КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

ЛЯШЕНКО ВАЛЕНТИНА ПЕТРІВНА

УДК 612.08+612:546.41+612.397

РОЛЬ КАЛЬЦІЮ В СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНИХ ЗМІНАХ ТКАНИН ЗА УМОВ ГІПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМІЇ

03.00.13 - фізіологія людини і тварин

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Дніпропетровському національному університеті МОН України

Науковий консультант:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Шаповал Людмила Миколаївна,

Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України,

провідний науковий співробітник відділу фізіології кровообігу

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Янчук Петро Іванович,

НДІ фізіології імені акад. Петра Богача Київського національного університету

імені Тараса Шевченка, старший науковий співробітник відділу загальної фізіології

доктор біологічних наук

Скрипнюк Зеновій Дмитрович,

Науково-дослідний інститут інтегративної-негентропійної Медицини,

керівник відділу біоінформатики

доктор медичних наук, професор

Неруш Петро Опанасович,

Дніпропетровська медична академія МОЗ України,

завідувач кафедрою нормальної фізіології

Провідна установа:

Національний медичний університет ім. О. О. Богомольця МОЗ України,

кафедра нормальної фізіології, м. Київ

Захист відбудеться 11 травня 2005 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 у Київському національному університеті ім. Тараса Шевченка (проспект академіка Глушкова, 2, біологічний факультет).

Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64.

З дисертацією можна ознайомитися у науковій бібліотеці

Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою:

01033, Київ-33, вул. Володимирська, 58.

Автореферат дисертації розісланий 6 квітня 2005 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Цимбалюк О. В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. За фізіологічних умов холестерин (ХС) є головним ліпідним компонентом плазматичних мембран клітин, попередником стероїдних гормонів і жовчних кислот. Звичайно він надходить до організму при споживанні їжі, багатої на ХС. Надлишкове надходження ХС в організм лежить в основі аліментарної гіперхолестеринемії (ГХС), яка, по суті, є екзогенною і спостерігається не досить часто [Лопухин, Арчаков, 1983, 1991; Климов, Никульчева, 1995; Moriel et al., 2000]. Відомо, що практично всі клітини організму можуть в тій чи іншій мірі синтезувати ХС з ацетату та інших низькомолекулярних сполук, що регулюється концентрацією як внутрішньоклітинного, так і позаклітинного холестерину [Томсон, 1990; Амосова, 1996; Золотарева, Бабов, 1999; Dietschy, Turley, 2001]. Тривале надлишкове утворення ендогенного ХС робить можливим розвиток ГХС і сприяти розвитку ряду патологічних станів, зокрема атеросклерозу, ішемічної хвороби серця, панкреатиту, ксантом та інших [Якушкин, Орехов, 1992; Поляков, Прокопова, 1998; Теппермен, Теппермен, 1989; Какауридзе, 2001; Либов, Иткин, Черкесова, 2001; Кульчицкий и соавт., 2002]. Важливим фактором, що сприяє надлишковому утворенню ендогенного ХС є стрес, але, незважаючи на значну кількість експериментального і клінічного матеріалу, який накопичений з проблем стресу, питання про механізм стрес-індукованої ГХС до теперішнього часу залишається значною мірою відкритим.

На цей час отримані дані про надмірне накопичення кальцію в аорті її ушкодження при ГХС [Вихерт, Сєдов, Соколова, 1970; Сперелакис, 1988; Чазов, 1992; Kummerow et al., 1994; Perrault et al., 2000]. Відомо, що порушення кальцієвого гомеостазу негативно впливає на функціональну активність кардіоміоцитів, нейронів, гепатоцитів, скоротливу активність судин і скелетних м’язів [Курский, 1989; Логинов, Митюшин, 1994; Гавриш, Сергиенко, Лисовец, 1999; Ходоров, 2000; Bennani-Kabchi et al., 2000; Hu, Fukuda, Su, 2001; Liu et al., 2003; Бондаренко, 2004], тому важливим уявляється дослідження вмісту кальцію в цих органах та виявлення можливих шляхів порушення кальцієвого гомеостазу в умовах розвитку ендогенної ГХС. На цей час питання про вплив надлишку кальцію в цих органах на їхню морфо-функціональну організацію при ендогенній ГХС залишається не вивченим.

Зважаючи на те, що вхід Са2+ в клітини значною мірою забезпечують потенціалзалежні Са2+-канали (які широко поширені у нейронах ЦНС, кардіоміоцитах, гладеньких м’язах судин) [Дьячук, 1991; Авдонин, Ткачук, 1994; Lemay et al., 2001; Костюк, Костюк, 2003], 1-адренорецептори [Ikeno et al., 1998; Пшенникова, 2000, 2001; Bur et al., 2002; Lopez-Farre et al., 2002], або рецептори ренін-ангіотензинової системи [Tamura, Harris, Gerdes, 2000; Duman et al., 2001; Wassmann et al., 2002], порушення їхньої роботи можуть сприяти надмірному накопиченню кальцію в тканинах, але питання про відносний вклад цих шляхів у зміни функціонування організму в умовах ендогенної ГХС залишається відкритим.

