МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

ДОНЕЦЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ім. М. ГОРЬКОГО

ЛЮБОМИРСЬКА Віта Анатоліївна

УДК 616 - 092.11:612.112.94:612.438]:616.379 - 008.64:577.175.8

ФУНКЦІОНАЛЬНИЙ СТАН ЛІМФОЇДНОЇ ПОПУЛЯЦІЇ ВИЛОЧКОВОЇ ЗАЛОЗИ В ДИНАМІЦІ РОЗВИТКУ ЦУКРОВОГО ДІАБЕТУ ТА ЙОГО МОДУЛЯЦІЯ ЗА ДОПОМОГОЮ НЕЙРОПЕПТИДІВ

14.03.04 – патологічна фізіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Донецьк-2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Запорізькому державному медичному університеті МОЗ України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор

АБРАМОВ Андрій Володимирович,

Запорізький державний медичний університет,

професор кафедри патологічної фізіології

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, КРИШТАЛЬ Микола Васильович, Національний медичний університет ім. О.О.Богомольця, м. Київ, професор кафедри патологічної фізіології

доктор медичних наук, професор ЗВЯГІНЦЕВА Тетяна Володимирівна, Харківський державний медичний університет, завідувач кафедри фармакології

Провідна установа:

Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України, м. Київ, відділ ендокринології репродукції та адаптації

Захист дисертації відбудеться “8” червня 2004 року о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 11.600.02 при Донецькому державному медичному університеті ім. М.Горького МОЗ України (83003, м. Донецьк, пр. Ілліча, 16).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Донецького державного медичного університету ім.. М. Горького (83003, пр. Ілліча, 16)

Автореферат розісланий “7” травня 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор медичних наук, професор Г. А. Ігнатенко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Цукровий діабет I типу – важка ендокринна хвороба, яка вражає дітей та молодих людей, призводить до ранньої інвалідізації та передчасної смерті, вимагає великих матеріальних і моральних витрат з боку хворої людини та суспільства (Васильєва Е.В., 1998). Основним патогенетичним фактором розвитку цукрового діабету першого типу є аутоімунна деструкція _клітин підшлункової залози, що індукується активованими Т-лімфоцитами-кілерами і макрофагами, яка призводить до абсолютної інсулінової недостатності і, як наслідок, гіперглікемії. Крім цього, імунологічні порушення при діабеті виявляються синтезом аутоантитіл до інсуліну (Головизин М.В., 1999), глутаматдекарбоксілази (Полторак В.В., 1999), карбоксипептидази Н. В клітинах вилочкової залози при нормальних умовах відбувається презентація ендогенного інсуліну, а також самостійна експресія генів, що кодують синтез інсуліну і глутаматдекарбоксілази, які мають бути аутоантигенами при цукровому діабеті I типу. Ці явища є важливими та необхідними для селекції аутореактивних до інсуліну клонів Т-лімфоцитів (Adkins B., 1999), та для збереження аутотолерантності до в_?літин панкреатичних острівців. У підтримці механізмів аутотолерантності Т-лімфоцитів до ?_клітин підшлункової залози важливу роль відіграє синтез інсуліноподібних факторів росту I і II типів (Балаболкин М.И., 2000, Chentoufi A.A, 2002, Chervonsky A. V., 1997.). При діабеті I типу знижується синтез не тільки панкреатичного інсуліну, а також експресія синтезу тимічного інсуліну (Васильєва Е.В., 1998), що призводить до порушень процесів диференціювання Т_лімфоцитів у вилочковій залозі. Ряд дослідників вважають, що при аутоімунних захворюваннях, а також при цукровому діабеті I типу, можливі порушення взаємовідносин різних типів клітин у лімфоїдній популяції вилочкової залози (Іванівська Т.Є., 1996), а також поява активованих Т- клітковинних клонів з незрілим фенотипом та великою адгезивною та секреторною активністю (Сєров В.В., Зайратьянц О.В., 1998). Разом з цим, у сучасній літературі про зміщення складу лімфоїдної популяції вилочкової залози в динаміці розвитку експериментального цукрового діабету, про особливості проліферативної активності лімфоцитів та процесів антигенного диференціювання Т-лімфоцитів данні майже відсутні.

Враховуючи регулюючий та моделюючий вплив гіпоталамічних нейропептидів на процеси імуногенезу у вилочковій залозі, вважається доцільним вивчення реакції лімфоїдної популяції вилочкової залози на багатоденне введення синтетичних нейропептидів окситоцину і нейропептида Y при експериментальному цукровому діабеті.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тема дисертації є фрагментом комплексної науково-дослідної роботи Запорізького державного медичного університету “Роль пептидергічної системи гіпоталамуса в регуляції ендокринної функції підшлункової залози та стану міокарда в нормі і при цукровому діабеті, та обґрунтування способів корекції його порушень за допомогою синтетичних нейрогормонів” (експериментально-клінічне дослідження) (№ державної реєстрації 0198U004224) і “Роль порушень нейро-імунно-ендокринних взаємовідносин у розвитку експериментальної та клінічної патології” (№ державної реєстрації 0103U000937). Дисертант є співвиконавцем даної теми.

Мета і завдання дослідження. Встановити особливості функціонального стану лімфоїдної популяції вилочкової залози та ендокринних клітин підшлункової залози в динаміці розвитку експериментального цукрового діабету та його зміни при введенні синтетичних нейропептидів.

Для досягнення мети були сформульовані такі завдання дослідження:

1. Провести класифікаційний аналіз структури лімфоїдної популяції вилочкової залози в контролі, в динаміці розвитку цукрового діабету, а також після багатоденного введення діабетичним щурам окситоцину і нейропептида Y.

2. Встановити особливості експресії поверхневих CD4 і CD8 антигенів в клітинах лімфоїдної популяції вилочкової залози в контролі та в динаміці розвитку цукрового діабету.

