІЛ-6 і ІЛ-2) і рівнем гострофазового показника запалення (СРБ) і NO у різні періоди інфекційного процесу.

Практичне значення одержаних результатів. Продемонстровано значущість комплексного обстеження хворих на ГВГВ із необхідністю визначення маркерів активної вірусної реплікації (а саме ДНК НВV і генотипу вірусу) та рівня основних регуляторних цитокінів.

Виявлений генотип НBV та типи імунного реагування у хворих із різною тяжкістю ГВГВ дозволяють судити про перебіг і наслідки хвороби. Визначення нормореактивного типу імунного реагування свідчить про гладкий перебіг хвороби, дисоціативний і гіпореактивний типи дають підстави прогнозувати затяжний перебіг та можливу хронізацію захворювання. Це дозволяє контролювати позитивну динаміку інфекційного процесу, вчасно діагностувати розвиток вторинної імунної недостатності і своєчасно провести її корекцію.

Вивчення рівня гострофазових показників дозволяє використовувати їх як додаткові критерії, що прогнозують перебіг захворювання.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведено аналіз наукової літератури за темою дисертації та патентно-інформаційний пошук, проведено клінічне та епідеміологічне обстеження хворих, організовано лабораторні та інструментальні дослідження. Особисто проведено комплексний аналіз, систематизацію отриманих результатів обстеження хворих, їх статистичну обробку, написані всі розділи роботи, розроблені таблиці та рисунки, сформульовані висновки та практичні рекомендації.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались і обговорювалися на науково-практичних конференціях "Інфекційні хвороби в практиці терапевта. Сучасні методи діагностики та терапії" (13 листопада 2001 р., м. Харків); науково-практичній конференції з міжнародною участю "Сучасна терапія хворих з інфекційною та паразитарною патологією на догоспітальному та госпітальному етапах, методи профілактики" (12-13 березня 2002 р., м. Харків); VI з?їзді інфекціоністів України "Клінічні проблеми боротьби з інфекційними хворобами" (25-27 вересня 2002 р., м. Одеса); підсумковій науковій конференції молодих учених "Нові технології в медицині" (21 листопада 2002 р., м. Харків); науково-практичній конференції "Гепатити в практиці терапевта, сімейного лікаря та інфекціоніста. Сучасні методи діагностики і терапії" (11-12 березня 2003 р., м. Харків); семінарі-конференції молодих учених "Проблема внутрішньолікарняних інфекцій в клінічній практиці" (8 квітня 2004 р. м. Харків); міжнародній конференції "Молода наука Харківщини – 2004", присвяченій 350-річчю заснування Харкова та 200-річчю з дня створення Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна (29-30 квітня 2004 р. М. Харків); науково-практичній конференції головних спеціалістів зі спеціальностей "інфекційні хвороби" та "дитячі інфекційні хвороби" "Актуальні питання клінічної інфектології та паразитології" (11-12 вересня 2004 р., м. Севастополь).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 15 наукових робіт, із них 4 статті у наукових фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, та 11 тез конференцій.

Структура й обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, загальної характеристики хворих і методів дослідження, розділів власних досліджень, узагальнення результатів, висновків, практичних рекомендацій та списку використаної літератури, який містить 216 джерел, з яких 134 роботи – з кириличною графікою і 82 – з латинською графікою. Робота ілюстрована 25 таблицями та 19 рисунками. Повний обсяг дисертації складає 158 сторінок друкованого тексту.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Об?єкт і методи дослідження. Результати даної роботи базуються на клінічному спостереженні і обстеженні 163 хворих на ГВГВ віком від 16 до 60 років, які перебували на стаціонарному лікуванні в інфекційній клінічній лікарні м. Харкова в 2000-2003 рр. З них жінок було 79, чоловіків – 84. В основному переважали особи молодого та середнього віку – 154 (94,5%) і лише 9 осіб були старші 51 року (5,5%). Відповідно до тяжкості перебігу хвороби пацієнти були розподілені наступним чином: хворі з легким перебігом – 85 осіб (52,1%), із середньотяжким – 78 (47,9%). На підставі детально зібраного анамнезу життя та хвороби, клінічних, лабораторних та інструментальних досліджень у обстежених хворих на ГВГВ була виключена супутня патологія, яка б могла суттєво вплинути на результати досліджень. Контрольну групу склали 20 практично здорових осіб – донорів крові, віком від 18 до 34 років. З них чоловіків – 16, жінок – 4, в анамнезі яких були відсутні супутні та хронічні захворювання.