Ендогенна ГХС є таким станом організму, при якому відбуваються значні метаболічні перебудови в різних органах, і розуміння принципів регуляції кальцію в цих умовах має важливе значення як для розширення наших уявлень про механізми виникнення ендогенної ГХС, так і для пошуку шляхів її корекції. Логіка виконаної роботи полягала у створенні експериментальної моделі ендогенної ГХС у щурів, які є зручним об’єктом для досліджень, але вважаються мало чутливими до надлишку екзогенного ХС; у визначенні вмісту кальцію в різних органах і порушень їхньої морфо-функціональної організації в умовах розвитку ендогенної ГХС; в аналізі вкладу різних шляхів надходження надлишкового кальцію в зміни морфо-функціональної організації ряду органів при ендогенній ГХС.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація є фрагментом наукової роботи кафедри фізіології людини і тварин Дніпропетровського національного університету за темами:

“Дослідження нервових механізмів керування, регуляції і зв’язку в організмі людини і тварин”, № державної реєстрації 0195V023144;

“Фундаментальні дослідження впливу синергічних екопатогенних чинників та наукове обґрунтування нових комплексних методів діагностики, корекції та профілактики порушень стану здоровя населення”, № державної реєстрації 0197V000655;

“Дослідження змін масових потенціалів спинного мозку в залежності від віку”, № державної реєстрації 0100U005213;

“Фундаментальні комплексні дослідження фізіологічних механізмів виникнення, розвитку та прояву серцево-судинних та шлунково-кишкових порушень”, № реєстрації по ДНУ БЕФ-85.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи – розробити у щурів експериментальну модель ендогенної гіперхолестеринемії і на відтвореній моделі дослідити роль кальцію в розвитку структурно-функціональних змін аорти, серця, печінки, головного мозку, скелетних м’язів.

Для досягнення вказаної мети в роботі вирішуються такі основні задачі:

Розробити модель ендогенної ГХС у щурів, в основі якої лежить створення зооконфліктної ситуації внаслідок обмеження їхнього життєвого простору. Провести порівняльний аналіз розробленої моделі ендогенної ГХС і аліментарної ГХС, в основі якої лежить надходження надлишкового ХС ззовні.

Провести порівняльний аналіз впливу екзогенної і ендогенної гіперхолестеринемії на морфологічну структуру аорти, серця, скелетного м’язу, печінки і головного мозку.

Визначити вміст кальцію в плазмі крові та тканинах досліджуваних органів щурів при ендогенній гіперхолестеринемії.

Вивчити вплив блокування потенціалзалежних Са2+ каналів L-типу на вміст кальцію в досліджуваних тканинах, а також загального ХС і холестерину ліпопротеїдів високої щільності (ХС ЛПВЩ) в сироватці крові на фоні розвитку ендогенної ГХС.

Вивчити вплив блокування ангіотензинперетворюючого ферменту (АПФ) на вміст тканинного кальцію, загального ХС і ХС ЛПВЩ в крові при відтворенні ендогенної ГХС.

Виявити вплив блокування 1-адренорецепторів на динаміку вмісту кальцію в досліджуваних тканинах, а також загального ХС і ХС ЛПВЩ в сироватці крові при ендогенній ГХС.

Вивчити вплив К+ і Mg2+ на динаміку рівня кальцію в органах і рівня ХС і ХС ЛПВЩ в сироватці крові при ендогенній гіперхолестеринемії.

Визначити вплив блокування потенціалзалежних Са2+ каналів L-типу, 1-адренорецепторів, АПФ, К+ і Mg2+ на мембранний потенціал і електричні реакції ендотелію аорти щурів на фоні розвитку ендогенної ГХС.

Вивчити особливості скоротливої активності ізольованих препаратів судин після блокування Са2+ каналів L-типу, 1-адренорецепторів, АПФ і застосування калій-, магній-аспарагінату при ендогенній ГХС.

Проаналізувати особливості параметрів ЕМГ, нейро-міогенних зв’язків, рухової і дослідницької діяльності тварин при застосуванні антагоністів кальцію на фоні розвитку гіперхолестеринемії.

Об’єкт дослідження. Показники рівня тканинного кальцію за фізіологічних умов, в умовах розвитку гіперхолестеринемії і застосування антагоністів кальцію, а також параметри функціонального стану організму: мембранний потенціал ендотелію аорти, скоротлива активність ізольованих препаратів артерій, частота серцевих скорочень, фонова електроміограма, рухова і дослідницька діяльність тварин.

Предмет дослідження. Роль кальцію в функціональних і структурних змінах, що виникають в умовах гіперхолестеринемії.

Методи дослідження. В роботі використані фізіологічні, біохімічні, морфологічні і математичні методи наукового аналізу.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше у щурів розроблена експериментальна модель ендогенної гіперхолестеринемії (ГХС) шляхом створення зооконфліктної ситуації внаслідок обмеження їхнього життєвого простору і використання NaCI у якості кондиціонуючого фактора. Доведені переваги розробленої моделі перед моделлю аліментарної гіперхолестеринемії у щурів. На відтворенній моделі ендогенної гіперхолестеринемії вперше виявлені і описані зміни морфологічної структури аорти, серця, скелетного м’язу, печінки і головного мозку. Показано, що в умовах ендогенної ГХС структурні зміни досліджених органів розвивались швидше і були більш вираженими, ніж при екзогенній ГХС. Визначено, що резистентність різних органів до стійкого підвищення рівня ХС неоднакова.

Вперше одержані дані про динаміку рівня тканинного кальцію в аорті, серці, скелетних м’язах, печінці і головному мозку щурів в умовах розвитку ендогенної гіперхолестеринемії. Встановлено, що вміст кальцію у всіх досліджених органах значно перевершував рівень його фізіологічної норми.

Встановлено, що блокування потенціал-залежних Ca2+ каналів L-типу, 1-адренорецепторів, АПФ або введення K+ і Mg2+, супроводжувалось зниженням рівня кальцію в усіх досліджених органах, що здебільшого корелювало з вмістом кальцію, ХС і ХС ЛПВЩ в сироватці крові.