3. Визначити інтенсивність процесів проліферації клітин лімфоїдної популяції вилочкової залози в контролі та в динаміці розвитку цукрового діабету.

4. Встановити інтенсивність процесів утворення активованих Т-лімфоцитів вилочкової залозі, експресуючих CD134-антиген в динаміці розвитку цукрового діабету.

5. Встановити динаміку функціонального стану - і - клітин панкреатичних острівців у динаміці розвитку цукрового діабету.

Об’єкт дослідження - експериментальний цукровий діабет та його модуляція за допомогою нейропептидів.

Предмет дослідження - структура і функціональний стан лімфоїдної популяції вилочкової залози та ендокринних клітин підшлункової залози щурів в нормі та в динаміці цукрового діабету.

Методи дослідження: для виконання поставлених у дисертації задач використовувалися сучасні морфометричні, гістохімічні та імуноцитофлюоресцентні методи аналізу гістологічного матеріалу, методи математичного класифікаційного аналізу, статистичного аналізу отриманих результатів.

Про функціональний стан лімфоїдних клітин вилочкової залози робили висновки на підставі вивчення серійних гістологічних зрізів із різних відділів залози і даних морфометричних і денситометричних характеристик при фарбуванні зрізів гематоксиліном-еозином, даних імуноцитофлюоресцентного виявлення клітинних антигенних маркерів CD4, CD8 і CD134, а також даних виявлення ядерного антигену клітинної проліферації PCNA.

Для вивчення функціонального стану ендокринних клітин панкреатичних острівців застосовували імуноцитофлюоресцентний метод ідентифікації ?- і ?- клітин в серійних гістологічних зрізах підшлункової залози із її різних відділів з наступним кількісним аналізом.

Всі отримані експериментальні дані обробляли на IBM-сумісному персональному комп'ютері пакетом прикладних і статистичних програм VIDAS-2.5 (Kontron Elektronik, Німеччина) і EXCEL з пакета MS Office 2000 (Microsoft Corp., США). Статистичне оцінювання експериментальних даних і вірогідність відмін в групах визначали t-статистикою Ст'юдента.

Наукова новизна одержаних результатів. У цьому дослідженні були отримані нові дані про особливості структурно-функціональної організації лімфоїдної популяції вилочкової залози в динаміці розвитку експериментального цукрового діабету та його корекція за допомогою багатоденних введень синтетичних аналогів окситоцину та нейропептида Y, а також особливості проліферації та антигенного диференціювання Т- лімфоцитів вилочкової залози контрольних тварин та в динаміці експериментального цукрового діабету. При цьому вперше:

- використовувався сучасний метод автоматичного морфометричного класифікаційного аналізу лімфоїдної популяції, за допомогою якого були отримані унікальні характеристики лімфоцитів різних функціональних класів лімфоїдної популяції вилочкової залози та встановлена наявність в кожному з них групи деструктивно змінених клітин;

- використовувався сучасний метод оцінки проліферативної активності лімфоїдних клітин на основі імунофлюоресцентної реакції виявлення ядерного антигену проліферируючих клітин PCNA;

- отримані нові дані про експресію CD4 і CD8_рецепторів на лімфоцитах функціональних класів у щурів в нормі та в динаміці розвитку експериментального цукрового діабету; проведений аналіз експресії поверхневого CD134- антигену на лімфоцитах, котрий є рецептором до фактору некрозу пухлин альфа і характеризувався появленням активованих Т-лімфоцитів при експериментальному цукровому діабеті;

- встановлені впливи багатоденного інтрацеребровентрікулярного та інтраперітонеального введень синтетичних нейропептидів окситоцину та нейропептида Y на структуру лімфоїдної популяції вилочкової залози при експериментальному цукровому діабеті.

У роботі вперше обґрунтовані нові факти, основними мають бути такі: розвиток цукрового діабету супроводжувався прогресуючим зменшенням сумарної щільності лімфоцитів в усіх зонах вилочкової залози і зростанням в деяких зонах долі деструктивно змінених лімфоцитів та апоптотичних лімфоцитів; у вилочковій залозі діабетичних щурів спостерігалося порушення процесів диференціювання лімфоцитів, що проявлялося в зміні співвідношень різних класів CD4 і CD8_імунопозитивних лімфоцитів; вперше показано, що в результаті експерименту в корковій і мозковій речовинах вилочкової залози було збільшення абсолютної та відносної щільностей окремих класів CD134_імунопозитивних лімфоцитів.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані у роботі дані свідчать про утягнення вилочкової залози в патологічний процес при експериментальному цукровому діабеті та виступають як критерії для оцінки ступеня важкості течії хвороби.

Проведені дослідження встановили вражаючий ефект багатоденного введення нейропептидів окситоцину та нейропептида Y на структурно-функціональну організацію лімфоїдної популяції вилочкової залози, виявлений у відновленні питомої щільності лімфоїдної популяції, збільшенні вмісту зрілих форм лімфоїдних клітин – малих лімфоцитів та зниження кількості деструктивно змінених лімфоцитів та апоптотичних клітин у вилочковій залозі щурів з експериментальним цукровим діабетом (лише в субкапсулярній зоні та зоні глибокої кори спостерігалось зростання щільності та частки апоптотичних лімфоцитів після багатоденного введення окситоцину та нейропептида Y). Одержані дані представляють значний практичний інтерес для сучасної діабетології та імунології, так як демонструють порушення імунологічних механізмів дозрівання та диференціювання лімфоцитів при цукровому діабеті, що призводить до розвитку вторинної імунологічної недостатності. Застосовування синтетичних аналогів нейропептидів (окситоцину та нейропептида Y) доцільно, так як в значних випадках зменшує важкість перебігу патологічних процесів.