Діагноз ГВГВ встановлювали з урахуванням комплексу епідеміологічних, клінічних і лабораторних даних. Вирішальним у підтвердженні діагнозу ГВГВ було виявлення у сироватці специфічних серологічних маркерів ГВ (HBsAg, анти-HBc IgM, HBeAg, анти-НВе) методом імуноферментного аналізу (ІФА) за допомогою тест-систем НВО "Диагностические системы" (Росія). Виключення мікст-гепатитів здійснювалося на підставі негативних результатів індикації серологічних маркерів гепатитів А і С (анти-НАV Ig M, анти-НСV (сум.)).

Молекулярно-біологічні дослідження включали визначення реплікативної активності НВV на підставі виявлення в сироватці крові ДНК НВV методом ПЛР із використанням тест-систем ЦНДІ епідеміології МОЗ РФ. Усім хворим було проведено генотипування ДНК НBV з використанням рестрикційного аналізу за методом М.Мizokami із співавт. (1999) у модифікації ЦНДІЕ м. Москви.

Для дослідження сироваткового рівня ІЛ-1?, ФНП-?, ІЛ-6, ІЛ-2, ІЛ-4 використовували тест-системи ООО “Протеиновый контур” (Санкт-Петербург, Росія), користуючись інструкцією виробника.

Для напівкількісного визначення СРБ використовувалися діагностичні набори "Ольвекс Диагностикум" (Санкт-Петербург), зареєстровані в Україні.

Для визначення рівня нітриту у сироватці крові використовували метод Гріса-Ілосвая (Ванханен В.Д., Суханова Г.А., 1983) із сульфонамідом і N(1-нафтилетилен-діаміндигідрохлоридом) за допомогою спектрофотометру.

У результаті проведених досліджень контрольної групи були встановлені показники, прийняті для здорових осіб: ІЛ-1? – 35,49±3,1 пкг/мл; ФНП-? – 37,83±2,7 пкг/мл; ІЛ-6 – 4,85±1,1 пкг/мл; ІЛ-2 – 38,26±1,3 пкг/мл; ІЛ-4 – 18,73±1,5 пкг/мл; СРБ – 3,19±1,02 мг/л; NO – 2,83±0,25 мкмоль/л.

Забір крові для дослідження проводили двічі у процесі хвороби: у періоді розпалу та в періоді реконвалесценції.

Із загальноприйнятих біохімічних тестів у динаміці захворювання були використані вміст білірубіну та його фракцій методoм L. Jendrassik, P. Grof (1938), активність аланінамінотрансферази (АлАТ) визначали уніфікованим методом S. Reitman, S. Frankel (1957), тимолову пробу – методом J. Huerga, H. Popper та сулемову пробу – методом F. Grinstedt (1987). У більшості хворих досліджувався рівень загального білка мікробіуретовим методом G. Kingsley (1940), а також білкові фракції турбодиметричним методом (1987). Як норму біохімічних показників використовували загальноприйняті значення.

Усім хворим було проведено УЗ дослідження органів черевної порожнини і загальноприйняті у клінічній практиці дослідження.

Статистична обробка отриманих результатів досліджень здійснювалася за допомогою програми STATISTIKA for Windows (Stat Soft Inc, США) на комп'ютері із процесором Pentium II Celeron 850 PPGA.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

У обстежених хворих методом ПЛР у 100% випадків виявлялася ДНК НВV.

При генотипуванні вірусу ГВ у 90,8% випадків (148 осіб) був виявлений генотип D вірусу ГВ, у 5-ти пацієнтів – генотип А, що склало 3,1%. Кількість хворих, у яких була виявлена ДНК НВV, але генотип вірусу встановити не вдалося, склала 6,1% (10 осіб).

У хворих із легким перебігом ГВГВ генотип D був встановлений у 89,4% (76 хворих), генотип А – у 5,9% (5 осіб), у 4,7% (4 особи) генотип вірусу встановити не вдалося. При середньотяжкому перебігу ГВГВ генотип D HBV був виявлений у 92,3% (72 особи), генотип А не зустрічався зовсім, у 7,7% хворих (6 осіб) генотип встановити не вдалося.

При вивченні субтипів НBV методом рестрикційного аналізу було виявлено два генетичних варіанти вірусу: І – генетично близький до ізоляту XXHEPAV (GeneBank No X02469, Латвія, Bichko V. et al. FEBS Lett. 185:208-212, 1985) та ІІ – генетично близький до ізоляту НВVGEN1 (GeneBank No Z35716, Польща, Plucienniczak A., 1994). Частота виявлення геноваріантів у залежності від перебігу захворювання представлена на рис. 1.