Вперше показано, що в умовах ендогенної гіперхолестеринемії, зумовленої зооконфліктною ситуацією, у щурів пригнічувались ацетилхолін-індуковані електричні реакції та скоротлива активність ізольованих препаратів судин, відмічалась модуляція параметрів фонової ЕМГ, посилювалась рухова і послаблювалась дослідницька діяльність тварин. Доведено, що найбільш чутливими до гіперхолестеринемічного стану є показники електричної і скоротливої активності ізольованих препаратів черевної аорти. Зміни показників ЧСС, параметрів ЕМГ, рухової і дослідницької діяльності в умовах ГХС були менш вираженими.

Вперше доведено, що при ендогенній ГХС порушення кальцієвого гомеостазу і активності досліджених функціональних систем в найбільшій мірі були зумовлені надмірною активацією потенціалзалежних Ca2+ каналів L-типу і 1-адренорецепторів, що призводило до надмірного накопичення кальцію в тканинах всіх досліджених органів і пригнічення їхньої функціональної активності.

Практичне та теоретичне значення отриманих результатів. Отримані нами відомості про те, що при тривалій ГХС відбувається значне збільшення вмісту кальцію в аорті, серці, скелетному м’язі, печінці і головному мозку внаслідок надмірної активації потенціалзалежних Ca2+ каналів L-типу, 1-адренорецепторів і ренін-ангіотензинової системи, можна суттєво зменшити шляхом їх блокування, можуть бути корисними для корекції наслідків тривалої ГХС. Отримані результати можуть бути врахованими в клінічній практиці при визначенні часу перебігу адаптаційної реакції на надлишок ХС в патологічний синдром і при виборі антагоністів кальцію для корекції структурно-функціональних змін організму при розвитку ендогенної гіперхолестеринемії. Отримані нами результати можуть бути корисними при розробці нових методів профілактики гіперхолестеринемічного ушкодження клітин; вони можуть бути врахованими при розробці нових діагностичних маркерів розвитку ушкодження, особливо на ранніх, доклінічних стадіях патологічного процесу.

Отримані результати можуть бути використані в учбовому процесі, зокрема в курсі загальної і патологічної фізіології людини і тварин, а також у спецкурсах фізіології серцево-судинної системи, фізіології нервів та м’язів, обміну речовин і енергії.

Теоретичне значення роботи полягає у тому, що наведені дані поглиблюють сучасні уявлення про важливе значення порушень кальцієвого гомеостазу в розвитку ендогенної гіперхолестеринемії, що може сприяти більш повному розумінню механізмів функціонування організму як системи.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведено патентно-інформаційний пошук, визначено мету і задачі роботи, особисто виконані всі експерименти по визначенню вмісту тканинного кальцію в органах, рівня гіперхолестеринемії і модуляції параметрів ЕМГ, ЧСС, а також рухової і дослідницької діяльності тварин. Експерименти по визначенню морфологічних змін в досліджуваних органах і впливах антагоністів кальцію проводились разом з к.м.н. Коцарєвим О. С. і к.м.н. Лукашовим С. М. на базі біолого-екологічного і медичного факультетів Дніпропетровського національного університету. Визначення мембранного потенціалу ендотелію аорти щурів було проведено в Інституті фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України; дослідження скоротливої активності ізольованих препаратів артерій – на кафедрі фізіології людини і тварин Київського національного університету ім. Тараса Шевченка разом з к.б.н. Пасічниченко О. М. Аналіз, систематизацію, математичну обробку результатів та побудову на їхній підставі відповідних висновків автор провела самостійно. У дисертації не використовувались теоретичні ідеї і практичні розробки співавторів опублікованих робіт.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації представлені у доповідях на конференціях Дніпропетровського національного університету за підсумками науково-дослідних робіт в 1998-2004 рр.; на III-VI Міжнар. наук.-практ. конференціях Наука і освіта (Дніпропетровськ, 2000-2003 р.р); на Міжнародних науково-практичних конференціях Людина і космос (Дніпропетровськ, 1999-2002 р.); на 16-ому з’їзді Українського фізіологічного товариства (Вінниця, 2002 р.); на Всеукр. наук.-метод. конф. ”Культура здоровя як предмет освіти” (Херсон,1998 р.); на II Укр. конф. молодих вчених, присвяченій памяті акад. В. В. Фролькіса (Київ, 2001 р.); на конференції, присвяченій 160-річчю національного мед. ун-ту (Київ, 2001 р.); на Міжнародній науково-практичній конференції “Биосфера и человек” (Майкоп, 2001 р.); на Всеукраїнській наук. конференції, присвяченій 160-річчю каф. фізіології людини і тварин КНУ (Київ, 2002 р.); на Всеукраїнській науково-практичній конференції “Фізіологія людини і тварин” (Дніпропетровськ, 2003); на Всеукраїнській науково-практичній конференції “Довкілля і здоровя” (Тернопіль, 2003); на VIII міжнародній конференції по квантовій медицині “Теоретические и клинические аспекты квантовой медицины” (Донецьк, 2003); на симпозіумі “Особливості формування та становлення психофізіологічних функцій в онтогенезі” (Черкаси, 2003); на науково-практичній конференції з міжнародною участю, присвяченій 175-річчю з дня народження І. М. Сєченова “І. М. Сєченов та Одеська школа фізіологів” (Одеса, 2004); Х конгрес світової федерації Українських лікарських товариств (Чернівці, 2004).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 45 робіт, із яких 30 - у наукових фахових журналах, 15 є тезами доповідей з’їздів і конференцій, отримано патент на винахід 7G09B23/28.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису методів досліджень, дев’яти розділів результатів дослідження та їхнього обговорення, висновків і списку використаних джерел. Дисертація викладена на 277 сторінках, містіть 20 таблиць і 69 рисунків, список використаних джерел із 420 найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Методика досліджень

2.1. Утримання лабораторних тварин в умовах експерименту та розподіл їх на групи

Всі експерименти проведені у відповідності з існуючими міжнародними вимогами і нормами гуманного відношення до тварин.