У роботі був обґрунтований, розроблений і апробований алгоритм автоматичного морфометричного та денситометричного аналізів, з наступним класифікаційним аналізом на підставі ретельних математичних критеріїв, який дозволяв проводити швидкий, якісний, повний та комплексний морфофункціональний аналіз лімфоїдної популяції будь-якого органу імунної системи, та може бути використаний в практичній роботі морфологами, гістологами та імунологами.

Результати наукових досліджень, викладених в дисертації, впроваджені в навчальний процес на кафедрах патологічної фізіології Запорізького, Донецького і Одеського медичних університетів. Впроваджено інформаційного листа про нововведення в системі охорони здоров’я України №257-2003 „Спосіб оцінки морфофункціонального стану вилочкової залози в експерименті”.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно визначена актуальність теми, поставлена мета та сформульовані завдання дослідження, розроблені методи рішення поставлених завдань, написані всі розділи дисертації. Дослідження структури лімфоїдної популяції вилочкової залози в усіх експериментальних групах, а також після багатоденного інтрацеребровентрікулярного та інтраперітонеального введень нейропептидів автором проведені самостійно. Імуноцитофлюоресцентне вивчення ендокринної функції підшлункової залози та лімфоїдної інфільтрації панкреатичних острівців при експериментальному діабеті автором проведені також самостійно. Було проведено імуноцитофлюоресцентне дослідження проліферативної активності лімфоцитів і імуноцитофлюоресцентне виявлення їх CD- антигенів. Розробка алгоритмів автоматичного морфометричного і денситометричного аналізів параметрів клітин лімфоїдної популяції, а також їх математичного класифікаційного аналізу здійснювалася разом із співробітниками кафедри патологічної фізіології Запорізького державного медичного університету.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи доповідались на 4-й Українській конференції молодих вчених (Київ, 2003), на науково-практичній конференції “Сучасні питання ендокринології” (Харків, 2003), на науково-практичній конференції “Роль імунної, ендокринної та нервової систем у процесах морфогенезу та регенерації” (Запоріжжя, 2003), спільному засіданні кафедр патофізіології, нормальної фізіології, оперативної хірургії і топографічної анатомії, патологічної анатомії, фармакології, гістології й ембріології, нормальної анатомії, ЦНДЛ Запорізького державного медичного університету (Запоріжжя, 2003), апробаційному фаховому семінарі спеціалізованої вченої ради Д.11.600.02 при Донецькому державному медичному університеті ім. М Горького (Донецьк, 2004).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 9 наукових робіт: 7 у фахових виданнях, затверджених ВАК України (із них 2 самостійно) та 2 тези.

Обсяг і структура дисертації. Робота викладена на 219 сторінках тексту й складається з вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, чотирьох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, списку використаних літературних джерел, що містить 328 найменувань (135 кирилицею і 193 латиницею). Матеріали дисертації проілюстровані 26 малюнками та 69 таблицями. Обсяг ілюстрацій, таблиць і списку використаних джерел літератури складає 74 повні сторінки.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Дослідження проведені на 150 самцях білих щурів лінії Вістар, масою 230-250 г. Тварини були розподілені на 12 експериментальних груп: 1 група - інтактні тварини; з 2 по 6 групу –тварини с цукровим діабетом; 7 та 8 групи – діабетичні щури, яким інтраперітонеально або інтрацеребровентрікулярно вводили розчин 0,9% NaCL (контроль); з 9 по12 групу – діабетичні щури, яким інтраперітонеально або інтрацеребровентрікулярно вводили синтетичні аналоги нейропептидів (NPY та окситоцин).

Для моделювання діабету використовували стрептозотоцин (SIGMA Chemical, США), який уводили щурам однократно, внутриочеревинно в дозі 50мг/кг. Час, що пройшов із дня введення препарату, надалі характеризувався як тривалість діабету. У всіх експериментальних тварин у сироватці крові до та після введення стрептозотоцину на кожному тижні цукрового діабету здійснювали моніторинг глюкози в крові за допомогою тест-смужок і глюкометра One Touch II (США). В експеримент відбирали тільки тих тварин, у котрих на 1-му тижні після введення препарату спостерігався розвиток гіперглікемії. Концентрацію інсуліну визначали імуноферментним методом за допомогою наборів виробництва Peninsula Laboratories Inс., (США).

Для вивчення функціонального стану ендокринних клітин панкреатичних острівців застосовувався імуноцитофлюоресцентний метод ідентифікації ?- і ?- клітин. Для цього експериментальних тварин в останній день досліджень позбавляли їжі, і після 16 годин голодування декапітували під етаміналовим наркозом. Підшлункову залозу поміщали в фіксатор Буену, після стандартної процедури зневоднювання і просочення хлороформом і парафіном, залозу заливали в парафін. На ротаційному мікротомі готувалися серійні зрізи з різних ділянок підшлункової залози товщиною 5 мкм. Концентрацію інсуліну в - клітинах і глюкагона в -клітинах, а також утримання цих гормонів у панкреатичних острівцях оцінювали методом непрямої імунофлюоресценції за допомогою моноклональних антитіл до інсуліну та глюкагона, виробництва Sigma Chemical (США). При цьому ідентифікувались відповідні типи клітин, визначалася їхня площа, концентрація в них інсуліну і глюкагона, а також утримання цих гормонів в острівцях.