Наявність I геноваріанту генотипу D HBV у групі хворих з легким перебігом складала 42,1% (32 особи), тоді як ІІ геноваріант був виявлений у 57,9% (44 осіб). У групі хворих із середньотяжким перебігом ГВГВ частота виявлення І геноваріанту складала 47,2% (34 особи), II – у 52,8% (38 осіб).

Для можливого взаємозв?язку між клінічними проявами хвороби і геноваріантом генотипу D НВV, проводилося порівняння частоти окремих клінічних симптомів залежно від встановленого геноваріанту. Так, у пацієнтів з ІІ геноваріантом частіше зустрічалися артралгії – у 18,3%, тоді як у осіб з І геноваріантом – у 7,5% (р<0,05). Підвищення температури тіла відзначалося у 34,1 і 16,6%, відповідно (р<0,05). Навпаки, у хворих з І геноваріантом частіше реєструвався диспепсичний синдром. При цьому зниження апетиту відзначалося у 68,2%, а у пацієнтів з ІІ геноваріантом – у 54,9% (р<0,05), важкість в області правого підребер'я – відповідно у 53 і 48,8% (р>0,05), нудота – у 48,5 і 43,9% (р>0,05).

При вивченні біохімічних показників (рівнів загального і прямого білірубіну, активності АлАТ) і тривалості стаціонарного лікування у хворих з різними геноваріантами генотипу D HBV, статистичної вірогідності не встановлено.

Для виявлення імунної відповіді у хворих з І і ІІ геноваріантами генотипу D вивчалася динаміка цитокінів і опосередкована ними активація СРБ і NO у 82-ох хворих на ГВГВ (рис.2). Серед обстежених хворих І геноваріант зустрічався у 47,6% (39 осіб), ІІ – у 52,4% (43 особи). При цьому були виявлені деякі розбіжності в рівнях продукованих цитокінів: рівні ІЛ-1?, ФНП-? та ІЛ-6 у хворих з ІІ геноваріантом у розпалі ГВГВ були більш високі в порівнянні з такими у хворих з І геноваріантом. Однак отримані показники не відрізнялися статистичною вірогідністю (р>0,05).

На відміну від прозапальних цитокінів, рівні ІЛ-4 та ІЛ-2, навпаки, були підвищені у групі хворих з I геноваріантом генотипу D HBV, але й у цих випадках результати також не відрізнялися статистичною вірогідністю (р>0,05), що потребує подальшого вивчення на більшій кількості спостережень.

В подальшому, у періоді реконвалесценції рівень ІЛ-1? у сироватці крові хоча і знижувався, але залишався більш високим у групі хворих з ІІ геноваріантом –143,07±12,4 і 108,04±11,2 пкг/мл у хворих з І геноваріантом (р<0,05), тоді як концентрації ФНП-? і ІЛ-6 не відрізнялися статистично в порівнюваних групах хворих (рис.2В).

У той же час рівень ІЛ-4 у цьому періоді залишався більш високим у хворих з I геноваріантом (р>0,05), на відміну від сироваткової концентрації ІЛ-2, що була більш високою у хворих з II геноваріантом (р>0,05).

Сироваткові концентрації СРБ і NO як у періоді розпалу, так і в періоді реконвалесценції були практично однаковими в порівнюваних групах і не характеризувалися статистичною вірогідністю.

Динаміка регуляторних цитокінів вивчалася у 122 хворих на ГВГВ з генотипом D.

При дослідженні рівнів прозапального цитокіну ІЛ-1?, було встановлено вірогідне підвищення концентрації в розпалі хвороби зі зниженням показників у періоді реконвалесценції як у групі з легким (перша група), так із середньотяжким перебігом ГВГВ (друга група) порівняно з показниками контрольної групи. Причому в періоді розпалу середній рівень ІЛ-1? перевищував показники контрольної групи більше ніж у 4 рази у хворих першої групи – 138,29±13,2 пкг/мл, (р<0,05), та більше ніж у 5 разів у хворих другої групи – 204,52±16,9 пкг/мл (р<0,05). Відзначалася статистична вірогідність між показниками, отриманими у хворих із легким та середньотяжким перебігом хвороби (р<0,05). У періоді реконвалесценції спостерігалося досить помітне зниження рівня ІЛ-1? до115,88±11,7 пкг/мл (р<0,05) у хворих 1-ої і 142,67±11,9 пкг/мл (р<0,05) 2-ої групи.