Досліди виконані на безпородних білих щурах-самцях вагою 125-140 г. Дослідження проводили вранці, в один і той же час, натще, через кожні три тижні впродовж всього експерименту, який тривав 21 тиждень. Тварини були поділені на групи наступним чином. В першу групу ввійшли контрольні тварини (n=58). Друга група (n=56) - тварини, у яких викликали аліментарну (екзогенну) гіперхолестеринемію шляхом комбінованого застосування холестерину (0,5 г/ кг маси тіла) і солей жовчних кислот (100 мг/ кг маси тіла) [Лопухин, Арчаков, Владимиров, 1983; Климов, Никульчева, 1995]. В третю групу ввійшли 76 тварин, у яких створювали ендогенну гіперхолестеринемію шляхом обмеження життєвого простору до 80-100 см2 на одну тварину. Це досягалося тим, що в стандартну клітку розміром 0,3х0,5 м., де повинно утримуватись 2-3 тварини, розміщували 15-18 щурів. До того ж ці тварини, поряд зі звичайним раціоном харчування, як кондиціонуючий (підсилюючий) фактор, отримували кухонну сіль з розрахунку 2 г /кг маси тіла. Всі наступні групи були представлені тваринами, які паралельно з утворенням ендогенної гіперхолестеринемії, отримували речовини, що перешкоджали підвищенню внутрішньоклітинної концентрації кальцію тим чи іншим шляхом. Так, тварини четвертої групи (n=38) отримували ніфедипін 2мг/кг/добу, який блокував потенціалзалежні Ca2+ канали L-типу. Щурі п’ятої групи (n=36) отримували 1-[N-[S]-1-карбокси-3-фенілпропіл]-L-аланіл]-L-пролін-1-етиловий ефір (фармакологічна назва – еналаприл – 25 мг/кг/добу), який пригнічував активність ангіотензин-перетворюючого ферменту і зменшував синтез ангіотензину II . У тварин шостої групи (n=35) на фоні ендогенної ГХС пригнічували 1-адренорецептори за допомогою 1-(4-аміно-6, 7-діметокси-2-хіназоліл)-4-(2-фуроіл)-піперазину гідрохлориду (фармакологічна назва – празозін – 1 мг/кг/добу). Тварини сьомої групи (n=42) отримували додатково K+ і Mg2+ у складі калію-, магнію аспарагінату (фармакологічна назва – аспаркам – 1,75 г/кг/добу).

2.2. Визначення рівня загального холестерину і холестерину ліпопротеїдів високої щільності у сироватці крові

Забір крові проводили вранці, натще, кількість загального холестерину визначали у сироватці за методом Ілька [Меншиков и колл., 1987]. Визначення холестерину ліпопротеїдів високої щільності (ХС ЛПВЩ) базується на здатності ЛПНЩ і ЛПДНЩ утворювати нерозчинні комплекси з гепарином в присутності іонів марганцю [Колб, Камышников, 1982].

2.3. Атомно-абсорбційний метод визначення електролітів в тканинах і сироватці крові

Після декапітації тварин досліджували вміст кальцію, магнію і калію в аорті, серці, скелетному м'язі, печінці, мозку і сироватці крові. Проби готувались до аналізу методом вологого озолення. Визначення вмісту електролітів проводили у полум'ї “ацетилен - повітря” на атомно-абсорбційному спектрометрі AAS-30 фірми Карл Цейс Йєна (Німеччина) [Хавазов, Цалев, 1983].

2.4. Реєстрація ЕМГ як показника нейро-міогенних порушень за умов експерименту

Локальну ЕМГ реєстрували у тварин всіх груп за допомогою біполярних голкових електродів [Гехт, Коломенская, Строков, 1974]. Відведення ЕМГ проводили з m. biceps femoris за допомогою поліграфа П6ч-01 (Україна). Запамятовування, зберігання та подальша обробка результатів експериментальних досліджень проводилась на ЕОМ за допомогою програми “Eksperiment” (Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця, м. Київ) та “Mathcad 2000”. У всіх записах ЕМГ аналізували середню амплітуду (мкВ), частоту слідування імпульсів (Гц); кількість турнів на відрізках ЕМГ тривалістю 1 с і максимальне відношення кількості турнів ЕМГ до середньої амплітуди за 1 с (peak ratio) [Мейгал и колл., 2000]. Під турном мали на увазі коливання потенціалу ЕМГ амплітудою більше 100 мкВ [Антонен, Мейгал, Лупандин, 2002].

2.5. Методика “відкритого поля”. Аналіз рухової і дослідницької діяльності

Відкрите поле – це відкрита зверху пластикова камера розміром 90х90х60, дно якої розграфлено на 16 квадратів [Gray, 1974]. Під час досліду кожну тварину садовили в центр відкритого поля і реєстрували горизонтальну рухову активність (кількість перетнутих твариною квадратів) і дослідницьку активність (число заходів тварини в центральні квадратики) [Саркисов, Куликов, Коломейцева, 1996].

2.6. Визначення мембранного потенціалу ендотелію аорти

Дослідження проведені на ендотелії аорти щурів всіх груп на 21 тижні з початку експерименту. Мембранний потенціал (МП) ендотелію реєстрували методом перфорованого patch-clamp у режимі фіксації струму [Marchenko, Sage, 1993; Бондаренко, Сагач, 1996]. Ацетилхолін додавався в суперфузуючий розчин у концентрації 2 мкМ.