Структуру лімфоїдної популяції вилочкової залози вивчали за допомогою морфометричного і денситометричного аналізів гістологічних зрізів, взятих із різних відділів вилочкової залози, пофарбованих гематоксиліном-еозином, з наступним математичним класифікаційним аналізом. Для проведення подібного аналізу використовували мікроскоп Axioskop (Zeiss, Німеччина), систему цифрового аналізу зображення VIDAS-386 (Kontron Elektronik, Німеччина), а також оригінальне програмне забезпечення на основі макро-мови програмування і бібліотеки функцій із програмного пакета VIDAS 2.5 (Kontron Elektronik, Німеччина). Досліджувалися 4 морфофункціональні зони вилочкової залози - субкапсулярну, внутрішню кортикальну, медулярну і зону внутричасткових периваскулярних просторів (ВПП). Морфометрична та денситометрична характеристика лімфоцитів в лімфоїдній популяції визначалася індивідуально для кожної клітини в автоматичному режимі, що дозволяло одержувати унікальні морфометричні характеристики для будь-якої клітини лімфоїдної популяції вилочкової залози: площу, периметр, максимальний і мінімальний діаметри. Додатковими морфометричними характеристиками лімфоцитів були коефіцієнт форми та коефіцієнт елонгації. Денситометричними характеристиками лімфоїдних клітин були їх абсолютна і питома оптичні щільності. Крім зазначених характеристик лімфоїдних клітин, також оцінювали абсолютну щільність лімфоцитів, яку вимірювали як кількість клітин на 1 мм? площі зрізу вилочкової залози, а також відносну частку кожного класу лімфоцитів в структурі лімфоїдної популяції, яку визначали в процентній (%) частці клітин відносно їх абсолютної щільності.

Характеристику процесів антигенного диференціювання лімфоцитів оцінювали методом ідентифікації поверхневих антигенних детермінант CD4, CD8 та CD134 у серійних гістологічних зрізах вилочкової залози. Для їхнього виявлення застосовували високочутливий імуноцитофлюоресцентний метод за допомогою моноклональних антитіл (виробництво Beckman Coulters, США) із наступним морфометричним аналізом і кількісною оцінкою імуноцитофлюоресцентної реакції. При цьому досліджуваними параметрами були: щільність CD_імунопозитивних лімфоцитів на 1 мм? тканини залози і їхня частка в структурі лімфоїдної популяції, щільність відповідних CD-рецепторів на клітинній мембрані лімфоцитів та відповідність визначеному морфофункційному класу.

Стан проліферативної активності лімфоцитів вилочкової залози оцінювали на основі високочутливої методики імунофлюоресцентного виявлення ядерного антигену клітин, що проліферують (PCNA), за допомогою моноклональних антитіл (виробництво Sigma Chemical, США). У PCNA- імунопозитивних лімфоцитах імунореактивний матеріал розподілявся рівномірно по всій площі клітин. Це дозволяло відносити їх до визначеного класу клітин в лімфоїдній популяції.

Для вивчення впливу окситоцину та NPY на структуру вилочкової залози застосовували багатоденні інтрацеребровентрікулярні та інтраперітонеальні введення цих нейропептидів виробництва фірми Peninsula Laboratories Inс. (США). Для інтрацеребровентрікулярного введення нейропептидів тваринам попередньо імплантували канюлю в правий латеральний шлуночок мозку під етаміналовим наркозом (35 мг/кг внутриочеревинно) за допомогою стереотаксичного апарата THORAX (Угорщина). Тварин фіксували в такому положенні, при якому лінія різців була на 3,3 мм нижче міжвушної лінії. Сталеву стерильну канюлю (калібр G=27) занурювали в мозок по координатах нижнього зрізу канюлі: 8,5 мм уперед між вушної лінії, 1,5 мм вправо від середньої лінії, 4,0 мм нижче даху черепа, після чого канюлю фіксували ніхромовим дротом до гребенів кісток черепа і фіксували зубною швидкозатверджувальною пластмасою, а верхній зріз канюлі закривали стерильним ковпачком. Нейропептиди вводили в обсязі 3 мкл водяного розчину 0,9% NaCl один раз на добу (з 10 до 12 годину) протягом 10 діб. Щоденна доза нейропептидів складала: синтетичного окситоцину - 0,3 нм, нейропептида Y- 2,3 пм. Багатоденне інтраперітонеальне введення нейрогормонів здійснювали внутриочеревинно протягом 10 днів. Щоденна доза гормонів, що вводилася, складала для цього способу введення окситоцину – 3 нм у 0,5 мл 0,9% NaCl, для нейропептида Y -0,6 нм у 0,5 мл 0,9% р-ну NaCl. Контрольним щурам інтраперітонеально або інтрацеребровентрікулярно протягом 10 днів у тому ж обсязі вводили 0,9%розчин NaCl.

Всі отримані експериментальні дані обробляли на IBM-сумісному персональному комп'ютері пакетом прикладних і статистичних програм VIDAS-2.5 (Kontron Elektronik, Німеччина) і EXCEL з пакету MS Office 2000 (Microsoft Corp., США). Статистичне оцінювання експериментальних даних і вірогідність відмін в групах визначали t- статистикою Ст’юдента.

Основні результати досліджень та їх обговорення. Встановлено, що розвиток діабету супроводжувався поступовим наростанням рівня глікемії у експериментальних тварин від 2,8±0,1 ммоль/л до 22,5±1,1 ммоль/л до кінця 5-го тижня плину діабету. Зміст інсуліну в плазмі крові контрольних тварин складав 19,2±0,8 пмоль/л і в динаміці розвитку експериментального цукрового діабету вірогідно знижувався до 6,4 ±0,9 пмоль/ л (на 5-му тижні діабету).

При оглядовому мікроскопічному дослідженні підшлункової залози виявлений цілий ряд морфологічних ознак, що вказують на те, що істотну роль у деструкції панкреатичних острівців при експериментальному цукровому діабеті грає імунна атака, здійснювана лімфоїдними клітинами. На початкових етапах розвитку патологічного процесу в підшлунковій залозі (1-го і 2-го тижня діабету) відзначалася виражена дилятація судин. У просвіті судин і в перисудинній зоні виявлялося багато лімфоцитів, а також у навколишній острівці екзокринній частині підшлункової залози, що характерно для периінсуліта. Починаючи з 4-го тижня діабету спостерігалася інфільтрація острівців лімфоцитами і деструкція ?-клітин. Виразність інсуліту на цій стадії широко варіювала від змін, що ледь виявлялись, до середньої виразності локальних запалень острівців з наступною важкою поразкою одних острівців і збереженням інших і, нарешті, спостерігалося тотальне руйнування острівців з одиночною інфільтрацією лімфоцитами. Вивчення фенотипу лімфоцитів, інфільтруючих панкреатичні острівці, показало, що серед них переважали CD8_імунопозитивні лімфоцити (Т- кілери), а також зустрічалися поодинокі СD4+лімфоцити (Т- хелпери), та CD134- імунопозитивні лімфоцити.