Подібна динаміка відзначалася відносно іншого важливого прозапального цитокіну – ФНП-?. Його концентрація порівняно з показниками контрольної групи підвищувалася при легкому перебігу в період розпалу в середньому до 60,07±6,8 пкг/мл (р<0,05), при середньотяжкому – до 75,4±7,7 пкг/мл (р<0,05). У подальшому, у періоді реконвалесценції при згасанні клінічної симптоматики, середні показники рівнів ФНП-? у хворих із легким перебігом мали тенденцію до незначного зниження – 55,18±5,8 пкг/мл (р>0,05) порівняно з такими в періоді розпалу. У хворих же із середньотяжким перебігом отримані показники були достовірними відносно попередніх і складали 65,56±6,9 пкг/мл (р<0,05).

Динаміка ІЛ-6 була подібна такій у розглянутих прозапальних цитокінів. У період розпалу захворювання відзначалося достовірне підвищення його концентрації в сироватці крові у хворих з легким перебігом ГВГВ більше ніж у 4 рази (20,65±2,3 пкг/мл, р<0,05 при порівнянні з такими у осіб контрольної групи), а в періоді реконвалесценції, незважаючи на певне зниження, його рівень ще в 3 рази перевищував показники контрольної групи і складав 15,64±1,8 пкг/мл (р<0,05). У хворих із середньотяжким перебігом рівень ІЛ-6 у розпалі ГВГВ підвищувався і складав 22,65±3,3 пкг/мл. При повторному дослідженні відзначалося його зниження до 17,64±2,2 пкг/мл (р<0,05). Варто підкреслити, що показники рівнів ІЛ-6, на відміну від таких у ІЛ-1? і ФНП-?, у групах з різним ступенем тяжкості не відрізнялися між собою статистичною вірогідністю як у періоді розпалу захворювання, так і в періоді реконвалесценції.

Таким чином, у хворих на ГВГВ виникає активація прозапальних цитокінів, продукованих макрофагами внаслідок впливу збудника з тенденцією до їхнього зниження в періоді реконвалесценції. Сироваткові концентрації ІЛ-1? і ФНП-? у хворих на ГВГВ корелюють зі ступенем тяжкості процесу і підтверджують значення реакцій неспецифічної резистентності в інфекційному процесі.

При вивченні динаміки цитокінів, продукованих Тх1 і Тх2 типу (ІЛ-2 і ІЛ-4) була виявлена участь Т-клітинної ланки імунітету в захисті організму від вірусної інфекції, що супроводжувалося достовірним підвищенням їхньої концентрації протягом усього періоду захворювання.

Про активацію ІЛ-2 у періоді розпалу хвороби свідчить підвищення його рівнів у середньому до 122,4±12,5 пкг/мл у хворих з легким і до 190,7±14,8 пкг/мл у хворих із середньотяжким перебігом ГВГВ (р<0,05 порівняно з показниками контрольної групи). У періоді реконвалесценції вони значно знижувалися і складали 78,9±7,7 пкг/мл у пацієнтів 1-ої і 146,5±9,4 пкг/мл у 2-ої групи (р<0,05 порівняно з такими у групі контролю).

Виявлена динаміка коливання рівнів ІЛ-2 у хворих на ГВГВ свідчить про участь в активації клітинної ланки імунітету у відповідь на втручання вірусного антигену, що в остаточному підсумку сприяло стабілізації інфекційного процесу та подальшому періоду реконвалесценції.

Серед протизапальних цитокінів у патогенезі ГВГВ важливе місце посідає ІЛ-4. Вивчаючи його динаміку, було встановлено достовірне максимальне підвищення концентрації в періоді розпалу інфекції як при легкому (74,58±5,6 пкг/мл, р<0,05), так і при середньотяжкому перебігу (100,4±8,2 пкг/мл, р<0,05). Пізніше, у періоді реконвалесценції рівень ІЛ-4 знижувався в середньому до 65,63±5,8 пкг/мл у хворих 1-ої і до 88,11±6,3 пкг/мл у 2-ої групи, але ці показники залишалися ще досить високими й істотно перевищували такі, що були встановлені в контролі (р<0,05).

Таким чином, при вивченні динаміки цитокінів Тх1 і Тх2 типу було виявлено достовірне підвищення їхньої концентрації в періоді розпалу захворювання з поступовим зниженням при спаді інфекційного процесу. Відзначалася також кореляція показників із тяжкістю перебігу ГВГВ. Отримані результати досліджень цитокінового статусу в динаміці захворювання свідчать про одночасну активацію як гуморальних (підвищення сироваткової концентрації ІЛ-4), так і клітинних (підвищення рівня ІЛ-2) імунозапальних реакцій при ГВГВ, які були більш виражені при середньотяжкому перебігу хвороби.