2.7. Дослідження скоротливої активності ізольованих препаратів артерій

Реєстрували скоротливу активність ізольованих препаратів черевної ділянки аорти і черевного стовбуру (на 21 тижні експерименту) [Блаттнер и колл., 1983]. Скорочення реєстрували за допомогою електрофізіологічного устаткування (Конструкторське бюро інституту фізіології ім. О.О. Богомольця, Україна). Вазоактивні речовини (норадреналін - 110-5 моль/л, адреналін - 510-5 моль/л, ацетилхолін - 110-4 моль/л) перфузували по проточній системі з постійною швидкістю 2-3 мл/хв..

2.8. Визначення частоти серцевих скорочень і її змін за умов експерименту

Дослідження ЧСС у щурів всіх груп проводились в один і той же час, вранці за допомогою поліграфу П6Ч-01 (блок РКВ). Вимірювання ЧСС проводилось поверхневим датчиком пульсу у хвостовій артерії.

2.9. Мікроскопічне дослідження тканин

Для дослідження забирали аорту, серце, печінку, мозок та скелетний мяз. Після фіксації, зрізи тканин фарбували гематоксилін-еозином [Медведєв, 1969]. Фарбування сполучнотканних елементів робили за допомогою методу Маллорі (у модифікації Слінченко) [Саркисов, Перов, 1996]. Всі пофарбовані зрізи поміщали в полістирол і вивчали під мікроскопом Р-16. Частина експериментального матеріалу була досліджена морфометрично методом системної стереометрії по Г. Г. Автанділову з використанням гніздового квадрату площею 2500 мкм2 [Автандилов, Яблучанский, Губенко, 1981].

2.10. Статистична обробка отриманих результатів

Аналіз результатів проводили з використанням аналітичних програм Origin 6.0 Professional і статистичного пакету програм Exel. Результати представлені як середні значення і середньоквадратична похибка при обсязі вибірки n. Вірогідність розбіжності між значеннями визначали за t-критерієм Стьюдента. Відмінності, отримані за методом парних порівнянь оцінювали як достовірні при Р0,05. Крім того розраховувався коефіцієнт кореляції (r) і його помилку (Sr).

Результати досліджень та їх обговорення

Динаміка рівня загального холестерину і ХС ЛПВЩ при моделюванні екзо- і ендогенної гіперхолестеринемії.

Аналіз динаміки рівня загального ХС крові у щурів контрольної групи показав наявність незначних плавних коливань, що були в межах фізіологічної норми, яка становить 1,00 – 2,60 ммоль/л [Трахтенберг и соавт., 1991] (рис. 1).

При тривалому введенні тваринам холестерину ззовні (група 2), його рівень в сироватці крові залишався в межах фізіологічної норми впродовж перших 12-ти тижнів (максимальне значення цього показника складало 2,29+0,24 ммоль/л, Р0,05). Стійке, статистично вірогідне підвищення рівня ХС (в 1,4-1,8 разів) у тварин цієї групи спостерігалось тільки через 15 тижнів, що співпадає з даними інших авторів, які вважають, що щури є резистентними до надлишку екзогенного холестерину, а тому у них важко моделювати аліментарну ГХС [Лопухин, Арчаков, Владимиров, 1983; Климов, Никульчева, 1984, 1995].

У щурів з відтвореною ендогенною ГХС рівень загального ХС крові збільшувався значно швидше: вже на третьому тижні від початку експерименту він перевищував його вміст у тварин контрольної групи в 3,5 рази, максимальне його збільшення спостерігалось через 12 тижнів (6,95+0,24 ммоль/л, Р<0,05) і підтримувалось до кінця експерименту.

Рис. 1. Динаміка рівня загального холестерину в сироватці крові щурів 1, контрольної групи, 2 групи – тварини з аліментарною ГХС та 3 групи – тварини з ендогенною ГХС. По вісі абсцис – час від початку досліду, тижні; по вісі ординат – концентрація холестерину в сироватці крові, ммоль/л.

Рівень загального ХС був у 2,5 рази вищий за той, який спостерігався у тварин, що отримували екзогенний холестерин. Застосовані нами кондиціонуючі дози NaCl не змінювали динаміку рівня загального ХС в крові тварин в умовах зооконфліктної ситуації, але збільшували його вміст на 16-18 %.

В зв’язку з тим, що в крові ссавців ХС знаходиться у складі ліпопротеїдних комплексів, за допомогою яких здійснюється його транспорт, їх визначення є досить інформативним. Встановлено, що більша частина ХС сироватки крові у чутливих до нього тварин знаходиться у складі ліпопротеїдів низької і дуже низької щільності (ХС ЛПНЩ і ХС ЛПДНЩ). Навпаки, у резистентних до ХС тварин, до яких відносяться щури, транспортерами ХС значною мірою є ліпопротеїди високої щільності (ХС ЛПВЩ) [Климов, Никульчева, 1999], що зумовило саме їх вивчення в проведеному нами дослідженні. На цей час чіткої відповіді на питання про ліпідний спектр крові у щурів в умовах ендогенної ГХС немає. Результати, які отримані за умов стресу різного генезу досить суперечливі [Панин, 1983; Гавриш и колл., 1999; Пшенникова, 2001; Никонов, 2002], що, певною мірою, зумовлено видовими відмінностями тварин. Проведений нами аналіз показав (табл. 1), що при ендогенній ГХС відсоток ХС ЛПВЩ від рівня загального ХС статистично вірогідно збільшувався вже на початку експерименту: через 3 тижні він складав 71,67+5,59 % (Р<0,05), на відміну від його значення у контрольних щурів (54,47+3,61%). Його прогресивне збільшення тривало 12 тижнів, і максимальне значення становило 92,16+10,65 % ( P<0,05).