Вивчення процесів синтезу островкових гормонів при діабеті за допомогою моноклональних антитіл показало вірогідне зниження площі матеріалу, імунореактивного до інсуліну. Характерно, що вже до кінця 1-го тижня патологічного процесу (площа матеріалу 5422±267мкм? у контрольних тварин) величина даного показника зменшувалася більш ніж у 2 рази і складала 2465±213мкм? у щурів з 1 тижневим діабетом, а в кінці експерименту цей параметр складав приблизно 10% від значення в контрольній групі тварин (565±50мкм?). Подібні зміни характеризували процес деструкції панкреатичних острівців, що підтверджувалося вірогідним зменшенням кількості ідентифікованих ? _клітин, частка яких до кінця 5-го тижня патологічного процесу складала приблизно 12% (4 ±1 ?- клітини на островок) від їх первісної кількості (33±2 ?- клітини на островок). Деструкція панкреатичних острівців і зменшення кількості ?- клітин при діабеті супроводжувалося компенсаторним підвищенням у них концентрації імунореактивного інсуліну, хоча зміст самого гормону в острівцях прогресивно знижувався, відбиваючи важкість перебігу патологічного процесу, і до кінця 5-го тижня складала приблизно 14% від рівня в контрольній групі тварин.

Розвиток цукрового діабету призводив до вірогідного збільшення в панкреатичних острівцях площі матеріалу, імунореактивного до глюкагона, частка якого до кінця 2-го тижня збільшувалася приблизно в 1,5 рази в порівнянні з контролем. Це було пов'язано з вірогідним збільшенням кількості ?_клітин в острівцях, які у тварин з цукровим діабетом розташовувалися не тільки по периферії панкреатичних острівців, але й у їхній центральній частині. Ці зміни сполучалися з вірогідним збільшенням концентрації глюкагона в ?_клітинах і змісту гормону в острівцях. З огляду на отримані нами дані про характер лімфоїдної інфільтрації панкреатичних острівців і дані літератури про роль аутоіммунної деструкції в патогенезі цукрового діабету (Васильєва Е.В., 1998, Гриневич Ю.А., 1991, Жук Е.А., 1997, Kato S.,Owen J.J., 1997), ми припустили, що імунопатологічний характер перебігу цукрового діабету повинний супроводжуватися зміною функціонального стану і такого центрального органа імуногенезу, як вилочкова залоза. Це положення підтверджується даними інших досліджень, що доводять і показують, що у хворих цукровим діабетом мають бути визначені порушення функції вилочкової залози (Мохорт Т.В., 2000 та інші). Вони пов’язані з гальмуванням проліферативної відповіді тимоцитів на антигени та митогени, появою “ненормально” високої кількості незрілих тимоцитів, супроводжувалися порушенням архітектоніки тимусного матрикса (Полторак В.В., Блох К.О., 1999). Аналізуючи взаємозв'язок між функціональними порушеннями у вилочковій залозі і розвитком цукрового діабету, рядом авторів була сформульована концепція про те, що в розвитку останнього ключову роль відіграє вроджена чи придбана дисфункція вилочкової залози, яка супроводжувалася порушенням регуляторних механізмів імуногенезу і диференціювання Т_лімфоцитів (Сєров В.В., Зайратьянц О.В., 1998). Виходячи з вищевикладеного, подальше дослідження було присвячено вивченню змін структури лімфоїдної популяції в основних морфофункційних зонах вилочкової залози щурів в динаміці розвитку експериментального цукрового діабету.

Вивчаючи особливості лімфоїдної популяції вилочкової залози щурів у динаміці розвитку експериментального цукрового діабету ми встановили зниження чисельності клітин лімфоїдної популяції і порушення кількісного співвідношення окремих класів лімфоцитів у всіх морфофункційних зонах залози і на всіх тижнях експериментального діабету.

Так, у діабетичних щурів в усіх досліджуваних зонах вилочкової залози відбувалося зменшення відносної (%) і абсолютної щільностей (кількості клітин на 1 мм? площі зрізу вилочкової залози) практично всіх класів лімфоїдних клітин популяції і зростання апоптотичних лімфоцитів, та лімфоцитів з ознаками деструкції, що були морфологічним підтвердженням іммунодепресивного впливу цукрового діабету на центральний орган імуногенезу. В динаміці розвитку цукрового діабету знижувалася сумарна щільність лімфоцитів в усіх зонах вилочкової залози: в субкапсулярній зоні на 29%, зоні глибокої кори на 33%, зоні ВПП на 37%, медулярній зоні на 31% (див рис. 1), тоді як доля деструктивно змінених та апоптотичних лімфоцитів в зоні глибокої кори та ВПП зростала. Зменшення сумарної кількості лімфоцитів відбувалося за рахунок зниження, головним чином, кількості малих лімфоцитів в усіх зонах вилочкової залози.