Нарівні з активацією цитокінової мережі у хворих на ГВГВ відмічається активація білків гострої фази, а саме СРБ, а також підвищення рівня NO, які безпосередньо індукуються прозапальними цитокінами (ІЛ-1?, ІЛ-6 та ФНП-?). У процесі дослідження динаміки сироваткових рівнів СРБ у розпалі хвороби відзначається підвищення його рівня стосовно контрольної групи майже у 2,3 рази у хворих із легким перебігом – 7,38±1,75 мг/мл (р<0,05) і майже у 3 рази у хворих із середньотяжким перебігом – 10,0±1,86 мг/мл (р<0,05). У періоді реконвалесценції ці показники знижувалися до 5,5±0,94 і 6,4±0,58 мг/мл (р<0,05, порівняно з контролем).

Залежно від тяжкості перебігу рівні СРБ статистично відрізнялися лише у періоді розпалу: у хворих із легким перебігом сироватковий рівень СРБ складав 7,38±1,75 і 10,0±1,86 мг/мл (р<0,05) із середньотяжким перебігом ГВГВ. У періоді реконвалесценції статистичної різниці між рівнями СРБ у хворих із різним ступенем тяжкості ГВГВ не відзначалося: 5,5±0,94 і 6,4±0,58 мг/мл, (р>0,05).

Аналогічною була динаміка і при дослідженні NO залежно від періоду і тяжкості ГВГВ. Встановлено, що на висоті інфекційного процесу при легкому перебігу середні показники NO у 1,7 разів перевищували такі у осіб контрольної групи і складали 4,83±1,27 мкмоль/л (р<0,05), а у хворих із середньотяжким перебігом вони вдвічі перевищували такі в групі контролю і складали 5,85±1,34 мкмоль/л (р<0,05). При повторному досліджуванні, у періоді реконвалесценції, сироватковий рівень NO знижувався в середньому до 3,48±0,86 мкмоль/л (р<0,05) у хворих 1-ої та 4,75±1,24 мкмоль/л (р<0,05) у хворих 2-ої групи порівняно з показниками контролю.

Слід зазначити, що при дослідженні динаміки сироваткових рівнів NO у розпалі хвороби залежно від перебігу ГВГВ нами було виявлено статистично достовірне підвищення NO у хворих із середньотяжким перебігом ГВГВ порівняно з аналогічними показниками у хворих із легким перебігом. У періоді реконвалесценції ці показники знижувалися і досягали 3,48±0,86 і 4,75±1,24 мкмоль/л (р<0,05).

Результати спостереження за динамікою гострофазових показників можуть служити додатковим критерієм оцінки перебігу ГВГВ оскільки виявлявся зв'язок між клінічним перебігом захворювання і їх динамікою.

Зіставлення змін сироваткової концентрації прозапальних цитокінів зі ступенем тяжкості ГВГВ дало можливість знайти чітке підвищення рівнів ІЛ-1?, ІЛ-6 і ФНП-? мірі наростання клінічних проявів ГВГВ, що підтверджується позитивною когерентністю між рівнями прозапальних цитокінів (ІЛ-1в) ? дискримінантами виразності патологічних відхилень у клінічному стані хворих.

У періоді розпалу ГВГВ виявлялася помірна пряма кореляційна залежність між рівнями ІЛ-1? і АлАТ (r=0,6, p<0,05), рівнями ІЛ-1? і ФНП-? (r=0,43, р<0,05) як у хворих з легким (r=0,49, р<0,05), так і середньотяжким перебігом хвороби. У періоді реконвалесценції зв'язок між даними показниками ставав більш тісним і складав r=0,57 і r=0,53 (р<0,05), що посередньо свідчило про процес видужання. Також спостерігалася помірна пряма кореляційна залежність між показниками ІЛ-4 і ІЛ-1? (r=0,43, р<0,05), що свідчить про спроби організму компенсувати дії прозапальних цитокінів. Відзначалася помірна пряма кореляційна залежність між показниками ІЛ-4 і ІЛ-6 (r=0,6, p<0,05), між рівнем ІЛ-2 і ІЛ-4 (r=0,45, р<0,05).

Виявлений прямий помірний кореляційний зв'язок між рівнем ІЛ-6 і ФНП-? (r=0,52, p<0,05) у розпалі ГВГВ може служити відображенням стимулюючого впливу ФНП-? на продукцію ІЛ-6.