Таблиця 1

Динаміка вмісту ХС ЛПВЩ у сироватці крові щурів контрольної групи (1)

і в умовах розвитку ендогенної гіперхолестеринемії (3) (M+m, N=134)

Примітки:

*- вірогідність змін показника у порівнянні з відповідним контролем при рівні значимості Р<0,05.

Через 15 тижнів він починав поступово знижуватись до значень, які були навіть нижчими від таких у контрольних тварин. Отже, при ГХС зміни відсотку ХС ЛПВЩ від рівня загального ХС мали двофазний характер: в першу половину дослідження їх відсоток статистично вірогідно збільшувався, а в другій половині статистично вірогідно зменшувався.

Структурні зміни досліджених органів при аліментарній і ендогенній гіперхолестеринемії.

Аналіз морфологічної структури аорти, серця, печінки, мозку і посмугованого м’яза у щурів із тривалим (21 тиждень) підвищеним рівнем ХС в крові виявив його ушкоджуючий вплив в тій чи іншій мірі на всі досліджені органи, але в найбільшій мірі ушкоджувались аорта і печінка. Так, якщо у тварин контрольної групи аорта мала класичну будову, кількість клітин в її стінці дорівнювала 6,80+0,29 на 2500 мкм2, то у тварин з аліментарною ГХС стінка аорти була потовщеною за рахунок набряку і склерозу. Ендотелій був набряклим, місцями десквамованим. Еластичні мембрани витончені, дещо розпрямлені, з нечіткими контурами. Між волокнами спостерігалась проліферація гладеньком’язових клітин і клітин сполучної тканини з вираженим поліморфізмом ядер. Частина ядер мала округлу, неправильну форму, відзначався феномен “вертикального розташування ядер”, тобто перпендикулярно до внутрішньої поверхні аорти. В адвентиції спостерігалось явище хронічного запалення з периваскулярним розташуванням круглоклітиного інфільтрату переважно з макрофагів і лімфоїдних елементів. Еластичні волокна були витончені, прозорі, розпрямлені. Кількість клітинних елементів в стінці аорти у тварин цієї групи збільшувалась (11,58+0,90 на 2500 мкм2), що свідчить про інтенсивні процеси гіперплазії. Зміни морфологічної структури аорти при аліментарній і ендогенній ГХС були подібними, але у щурів з ендогенною ГХС спостерігалось більш виражене порушення цитоархітектоніки у вигляді витончення, розщеплення, розпаду і дегенерації еластичних мембран, їх заміні на колагенові волокна, порушення цілісності ендотелію за рахунок десквамації клітин. Стінка аорти мала класичні прояви ксантоматозу і атероматозу. Кількість клітин в стінці аорти на одиницю площі, що досліджувалась, становила 7,80+0,50 (Р0,05), тобто була статистично вірогідно більша, ніж у контрольних тварин, але значно меншою, ніж у щурів з відтвореною аліментарною ГХС.

Порушення цитоархітектоніки печінки проявлялось в тому, що контури печінкових балок були розмиті і синусоїди визначалися важко. Гепатоцити мали гранульовану цитоплазму та гіпохромні ядра з вираженими ядерцями. Відслідковувався набряк гепатоцитів за рахунок жирової дистрофії та зсув ядер на периферію клітини. Чітко визначалися місця апоптозу деяких гепатоцитів. При ендогенній ГХС спостерігались клітини з ознаками не тільки жирової, але й гідропічної дистрофії, а печінкові балки здебільшого зовсім не продивлялися. В кардіоміоцитах відмічались незначні зміни у вигляді дифузного кардіосклерозу з жировою дистрофією м’язових волокон. В тканинах головного мозку відмічався периваскулярний та перицелюлярний набряк, спостерігались дистрофічні зміни у нейронах. Морфологічна структура посмугованих м'язів при відтворенні обох моделей експериментальної ГХС майже не змінювалась.

Отже, при тривалому надходженні надлишкового ХС ззовні, або активації синтезу ендогенного ХС зооконфліктною ситуацією спостерігались порушення морфологічної структури, які були якісно подібними, але більш вираженими при ендогенній ГХС. Чутливість досліджених органів до ушкоджуючої дії стійкого підвищення рівня ХС була неоднаковою – найбільш чутливими виявились аорта і печінка, найменш чутливими – скелетні м’язи.

Динаміка вмісту кальцію в досліджених органах щурів при ендогенній гіперхолестеринемії (3 група тварин).

Аналіз динаміки вмісту кальцію в досліджених органах щурів контрольної групи показав наявність незначних його коливань, що були в межах фізіологічної норми і які, швидше за все, були зумовлені циклічністю фізіологічних процесів (рис.2).

При ГХС динаміка вмісту кальцію у всіх органах зберігалась, але його вміст був значно вищим, ніж у контрольних щурів, і збільшення спостерігалось вже на початку дослідження. Так, через 3 тижні в аорті вміст кальцію перевершував його значення у контрольних щурів більш, ніж в 3 рази (рис.2), що корелювало із значним збільшенням вмісту ХС в крові. Максимальне збільшення вмісту кальцію (в 6 разів) відмічалось через 15 тижнів і становило 4223,66+312,73 ммоль/кг, що теж співпадало в часі з максимальним збільшенням вмісту ХС в крові. Підвищений вміст кальцію спостерігався до кінця експерименту, хоч в другій половині дослідження він починав зменшуватись і через 21 тиждень тільки незначно перевищував його рівень у контрольних щурів. Рівень ХС при цьому залишався значно вищим за норму.