Експериментальні дослідження зафіксували значні порушення процесів диференціювання лімфоцитів вилочкової залози, що виражалися в змінах співвідношень різних класів CD4- і CD8- імунопозитивних лімфоцитів У діабетичних щурів спостерігалася протилежна спрямованість зміни сумарної щільності Т- хелперів (CD4- імунопозитивних лімфоцитів): суттєве зниження на 1 тижні в корковій речовині з поступовим зростанням кількості Т- хелперів на 4 тижні, а в мозковій речовині - поступове збільшення цього класу імунопозитивних клітин з максимальним наростанням також на 4 тижні (див. рис. 2) Вивчення щільності CD-рецепторів на CD4- імунопозитивних лімфоцитах у корковій і мозковій речовині показало деяке зниження щільності рецепторів на СD4- імунопозитивних лімфоцитах на 2-му тижні, і зростання цього показника з 3-го тижня діабету. Питома кількість CD8–імунопозитивних лімфоцитів при діабеті в корковій і мозковій речовинах характеризувалися односпрямованими фазними змінами Т- кілерів на 2-му і 4-му тижнях діабету (див рис. 2). Цей факт в дослідженнях повністю відповідає раніше представленій морфологічній картині лімфоїдної інфільтрації панкреатичних острівців СD8- імунопозитивними лімфоцитами при цукровому діабеті. Відзначалося деяке зниження щільності рецепторів на СD8-імунопозитивних лімфоцитах на 2-му тижні, і зростання цього показника на 4-му тижні експерименту.

Рис. 1 Сумарна щільність лімфоїдних клітин на 1мм? площі зрізу вилочкової залози в різних морфофункціональних зонах вилочкової залози в динаміці розвитку цукрового діабету, p<0,05.

Вивчення динаміки СD134-імунопозитивних лімфоцитів (активованих Т-лімфоцитів) при цукровому діабеті зафіксувало поступове збільшення сумарної щільності клітин цього фенотипу з піком на 4 тижні експериментального діабету в корковій і мозковій речовинах. З огляду на ту обставину, що антиген CD134 є рецептором до фактору некрозу пухлин - альфа, це може свідчити про збільшення імовірності апоптозу лімфоцитів вилочкової залози, що підтверджується даними морфометричного і денситометричного аналізів.

Вивчення проліферативної активності лімфоцитів у динаміці розвитку експериментального цукрового діабету показало фазні зміни сумарної щільності проліферируючих лімфоцитів у корковій і мозковій речовинах зі збільшенням на 1-му і 3-4-му тижнях та депресією цього показника на 2-му і 5-му тижнях діабету.

Рис. 2. Кількість CD4 (зліва) і CD8-імунопозитивних лімфоцитів (справа) у корковій і медулярній зонах вилочкової залози в динаміці розвитку цукрового діабету, p<0,05.

Таким чином, отримані нами дані свідчать про істотні зміни функціонального стану вилочкової залози при цукровому діабеті, що характеризувалися: зниженням сумарної щільності лімфоцитів у всіх морфофункційних зонах, збільшенням частки деструктивно змінених і апоптичних лімфоцитів, зменшенням щільності зрілих клітин лімфоїдної популяції, порушенням процесів диференціювання і проліферативної активності лімфоцитів. Отримані нами результати свідчать про безсумнівне залучення вилочкової залози в патологічний процес при цукровому діабеті. Тому, з метою розробки можливих способів корекції виникаючих імунних порушень при цукровому діабеті, що випливає наступним завданням дослідження, було вивчення стану лімфоїдної популяції вилочкової залози після багатоденного введення нейропептидів діабетичним щурам. Так, після інтрацеребровентрікулярного ведення нейропептида Y спостерігалося значне збільшення сумарної щільності лімфоїдних клітин у всіх зонах вилочкової залози, в основному за рахунок збільшення щільності малих і середніх лімфоцитів, а також зниження частки деструктивних лімфоцитів і апоптичних лімфоцитів. Так, в субкапсулярній зоні вилочкової залози щурів збільшувалася сумарна щільність на 22% в порівнянні з контрольною групою тварин. Під впливом введення нейропептида Y в субкапсулярній зоні змінювався спектр лімфоїдних клітин, який характеризувався наростанням питомої щільності лімфобластів на 6%, великих лімфоцитів на 30%, середніх лімфоцитів на 39% і малих лімфоцитів на 11% в порівнянні з контрольною групою тварин. Сумарна питома щільність лімфоїдних клітин в глибокій корі вилочкової залози після інтрацеребровентрікулярного введення NPY діабетичним тваринам збільшувалася на 25% в порівнянні з контрольною групою тварин (див. рис. 3).

Рис. 3. Сумарна кількість лімфоїдних клітин на 1 мм? площі зрізу вилочкової залози діабетичних щурів після інтраперітонеального та інтрацеребровентрікулярного введень NPY.

Зміна спектру лімфоїдних клітин в глибокій корі характеризувалася значним наростанням питомої щільності малих лімфоцитів (на 55%). Сумарна питома щільність лімфоїдних клітин у внутричасткових периваскулярних просторах вилочкової залози після інтрацеребровентрікулярного введення нейропептида Y діабетичним тваринам збільшувалася на 24%. Сумарна питома щільність лімфоїдних клітин в медулярній зоні вилочкової залози після інтрацеребровентрікулярного введення нейропептида Y діабетичним тваринам збільшувалася на 23% в порівнянні з контрольною групою тварин. В результаті інтраперітонеального введення нейропептида Y в усіх досліджуваних зонах вилочкової залози спостерігалося менш виражене збільшення сумарної питомої щільності лімфоїдних клітин в зрівнянні з інтрацеребровентрікулярним введенням NPY. В результаті інтрацеребровентрікулярного введення окситоцину не спостерігалися вірогідні зміни сумарної щільності популяції лімфоїдних клітин у всіх зонах вилочкової залози, хоча щільність окремих класів клітин збільшувалася (великих та середніх лімфоцитів). В структурі лімфоїдної популяції відбувалося збільшення частки великих і середніх лімфоцитів, а відсоткова частка малих лімфоцитів у всіх зонах вірогідно зменшувалася. В результаті інтраперітонеального введення окситоцину відбувалося значне збільшення сумарної щільності лімфоїдних клітин у всіх досліджуваних зонах вилочкової залози, за винятком медулярної зони. Найбільш значне збільшення сумарної щільності спостерігалося в глибокій корі (на 38%), в периваскулярних просторах (на 35%) і в субкапсулярній зоні (на 32%). Сумарна щільність апоптотичних і деструктивно змінених лімфоцитів зростала тільки в глибокій корі (на 65%). В цілому необхідно відзначити, що інтраперітонеальне введення окситоцину надає більш позитивний ефект на відновлення структури популяції вилочкової залози діабетичних тварин, в порівнянні з інтрацеребровентрікулярним введенням окситоцину (див. рис.4).