Оцінюючи кореляційні взаємозв'язки між рівнем регуляторних цитокінів та індукованих ними гострофазових показників запалення встановлено позитивний помірний зв?язок між рівнем СРБ та ФНП-? (r=0,41, p<0,05) у періоді розпалу хвороби та помірний прямий зв'язок між СРБ і ІЛ-6 (r=0,58, p<0,05). Слід відзначити тісний прямий зв?язок між показниками NO та ФНП-? (r=0,78, р<0,05). Інші кореляційні зв?язки були слабкими і не відрізнялися статистичною вірогідністю.

Наведені дані свідчать про те, що наявність прямої помірної кореляційної залежності між вмістом прозапальних, протизапальних цитокінів, біохімічних показників та гострофазових маркерів запалення у хворих на ГВГВ визначає значну роль в активації опосередкованих цитокінами механізмів імунного реагування у патогенезі ГВГВ і формування реконвалесценції.

У ході аналізу отриманих даних динаміки вмісту основних регуляторних цитокінів у 122 хворих із генотипом D вірусу ГВ і 5 хворих з генотипом А, були виявлені три типи імунного реагування: І – нормореактивний тип (помірне підвищення прозапальних цитокінів та цитокінів Тх1 і Тх2), ІІ – дисоціативний (високі показники прозапальних цитокінів на фоні низьких значень цитокінів Тх1 і Тх2) та ІІІ – гіпореактивний (низькі концентрації як прозапальних, так і протизапальних цитокінів). Відповідно до типу імунного реагування виділялись окремі групи хворих із різним ступенем тяжкості. Хворих із нормореактивним типом імунної відповіді з легким перебігом ГВГВ (1 група) було 51 (41,8%), із середньотяжким (2 група) – 50 (41%). Хворих із дисоціативним типом реагування з легким перебігом (3 група) було 12 (9,8%), із середньотяжким (4 група) – 9 (7,4%). У 5 хворих із гіпореактивним типом реагування імунної відповіді (5 група) перебіг ГВГВ був легким у 3 пацієнтів і у 2 хворих було діагностовано субклінічний перебіг.

При вивченні вмісту прозапальних та протизапальних цитокінів у хворих із норморективним типом імунної відповіді виявлялися розбіжності всіх показників у досліджуваних групах порівняно з нормою. Так, у розпалі ГВГВ відзначено вірогідне (р<0,05) підвищення рівнів ІЛ-1? у 3,8 рази, ФНП-? у 1,6 та ІЛ-6 у 4 рази у хворих з легким перебігом, тоді як у хворих із середньотяжким перебігом рівень ІЛ-1? перевищував у 5,7 рази, ФНП-? майже у 2, а ІЛ-6 у 4,4 рази перевищували показники контрольної групи. При порівнянні груп результати дослідження ІЛ-1? і ФНП-? відзначалися статистичною вірогідністю, крім рівнів ІЛ-6 (рис.3).

При аналізі сироваткових рівнів цитокінів Тх1 і Тх2 спостерігалась аналогічна динаміка. Рівень ІЛ-2 у хворих із легким перебігом у розпалі хвороби перевищував показники групи контролю у 3,4, а у хворих із середньотяжким перебігом у 5,4 рази. Рівні ІЛ-2 у групах із різним перебігом ГВГВ також відрізнялися статистичною вірогідністю (р<0,05).

Така ж динаміка мала місце відносно протизапального ІЛ-4, рівні якого у розпалі хвороби підвищувалися як у хворих 1-ої, так і 2-ої групи, що перевищувало показники контрольної групи у 4,4 та майже у 6 разів, відповідно. Статистична вірогідність отриманих результатів відзначалася при їх порівнянні у хворих із різним ступенем тяжкості ГВГВ.

При оцінці результатів прозапальних і протизапальних цитокінів у хворих із нормореактивним типом імунної відповіді у періоді реконвалесценції (рис.3В) виявлено їх помірне зниження відносно періоду розпалу, проте досліджувані показники були ще досить високими і продовжували відрізнялися від таких у контрольній групі. Статистична вірогідність рівнів ІЛ-1? і ФНП-? відзначалася між показниками у хворих із легким та середньотяжким перебігом хвороби, тоді як рівні ІЛ-6 не були вірогідними.

Рівні ІЛ-2 у періоді реконвалесценції при нормореактивному типі імунної відповіді також мали тенденцію до зниження відносно аналогічних у періоді розпалу ГВГВ, однак ще значно перевищували показники контрольної групи: у 2,2 рази при легкому та у 4 рази при середньотяжкому перебігу (р<0,05 в групах з різним ступенем тяжкості).