Рис. 2. Динаміка вмісту кальцію в аорті щурів 1, контрольної групи (білі стовпчики) і 3 групи – тварини з ГХС (чорні стовпчики) впродовж експерименту. По вісі абсцис – час від початку досліду, тижні; по вісі ординат – концентрація кальцію, ммоль/ кг.

В міокарді вміст кальцію збільшувався в 2-2,5 рази (Р0,05) через 3 тижні від початку моделювання ГХС. Максимальне збільшення його вмісту спостерігалось через 12-18 тижнів, коли вміст кальцію досягав 174,10+8,65 ммоль/кг (Р0,05). Викликає здивування, що таке значне збільшення вмісту кальцію в міокарді не супроводжувалось значними порушеннями його морфологічної структури, на відміну від аорти і печінки. Можливо, первинне ушкодження клітинної мембрани активує Са2+-залежні протеїнкінази і замикає своєрідне “порочне коло” порушення цитоскелету і загибелі клітини [Сперелакис, 1988], тому збільшення цитозольного Са2+ в кардіоміоцитах не призводить до їхньої загибелі. Аналіз цих явищ на ізольованому серці показав, що вони пов’язані з порушенням енергетичного забезпечення [Shine, 1979; Пшенникова, 2001].

Значне збільшення вмісту кальцію спостерігалось у посмугованому м'язі, з максимумом через 15 тижнів від початку дослідження і становило 175,82+18,83 ммоль/кг (P<0,05), тобто перевищувало його рівень в контролі в 7,4 рази.

Вміст кальцію в головному мозку щурів при ендогенній ГХС був в 1,5-8 разів вищий, ніж у тварин контрольної групи.

Найбільш вираженим виявилось накопичення тканинного кальцію в печінці. Впродовж перших 9 тижнів його вміст збільшився в 1,1-1,5 разів, але через 12 тижнів відмічалось його дуже значне збільшення, яке впродовж наступних трьох тижнів перевищувало рівень контролю у 18-37 разів. Через 21 тиждень вміст кальцію в печінці залишався в 10-12 разів вищим за його рівень у контрольних щурів.

Рівень кальцію в сироватці крові щурів контрольної групи впродовж експерименту становив 0,70+0,02 ммоль/л - 1,40+0,11 ммоль/л. В умовах ендогенної ГХС він максимально збільшувався до значень 2,790,06 ммоль/л (P<0,05) через 3 тижні від початку дослідження, після чого інтенсивно зменшувався до значень, навіть нижчих за рівень контролю: через 21 тиждень він становив 0,290,05 ммоль/л, Р<0,05.

Отже, в умовах ендогенної ГХС спостерігалось прогресивне накопичення кальцію в усіх досліджених органах, при цьому вміст кальцію в крові зменшувався в значній мірі. Динаміка накопичення кальцію в досліджених органах була подібною, але кількісні характеристики відрізнялись: найбільш значним збільшення тканинного кальцію виявилось в печінці. Відомо, що при стресі збільшення входу Са2+ в клітину, зумовлене активацією нейро-гуморальної системи, посилює процеси ПОЛ і може сприяти збільшенню утворення ендогенного ХС. Надмірне утворення ХС, в свою чергу, змінюючи специфічні функції мембран, може сприяти порушенню кальцієвого гомеостазу. Тобто кальцій- і ліпотропний ефекти тісно пов’язані один з одним. В проведеному нами дослідженні повільне збільшення вмісту кальцію в органах впродовж перших 9 тижнів дослідження свідчить про досить якісну роботу механізмів його виведення з клітин, але при тривалій дії стресора різке збільшення акумуляції кальцію в досліджених органах вже свідчить про виснаження шляхів енергозабезпечення клітини і ушкодження механізмів кальцієвого гомеостазу. Перевантаження клітин кальцієм стимулює апоптотичні і некротичні процеси, що було виявлено нами при аналізі морфологічної структури досліджених органів. Вважають [Mabile et al., 1995; Новиков, 1996; Уманский, 1996; Froese et al., 1999], що в цих умовах змінюється чутливість та спорідненість мембранних рецепторів до ряду гормонів і стає можливим розвиток так званого “тканинного остеопорозу”, коли кальцій може виходити у міжклітинний простір і вимиватись током крові. В наших дослідах це проявлялось у поступовому зниженні рівня тканинного кальцію майже до вихідних значень через 21 тиждень від початку експерименту.

Отже, в умовах ендогенної ГХС прогресивне збільшення в плазмі крові ХС супроводжувалось значним зменшенням в ній вмісту Са2+. Накопичення кальцію в досліджених органах призводило до ушкодження їх морфологічної структури в тій чи іншій мірі.

Зміни вмісту тканинного кальцію у досліджених органах при ендогенній гіперхолестеринемії і блокуванні потенціалзалежних кальцієвих каналів L-типу (4 група тварин).

Зважаючи на широку розповсюдженість потенціалзалежних Са2+ каналів L-типу в організмі, нам уявлялось важливим визначення їх вкладу в надмірне накопичення кальцію в різних органах при відтворенні ендогенної ГХС.

Аналіз отриманих даних показав, що в умовах ГХС блокування потенціалзалежних Са2+ - каналів L-типу за допомогою ніфедипіну попереджувало стійке збільшення вмісту кальцію у всіх досліджених органах. Так, в аорті вже через 3 тижні від початку експерименту вміст кальцію не тільки не підвищувався, але був навіть нижчим за його значення у тварин контрольної групи і підтримувався на цьому рівні впродовж всього експерименту (рис. 3).