Рис. 4. Сумарна кількість лімфоїдних клітин на 1 мм? площі зрізу вилочкової залози діабетичних щурів після інтрацеребровентрікулярного та інтраперітонеального введень окситоцину.

ВИСНОВКИ

В дисертації наведено теоретичне і експериментальне рішення наукової проблеми щодо особливості функціонального стану лімфоцитів вилочкової залози й ендокринних клітин підшлункової залози в динаміці розвитку експериментального цукрового діабету та його змін при введенні синтетичних нейропептидів.

1. У вилочковій залозі інтактних щурів найбільш високі показники питомої щільності лімфоцитів спостерігалися в зоні глибокої кори, а найменші в медулярній зоні. В структурі лімфоїдної популяції переважали малі лімфоцити, а найменш представлені лімфобласти, які концентрувалися в субкапсулярній зоні. В динаміці п’ятитижневого експериментального цукрового діабету в усіх морфофункціональних зонах вилочкової залози спостерігалося прогресуюче зменшення чисельності кожного класу лімфоцитів, яке супроводжувалося зростанням процентної частки деструктивно змінених лімфоцитів і апоптотичних клітин. Десятиденне введення нейропептида Y призводило до вірогідного зростання чисельності лімфоцитів, а також суттєвого зменшення процентної частки деструктивно змінених і апоптотичних лімфоцитів в усіх зонах вилочкової залози за винятком глибокої кори, де їх доля зростала. При цьому ефекти інтрацеребровентрікулярного введення нейропептида Y були більш вираженні, ніж при його інтраперітонеальному введенні. Десятиденне введення окситоцину призводило до вірогідного зростання чисельності лімфоцитів у вилочковій залозі тільки при його інтраперітонеальному введенні.

2. В корковій зоні вилочкової залози інтактних щурів переважали СD4_імунопозитивні лімфоцити (Т- хелпери), а в медулярній зоні СD8_імунопозитивні (Т-кілери), щільність СD- рецепторів яких зростала по мірі дозрівання лімфоцитів. В динаміці розвитку діабету показники питомої чисельності CD4_імунопозитивних лімфоцитів характеризувалися різноспрямованими змінами: зниженням їх кількості в корковій зоні і суттєвим зростанням чисельності в медулярній зоні. В корковій і медулярній зонах вилочкової залози діабетичних щурів спостерігались фазні зростання питомої кількості CD8_імунопозитивних лімфоцитів, максимально виражені на 2-му і 4-му тижнях розвитку патологічного процесу.

3. Проліферація лімфоцитів спостерігалась як в корковій, так і в медулярній зоні вилочкової залози інтактних щурів, до того ж, в останній - питомий показник проліферативної активності був приблизно на 30% вище. Серед клітин, які діляться, домінували малі лімфоцити, а їх частка становила до 50% від загальної чисельності PCNA-імунопозитивних лімфоцитів. В динаміці цукрового діабету спостерігались фазні зміни проліферативної активності лімфоцитів вилочкової залози: її підвищення на 1-му та 3-4-му тижнях розвитку патологічного процесу та депресією до контрольного рівня на 2-му і 5-му тижнях.

4. Дослідження інтенсивності процесів утворення активованих Т- лімфоцитів вилочкової залози встановило, що чисельність активованих CD134-імунопозитивних лімфоцитів вірогідно зростала тільки в кінці експерименту (4 -5 тиждень).

5. Розвиток експериментального цукрового діабету характеризувався деструкцією ?- клітин і супроводжувався розвитком лімфоїдної інфільтрації панкреатичних острівців, максимально вираженою на 3-4-му тижнях розвитку патологічного процесу, з переважливим типом клітин в інфільтраті СD8 і СD134-імунопозитивних лімфоцитів.

СПИСОК ПРАЦЬ ЗДОБУВАЧА, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Любомирская В.А. Динамика лимфоидной популяции тимуса при экспериментальном сахарном диабете у крыс //Український медичний альманах.- 2002, Т.5, №3. – С.80-82.

2. Абрамов А.В., Колесник Ю.М., Любомирська В.А., Камишний О.М. Характеристика процессов дифференцировки лимфоцитов вилочковой железы у крыс (светооптическое и иммуноцитохимическое ииследование). //Запорожский медицинский журнал.- 2002.- №4.- С.10-13. (Внесок автора полягає в проведенні моделювання експериментальної патології, проведенні статистичної обробки отриманих даних).

3. Абрамов А.В., Колесник Ю.М., Любомирська В.А., Камишний О.М. Алгоритм автоматичного аналізу лімфоїдної популяції тимуса. //Вісник морфології. - 2002. – Т.8, №2.- С. 261-262. (Внесок автора полягає в проведенні експериментальної частині роботи, комп’ютерного забезпечення обробки даних дослідження та проведенні їх статистичної обробки)

4. Абрамов А.В., Камышный А.М., Колесник Ю.М., Любомирская В.А. Структурно-функциональна организация лимфоидной популяции тимуса: опыт применения математического классификационного анализа //Клінічна та експериментальна патологія. - 2002.- Т.1, №1.-С.5-9. (Внесок автора полягає в участі у розробці алгоритму автоматичного аналізу вилочкової залози, в отриманні даних функціонального стану вилочкової залози, їх статистичної обробки).