Концентрація ІЛ-4 також знижувалася як у хворих з легким перебігом, так із середньотяжким перебігом, перевищуючи показники контрольної групи у 3,7 і 5 разів відповідно (р<0,05 в групах із різним ступенем тяжкості ГВГВ).

Таким чином, вивчення динаміки основних регуляторних цитокінів у хворих із нормореактивним типом імунної відповіді свідчило про їх підвищення пропорційно тяжкості хвороби у розпалі ГВГВ із подальшою тенденцією до зниження у періоді реконвалесценції.

При дисоціативному типі імунного реагування спостерігалася низька продукція цитокінів Тх1 і Тх2, а саме ІЛ-2 та ІЛ-4, тоді як рівні прозапальних цитокінів підвищувалися пропорційно тяжкості процесу (рис.4). Так, концентрація ІЛ-1? при легкому перебігу ГВГВ підвищувалася у 4 рази, ФНП-? – відповідно у 1,6 разів, і ІЛ-6 – у 4,4 разів відносно контрольної групи. У хворих із середньотяжким перебігом рівень ІЛ-1? перевищував аналогічні показники у контролі у 5,9, ФНП-? у 2 і ІЛ-6 – у 4,8 рази. Відзначалася статистична вірогідність показників ІЛ-1? і ФНП-? у групах із різним перебігом хвороби (р<0,05).

Рівні ІЛ-2 та ІЛ-4 у хворих із дисоціативним типом реагування у розпалі хвороби також підвищувалися, але порівняно із аналогічними у хворих із нормореактивним типом імунного реагування вони були досить низькими. У хворих з легким перебігом у розпалі ГВГВ рівень ІЛ-2 складав 49,7±3,6 пкг/мл (р<0,05), із середньотяжким – 51,1±4,8 пкг/мл (р<0,05). Причому рівні ІЛ-2 не відрізнялися статистичною вірогідністю у групах порівняння (р>0,05), тоді як у хворих із нормореактивним типом ці показники перевищували аналогічні із дисоціативним в 2,6 рази при легкому і у 4 рази при середньотяжкому перебігу (р<0,05).

Рівні ІЛ-4 при зазначеному типі імунної відповіді у хворих із різним перебігом ГВГВ також не відрізнялися вірогідністю (р>0,05). Порівняно з контрольними показниками рівень ІЛ-4 при легкому перебігу складав 37,4±3,6 і 41,8±4,1 пкг/мл (р<0,05), при середньтяжкому, тоді як у хворих із нормореактивним типом імунного реагування дані показники відрізнялися статистично і перевищували аналогічні у хворих із дисоціативним типом у 2,2 рази у хворих із легким і у 2,7 рази із середньотяжким перебігом ГВГВ.

У періоді реконвалесценції у хворих із дисоціативним типом імунного реагування рівень прозапальних цитокінів мав тенденцію до зниження, але все ще перевищував показники контрольної групи.

При вивченні рівня ІЛ-2 у хворих із дисоціативним типом імунної відповіді у періоді реконвалесценції було виявлено його незначне зниження відносно такого в періоді розпалу. Про це свідчить те, що у хворих із легким перебігом ГВГВ його рівень складав 41,2±4,2 пкг/мл (р>0,05), а у хворих із середньотяжким – 45,7±4,4 пкг/мл (р>0,05). Слід зазначити, що отримані показники не відрізнялися статистичною вірогідністю ні від показників контрольної групи, ні при порівнянні між собою (р>0,05). У хворих же із нормореактивним типом імунної відповіді рівень ІЛ-2 перевищував аналогічні при дисоціативниму типі удвічі при легкому і у 3,4 при середньотяжкому перебігу (р<0,05 в порівнянні між собою).

Протизапальний ІЛ-4 також мав тенденцію до зниження і порівняно з контролем складав 27,83±2,5 пкг/мл (р<0,05) у хворих з легким і 32,1±3,3 пкг/мл (р<0,05) у хворих із середньотяжким перебігом. Але при порівнянні між групами рівні ІЛ-4 не відрізнялися статистичною вірогідністю (р>0,05). У хворих із нормореактивним типом імунного реагування аналогічні показники складали 69,96±4,9 пкг/мл при легкому і 93,13±5,5 пкг/мл при середньотяжкому перебігу, що перевищувало у 2,5 і 2,9 рази відповідно показники у хворих із дисоціативним типом.

Таким чином, при дослідженні рівнів прозапальних та протизапальних цитокінів у пацієнтів із дисоціативним типом імунного реагування було виявлено низькі концентрації регуляторного ІЛ-2 та протизапального ІЛ-4 на фоні підвищених рівнів прозапальних цитокінів (ІЛ-1?, ФНП-? та ІЛ-6).