Рис. 3. Динаміка вмісту кальцію в аорті щурів 1, контрольної групи (білі стовпчики), 3 групи – тварини з ГХС (чорні стовпчики) та 4 групи – тварини з ГХС+ніфедипін (сірі стовпчики) впродовж експерименту. По вісі абсцис – час від початку досліду, тижні; по вісі ординат – концентрація кальцію, ммоль/ кг.

Аналіз морфологічної структури аорти (через 21 тиждень) показав, що блокування потенціалзалежних Са2+ - каналів L-типу не усувало повністю її пошкодження, але зменшувало їх: еластичні мембрани залишались витонченими, волокна розрізненими, без чітких контурів, але розпаду і дегенерації мембран не виявлено. Простір між мембранами був розширений і заповнений ксантомними, гладеньком’язовими клітинами і фібробластами. Ядра гладко’мязових клітин поліморфні. Ендотелій набухлий, але цілісність його не порушена. Стереометричні дослідження стінки аорти виявили значне зростання кількості клітинних елементів в порівнянні з показниками щурів з відтвореною ГХС (12,00+1,06 на 2500 мкм2 , Р0,05).

Аналогічним чином, блокування потенціалзалежних Са2+ - каналів L-типу попереджувало збільшення вмісту кальцію в міокарді: впродовж перших 15 тижнів він не відрізнявся від значень у контрольних щурів, а через 18 тижнів навіть знижувався відносно його значень у щурів контрольної групи.

Динаміка вмісту кальцію в скелетному м’язі була подібною тій, що спостерігалась в міокарді: через 3 тижні рівень тканинного кальцію в скелетному м’язі знижувався майже до контрольних величин, а через 18 тижнів цей показник ставав навіть нижчим за контрольні значення і складав 1,1+0,1 ммоль/кг.

У головному мозку вміст кальцію знизився в перші 12 тижнів в середньому в 1,9 разів, а через 15 тижнів і до кінця експерименту – в 5 разів, порівняно з його вмістом у щурів з ГХС без застосування ніфедипіну, але впродовж практично всього експерименту вміст кальцію перевищував його значення у контрольних щурів.

Застосування ніфедипіну не з початку моделювання ГХС, а на піку її прояву, тобто з 12-го тижня, також досить суттєво знижувало рівень тканинного кальцію в досліджених органах, але в меншій мірі, ніж при його застосуванні паралельно з розвитком ГХС (Р0,05). Отримані дані можуть свідчити, що впродовж перших 12 тижнів моделювання ГХС функціональна активність мембранних структур залишається майже неушкодженою.

Вміст кальцію в плазмі крові різко збільшувався впродовж перших 6 тижнів до значень 5,17 +0,20 ммоль/л. Через 15 тижнів спостерігалось максимальне його збільшення, яке сягало 7,99+0,09 ммоль/л. Через 18-21 тиждень рівень кальцію у сироватці крові знижувався навіть нижче рівня контролю. Найбільш високий рівень кореляції між вмістом кальцію в досліджених органах і крові виявлено в період 15-21 тиждень дослідження (r= 0,99; P<0.001).

В печінці після блокування потенціалзалежних Са2+ - каналів L-типу вміст кальцію впродовж перших 9 тижнів від початку дослідження теж був майже на рівні його значень у контрольних щурів. Через 12 тижнів він становив 1,97+0,03 ммоль/кг, а через 15 тижнів – 2,99+0,01 ммоль/кг, тобто вміст кальцію в печінці знижувався майже в 20 разів порівняно з щурами, у яких ГХС формувалась без блокування потенціалзалежних Са2+ - каналів L-типу. Цей факт цікавий тим, що в печінці не виявлено потенціалзалежних Са2+ - каналів L-типу. Зважаючи на це, не виключено, що ніфедипін впливав на вміст кальцію в цьому органі непрямо.

Блокування потенціалзалежних Са2+-каналів L-типу супроводжувалось зменшенням вмісту ХС та ХС ЛПВЩ в крові (табл.2). Коефіцієнт кореляції між вмістом ХС ЛПВЩ крові і кальцію печінки впродовж всього часу дослідження був досить високим і вірогідним: r=0,83-0,86, Р0,001.

Таблиця 2

Динаміка вмісту ХС і ХС ЛПВЩ в сироватці крові щурів при

блокуванні потенціалзалежних кальцієвих каналів на фоні ГХС (М+m, N=38)

Примітки:

* - достовірні зміни по відношенню до значень групи 1;

* * - достовірні зміни по відношенню до значень групи 3.

Таким чином, отримані дані дають підставу вважати, що ендогенна ГХС розвивалась, значною мірою, в результаті надмірної активації потенціалзалежних Са2+- каналів L-типу, оскільки пригнічення цього шляху надходження Ca2+ в клітину значно зменшувало його вміст в досліджених органах і ХС в сироватці крові.

Роль ренін-ангіотензинової системи у збільшенні вмісту тканинного кальцію при ендогенній гіперхолестеринемії (5 група тварин).

Відомо, що активація ренін-ангіотензин-альдостеронової системи сприяє підвищенню рівня внутрішньоклітинного кальцію, тому блокатори рецепторів АТ 1, АТ 2 і ангіотензинперетворюючого ферменту (АПФ) широко використовуються в клініці і фізіологічних експериментах з метою запобігання гіпертрофії і гіперплазії судин та міокарду [Tamura et al., 2000; Gouzalez et al., 2001; Mandarim-Lacerda, Pereira, 2001], надмірного синтезу колагену [Molteni et al., 2000], зниження активації ПОЛ [Свіщенко та ін., 2002], тощо. У зв’язку з цим, важливим уявляється визначення ролі ренін-ангіотензинової системи у підвищенні