5. Абрамов А.В., Камышный А.М., Любомирская В.А., Колесник Ю.М. Эффекты многократного введения нейропептида Y на структуру лимфоидной популяции тимуса в норме и при экспериментальном сахарном диабете //Запорожский медицинский журнал.- 2003.- №5.- С.4-6. (Внесок автора полягає в проведенні експериментальних досліджень, виконанні статистичної обробки результатів).

6. Любомирська В.А., Абрамов А.В., Колесник Ю.М. Вплив нейропептида Y на структуру лімфоїдної популяції вилочкової залози при експериментальному цукровому діабеті // Ендокринологія.- 2003,- Т. 8, № 2, С.187-193. (Внесок автора полягає в участі при введенні нейропептидів двома шляхами, обробці даних про зміни в структурі вилочкової залози, проведенні їх статистичної обробки).

7. Любомирська В.А. Вплив окситоцину на структуру лімфоїдної популяції вилочкової залози у щурів з експериментальним цукровим діабетом. //Актуальні питання фармацевтичної та медичної науки та практики: Зб. наук. ст. - Запоріжжя: Видавництво ЗДМУ, 2003.- Вип. XI.- С.97-102.

8. Любомирская В.А. Особенности цитоархитектоники и процессов дифференцировки лимфоцитов в вилочковой железе у крыс в динамике сахарного диабета. //Матеріали IV Української конференції молодих вчених, присвяченій пам'яті академіка В.В. Фролькіса.-Київ.- 2003.- С.146-147.

9. Любомирская В.А., Абрамов А.В. Особенности цитоархитектоники вилочковой железы у крыс с экспериментальным сахарным диабетом //Матеріали науково-практ. конф. з міжнародною участю “Сучасні питання розвитку ендокринології”.- Харків.- 2003. - С. 131-133. (Внесок автора полягає в отриманні даних по зміни цитоархитектоники вилочкової залози в динаміці цукрового діабету та проведенні їх статистичної обробки).

АНОТАЦІЯ

Любомирська В. А. Функціональний стан лімфоїдної популяції вилочкової залози у динаміці розвитку цукрового діабету і його модуляція за допомогою синтетичних нейропептидів.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.04- патологічна фізіологія. - Донецький державний медичний університет ім. М Горького МОЗ України, Донецьк, 2004.

Дисертацію присвячено вивченню функціонального стану лімфоїдної популяції вилочкової залози й ендокринних клітин підшлункової залози при експериментальному цукровому діабеті, а також корекції імунних порушень за допомогою синтетичних гіпоталамічних нейропептидів. Для виконання завдань дослідження використовувалися морфометричні, гістохімічні та імуноцитохімічні методи, а також методи математичного класифікаційного і статистичного аналізу отриманих результатів. У результаті дослідження встановлено, що розвиток експериментального цукрового діабету характеризувався деструкцією ?-клітин, сполучався з розвитком лімфоїдної інфільтрації панкреатичних острівців з перевагою в них СD8 та СD134- імунопозитивних клітин. У динаміці цукрового діабету у вилочковій залозі спостерігалось прогресуюче зменшення чисельності всіх класів лімфоцитів і наростання кількості деструктивно змінених лімфоцитів і апоптотичних клітин. Розвиток діабету характеризувався значними порушеннями процесів диференціювання та проліферативної активності лімфоцитів вилочкової залози. Десятиденне інтрацеребровентрікулярне введення нейропептида Y призводило до вірогідного наростання щільності популяції лімфоїдних клітин у вилочковій залозі. Десятиденне введення окситоцину призводило до прогресуючого зростання щільності популяції лімфоїдних клітин у вилочковій залозі переважно за рахунок збільшення кількості малих лімфоцитів тільки при його інтраперітонеальному введенні. При обох шляхах введення процентна частка деструктивно змінених і апоптотичних лімфоцитів, за винятком глибокої кори, помірно зростала.

Ключові слова: вилочкова залоза, цукровий діабет, нейропептиди, панкреатичні острівці.

АННОТАЦИЯ

Любомирская В. А. Функциональное состояние лимфоидной популяции вилочковой железы в динамике развития сахарного диабета и его модуляция с помощью синтетических нейропептидов. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.04 - патологическая физиология. - Донецкий государственный медицинский университет МОЗ Украины, Донецк, 2004г.

Диссертация посвящена изучению функционального состояния лимфоидной популяции вилочковой железы и эндокринных клеток поджелудочной железы при экспериментальном сахарном диабете, а также коррекции возникающих иммунных нарушений с помощью синтетических аналогов гипоталамических нейропептидов. Исследования проводились на 155 самцах крыс линии Вистар массой 230-250 г. Животные были разделены на 12 экспериментальных групп: 1 группа - интактные животные; с 2 по 6 группу – животные с сахарным диабетом; 7 и 8 группы – диабетические крысы, которым интраперитонеально или интрацеребровентрикулярно вводили раствор 0,9% NaCL (контроль); с 9 по12 группу – диабетические крысы, которым интраперитонеально или интрацеребровентрикулярно вводили синтетические аналоги нейропептидов (NPY и окситоцин).

Объектом исследования была вилочковая железа и эндокринная часть поджелудочной железы. О функциональном состоянии лимфоидных клеток вилочковой железы судили на основании изучения серийных гистологических срезов из различных отделов железы и данных морфометрических и денситометрических характеристик при окраске гематоксилином-эозином, данных иммуноцитофлюоресцентного выявления клеточных антигенных маркеров CD4, CD8 и CD134, а также данных иммуноцитофлюоресцентного выявления ядерного антигена клеточной пролиферации PCNA. Для проведения подобного анализа