Аналізуючи дані рівнів СРБ у хворих із різними типами імунного реагування, було встановлено достовірне їх підвищення стосовно контрольної групи (р<0,05). У розпалі ГВГВ у хворих із легким перебігом як із нормореактивним, так і дисоціативним типами імунної відповіді був виявлений майже однаковий рівень СРБ. У хворих же із середньотяжким перебігом при нормореактивному типі імунного реагування середній рівень СРБ складав 10,92±1,7 мг/мл проти 8,85±1,5 мг/мл при дисоціативному типі (р<0,05). Середні рівні СРБ мали відмінності у хворих із різним перебігом ГВГВ і типами імунного реагування (р<0,05).

При оцінці рівнів NO у хворих із нормореактивним типом імунного реагування у розпалі ГВГВ також було відзначено підвищення їх концентрації стосовно контрольної групи у 1,7 рази у хворих із легким і у 2,1 рази із середньотяжким перебігом. Аналогічна динаміка рівнів NO спостерігалась і у хворих із дисоціативним типом. Про це свідчить підвищення рівня NO при легкому перебігу до 4,8±1,2 і до 5,81±1,14 мкмоль/л (р<0,05), при середньотяжкому. У періоді реконвалесценції рівні СРБ і NO знижувалися у хворих як з нормореактивним, так із дисоціативним типами імунного реагування. Відзначалася статистична вірогідність між отриманими результатами та показниками контролю.

Така динаміка гострофазових показників запалення не випадкова, адже відомо, що основними активаторами їх синтезу являються прозапальні цитокіни, зокрема для СРБ – ІЛ-1? та ІЛ-6, для NO – ІЛ-1? і ФНП-?. Як у хворих із нормореактивним, так і з дисоціативним типом імунної відповіді вміст прозапальних цитокінів достатньо високий, що відповідно вплинуло і на продукцію гострофазових показників запалення.

У хворих на ГВГВ з різними типами імунного реагування встановлені відмінності у тривалості основних клінічних симптомів. При нормореактивному типі імунної відповіді відзначалася менша тривалість основних клінічних симптомів (р<0,05) на відміну від дисоціативного типу. Зокрема, загальна слабкість у хворих із середньотяжким перебігом нормореактивним типом імунного реагування складала 3,8±0,6 дні, при дисоціативному – 5,9±1,3 дні (р<0,05).

Тривалість диспепсичних проявів захворювання у вигляді зниження апетиту у хворих із легким перебігом нормореактивного типу складала 2,9±0,3 дні, тоді як у хворих із дисоціативним типом – 4,3±0,5 (р<0,05), нудота – 1,0±0,1 дні та 1,4±0,3 дні (р>0,05). При середньотяжкому перебігу та різних типах імунного реагування диспепсичні порушення тривали довше (р<0,05).

Також при дисоціативному типі імунного реагування довше зберігалися скарги на відчуття важкості в епігастральній ділянці та правому підребер'ї при середньотяжкому перебігу хвороби – 8,7±0,7 днів, тоді як при нормореактивному типі – 5,1±0,4 дня (р<0,05).

Тривалішою була шкірна сверблячка у хворих із дисоціативним типом імунної відповіді при середньотяжкому перебігу ГВГВ (р<0,05).

Період жовтяниці був вірогідно коротший у хворих із нормореактивним типом імунного реагування, порівняно із зареєстрованим у хворих із дисоціативним типом (р<0,05).

Важливо відзначити, що у пацієнтів із нормореактивним типом імунного реагування із різним перебігом ГВГВ зменшення розмірів печінки відбувалося значно раніше від початку госпіталізації – 10,5±2,0 і 19,2±2,1 дні (р<0,05), порівняно із даними показниками у хворих із дисоціативним типом імунного реагування – 6,8±1,8 і 12,8 ±1,9 дні (р<0,05) відповідно.

Строки стаціонарного лікування у хворих з нормореактивним типом складали 16,1±2,5 дні при легкому і 27,6±0,9 – при середньотяжкому перебігу, у хворих же з дисоціативним типом тривалість стаціонарного лікування перевищувала такі відповідно майже в 1,4 і 1,2 рази і складала 22,2±2,4 і 33,4±2,3 дні (р<0,05).

Статистична вірогідність відзначалася між рівнями загального і прямого білірубіну у хворих із різними типами імунного реагування при легкому перебігу ГВГВ (р<0,05).